Demuestra de la dirigida de inhibidores de peptidilos fluorescentes en ClpXP mitocondrial mediante microscopía de fluorescencia en células de mamíferos

Resumen

Este protocolo establece un flujo de trabajo de imagen cuantitativa que incluye la aplicación de microscopía confocal para monitorizar la localización selectiva del inhibidor fluorescente del peptidil ClpP FAM-FAPAL-CMK (Carboxifluoresceína-FAPAL-clorometil cetona) en las mitocondrias para dirigirse a ClpP, y los posteriores cambios morfológicos en las mitocondrias de células intactas causados por la inhibición de ClpP.

Resumen

Las proteasas mitocondriales dependientes de ATP son esenciales para mantener la homeostasis proteica mediante la degradación de proteínas dañadas o mal plegadas. Entre ellas, el complejo proteasa ClpXP se localiza en la matriz mitocondrial y contribuye al control de calidad mitocondrial bajo condiciones fisiológicas y de estrés. Este trabajo demuestra un flujo de trabajo de microscopía de fluorescencia cuantitativa para evaluar la orientación mitocondrial del inhibidor de peptidilos fluorescentes FAM-FAPAL-CMK y evaluar los cambios morfológicos mitocondriales asociados a la inhibición de ClpXP en células de mamíferos. Las células HeLa fueron tratadas con FAM-FAPAL-CMK y analizadas mediante microscopía confocal combinada con tinción por inmunofluorescencia de marcadores mitocondriales y análisis cuantitativo de imágenes. El análisis de colocalización utilizando el umbral de Costes y los coeficientes de solapamiento de Manders demostró enriquecimientos mitocondriales de la señal inhibidora. Como consecuencia, la inhibición de ClpP alteró la morfología mitocondrial. El análisis de inmunoblot no mostró cambios significativos en la abundancia de proteínas ClpP tras el tratamiento con inhibidor. En conjunto, este trabajo describe un flujo de trabajo reproducible basado en imágenes que permitirá la interrogación de funciones mitocondriales de ClpXP en células intactas en respuesta a perturbaciones de la homeostasis, como el estrés oxidativo.

Introducción

Las proteasas mitocondriales dependientes de ATP son centrales para la homeostasis de proteínas, degradando proteínas mal plegadas o^dañadas 1,2,3,4,5,6. Entre ellas, ClpXP es un complejo proteasa AAA+ hetero-oligomérico situado en la matriz mitocondrial. La ATPasa ClpX reconoce y despliega proteínas, para luego translocarlas a la cámara proteolítica^{ClpP 7,8,9}. Junto con otras proteasas mitocondriales, ClpXP mantiene el control de calidad de las proteínas tanto en condiciones normales como de estrés, incluyendo estrés oxidativo y perturbaciones^{metabólicas 1,2,4}. La alteración de la homeostasis de las proteínas mitocondriales se ha relacionado con enfermedades como la neurodegeneración y el cáncer, lo que subraya la importancia de comprender estas actividades proteasas en sistemas celulares^{intactos 3,6,10}.

Un gran desafío en el campo es la falta de métodos para monitorizar directamente la actividad de las proteasas mitocondriales con resolución espacial en células intactas. Los enfoques existentes se basan principalmente en ensayos bioquímicos utilizando proteínas purificadas o lisados celulares, que proporcionan información cinética detallada pero no preservan el contexto subcelular 11,12,13,14. Las estrategias de biología química han abordado esta limitación en parte desarrollando sustratos peptídicos fluorogénicos e inhibidores dirigidos al sitio activo. Los sustratos peptidílicos fluorescentes permiten la medición cuantitativa de la actividad peptidasa dependiente de ATP, mientras que los inhibidores peptidilos forman interacciones covalentes reversibles con el sitio proteolítico para lograr una inhibición^selectiva 13,15,16,17,18,19. Anteriormente, se ha demostrado que el inhibidor de ClpXP sintetizado en laboratorio FAPAL-CMK forma un enlace covalente con^{ClpP 20}. En este estudio, se desarrolló FAM-FAPAL-CMK, un derivado marcado con fluoresceína de FAPAL-CMK, como inhibidor basado en mecanismos de ClpP, permitiendo la visualización de su localización intracelular.

