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Artículo de método

Trasplante intracerebral neonatal para reemplazo de microglía y análisis de linaje in vivo

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DOI:

10.3791/72119

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28 de julio de 2026

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

Este protocolo permite un trasplante intracerebral neonatal eficiente de poblaciones definidas de microglía, apoyando un enjerto y análisis robustos a largo plazo del linaje de la microglía y la integración in vivo entre múltiples fuentes de donantes y modelos receptores.

Resumen

El reemplazo de la microglía mediante trasplante de células mieloides ha surgido como un enfoque experimental prometedor para estudiar procesos y enfermedades neurológicas. Sin embargo, las estrategias de trasplante existentes suelen estar limitadas por un injerto ineficiente, dependencia del condicionamiento basado en irradiación o flexibilidad restringida entre los sistemas donante y receptor. Aquí describimos un protocolo de trasplante intracerebral neonatal para introducir poblaciones purificadas de microglía (Hoxb8 y microglas no Hoxb8) en el cerebro del ratón en desarrollo. Este método permite un injerto y una integración eficiente de células donantes en el parénquima cerebral bajo condiciones fisiológicamente permisivas. Es importante destacar que el protocolo es compatible con múltiples fuentes de donantes, incluidos progenitores hematopoyéticos embrionarios y microglías derivadas del cerebro posnatal, y puede aplicarse en modelos de receptores distintos con microglía endógena reducida o ausente, incluyendo ratones condicionalmente deficientes en Csf1r y ratones ΔFIRE de Csf1r. Las células donantes se purifican mediante selección celular activada por fluorescencia y se administran bilateralmente en cerebros neonatales de ratón mediante micropipetas de vidrio para un parto eficiente y mínimamente invasivo. Los ratones receptores envejecen para permitir que las células donantes se expandan y poblan el nicho de la microglía, y los resultados se evalúan mediante un análisis histológico de la distribución y expresión de marcadores por células. Este enfoque proporciona una plataforma robusta y escalable para estudiar la ontogenia de la microglía y la integración in vivo a través de diversos contextos experimentales.

Introducción

La sustitución de la microglía mediante trasplante de células mieloides ha surgido como una estrategia poderosa para sondear la biología de la microglía y como un posible paradigma terapéutico para enfermedades neurológicas. En los últimos años, el campo ha avanzado hacia estrategias capaces de reemplazar ampliamente la microglía en el sistema nerviosocentral 1. Estudios recientes han demostrado que los macrófagos y progenitores derivados del donante pueden injertar el cerebro, adoptar programas transcripcionales similares a los de la microglía y, en algunos casos, mejorar fenotipos asociadosa la enfermedad 2,3,4,5,6,7,8. Estos hallazgos apoyan la idea de que el reemplazo de macrófagos cerebrales puede aprovecharse para estudiar y potencialmente modificar los procesos de enfermedades neurológicas.

Un desafío central en el trasplante de microglía es lograr un enjerto robusto minimizando las confusiones experimentales. Muchas estrategias de reemplazo establecidas se basan en la irradiación, la quimioterapia o paradigmas de agotamiento de la microglía para generar un nichoengretabable 6,9,10,11,12,13. A pesar de su eficacia, estos enfoques pueden inducir la senescencia de la microglía, alterar la barrera hematoencefálica y alterar la señalización inflamatoria, todo lo cual puede complicar la interpretación del comportamiento de las célulasdonantes 9,14. Trabajos más recientes han comenzado a explorar enfoques independientes del condicionamiento o de toxicidad reducida para la sustitución de lamicroglía 5,8,15.

El momento del desarrollo es un factor determinante importante para el éxito del trasplante. El cerebro neonatal proporciona un entorno permisivo que favorece la expansión de células donantes y la integración a largo plazo, probablemente debido a la reducción de barreras estructurales y al establecimiento continuo del nicho endógeno de la microglía. Estudios recientes de trasplante utilizando el parto posnatal temprano (P0–P5) demuestran un robusto enfrate parenquimatoso y la adquisición de identidad similar a la microglia, reforzando la importancia del contexto de desarrollo para un reemplazo eficiente 7,8,16,17.

