Este estudio tiene como objetivo evaluar el miR-215-5p sérico como biomarcador diagnóstico de la osteoartritis e investigar su mecanismo regulador en los condrocitos inducidos por IL-1β.
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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Este estudio tiene como objetivo evaluar el miR-215-5p sérico como biomarcador diagnóstico de la osteoartritis e investigar su mecanismo regulador en los condrocitos inducidos por IL-1β.
La osteoartritis (OA) es una enfermedad degenerativa articular caracterizada por la degradación del cartílago articular y la infiltración inflamatoria sinovial. Este estudio tiene como objetivo evaluar el miR-215-5p sérico como biomarcador diagnóstico para la artrosis y investigar su mecanismo regulador en los condrocitos inducidos por IL-1β. Se reclutaron 110 pacientes con OA y 105 controles sanos. La expresión sérica de miR-215-5p y EREG se determinó mediante reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa de transcripción inversa. El valor diagnóstico de miR-215-5p para la OA se evaluó utilizando una curva característica de funcionamiento del receptor. Los condrocitos C28/I2 fueron estimulados con IL-1β para construir un modelo de células OA. La viabilidad celular, la capacidad migratoria y los niveles de citocinas inflamatorias se evaluaron mediante el Kit de Recuento Celular-8, el ensayo Transwell y un ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA). La asociación entre miR-215-5p y EREG fue validada mediante un ensayo reportero de doble luciferasa y un ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP). En pacientes con OA, el miR-215-5p en suero se reguló al alza, mientras que el EREG fue regulado a la baja. MiR-215-5p mostró un buen rendimiento diagnóstico para la AO (área bajo la curva, AUC = 0,883). En células C28/I2 tratadas con interleucina-1β (IL-1β), la inhibición de miR-215-5p mejoró la viabilidad y migración celular, y atenuó los niveles de IL-1β, IL-6 y factor de necrosis tumoral α (TNF-α). Se confirmó que EREG era un objetivo directo del miR-215-5p. La reducción de EREG revirtió parcialmente el efecto promotor de la regulación a la baja de miR-215-5p sobre la viabilidad y capacidad migratoria de las células C28/I2 tratadas con IL-1β y atenuó su efecto inhibitorio sobre los factores inflamatorios. miR-215-5p contribuye a la patogénesis de la AAO al regular el EREG y representa un biomarcador diagnóstico prometedor y un posible objetivo terapéutico para la OA.
La artrosis (OA) es una enfermedad degenerativa articular, y su patología se caracteriza por la degeneración del cartílago con inflamaciónsinovial 1,2. A nivel mundial, la incidencia de la artrosis sigue siendo alta, y estudios relevantes han informado de una tendencia al aumento de la incidencia año trasaño 3,4. Se ha demostrado que factores como la obesidad, el envejecimiento, la susceptibilidad genética y la densidad ósea están asociados con el desarrollo de laAO 5. En cuanto a los síntomas clínicos, los pacientes con artrosis suelen presentar dolor articular, hinchazón, movilidad limitada y rigidez, lo que reduce gravemente la calidad de vida de lospacientes 6,7. Cabe destacar que existen diferentes fenotipos de la artrosis, y estos fenotipos reflejan adecuadamente la diversidad de la patogénesis de laenfermedad 8. Actualmente, el tratamiento de la artrosis sigue centrado en la mejora de los síntomas, y los medicamentos clínicos más utilizados incluyen analgésicos y antiinflamatorios no esteroideos, que solo pueden aliviar el dolor y no pueden revertir eficazmente la progresión de laenfermedad 9. Por ello, explorar nuevos biomarcadores de la AO se ha convertido en una necesidad urgente para la investigación actual.
