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Artículo de método

Protocolo de aislamiento de ARN de tardígrados de múltiples especies

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DOI:

10.3791/72120

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1 de septiembre de 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe los procedimientos de aislamiento de ARN a partir de diversas especies de tardígrados, utilizando un kit de aislamiento de ARN basado en columnas, diseñado para obtener ARN a partir de pequeñas cantidades de tejido y producir cantidades suficientes de ARN de alta calidad para aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN y la síntesis de ADN complementario.

Resumen

Los tardígrados son animales microscópicos conocidos por su tolerancia excepcional al estrés ambiental. Estos animales pueden sobrevivir a la desecación, presiones extremas, bajas temperaturas y altos niveles de radiación ionizante. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a estas capacidades de extremotolerancia aún no se comprenden completamente. Los enfoques moleculares utilizados para investigar estos mecanismos, que incluyen secuenciación de ARN, interferencia de ARN (ARNi) y expresión heteróloga de genes de tardígrados en sistemas como bacterias, requieren el aislamiento de ARN mensajero (ARNm) de alta calidad a partir de material biológico limitado. En este estudio, describimos un protocolo reproducible para el aislamiento de ARN total a partir de tardígrados que (1) es eficaz en múltiples especies, incluida una especie de heterotardígrado, (2) requiere únicamente entre 25 y 200 animales, dependiendo del tamaño corporal, y (3) produce ARN con cantidad y calidad suficientes para aplicaciones posteriores. El presente protocolo permite eficazmente la recuperación de ARN a partir de un número razonable de tardígrados y apoya las investigaciones moleculares sobre la tolerancia al estrés en diversas especies de tardígrados.

Introducción

Se sabe bien que los tardígrados tienen la capacidad de sobrevivir a estrés extremo al que otros animales no resistirían, incluyendo desecación, presiones extremas, temperaturas extremas y agentes que dañan el ADN, como fármacos quimioterapéuticos y radiación ionizante1,2,3,4,5,6,7,8. En años recientes, los científicos han investigado los mecanismos que subyacen a la resistencia extrema de los tardígrados utilizando enfoques moleculares como la secuenciación de ARN, interferencia de ARN (ARNi) y expresión heteróloga de genes de tardígrados en otros sistemas, incluyendo células humanas y bacterias8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Cuando se aplican, estos enfoques han sido una herramienta poderosa para darnos una idea de cómo exactamente los tardígrados son capaces de resistir un estrés tan extremo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Sin embargo, todos estos enfoques moleculares para comprender la tolerancia al estrés en los tardígrados dependen de la capacidad de aislar ARN de estos pequeños animales en cantidad suficiente y con calidad adecuada para su uso en procesos posteriores.

Un método previo para el aislamiento de ARN de tardígrados demostró ser exitoso para investigadores que trabajan con Hypsibius exemplaris23. Sin embargo, al intentar replicar este protocolo en H. exemplaris, descubrimos que era poco confiable en cuanto a la concentración y calidad del ARN obtenido (datos no publicados). Se ha demostrado que un método alternativo de aislamiento de ARN basado en fenol funciona para H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus y una especie de heterotardígrado13,21,22,24,25,26. Este protocolo ha demostrado proporcionar ARN de calidad y cantidad suficientes para procesos posteriores, tanto a partir de un solo animal como de grupos de animales (~50). No obstante, este protocolo requiere que el usuario manipule reactivos que contienen fenol. El fenol es una sustancia química peligrosa que exige un manejo cuidadoso, y una ejecución inadecuada de este protocolo puede provocar arrastre de fenol que afecte la pureza del ARN y sus aplicaciones posteriores. Otro protocolo publicado previamente para el aislamiento de ARN de tardígrados se centra en la capacidad de obtener ARN a partir de un solo animal27. Aunque este protocolo es valioso para aplicaciones como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)27, es menos adecuado para aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN, en las que el objetivo es obtener una visión más integral de cómo los animales responden a un determinado agente estresante o condición.