La microglía Hoxb8 proporciona un sistema especialmente informativo para estudiar las contribuciones específicas de la línea de linaje a la biología de la microglía. Estas células provienen de progenitores hematopoyéticos embrionarios y representan un subconjunto definido de la microglía parenquimatosa con consecuencias conductuales cuando sondisfuncionales 17,18,19,20,21. Trabajos recientes utilizando progenitores primarios de Hoxb8 y sistemas progenitores de los receptores microglógicos y de estrógenos (ER)-Hoxb8 demuestran que estas células pueden expandirse, manipularse genéticamente y ser injertadas con éxito en el cerebro, donde adoptan perfiles transcripcionales similares a los de la microglía y características funcionales 7,8,17. Estos avances ponen de manifiesto aún más la utilidad de los enfoques de trasplante para diseccionar la línea y heterogeneidad de la microglía.

Aquí describimos una plataforma de trasplante intracerebral neonatal optimizada para la versatilidad entre los sistemas de donante y receptor. A diferencia de los enfoques que dependen de la irradiación o el condicionamiento sistémico, este método utiliza la entrega intracerebral bilateral directa en ratones neonatales, permitiendo la colocación de células donantes en un entorno cerebral permisivo para el desarrollo y minimizando la perturbación sistémica. La técnica es compatible con múltiples fuentes de donantes, incluidos progenitores hematopoyéticos embrionarios y microglías derivadas del cerebro posnatal, y puede aplicarse en modelos de receptores distintos con microglía endógena reducida o ausente. Una gran ventaja práctica es que el cráneo neonatal delgado permite una inyección manual rápida con micropipetas de vidrio, eliminando la necesidad de perforación o fijación estereotáxica y logrando un enjerto parénquimatose amplio.

En conjunto, este enfoque proporciona un sistema robusto, flexible y escalable para estudiar la ontogenia, heterogeneidad e integración in vivo de la microglía a través de diversos contextos experimentales. Esto posiciona el trasplante intracerebral neonatal como una alternativa complementaria y controlada experimentalmente a las estrategias de reemplazo sistémico de la microglía.

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Protocolo

Todos los métodos y experimentos de este estudio se han realizado en ratones. Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) de la Universidad de Utah, Public Health Service Assurance #D16-00018 (A3031-01).

1. Preparar parejas reproductoras para camadas donantes y receptoras

  1. Coloca parejas reproductoras en la misma jaula por la tarde para iniciar los apareamientos programados.
  2. Inspecciona cada mañana a las hembras para detectar la presencia de un tapón vaginal y confirmar el apareamiento exitoso.
  3. Retirar las hembras tapadas de los machos y alojarlas individualmente hasta el parto, que dura aproximadamente entre 18 y 20 días.
  4. Manipula suavemente a las madres embarazadas durante 5 minutos diarios y de 7 a 10 días antes del nacimiento para reducir el estrés asociado al manejo neonatal.
  5. Exponer a las madres a un hisopo de algodón que contiene olor a betadine durante las sesiones diarias de manipulación para reducir el estrés materno cuando los cachorros regresen tras la cirugía.
  6. Prepara jaulas limpias con material de anidación para las hembras preñadas antes del parto previsto.

2. Extracción y procesamiento de cerebros neonatales

  1. Eutanasiar ratones donantes neonatales (P0–P4) mediante sobredosis de isoflurano utilizando una campana o cámara cerrada similar equipada con un suelo falso para evitar el contacto directo con el anestésico.
  2. Una vez que la respiración cesa y se confirme la ausencia de reflejos, decapitar inmediatamente.
  3. Extrae todo el cerebro, incluidos el cerebelo y los bulbos olfativos. Coloca cerebros en 3 mL de solución salina balanceada fría de 1× Hanks (HBSS) en una placa de Petri de plástico sobre hielo.
  4. Utilizando bisturís y pinzas estériles, pica el cerebro en trozos de aproximadamente 1–2mm 3 .
  5. Transfiere el tejido cerebral picado (1 cerebro por tubo de disociación tisular) a tubos de disociación tisular que contienen reactivos digestivos enzimáticos suministrados por el sistema de disociación del tejido neural según el protocolo recomendado por el fabricante.
  6. Coloque los tubos en un dispositivo de disociación mecánica con capacidad de calentamiento e incube a 37 °C durante 30 minutos utilizando el programa de disociación de tejidos neurales recomendado por el fabricante.
  7. Pre-remojo los coladores de células de 70 μm con 400 μL de 1× HBSS.
  8. Pasa el tejido disociado por los coladores preremojados que se colocan sobre un tubo cónico de 50 mL sobre hielo.
  9. Lava los tubos con 10 mL de 1× HBSS y pasa por filtros para asegurar la máxima recuperación celular.
  10. Descarta los filtros y centrifuga las células a 300 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspira el sobrenadante.
  11. Resuspender las células en 1 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos en agua ultrapura estéril por muestra e incubar durante 10 minutos a 4 °C.
  12. Apaga la reacción de lisis con 10 mL de 1× HBSS/1% BSA/5% FBS.
  13. Descarta los filtros y centrifuga las celdas a 300 × g durante 10 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante.
  14. Determina el número de células usando un hemocitómetro. El rango típico de rendimiento de celda es de 3,2–4,0 ×10,6 antes de la clasificación.
  15. Resuspender células en 5% FBS en 1× HBSS a la concentración deseada para la tinción posterior de anticuerpos.