En comparación con los ensayos bioquímicos, la microscopía de fluorescencia confocal permite evaluar espacialmente la distribución de las sondas y la morfología mitocondrial en células intactas, proporcionando información que no puede obtenerse únicamente de los lisados. Sin embargo, a diferencia de los ensayos enzimáticos, la localización de fluorescencia no mide directamente la actividad catalítica ni los eventos de unión molecular y puede verse influenciada por la eficiencia de captación de la sonda, la dinámica mitocondrial y las condiciones de imagen. Además, una implementación exitosa depende de una acumulación adecuada de la sonda y de redes mitocondriales suficientemente resueltas, lo que hace que este flujo de trabajo sea más adecuado para células cultivadas adherentes con morfología mitocondrial claramente distinguible.

El objetivo de este estudio es establecer un flujo de trabajo cuantitativo que integre sondas fluorescentes basadas en mecanismos con microscopía confocal para monitorizar la localización y función de la proteasa mitocondrial en células intactas. Al combinar sondas químicas selectivas con imágenes confocales de alta resolución, este flujo de trabajo permite evaluar la localización mitocondrial, la distribución de las sondas y las respuestas morfológicas a perturbaciones de la homeostasis mitocondrial en células intactas. Puede complementar los ensayos bioquímicos existentes que miden directamente la actividad de las proteasas pero carecen de resolución espacial.

Protocolo

Se realizaron experimentos utilizando células HeLa disponibles comercialmente. No se utilizaron participantes humanos, animales vertebrados ni materiales biológicos primarios derivados de humanos o vertebrados. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo celular y tratamiento

1. Cultivar células HeLa en el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
2. Colocar las células de placa sobre cubiertas de cristal estériles e incubarlas durante 24 horas para permitir la unión celular.
3. Disuelva el inhibidor FAM-FAPAL-CMK en DMSO para preparar un stock de 50 μM y congele a -20 °C para su almacenamiento.
4. Añade 50 nM FAM-FAPAL-CMK al medio de crecimiento celular en las muestras de células tratadas.
5. Añadir un volumen igual de DMSO a las muestras de control para igualar la concentración final de disolvente de las muestras tratadas con inhibidores, asegurando que ningún efecto se deba al DMSO.
6. Incubar las células durante 18 horas adicionales bajo las mismas condiciones de cultivo antes del procesamiento posterior.
   Nota: El inhibidor de FAM-FAPAL-CMK está diseñado y sintetizado en laboratorio, y el método de síntesis ha sido reportado^{previamente 20}.

2. Fijación y permeabilización

1. Lava las células con D-PBS precalentado durante 5 minutos y repite una vez.
2. Fije las células durante 15 minutos a temperatura ambiente usando un tampón PHEM (68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM_{MgCl 2}, pH 6,9) que contienen 2,4% (v/v) de formaldehído, 0,05% (v/v) de glutaraldehído y 0,5% (v/v) de saponina.
3. Prepara una solución fresca de borohidruro de sodio (5 mg/mL en D-PBS).
4. Incubar las células en la solución de borohidruro de sodio durante 15 minutos a temperatura ambiente para neutralizar el glutaraldehído residual.
5. Enjuaga las células tres veces con D-PBS durante 5 minutos cada una antes de teñir.
   NOTA: El formaldehído y el glutaraldehído son fijadores tóxicos. Realiza los pasos de fijación en la capucha y lleva el equipo de protección personal adecuado (guantes, bata de laboratorio y protección ocular). El borohidruro de sodio es un agente reductor reactivo y debe manipularse con cuidado. Se seleccionó el tampón de fijación basado en PHEM que contiene formaldehído, glutaraldehído y saponina para preservar la morfología mitocondrial manteniendo la accesibilidad de antígenos durante la inmunotinción. El formaldehído y el glutaraldehído proporcionan reticulación proteica para la preservación estructural, mientras que la composición tampón y el pH del PHEM ayudan a estabilizar la ultraestructura mitocondrial²¹. La saponina facilita la permeabilización de membrana para mejorar la velocidad de penetración del fijador. Esta estrategia de fijación minimiza la distorsión de las redes mitocondriales y es especialmente adecuada para el análisis cuantitativo de la morfología mitocondrial.