Estas limitaciones en los protocolos disponibles de aislamiento de ARN llevaron a investigar métodos alternativos para aislar ARN de tardígrados. El kit de aislamiento de ARN basado en columnas utilizado en este protocolo está diseñado para aislar ARN a partir de pequeñas cantidades de tejido. Este kit también se ha usado previamente para aislar ARN de tejidos de insectos para análisis de secuenciación de ARN posterior, lo que sugiere que podría ser adecuado para aislamientos de otros animales pequeños con cutícula, como los tardígrados28. Este estudio describe el protocolo paso a paso para usar este kit de aislamiento de ARN basado en columnas con tardígrados, incluyendo explicaciones sobre precauciones específicas que deben tenerse al realizar este protocolo con tardígrados. En este artículo se informa el éxito de este protocolo en seis especies de tardígrados (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti y el heterotardígrado Viridiscus celatus). El estudio ha validado que se puede obtener ARN de calidad y cantidad considerables a partir de tan solo 25 animales. También se proporcionan ejemplos de datos de concentración y calidad del ARN obtenido, adecuados para aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN (con sesgo mínimo y amplificación exponencial de la biblioteca) y la síntesis de ADN complementario (cADN). Este protocolo de aislamiento de ARN ya ha demostrado ser útil para descubrir los mecanismos de tolerancia a la radiación en H. exemplaris8. El éxito de este protocolo en diversas especies de tardígrados sugiere que podría aplicarse más ampliamente al estudio de mecanismos de tolerancia al estrés, mecanismos del desarrollo y procesos evolutivos.

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Protocolo

El siguiente protocolo no requiere aprobación ética institucional para el uso de animales, ya que los animales invertebrados están exentos de este requisito. Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del equipo y del área para el aislamiento de ARN

  1. Encienda un bloque térmico o baño de agua a 42 °C para prepararse para la extracción de ARN.
  2. Obtenga una gradilla para tubos microcentrífugos, pipetas (2 µL, 20 µL, 200 µL y 1000 µL) y puntas filtradas de pipeta del tamaño adecuado.
  3. Limpie la superficie del banco de trabajo, la gradilla, las pipetas y las cajas de puntas con RNase Away, solución de lejía diluida (10%) o etanol al 70% para desnaturalizar cualquier RNasa residual.
    NOTA: La presencia excesiva de RNasa en el equipo o en el área donde se aísla el ARN puede provocar una calidad insuficiente de ARN después del aislamiento debido a la degradación. Reduzca este riesgo permitiendo suficiente tiempo para que los productos químicos desnaturalizantes de RNasa actúen y asegurándose de que el área y el equipo se sequen completamente antes de continuar.
  4. Use guantes en todos los pasos de este protocolo y trate frecuentemente los guantes con una solución desnaturalizante de RNasa durante todo el protocolo para prevenir la degradación del ARN por RNasa.

2. Recolección de animales para el aislamiento de ARN

  1. Utilizando una pera de pipeteo conectada a una cámara de aspiración equipada con una capilar de vidrio (Figura 1A), un bucle de Irwin o una micropipeta, transfiera 25–200 animales (según el tamaño de la especie) desde sus placas de cultivo a una placa con agua de manantial limpia para reducir la cantidad de material no correspondiente a tardígrados (algas u otras fuentes de alimento como nematodos o rotíferos, según la especie).
  2. Obtenga un tubo libre de RNasa de 1,5 mL y un pistilo.
  3. Utilizando una pera de pipeteo conectada a una cámara de aspiración equipada con una capilar de vidrio o un bucle de Irwin, transfiera los animales al fondo del tubo libre de RNasa de 1,5 mL, teniendo especial cuidado de transferir con ellos la menor cantidad posible de agua.
  4. Centrifugue a 4.500 g durante 3 min para sedimentar los tardígrados en el fondo del tubo de microcentrífuga.
  5. Mientras observa el tubo con los tardígrados sedimentados bajo un microscopio estereoscópico, utilice una pipeta de 20 µL o una pera de pipeteo conectada a una cámara de aspiración equipada con una capilar de vidrio cuya abertura sea más pequeña que los tardígrados de los que está aislado el ARN, para retirar con cuidado la mayor cantidad posible de agua sin perturbar el sedimento de tardígrados. Vea la Figura 1B para una representación de la cantidad aceptable de agua residual.
    NOTA: Tenga cuidado de dejar una fina capa de agua para que los animales no se deshidraten durante el breve periodo entre la eliminación del agua y la adición del tampón de extracción (XB). Si los animales se deshidratan, esto podría resultar en una mala calidad del ARN tras el aislamiento.
  6. Agregue 100 µL del tampón de extracción (XB) al tubo que contiene los tardígrados.