3. Tinción de anticuerpos celulares para la clasificación FACS de poblaciones de microglía

  1. Resuspender las células en 1 mL de tampón de tinción (5% FBS en 1× HBSS) que contenga anticuerpo bloqueador de los receptores Fc (CD16/32 purificado, 1:2000) e incubar células durante 10 minutos a 4 °C.
  2. Centrifuga las células a 240 × g durante 3 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante.
  3. Incubar células con anticuerpos conjugados fluorescentes (CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) en 1 mL de tampón de tinción durante 30 minutos sobre hielo en la oscuridad.
  4. Centrifuga las células a 240 × g durante 3 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante.
  5. Añade un colorante de viabilidad (por ejemplo, 3 μM DAPI en 1× HBSS) para excluir células muertas.
  6. Realizar la clasificación FACS utilizando un clasificador de celdas de alta velocidad equipado con láseres adecuados para la detección DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC y CD11b-Alexa Fluor 700.
  7. Utiliza una boquilla de 100 μm con baja presión de vaina cuando sea posible para maximizar la viabilidad de la célula. Mantén los tubos de recogida de muestras y las células clasificadas en hielo durante todo el proceso.
  8. Utiliza celdas sin teñir, controles de compensación de color único y controles de fluorescencia menos uno cuando sea necesario para ajustar voltajes, compensación y compuertas.
  9. Primero, las celdas de compuerta por área de dispersión hacia adelante frente a área de dispersión lateral para excluir los residuos.
  10. Singlets de puerta usando la altura de dispersión lateral frente al ancho de dispersión lateral.
  11. Excluye las células muertas mediante la puerta en las células DAPI⁻.
  12. Desde singlets en directo, puerta en CD45CD11b⁺ microglia baja .
  13. Dentro de la compuertamicroglial baja CD11b⁺ CD45, se utiliza GFP y fluorescencia de tdTomato para separar las poblaciones de microglía donante (microglia Hoxb8 : DAPI⁻ CD45CD11b ⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, microglía no Hoxb8 : DAPI⁻ CD45CD11b ⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. Clasifica cada población en tubos de recogida estériles que contengan HBSS frío 1x.
  15. Después de la clasificación, reanaliza una pequeña alícuota de células clasificadas para confirmar la pureza y viabilidad antes del trasplante.
  16. Recoge las células clasificadas en estériles 1× HBSS y mantenlas en hielo en la oscuridad hasta el trasplante.
    NOTA: Los rendimientos típicos para la microglía de Hoxb8 oscilan entre 3,70 y 4,60 x10 4 células y para la microglía no Hoxb8 de 1,10 a 1,14 x10 5 células por cerebro neonatal (P0–P4), aunque los rendimientos pueden variar según la edad, el genotipo y la eficiencia del procesamiento de tejidos. Trasplanta las células vivas purificadas lo antes posible, idealmente dentro de los 60 minutos de la clasificación celular.