3. Tinción por inmunofluorescencia

1. Bloquear células durante 1 hora a temperatura ambiente en un tampón bloqueador que contiene albúmina sérica bovina (BSA) al 3% (p/v) en PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_{Na 2HPO 4}, 1,8 mM_{KH 2}PO₄, pH 7,4) con 0,1% (v/v) Triton X-100.
2. Incubar células con anticuerpos primarios diluidos en un tampón bloqueador durante 1 hora a temperatura ambiente. Usa anti-TOMM20 para ratón (1:500) y anti-ClpP para conejo (1:500).
3. Lava las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada una para eliminar los anticuerpos primarios no unidos.
4. Incubar células con anticuerpos secundarios diluidos en un tampón bloqueador durante 1 hora a temperatura ambiente. Utiliza anticuerpo secundario de ratón conjugado con CF405S (1:500) y anticuerpo secundario de conejo conjugado con Alexa Fluor 647 (1:500).
5. Proteger las muestras de la luz durante y después de la incubación secundaria de anticuerpos.
6. Repite el paso 3.3.
7. Monta los cubreabrimos sobre correderas de vidrio usando un medio de montaje.
   NOTA: ClpP y TOMM20 se visualizaron bajo 405 nm y 647 nm para evitar cualquier solapamiento espectral con señales FAM.

4. Adquisición de imágenes

1. Adquirir imágenes utilizando un microscopio láser confocal equipado con un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica.
2. Excita fluoróforos usando líneas láser de 405 nm y 633 nm. Utiliza divisores de haz dicróicos apropiados para reflejar la luz de excitación y transmitir la fluorescencia emitida a los detectores.
3. Ajusta el tamaño del píxel a 35,3 nm (X, Y) y el paso Z a 0,1 μm para asegurar un muestreo axial suficiente de las estructuras mitocondriales.
4. Adquirir imágenes con un tamaño de fotograma de 1900 x 1900 píxeles (X, Y) y recoger 5 secciones ópticas por pila Z, comenzando en la señal mitocondrial superior y terminando por debajo de la señal mitocondrial para asegurar que se recoja la señal mitocondrial predominante.
   NOTA: Los ajustes representativos de adquisición del microscopio se proporcionan en la Figura Suplementaria 1. En las células HeLa, las mitocondrias suelen ser estructuras tubulares delgadas, de alrededor de 0,5-1 μm de diámetro²². Así que un Z-volumen de 0,5 μm es suficiente para capturar una fracción sustancial de la matriz mitocondrial individual, pero no necesariamente toda la célula. Se seleccionó una pila en Z de 5 secciones para equilibrar el muestreo suficiente de estructuras mitocondriales con la adquisición rápida de imágenes para minimizar artefactos relacionados con el movimiento durante la imagen celular.

5. Tratamiento con células vivas e imagen

1. Cultivar células HeLa en platos de fondo de vidrio de 35 mm en DMEM con un 10% de FBS a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
2. Añadir inhibidor (concentración final: 50 nM) o un volumen equivalente de DMSO a las células 24 horas después de la siembra. Incubar las células durante 18 horas adicionales bajo condiciones estándar de cultivo.
3. Retira el medio de cultivo que contiene el inhibidor o DMSO y enjuaga las células una vez con D-PBS precalentado durante 5 minutos.
4. Añadir solución de imagen de células vivas que contiene MitoTracker DeepRed de 20 nM.
5. Realizar imágenes de células vivas a temperatura ambiente utilizando los mismos ajustes de microscopio descritos anteriormente. Adquiere imágenes en modo de escaneo por fotograma con un promedio aproximado de 4,72 s por sección óptica (unos 24 s en total por pila Z de 5 secciones).
   NOTA: Cinco secciones ópticas por pila Z se configuran para equilibrar un muestreo suficiente de estructuras mitocondriales con tiempos de adquisición manejables. Además, se utiliza una solución de imagen de células vivas a temperatura ambiente para reducir la motilidad mitocondrial en comparación con la imagen a 37 °C. Aunque el movimiento mitocondrial durante la imagen de células vivas puede contribuir aún a la variabilidad en las mediciones de colocalización, la consistencia de la adquisición en todas las muestras ayuda a reducir el sesgo sistemático. Los ajustes representativos del software se muestran en la Figura Suplementaria 2.