3. Disrupción mecánica de los tardígrados y extracción de ARN

  1. Utilizando el mortero libre de RNasa, desintegre los tardígrados moliendo suavemente pero firmemente el mortero contra el fondo del tubo durante aproximadamente 30 s. Un total de 20 a 30 movimientos de molienda debería ser suficiente para desintegrar los tardígrados.
  2. Retire el mortero del tubo, teniendo cuidado de asegurar que permanezca en el fondo del tubo la mayor cantidad posible de líquido.
  3. Revise el contenido del tubo de microcentrífuga bajo el microscopio de disección para asegurarse de que no queden animales intactos visibles.
  4. Incube la mezcla a 42 °C durante 30 min en un bloque térmico agitador con agitación suave (300 rpm).
    NOTA: El tampón de extracción (XB) estabiliza el ARN para prevenir su degradación a esta temperatura.

4. Acondicionamiento de la columna de aislamiento de ARN

  1. En los últimos 10 min de la incubación de extracción, ensamble la columna para la recolección y purificación del ARN. Coloque una columna de purificación en un tubo de recolección y etiquete la columna adecuadamente.
  2. Añada 250 µL de tampón de acondicionamiento (CB) directamente a la columna.
  3. Incube a temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Centrifugue a 16,000 × g durante 1 min y deseche el flujo pasante. La columna ya está lista para recibir el sobrenadante de ARN del siguiente paso.
  5. Retire el tampón de reacción 10x de DNasa I y el agua libre de nucleasas del congelador para que descongele completamente a tiempo para el paso 6 a continuación.

5. Unión del ARN a la columna

  1. Después de la incubación de extracción, centrifugar el tubo que contiene los tardígrados disruptados mecánicamente y el tampón de extracción (XB) a 3,000 × g durante 2 min.
  2. Obtener un nuevo tubo libre de RNasas y etiquetarlo adecuadamente.
  3. Utilizando una pipeta de 200 µL con punta filtrante, retirar cuidadosamente el sobrenadante del pellet de cutículas de tardígrados. Tener cuidado de no perturbar el pellet de cutícula y de solo retirar el sobrenadante.
    NOTA: La transferencia de cutícula a los pasos siguientes dará como resultado una menor eficiencia en el rendimiento de ARN en la columna debido al taponamiento físico de la misma. Para evitar este error potencial, se puede observar la punta de la pipeta con el sobrenadante bajo el microscopio para asegurar la ausencia de cutícula. Si se observa alguna cutícula, devolver el sobrenadante al tubo y repetir el paso de centrifugación.
  4. Transferir el sobrenadante al tubo nuevo y etiquetado, libre de RNasas.
  5. Pipetear 100 µL de etanol al 70 % al tubo que contiene el ARN y mezclar completamente aspirando y expulsando varias veces. En este paso, se deben observar filamentos viscosos claros tras añadir el etanol. Este es un buen indicio de que hay ARN presente en el sobrenadante.
  6. Pipetear toda la mezcla (200 µL) sobre la columna preparada en el paso 4.
    NOTA: Al pipetear cualquier solución sobre la columna en este y los pasos siguientes, tener cuidado de dispensar el líquido en el centro de la columna y evitar tocar físicamente la columna con la punta de la pipeta. La perforación mecánica de la columna provocará problemas posteriores en la calidad y cantidad de ARN.
  7. Para unir el ARN a la columna, centrifugar durante 2 min a 100 × g, seguido de una centrifugación a 16,000 × g durante 30 s para eliminar el flujo pasante.

6. Preparación de la solución de DNasa I

  1. Deje que el tampón de reacción 10x de DNasa I y el agua libre de nucleasas se descongelen completamente antes de preparar la solución.
  2. Para cada aislamiento de ARN, prepare una solución de 40 µL en un tubo microcentrífugo separado de 1,5 mL que contenga 32 µL de agua libre de nucleasas, 4 µL de tampón de reacción 10x de DNasa I y 4 µL de enzima DNasa I. Mantenga la solución en hielo hasta que esté lista para aplicarla a la columna en el paso 7.3.