Los microARN (miARN) son una categoría de moléculas de ARN de cadena corta que no participan en la codificación de proteínas10. Actúan como importantes moléculas reguladoras de genes en organismos multicelulares y pueden influir en la salida de expresión de numerosos genes codificadoresde proteínas. Numerosos estudios han confirmado que los miARN ejercen una influencia notable en el desarrollo de laOA 12. Un estudio previo mostró que miR-215-5p estaba sobreexpresado en la preeclampsia y redujo la migración y capacidad invasiva de los trofoblastos al regular la expresión13 de CDC6. La sobreexpresión de miR-215-5p atenuó la lesión inflamatoria en células H9c2 ensepsis 14. MiR-215-5p podría ejercer un efecto protector en la patogénesis de la osteoporosis al inhibir la expresión de XIAP y promover la diferenciación dehBMSC 15. Cabe destacar que se encontró una regulación al alza de miR-215-5p cuando se analizaron los perfiles de expresión de miARN de tejidos sinoviales de pacientes con artrosis16. Sin embargo, aún no se ha explorado la expresión sérica de miR-215-5p y su potencial como biomarcador diagnóstico para la artrosis. El papel de miR-215-5p en los condrocitos de la AO, especialmente sus efectos en la viabilidad celular, la migración y la respuesta inflamatoria, sigue sin estar claro. No se ha informado de estudios sobre si el miR-215-5p ejerce su función reguladora en la OA a través de objetivos específicos aguas abajo. Cubrir estas lagunas proporcionará nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares de la OA e identificará nuevos objetivos terapéuticos candidatos.
EREG pertenece a la familia de factores de crecimiento epidérmicos y se ha demostrado que está implicado en la reparación tisular y en respuestasinflamatorias 17,18. El estudio de Chen et al. informó que la expresión de EREG se redujo significativamente en cartílago y tejido sinovial de pacientes con artrosis en comparación con el grupocontrol 19. Sin embargo, por el momento no está claro si EREG sirve como objetivo aguas abajo de miR-215-5p en los condrocitos de la OA y el papel de este eje regulador en la patogénesis de la OA.
Basándonos en el contexto anterior, hipotetizamos que la expresión sérica de miR-215-5p está aumentada en pacientes con artrosis y provoca la disfunción inflamatoria de los condrocitos al dirigirse directamente a EREG, mientras que la inhibición de miR-215-5p alivia la lesión condrocitaria inducida por interleucina-1β (IL-1β). Este estudio adoptó criterios unificados de criterios medibles y de juicio para la validación clínica y celular: clínicamente, se incluyeron 110 pacientes con artrosis y 105 controles sanos; los niveles séricos de miR-215-5p y EREG se cuantificaron mediante qRT-PCR, y se aplicaron curvas ROC para evaluar el rendimiento diagnóstico (válido si AUC ≥ 0,7, P < 0,05). Se analizaron las correlaciones mediante pruebas de chi-cuadrado entre miR-215-5p y las características clínicas de la OA, y la regresión logística multivariante identificó factores de riesgo de OA independientes (P ajustada < 0,05). In vitro, los condrocitos C28/I2 se trataron con 10 ng/mL de IL-1β durante 24 horas para establecer un modelo de OA, seguido de la transfección con inhibidor/mimetizador de miR-215-5p y si-EREG. Se utilizaron ensayos CCK-8, Transwell y ELISA para evaluar la viabilidad celular, la migración y los niveles de citocinas inflamatorias. Criterios del experimento de rescate: el inhibidor de miR-215-5p restauró la viabilidad y migración de los condrocitos (P < 0,05), y el silenciamiento de EREG anuló parcialmente este efecto protector (P < 0,05). La predicción bioinformática TargetScan, los ensayos con reportero de doble luciferasa y los ensayos RIP validaron aún más su unión directa: se definieron una reducción significativa en la actividad de la luciferasa WT-EREG tras la transfección miM-215-5p y un enriquecimiento marcadamente elevado con miR-215-5p/EREG en precipitados Ago2 frente al control de IgG (ambos P < 0,05) como criterios para la interacción con el objetivo. En conjunto, este trabajo aclaró sistemáticamente el valor diagnóstico y el mecanismo molecular de miR-215-5p en la OA, identificando así nuevos candidatos terapéuticos.
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El estudio se realizó conforme a los principios de la Declaración de Helsinki. El Comité de Ética del Hospital General del Condado de Xianyou aprobó el estudio antes de que comenzara (Aprobación nº 202514, el 18 de junio de 2025).
Un resumen del protocolo se proporciona en la Figura Suplementaria 1.