6. Análisis de morfología mitocondrial

1. Abre archivos de imagen en Fiji²³ y genera proyecciones de máxima intensidad a partir de pilas Z seleccionando Pilas de Imágenes → → proyecto Z y eligiendo Intensidad Máxima.
2. Aplica el método de umbral de Otsu navegando a Imagen → Ajustar → umbral y seleccionando Otsu entre las opciones de umbral. Aplica el umbral a las mitocondrias segmentadas.
3. Ejecuta el plugin²⁴ de Mitochondria Analyzer y selecciona el modo de análisis 2D por mito.
4. Mide el tamaño (área) y el perímetro mitocondrial utilizando la salida del analizador de mitocondrias.
5. Obtén los valores del factor de forma mitocondrial directamente de la salida del analizador de mitocondrias, donde el factor de forma se calcula como P²/(4πA), con P representando el perímetro y A el área.
6. Mide la longitud total de rama por mitocondria utilizando la función de análisis de redes dentro del plugin para evaluar la conectividad mitocondrial.
7. Presenta los datos como distribuciones de mediciones mitocondriales individuales junto con valores medios derivados de 30 células por condición en tres réplicas biológicas independientes.
8. Evalúa la significación estadística usando la prueba t de Welch en un software de análisis estadístico.

7. Análisis de colocalización

1. Abre archivos de imagen en Fiyi y genera proyecciones 2D de máxima intensidad a partir de pilas de imágenes 3D. Para mayor coherencia, analiza todas las muestras utilizando la misma estrategia de proyección y adquisición.
2. Divide los canales de fluorescencia seleccionando Imagen → Color → Canales Divididos.
3. Inicia el plugin Coloc 2 seleccionando Plugins → Colocalization → Coloc 2.
4. Asigna los canales apropiados para el análisis y activa la regresión umbral de Costes en la configuración del plugin. Haz el análisis por célula.
5. Registrar los coeficientes de solapamiento de Manders (M1 y M2) para evaluar la fracción de señal en cada canal que coincide espacialmente con el otro.
6. Activa la aleatorización de Costes en la configuración de Coloc 2 y configura el número de aleatorizaciones en 50 para evaluar la significación estadística.

8. Generación de lisatos celulares

1. Siembra células HeLa en DMEM con 10% de FBS e incuba a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de_CO2.
2. Añadir un inhibidor de 50 nM o un volumen equivalente de DMSO a las células 24 horas después de la siembra, e incubar durante 18 horas adicionales bajo condiciones estándar de cultivo.
3. Retira el medio de cultivo y enjuaga las células con D-PBS precalentado durante 5 minutos, y tripsina para desprenderse.
4. Templar la tripsinización con medio de crecimiento celular fresco y centrifugar a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Descarta el sobrenadante.
5. Resuspende el pellet de celda en D-PBS y centrifuga a 300 x g durante 3 minutos para lavar las celdas. Descarta el sobrenadante.
6. Resuspende el pellet celular en un tampón de lisis preenfriado (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM cloruro de sodio, 0,1% SDS, 0,5% desoxicolato de sodio, 2% CHAPS, 10 mM TCEP, 1 mM PMSF, 1x cóctel inhibidor de proteasa).
7. Incubar lisados sobre hielo durante 20 minutos y sonicar lisados en un baño de agua con hielo durante 2 minutos para asegurar una lisis completa.
8. La centrifugadora lisa a 13.000 x g, 4 °C durante 20 minutos.
9. Transfiere el sobrenadante despejado a un tubo fresco preenfriado para su análisis aguas abajo.
   NOTA: El PMSF es tóxico y debe manipularse en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado. El SDS es un irritante, y la sonicación genera calor y aerosoles. Realizar pasos de lisis y sonicación sobre hielo y seguir las directrices de seguridad institucional.