4. Extracción y procesamiento de progenitores hematopoyéticos hematopoyéticos del hígado fetal

  1. Eutanasiar a las madres embarazadas utilizando isoflurano al 5% administrado en oxígeno a través de un vaporizador de precisión hasta que cesa la respiración y se confirme la ausencia de reflejos.
  2. Tras una sobredosis de isoflurano, realizar un método físico secundario mediante dislocación cervical para asegurar la muerte, de acuerdo con las directrices institucionales de cuidado y uso animal.
  3. Retira los cuernos uterinos de los ratones embarazados y colócalos en 3 mL fríos de 1× HBSS en placas de Petri de plástico (60 mm × 15 mm).
  4. Diseccionar embriones de E12.5 del útero y colocarlos en fresco y frío 3 mL de 1× HBSS en placas de Petri de plástico.
  5. Disecciona el hígado fetal con pinzas finas y colócalos en 3 mL frescos de HBSS 1× frío que contenga un 5% de FBS en placas de Petri.
  6. Disociar mecánicamente tejido hepático fetal agrupado usando una aguja de 26 G y una jeringuilla de 3 mL.
  7. Centrifuga las células a 240 × g durante 5 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante.
  8. Lava las celdas con 1× HBSS.
  9. Pasa la suspensión de la celda por un colador de celda de 80 μm.
  10. Incubar células en 20 μL de tampón de lisis de glóbulos rojos (0,15 M cloruro de amonio, 1 mM KHCO3) durante 5 minutos, seguido de añadir 13 mL de 1× HBSS para el temple.
  11. Continúa la incubación durante 5 minutos para lisar los glóbulos rojos.
  12. Centrifuga las células a 200 × g durante 5 minutos a 4 °C.

5. Tinción de anticuerpos celulares para la clasificación FACS de células progenitoras hematopoyéticas

  1. Incubar células hepáticas fetales con anticuerpos conjugados fluorescentes (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; Kit PE-Cy7, 1:100) en 5% FBS/1% BSA en 1× HBSS durante 30 minutos sobre hielo a oscuras.
  2. Lava las células con 1× HBSS y centrifuga a 240 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  3. Añade un colorante de viabilidad (por ejemplo, 3 μM DAPI en 1× HBSS) para excluir células muertas.
  4. Realizar la clasificación FACS utilizando un clasificador de celdas de alta velocidad equipado con láseres y filtros apropiados para detección DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato y GFP.
  5. Utiliza una boquilla de 100 μm con baja presión de vaina cuando sea posible para maximizar la viabilidad de la célula. Mantén los tubos de recogida de muestras y las células clasificadas en hielo durante todo el proceso.
  6. Utiliza celdas sin teñir, controles de compensación de color único y controles de fluorescencia menos uno cuando sea necesario para ajustar voltajes, compensación y compuertas.
  7. Primero, las celdas de puerta utilizan el área de dispersión frontal frente al área de dispersión lateral para excluir los residuos.
  8. Singlets de puerta usando altura de dispersión hacia adelante frente frente a ancho de dispersión hacia adelante, seguido de altura de dispersión lateral frente a ancho de dispersión lateral.
  9. Excluye las células muertas mediante la puerta en las células DAPI⁻.
  10. De los singletes vivos, se excluyen las células de la línea eritroide mediante la gating en células Ter119⁻.
  11. Dentro de la población Ter119⁻, la puerta en células progenitorashematopoyéticas de alto nivel Kit es alta.
  12. Dentro de laalta población del kit DAPI⁻ Ter119⁻, aislar progenitores positivos para la línea Hoxb8 mediante la gating en células tdTomato⁺.
  13. Si la línea donante también lleva el reportero Cx3cr1-GFP, utilice fluorescencia de GFP para confirmar que la población progenitora hepática fetal clasificada tiene GFP⁻ oGFP baja en esta etapa, distinguiendo las células progenitoras de las mieloides diferenciadas que expresan Cx3cr1.
  14. Clasificar la población final DAPI⁻ Ter119⁻ Kithigh tdTomato⁺ GFP en tubos estériles de recogida que contengan frío 1× HBSS.
  15. Después de la clasificación, reanaliza una pequeña alícuota de células clasificadas para confirmar la pureza y viabilidad antes del trasplante.
  16. Recoge las células clasificadas en estériles 1× HBSS y mantenlas en hielo en la oscuridad hasta el trasplante.
    NOTA: Los rendimientos típicos varían aproximadamente entre 5,0 y 7,0 × 10 progenitores hematopoyéticos de 4 Hoxb8 por preparación hepática fetal E12,5, dependiendo del tamaño del embrión y la eficiencia de la clasificación. Trasplanta las células vivas purificadas lo antes posible, idealmente en un plazo de 60 minutos tras la clasificación.