Ejemplar
En total se reclutaron 110 pacientes con OA tratados en este hospital y 105 controles sanos para esta investigación. Los criterios de inclusión para el grupo de OA fueron los siguientes: diagnóstico de OA confirmado según los criterios de clasificación establecidos por el American College ofRheumatology 20. Todos los pacientes se sometieron a radiografías y a la graduación de imagen Kellgren-Lawrence (K-L); no se ha recibido tratamiento antibiótico en los 3 meses previos al ingreso; datos clínicos completos; y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Los criterios de exclusión para el grupo de la AO incluían a pacientes que habían recibido tratamiento relevante o que se encontraban en las fases terminales de la enfermedad; quienes sufren otros tipos de enfermedades articulares como gota, artritis reumatoide, etc.; aquellos con una combinación de tumores, insuficiencia hepática y renal severa, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades neurológicas o enfermedades cardiorrespiratorias graves; y aquellos con condiciones de discapacidad física que les impedían cuidarse por sí mismos. En el momento de la inscripción, se registraron datos iniciales de todos los participantes, incluyendo edad, sexo, índice de masa corporal (IMC), tabaquismo, consumo de alcohol, antecedentes familiares, curso de la enfermedad, grado K-L, puntuación de la Escala Visual Analógica (VAS), puntuación del Índice de Artrosis de las Universidades de Western Ontario y McMaster, y sitio lesional. Los datos relevantes fueron analizados y resumidos en la Tabla 1. A todos los sujetos se les extrajeron 8 mL de sangre venosa en ayuno, los dejaron de pie durante 3 horas a 4 °C, y luego centrifugados a 3000 × g durante 15 minutos a 4 °C para aislar el suero. El suero se extrajo suavemente y se mantuvo a −80 °C hasta más pruebas.
La sangre/suero humano (material biológico infeccioso de Categoría B) contiene fluidos corporales humanos que pueden portar patógenos infecciosos desconocidos y pueden causar infecciones percutáneas o mucosas mediante salpicaduras, pinchazos de aguja o contacto con piel dañada. Debe llevar guantes desechables de nitrilo, batas de aislamiento médico desechables, gafas protectoras o mascarillas faciales y mascarillas quirúrgicas. Tras ser sometido a esterilización a alta presión, es recogido y incinerado centralmente por instituciones certificadas para la eliminación de residuos médicos.
Cultivo celular y construcción de modelos celulares de OA
Los condrocitos humanos C28/I2 se mantuvieron en un medio DMEM/F12 que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37 °C dentro de una incubadora humidificada llena de 5% de CO₂. Todos los experimentos se realizaron utilizando células en los conductos 3–6 para mantener un fenotipo celular estable. Se realizaron manipulaciones experimentales posteriores una vez que la confluencia celular alcanzó el 80%. Las células del grupo experimental fueron tratadas con 10 ng/mL de IL-1β a 37 °C durante 24 horas para establecer un modelo21 de OA in vitro, mientras que las del grupo de control quedaron sin tratar.
Transfección celular
Se sintetizaron comercialmente inhibidor de control negativo (inhibidor-NC), inhibidor miR-215-5p, miR-215-5p mimic, control negativo de pequeño ARN interferente (si-NC) y si-EREG. Los ensayos de transfección se realizaron en placas de 6 pozos utilizando un reactivo de transfección durante la fase logarítmica de crecimiento de las células. Específicamente, se diluyeron 50 nM del inhibidor/control mimetizo o negativo en 125 μL de medio Opti-MEM por pozo, combinados con 5 μL de reactivo de transfección disueltos en 125 μL de Opti-MEM, y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos para formar un complejo. La mezcla se añadió a las células. Las células se extrajeron 48 horas después de la transfección para experimentos posteriores.
Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa por transcripción inversa (ensayo qRT-PCR)
El ARN total se aisló usando reactivo TRIzol siguiendo los protocolos del fabricante, y las muestras incluían suero y células. Para la transcripción inversa, se utilizó 1 μg de ARN total en cada reacción, de acuerdo con el protocolo del fabricante PrimeScript Reverse Transcriptase. Tras completar la transcripción inversa, las reacciones de amplificación se realizaron en un instrumento de PCR en tiempo real utilizando la mezcla SYBR-Green Real Master como reactivo de reacción. Los parámetros del ciclo térmico fueron los siguientes: una desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, luego 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s. Se realizó la qRT-PCR en triplicado técnico para todas las muestras. Para la detección cuantitativa de niveles de miARN y mRNA, los valores del umbral de ciclo (Ct) se normalizaron usando U6 y β-actina como referencias endógenas, y el análisis final de datos se cuantificó con el método 2-ΔΔCT . Las secuencias de cebadores utilizadas para qRT-PCR se presentan en la Tabla Suplementaria 1.