9. Ensayo de Bradford

1. Prepara un conjunto de soluciones estándar usando BSA en 0,15 M cloruro de sodio. Las concentraciones son: 0, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL.
2. Diluir el lisato celular desconocido 50 veces y 100 veces en 0,15 M cloruro de sodio.
3. La pipeta replica cada solución de curva estándar y muestras desconocidas en una placa de 96 pozos.
4. Añade reactivo Bradford a cada pozo. Para cada pozo, utiliza una solución proteica de 160 μL con 40 μL de reactivo Bradford 5x (disponible comercialmente). Mezcla suavemente pipeteando.
5. Incuba la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos y mide la absorbancia a 595 nm usando un lector de placas.
6. Genera una curva estándar representando las concentraciones de BSA en el eje x y la absorbancia media a 595 nm a partir de mediciones replicadas en el eje y.
7. Determinar las concentraciones de proteínas de las muestras usando la curva estándar. Multiplica los valores calculados por el factor de dilución para obtener la concentración original.

10. Inmunoblot

1. Carga cantidades iguales de lisado celular en un gel de poliacrilamida al 12% y separa proteínas mediante SDS-PAGE.
2. Activa la membrana PVDF sumergiéndola brevemente en etanol. Equilibra tanto la membrana como los papeles absorbentes en el buffer de transferencia.
3. Transfiere proteínas del gel a una membrana PVDF usando un sistema de transferencia semi-seco.
4. Bloquea la membrana con leche seca desnatada al 5% (p/v) en TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) a temperatura ambiente durante 1 hora con una agitación suave.
5. Incubar la membrana con el anticuerpo primario diluido en un tampón bloqueador a temperatura ambiente durante 1 hora con una agitación suave. Utiliza anti-ClpP de conejo (1:2000) y anti-beta-actina de ratón (ACTB, 1:10.000).
6. Lava la membrana tres veces con TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20, pH 7,6) durante 5 minutos por lavado para eliminar el anticuerpo no unido.
7. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con HRP diluido en buffer bloqueante (1:3000) a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave.
8. Repite el paso de lavado.
9. Detectar bandas proteicas usando reactivos de detección quimioluminiscentes.

11. Análisis densitométrico

1. Abre la imagen de la mancha occidental en Fiyi.
2. Cambia el tipo de imagen a 8 bits por el tipo de Imagen → → 8 bits.
3. Resta el fondo de la imagen por Process → resta fondo. Comprueba el fondo de luz y ajusta el radio de la bola rodante a 50,0 píxeles.
4. Rodea la banda en el primer carril usando la herramienta rectángulo, luego selecciona analizar → gel → selecciona primer carril.
5. Mueve la herramienta rectángulo al segundo carril y selecciona analizar → gel → selecciona siguiente carril. Repite este paso hasta que se seleccionen todos los carriles.
6. Grafica la densidad de bandas analizando → gel → trazando líneas.
7. Usa la herramienta de línea recta para dibujar una línea en la parte inferior del pico de densidad de bandas, y usa la herramienta de varita para leer la densidad de bandas.
8. Repite el mismo procedimiento de los pasos 11.1–11.8 en la imagen de la mancha de control de carga.
9. Informa de la densidad de bandas relativa dividiendo la densidad (ClpP) por la densidad (ACTB).

Resultados

La inhibición de ClpP altera la morfología mitocondrial y la organización de la red
Se evaluó la morfología mitocondrial para determinar si la inhibición de ClpP altera la organización mitocondrial en las células HeLa. Las imágenes representativas de fluorescencia mostraron diferencias claras en la organización mitocondrial entre las células control y las tratadas con FAM-FAPAL-CMK (Figura 1A). El análisis cuantitativo mostró que el área ...

Discusión

La cetona peptidil clorometil FAPAL-CMK¹⁵ ha demostrado anteriormente ser un posible inhibidor irreversible de la subunidad proteasa (ClpP) de la proteasa dependiente de ATP mitocondrial ClpXP. Aunque los experimentos cinéticos demostraron la potencia del inhibidor y el mecanismo de acción, el enfoque in vitro no pudo evaluar la eficacia de FAPAL-CMK como inhibidor mitocondrial selectivo de ClpP en células intactas. La microscopía confocal de fluorescenci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3