6. Preparación de agujas de inyección

  1. Carga capilares de vidrio borosilicato (1,0 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interior, con filamento) en un extractor de micropipeta.
  2. Extrae los capilares utilizando un programa de extracción de dos líneas optimizado para generar agujas largas y cónicas adecuadas para trasplantes intracerebrales neonatales.
    1. Los ajustes típicos incluyen: Calor = 645, Tracción = 30, Velocidad = 120, Retardo = APAGADO y Presión = 200. Optimiza la configuración final para el tipo específico de cristal, las condiciones ambientales y la calibración del extractor. Posteriormente, recorta las agujas resultantes y bisela para obtener un diámetro final de la punta exterior de aproximadamente 30 μm.
  3. Coloca las agujas extraídas sobre dos tiras de masilla dentro de una gran placa de Petri de plástico para proteger las puntas de daños antes de recortar y biselar.
  4. Coloque la aguja extraída bajo un microscopio estereoscópico disecable a una ampliación aproximadamente de 10× a 20× y sujeite con una férula suave.
    NOTA: Durante la inspección de la punta puede utilizarse una mayor ampliación (20×–40×) para verificar la correcta formación del cónico e identificar cualquier defecto antes del recorte y biselado.
  5. Utiliza una cuchilla de afeitar estéril para recortar la punta de la aguja y obtener un diámetro exterior de aproximadamente 30 μm.
  6. Asegura la aguja recortada en un soporte para micromolinilla.
  7. Ajusta el ángulo de bisel a 30°–35°.
  8. Enciende el molinillo y la iluminación.
  9. Permite que el agua destilada gotee sobre la piedra de moler a un ritmo constante de aproximadamente una gota cada 4–5 segundos.
  10. Lleva la punta de la aguja suavemente al contacto con la piedra de moler giratoria hasta que se forme un borde biselado.
  11. Mide el diámetro exterior de la punta biselada usando un dispositivo de medición de punta cuando esté disponible.
  12. Selecciona agujas con un diámetro exterior cercano a los 30 μm para trasplante.
  13. Llena la aguja con un buffer estéril y expulsa suavemente el líquido para confirmar que la punta está abierta y sin obstrucciones.

7. Preparación del aparato de inyección

  1. Monta una pipeta manual controlada por la boca que consiste en tubos flexibles, una boquilla, un filtro en línea y un soporte capilar.
    NOTA: Se incorpora un filtro en línea en el aparato de pipeteo controlado por la boca para evitar la contaminación.
  2. Marca la aguja cada 2 mm (hasta 2 marcas por aguja). Cada 2 mm corresponde a ~2 μL.
  3. Inserta la aguja de inyección de vidrio preparada ~1,5 cm en el soporte capilar y verifica que el conjunto esté seguro y hermético.
  4. Aplica una succión suave a través de la boquilla para comprobar que el flujo de aire no está obstruido y la resistencia adecuada.
  5. Confirma que el sistema permite un control fluido de la aspiración e inyección antes de cargar las células donantes.
  6. Rellena la aguja de inyección de vidrio con la suspensión de células donantes preparada (4,5 μL en total) usando una punta fina de pipeta.
    NOTA: Asegúrese de que no queden burbujas de aire en la aguja antes de comenzar el trasplante. Usa una aguja por ratón.