7. Lavado del ARN y tratamiento con DNasa I

  1. Pipetee 100 µL de tampón de lavado 1 (W1) directamente sobre la columna de purificación que contiene el ARN unido (del paso 5.7).
  2. Centrifugue durante 1 min a 8,000 × g y deseche el flujo filtrado.
  3. Pipetee 40 µL de la solución de DNasa I del paso 6 directamente sobre la columna de purificación e incube a temperatura ambiente durante 15 min para eliminar la contaminación por ADN.
  4. Pipetee 40 µL de tampón de lavado 1 (W1) sobre la columna de purificación y centrifugue a 8,000 × g durante 30 s.
  5. Pipetee 100 µL de tampón de lavado 2 (W2) sobre la columna de purificación y centrifugue a 8,000 × g durante 1 min.
  6. Pipetee otros 100 µL de tampón de lavado 2 (W2) sobre la columna de purificación y centrifugue a 16,000 × g durante 2 min. Deseche el flujo filtrado.
  7. Centrifugue la columna a 16,000 × g durante 1 min para secar la columna.

8. Elución del ARN

  1. Obtenga un tubo de 0,5 mL (incluido en el kit) para cada aislamiento de ARN y etiquételo adecuadamente. Este será el tubo que contenga el ARN después del aislamiento.
  2. Transfiera la columna con el ARN unido y lavado al tubo de 0,5 mL etiquetado. La columna debe encajar firmemente en este tubo.
  3. Mientras observa el tubo desde un ángulo lateral, coloque la punta de la pipeta directamente sobre la membrana de la columna, expulse 11 µL de tampón de elución (EB) sobre la columna e incube durante 1 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Si no se dispersa el tampón de elución (EB) directamente sobre la columna, se obtendrán rendimientos reducidos de ARN. Si se observan gotas de líquido alrededor del perímetro de la columna, esto indica una dispersión inadecuada del tampón de elución (EB). En tal caso, se recomienda repetir este paso con el flujo pasante del paso 8.5, asegurándose de que el tampón de elución (EB) se expulse directamente al centro de la columna.
  4. Coloque el tubo de 0,5 mL que contiene la columna dentro del tubo colector proporcionado con el kit para garantizar un ajuste adecuado durante la centrifugación (Figura 2).
  5. Centrifugue la columna a 1.000 × g durante 1 min para distribuir el tampón de elución (EB) y luego gire a 16.000 × g durante 1 min para eluir el ARN.
  6. Coloque inmediatamente el tubo de 0,5 mL que contiene el ARN sobre hielo.

9. Validación de la cantidad y calidad de ARN con un espectrofotómetro de microvolumen

NOTA: Se pueden utilizar otros métodos para evaluar la cantidad y calidad del ARN. Aquí se emplea un método con un espectrofotómetro de microvolumen. También se puede utilizar un fluorímetro o una herramienta de electroforesis en gel por microfluidica29.

  1. Limpie el pedestal del espectrofotómetro de microvolumen con una toallita sin pelusa para asegurarse de que esté libre de otros líquidos.
  2. Seleccione la configuración de ARN en el espectrofotómetro para el análisis.
  3. Realice el blanco en el espectrofotómetro con 1 µL del tampón de elución (EB) utilizado en el paso 8.3.
  4. Después de realizar el blanco, limpie el tampón de elución (EB) del pedestal con una toallita sin pelusa.
  5. Manteniendo el tubo de 0,5 mL que contiene ARN sobre hielo, pipetee 1 µL de ARN sobre el pedestal del espectrofotómetro. Baje el brazo del espectrofotómetro para medir la absorbancia de la muestra y cuantificar, así como evaluar, la calidad del ARN aislado.
    NOTA: Consulte la sección “Resultados” a continuación para obtener detalles sobre la calidad y cantidad aceptables para aplicaciones posteriores.

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Resultados

Un paso crítico en este protocolo, como se mencionó anteriormente, es eliminar una cantidad adecuada de agua de los tardígrados recolectados antes de agregar el tampón de extracción (XB) para la extracción de ARN. Dejar demasiada agua provocará la dilución del tampón de extracción (XB) y una extracción de ARN deficiente (es decir, RIN < 7, relación 260/280 <1.8, relación 260/230 <1.8 y/o concentración <5 ng/µL) a partir de los animales, lo que resulta en una concentración y calidad reducidas del ARN tras la e...