El reactivo de Trizol es un químico peligroso. Es altamente corrosivo; El contacto directo puede causar quemaduras graves en la piel y los ojos, y sus humos volátiles pueden irritar las vías respiratorias. Es necesario llevar guantes de nitrilo resistentes a productos químicos, batas de laboratorio y gafas antisalpicaduras químicas; Solo puede usarse en una campana extractora. El líquido residual se almacena en recipientes plásticos sellados con etiquetas y se elimina correctamente conforme a la normativa local.
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó mediante el Kit de Recuento Celular-8 (CCK-8). Las celdas se emplacaron en placas de 96 pozos a 5 × 103 celdas por pozo. A las 0, 24, 48 y 72 horas de incubación, se añadieron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pozo. Tras incubar las células a 37 °C durante 1 hora, la densidad óptica de cada pozo se midió en 450 nm.
Ensayo Transwell
La capacidad de migración celular se evaluó utilizando una cámara Transwell con membranas de 8 μm del tamaño de un poro. Brevemente, se introdujeron 5 × 104 células/pozo en los insertos superiores que contenían un medio libre de suero, mientras que los insertos inferiores se complementaron con medio completo. Las cámaras se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Las células que no migraron, permaneciendo en la superficie superior de la membrana, fueron limpiadas suavemente con un hisopo de algodón. Las células que migraron a la superficie inferior se fijaron con formaldehído al 4% durante 10 minutos y teñidas con violeta cristalino al 0,1% durante 20 minutos. Finalmente, se observaron y contaron las células que penetraron la membrana usando un microscopio óptico (×200). Para cada modelo, se seleccionaron al azar cinco campos de visión no solapados para el contar. Se calculó y registró el número medio de células migratorias en cada grupo experimental.
Formaldehído (carcinógeno, irritante de la piel/respiratorio, compuesto orgánico tóxico volátil). Su gas volátil puede causar irritación mucosa, dermatitis y reacciones alérgicas. Todas las operaciones deben realizarse en una campana extractora bien ventilada. Lleva guantes resistentes a productos químicos, bata de laboratorio, gafas antiempaña y un respirador de carbón activado. Los residuos que contienen PFA deben tratarse conforme a la normativa sobre residuos peligrosos. Los residuos deben eliminarse conforme a la normativa local.
El violeta cristalino es una mancha biológica. Es tóxico cuando se absorbe a través de la piel; tiene efectos dañinos a largo plazo para el medio ambiente. Evita el contacto directo con la piel y el flujo aleatorio. Lleva guantes desechables de nitrilo y bata de laboratorio.
Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA)
Se midieron los niveles de IL-1β, IL-6 y factor de necrosis tumoral α (TNF-α) mediante kits ELISA humanos siguiendo las directrices operativas especificadas en el manual del producto.
Ensayo génico de reportero de luciferasa dual
La base de datos TargetScan se utilizó para predecir genes candidatos objetivo de miR-215-5p. La interacción de miR-215-5p con el gen objetivo EREG se analizó mediante el kit de ensayo dual luciferasa: las secuencias tipo salvaje y mutante de EREG se amplificaron y clonaron en el vector pGL3. Posteriormente, los plásmidos recombinantes construidos fueron cotransfectados en células C28/I2 con mimic-NC o miR-215-5p, respectivamente. Se detectó actividad luciferasa tras 48 horas de incubación.
Inmunoprecipitación de ARN (RIP)
La interacción entre miR-215-5p y EREG fue validada mediante el kit EZ-Magna RIP. Los pasos fueron los siguientes: las células se lisaron primero con lisado RIP. Posteriormente, los lisados celulares fueron coincubados con perlas magnéticas conjugadas a anticuerpos anti-argonauta 2 (Ago2) o antiinmunoglobulina G (IgG) (humanos) en un tampón RIP. Luego, el ARN se trataba con la proteinasa K y se purificaba. Finalmente, se midieron los niveles de miR-215-5p y EREG mediante qRT-PCR.