8. Anestesiar a receptores neonatales y preparar el campo quirúrgico

  1. Colocar al ratón neonatal en orientación supina sobre la mesa quirúrgica e inducir anestesia usando isoflurano al 2,0%–5,0% administrado en oxígeno a través de un vaporizador de precisión.
  2. Coloca la nariz del ratón dentro de un cono nasal para mantener la entrega continua de isoflurano y oxígeno durante todo el procedimiento.
  3. Permite aproximadamente 1 minuto para la inducción de la anestesia mientras se monitoriza la respiración.
  4. Toca suavemente las extremidades y confirma la ausencia de reflejo de abstinencia para verificar la anestesia adecuada.
  5. Una vez alcanzado un plano anestésico adecuado, se reduce la concentración de isoflurano al 0,5%–2,0% para el mantenimiento y se continúa la anestesia hasta 10 minutos durante el procedimiento de trasplante.
  6. Mantenga al ratón neonatal aproximadamente a 38 °C utilizando una almohadilla térmica situada bajo la mesa quirúrgica.
  7. Limpia la zona del lugar de inyección en la cabeza usando aplicaciones alternas de betadine y etanol al 70% con hisopos de algodón estériles.
  8. Aplica una última capa de betadine y deja que la piel se seque antes de la inyección.
    PRECAUCIÓN: El isoflurano es un agente anestésico peligroso. Utilice sistemas adecuados de limpieza anestésica y asegure una ventilación adecuada de la habitación, de acuerdo con las directrices de seguridad institucionales.

9. Realizar trasplantes intracerebrales neonatales

  1. Estabiliza suavemente la cabeza usando dedos enguantados o un soporte suave para minimizar el movimiento durante la inyección.
    NOTA: Los ratones receptores se trasplantan entre P1 y P4.
  2. Identificar los sitios bilaterales de inyección en el telencéfalo dorsal anterior (futura región de la corteza frontal), aproximadamente 1–2 mm laterales a la línea media sagital y caudales inmediatamente a los bulbos olfativos. Coloca los puntos de inyección simétricamente en cada hemisferio evitando los vasos sanguíneos superficiales visibles.
    NOTA: Debido al cráneo delgado y al pequeño tamaño de los ratones neonatales, las inyecciones se realizan utilizando puntos anatómicos visuales en lugar de coordenadas estereotaxicas.
  3. Inspecciona visualmente el cráneo y evita insertar la aguja cerca de vasos sanguíneos visibles.
  4. Avanza suavemente la micropipeta de vidrio biselado a través de la piel y el cráneo en desarrollo.
  5. Guiar la aguja aproximadamente 1–2 mm por debajo de la superficie del cráneo hasta el hemisferio frontal.
  6. Administrar células donantes mediante presión manual controlada a través del aparato de pipeta controlado por la boca.
    NOTA: Al trasplantar progenitores hematopoyéticos purificados o microglía neonatal, inyectar 2–3 μL por hemisferio, lo que corresponde aproximadamente a 2,5 × 104 células por inyección. Esto proporciona aproximadamente 5 × 104 células por cerebro de ratón.
  7. Retira lentamente la micropipeta del cerebro para minimizar el reflujo de las células inyectadas y reducir el daño tisular.
  8. Realizar la inyección contralateral.
    NOTA: Utiliza una aguja por ratón para evitar la contaminación cruzada entre ratones.

10. Recuperación de recién nacidos trasplantados

  1. Coloca a cada cachorro sobre una almohadilla térmica inmediatamente después del procedimiento.
  2. Vigila a los cachorros hasta que vuelvan el color corporal normal, el movimiento espontáneo y la actividad general.
    NOTA: El tiempo de recuperación varía entre 5 y 10 minutos.
  3. Devuelve a los cachorros a la presa.
  4. Frota bien a cada cachorro con la cama de la jaula y el material para anidar.
  5. Vuelve a poner a los cachorros en la jaula con la madre.
  6. Confirma que la madre recupera y acepta a los cachorros devueltos.

11. Seguimiento de la salud postoperatoria

  1. Observa a los cachorros diariamente durante 10 minutos durante los primeros 3 días tras el trasplante.
  2. Evalúa a los cachorros para detectar actividad normal, comportamiento de mamación e interacción con la madre.
    NOTA: No molestar las jaulas de ratones durante este tiempo. Esto puede aumentar la tensión sobre la presa.
  3. Sigue controlando a los cachorros día sí y día no hasta que los destete después del periodo inicial de 3 días.
  4. Evaluar a los cachorros para su desarrollo normal, comportamiento alimenticio, nivel de actividad y cuidado materno.
  5. Mide y registra el peso corporal diariamente durante el periodo postoperatorio temprano.
  6. Evalúa a los cachorros en busca de signos de malestar, postura anormal, letargo o alimentación deficiente.
  7. Realizar la eutanasia humana cuando sea necesario según las directrices institucionales de cuidado animal.
    1. En ratones neonatales, se debe eutanasiar por sobredosis de isoflurano utilizando una campana o cámara cerrada similar equipada con un falso suelo para evitar el contacto directo con el anestésico. Una vez que la respiración cesa y se confirme la ausencia de reflejos, decapitar inmediatamente.
    2. En ratones adultos, se eutanasia usando isoflurano al 5% administrado en oxígeno a través de un vaporizador de precisión hasta que la respiración cesa y se confirme la ausencia de reflejos, seguido de una luxación cervical como método físico secundario para asegurar la muerte.
      NOTA: Los animales que mostraron mortalidad postoperatoria o ausencia de injerto de células donantes detectables en el punto final experimental fueron excluidos del análisis. No se administró analgesia postoperatoria porque el trasplante intracerebral neonatal se consideró mínimamente invasivo.