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Discusión

El objetivo de este protocolo es facilitar el aislamiento de ARN a partir de tardígrados, con una cantidad y calidad suficientes para aplicaciones posteriores que permitan investigar la tolerancia al estrés en estos organismos. En este protocolo se han destacado los aspectos en los que los usuarios podrían encontrar dificultades, como eliminar suficiente agua antes de añadir el tampón de extracción (XB) (Paso 2.5), romper las células de los tardígrados (Paso 3.1–3.3), transferir el sobrenadante a la columna para su purif...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue respaldado por fondos iniciales de la UNC Asheville (para CCH) y una subvención de la NSF 2225683 otorgada a Jason Pienaar (asesor posdoctoral de PK). Agradecemos a la Instalación de Secuenciación de Alta Rendimiento de la UNC por la asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos microcéntrifugos de 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Tubo microcéntrifugo graduado Seal-Rite de 1,5 mL, natural, de polipropileno, 500/unidad en bolsa
Etileno al 70 %VWR71001-654Para limpieza de bancos/equipos
Kit Arcturis PicoPure para aislamiento de ARNFisherKIT0204Kit que contiene los componentes para el protocolo de aislamiento descrito en este manuscrito
CentrífugaEppendorf5405000441Centrífuga 5425, con mandos giratorios, no refrigerada, con rotor FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (EE. UU.)
Agua de manantial Deer ParkCualquier tienda de comestiblesN/AEste es el medio para cultivos de tardígrados y se utiliza para enjuagar los tardígrados antes del aislamiento de ARN
Microscopio de disecciónZeissN/AZeiss Stemi 305, relación de zoom 5:1 y aumento total de 8x a 40x, con unidad de transiluminación M LED
DNasa IFisherFEREN0521DNasa I Thermo Scientific, libre de RNasas (1 U/µL)
Puntas filtradas para pipeta de 10 µLVWR76322-528Cualquier punta filtrada para pipeta es adecuada
Puntas filtradas para pipeta de 1000 µLVWR76322-154Cualquier punta filtrada para pipeta es adecuada
Puntas filtradas para pipeta de 20 µLVWR76322-134Cualquier punta filtrada para pipeta es adecuada
Puntas filtradas para pipeta de 200 µLVWR76322-150Cualquier punta filtrada para pipeta es adecuada
Capilares de vidrioFisher50-821-811Capilares de vidrio estándar de World Precision Instrument - 1B120-6 (6 pulgadas, diámetro exterior 1,2 mm, sin filamento). Estos se estiran sobre una llama para formar dos capilares de vidrio con extremos estrechados y luego se rompen hasta el diámetro adecuado para pipetear con la boca la especie de tardígrado deseada.
Bloque térmicoEppendorf5382000023Dispositivo básico Eppendorf ThermoMixer C sin bloque térmico, 100-130 V/50-60 Hz (EE. UU./JP/América del Sur/TW)
Escalera de cinta de ARN de alta sensibilidadAgilent5067-5581Escalera para análisis de alta sensibilidad de ARN total en sistemas TapeStation
Cinta de ARN de alta sensibilidad (High Sensitivity RNA ScreenTape)Agilent5067-5579Para análisis de alta sensibilidad de ARN total en sistemas TapeStation
Tampón muestral para cinta de ARN de alta sensibilidadAgilent5067-5580Tampón para análisis de alta sensibilidad de ARN total en sistemas TapeStation
Electroforesis en gel de microfluídicaAgilentG2991BASistema Agilent 4200 TapeStation
Espetrofotómetro de microvolumenFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, tipo de detector: sensor de imagen lineal CMOS de 2048 elementos, pantalla: pantalla a color de alta definición de 10 pulgadas, idiomas: chino, inglés, francés, japonés, alemán, fuente de luz: destello de xenón, ancho de banda espectral: menor o igual a 1,8 nm (FMHM a Hg 254 nm), voltaje: 12 VCC
Pipeta bucalMillipore SigmaA5177Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas
Agua libre de nucleasasFisherFERR0581Agua Thermo Scientific, libre de nucleasas
Pipetas (2,5 µL, 20 µL, 200 µL y 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, paquete de 4 unidades
RNasa AwayFisher21-402-178Descontaminante de superficies Thermo Scientific RNase AWAY
Tubo y pistilo libres de RNasasFisher12-141-368Tubos y pistilos libres de RNasas para aislamiento de ARN

Referencias

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