12. Recoger tejidos cerebrales para criosección y tinción por inmunofluorescencia

  1. Retira el cerebro con cuidado y prepáralo para el análisis en secciones congeladas.
  2. Procesar tejido cerebral postnatal para criosección y cortar secciones coronales utilizando un criostato según los procedimientos descritos anteriormente.
    NOTA: Para cada ratón, se analizan entre 9 y 12 secciones coronales que abarcan la corteza somatosensorial.
  3. Monta secciones sobre portaobjetos de microscopio y guárdalas a -20 °C hasta que se teñan.
  4. Incubar brevemente secciones en un tampón de permeabilización que contenga 0,2% de Triton X-100 y 1% de desoxicolato de sodio.
  5. Prepara anticuerpos primarios (anti-GFP para pollo, 1:500; Anticuerpo anti-td de tomate para conejillos de indias, 1:250; conejo anti-Iba1; 1:500) diluidas en el tampón de dilución de anticuerpos adecuado.
  6. Incubar secciones de tejido con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
  7. Lava las secciones con solución salina tamponada con fosfato para eliminar los anticuerpos primarios no unidos.
  8. Incubar secciones con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo (anti-conejo de cabra Alexa Fluor 647, 1:500; anti-conejillo de cabra Alexa Fluor 555, 1:500; anti-pollo de cabra Alexa Fluor 488, 1:500) durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
  9. Contratinción de secciones con DAPI para visualizar los núcleos celulares.
  10. Monta secciones usando un medio antifade y aplica un recubrimiento de vidrio.

13. Adquisición de imágenes de microscopía confocal

  1. Adquirir imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal equipado con objetivos del 10× o 20×.
  2. Adquirir imágenes a 512 × 512 o 1024 × resolución de 1024 píxeles utilizando velocidades de escaneo de 200–400 Hz.
  3. Recoge secciones ópticas con intervalos de pasos z de 2–5 μm a través del tejido.

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Resultados

El trasplante intracerebral neonatal de poblaciones de microglía purificadas resulta en una supervivencia a largo plazo y en un enfratamiento generalizado de células derivadas del donante dentro del parénquima cerebral receptor. Las poblaciones de microglía purificadas de donantes fueron aisladas mediante selección celular activada por fluorescencia utilizando reporteros de linaje fluorescente (Hoxb8 microglia: tdTomato⁺ GFP⁺; microglas no Hoxb8 : tdTomato⁻ GFP⁺) antes ...

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Discusión

El trasplante intracerebral neonatal de progenitores microgliales purificados o subpoblaciones microgliales definidas proporciona un enfoque robusto para reconstruir el compartimento microglial in vivo y examinar las propiedades específicas de los linajes de los macrófagos cerebrales. Este método permite la reconstitución selectiva utilizando células donantes definidas genéticamente, permitiendo la evaluación directa del enjerto y maduración de células donantes en el entorno cer...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (R01 MH093595) (M.R.C.), la Fundación Familia Dauten y la Instalación de Citometría de Flujo de la Universidad de Utah. Los ratones Csf1r ΔFIRE fueron generados por el Dr. Ben Xu en la Universidad de Utah.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bell jarVariousN/AUtilizado para la eutanasia
Capilares de vidrio borosilicato con
filamento		Sutter InstrumentBF100-78-15Utilizado para agujas de inyección
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma AldrichA8806Utilizado para preparar el tampón PB. Varias marcas están disponibles. La que se enumera aquí es solo un ejemplo.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Células mieloides
CD45 APCBioLegend103112Células hematopoyéticas
Filtradores de celdas (70 µm)Falcon352350Utilizado para generar suspensiones de
células individuales. Varias marcas están disponibles. La que se enumera aquí es solo un ejemplo.
Anticuerpo anti-GFP de polloAves LabsGFP-1020Inmunofluorescencia
tinción
Anticuerpo c-Kit PE-Cy7BioLegend105814Progenitores hematopoyéticos
Microscopio confocalLeicaTCS SP5Utilizado para imágenes de
fluorescencia
Tubos cónicos (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Procesamiento de tejidos/células. Varias marcas están disponibles. La que se enumera aquí es solo un ejemplo.
Máquina cryostatLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Generación de secciones de tejidos
congelados. Varias marcas están disponibles. La que se enumera aquí es solo un ejemplo.
Colorante nuclear DAPIThermo Fisher ScientificD1306Utilizado para viabilidad y
tinción nuclear
Microscopio de disecciónLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Utilizado para recortar y preparar agujas de
inyección. Varias marcas están disponibles. La que se enumera aquí es solo un ejemplo.
Clasificador de flujo FACSAriaBD BioscienceFACSAria Purificación celular
Bloque Fc (CD16/32 purificado)Biolegend101302Bloquea la unión no deseada de anticuerpos a células de ratón que expresan receptores Fc
Suero fetal bovino (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlUtilizado en preparaciones de
células. Varias marcas están disponibles. La que se enumera aquí es solo un ejemplo.
Tubo flexible para pipeta bucalVariousN/AComponente del aparato de
inyección manual
Software de análisis de citomeátrica de flujoFlowJov10.8.1Utilizado para análisis de datos FACS
Clasificador de células de citomeátrica de flujoBD BiosciencesFACSAriaUtilizado para la purificación celular
Disociador gentleMACS Octo con
calentadores		Miltenyi Biotec130-096-427Utilizado para la disociación de
tejido cerebral
Anticuerpo secundario Alexa Fluor 488
anti-pollo		Thermo Fisher ScientificA-11039Anticuerpo secundario
Anticuerpo secundario Alexa Fluor
anti-conejo 647		Thermo Fisher ScientificA-21245Anticuerpo secundario
Anticuerpo secundario Alexa Fluor
anti-rata 647		Thermo Fisher ScientificA-48265Anticuerpo secundario
Anticuerpo anti-tdTomato de conejillo de indiasInstituto FrontierAB_2631185Inmunofluorescencia
tinción
Solución de sales balanceadas Hanks’ (HBSS)Gibco14175-079Utilizado durante la
preparación celular
HemocytometerVariousN/AConteo de células
Filtro en línea para pipeta bucalVariousN/APreviene la contaminación
MicrogrinderNarishigeEG-400Utilizado para biselar agujas de
inyección de vidrio
Pulsador de micropipetaSutter InstrumentP-1000Utilizado para generar agujas de
inyección finas
Boca de pipeta bucalVariousN/AUtilizado para el control manual de
la inyección
Kit de disociación de tejido neural (P)Miltenyi Biotec130-092-628Utilizado para la disociación enzimática del tejido cerebral
Platos de PetriThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Utilizado para almacenar agujas extraídas o
recolección de tejido. Varias marcas están disponibles. La que se enumera aquí es solo un ejemplo.
Anticuerpo anti-Iba1 de conejoWako019-19741Marcador de microglía
Anticuerpo anti-TMEM119 de conejoAbcam209064Marcador específico de microglía
Anticuerpo anti-CD206 de rataBioLegend141712Utilizado para identificar poblaciones de macrófagos
Anticuerpo anti-P2RY12 de rataBioLegend848002Marcador de microglía
Hojas de afeitar/bisturíesVariousN/AUtilizado para recortar puntas de aguja o
recolección de tejido
Tampon de lisis de RBCChemCruzsc-296258Utilizado para la eliminación de glóbulos
rojos
Aparato estereotáxicoKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/Utilizado para implantación
quirúrgica. Varias marcas están disponibles. La que se enumera aquí es solo un ejemplo.
Anticuerpo Ter119 PerCP-Cy5.5BioLegend116228Células de la línea eritroide

Referencias

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