Estadísticas
El análisis de datos y la trazación de imágenes se realizaron utilizando SPSS y GraphPad Prism. La prueba de Shapiro-Wilk se aplicó para evaluar la normalidad de la distribución antes del análisis estadístico. Las mediciones que siguen una distribución normal se expresaron como media ± desviación estándar (DS). El test t de Student se utilizó para comparaciones de dos grupos, mientras que el análisis de varianza (ANOVA) seguido del test post-hoc de Tukey se empleó para análisis de varios grupos. Las variables continuas no distribuidas normalmente se reportaron como medianas y rangos intercuartítiles (IQR) y se compararon utilizando la prueba U de Mann-Whitney. Las variables categóricas se expresaron como porcentajes (n (%)), y las diferencias entre grupos se examinaron mediante la prueba del chi-cuadrado. La eficacia diagnóstica de miR-215-5p para la AO se evaluó utilizando curvas de características de funcionamiento del receptor (ROC). La asociación entre miR-215-5p y las características clínicas de los pacientes con OA se evaluó mediante la prueba de chi cuadrado. Se exploraron los factores de riesgo para el desarrollo de la artrosis utilizando regresión logística multivariable. La asociación entre miR-215-5p y EREG se evaluó mediante análisis de correlación de Spearman. Se consideró estadísticamente significativo un P < 0,05.
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Características básicas
Se incluyeron 105 pacientes en el grupo control, incluyendo 58 (55,24%) varones y 47 (44,76%) mujeres, con una edad media de 52,81 ± 12,57 años y un IMC de 24,25 ± 2,71 kg/m2. El grupo de OA incluía 110 pacientes, 69 (62,73%) hombres y 41 (37,27%) mujeres, con una edad media de 54,42 ± 12,33 años y un IMC de 24,88 ± 3,51 kg/m 2. La información de referencia adicional para el grupo de la OA se prese...
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La artrosis, un trastorno articular prevalente en entornos clínicos, se ha convertido en la tercera causa más importante de discapacidad orgánica después de la diabetes y la demencia22,23. Sin embargo, la patogénesis de la artrosis es compleja y su diagnóstico suele requerir una combinación de síntomas clínicos, exámenes de imagen y otros medios, y el largo ciclo diagnóstico retrasa seriamente el tratamiento oportuno de
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Los autores no tienen intereses financieros ni de propiedad en ningún material tratado en este artículo.
Los autores no recibieron financiación específica para esta obra.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 96-well plates | Corning/USA | 3903 | |
| Anti-Ago2 | Abcam/USA | AB_867543 RRID: ab186733 | |
| Anti-IgG | Abcam/USA | AB_10673832 RRID: ab133470 | |
| C28/I2 chondrocytes | Merck Millipore/USA | SCC043 | |
| CCK-8 Kit | Beyotime/China | C0038 | Kit de ensayo de viabilidad celular |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich/USA | V5265 | |
| DMEM/F12 medium | Gibco/USA | 11320033 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | Promega/USA | E1910 | |
| EZ-Magna RIP Kit | Merck Millipore/USA | 17701 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific/USA | 26010074 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich/USA | F8775 | |
| Graphpad Prism 9.0 | GraphPad Software Inc. /USA | https://www.graphpad.com/features | |
| IL-1β | Sigma-Aldrich/USA | SRP3083 | |
| IL-1β ELISA kit | Nanjing Jiancheng/China | H002-1-2 | |
| IL-6 ELISA kit | Nanjing Jiancheng/China | H007-1-2 | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific/USA | BB150-2TCS-L | |
| Inhibitor-NC | GenePharma (síntesis personalizada) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| Light Cycler 480 | Roche/Suiza | https://lifescience.roche.com/global/en/article-listing/article/lightcycler-480-system-technology.html | Instrumento de PCR en tiempo real |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen/USA | L3000015 | El reactivo de transfección utilizado en la transfección celular |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific/USA | VA000010C | |
| Microscopy | Nikon/Japón | https://www.nikon.com.cn/sc_CN/ | |
| Mimic-NC | GenePharma (síntesis personalizada) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| MiR-215-5p inhibitor | GenePharma (síntesis personalizada) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| MiR-215-5p mimic | GenePharma (síntesis personalizada) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| Opti-MEM | Gibco/USA | 31985070 | |
| pGL3 vector | Promega/USA | E1751 | |
| PrimeScript Reverse Transcriptase | Takara/Japón | 2680 | Kit de transcripción inversa |
| Si-EREG | GenePharma (síntesis personalizada) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| Si-NC | GenePharma (síntesis personalizada) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| SPSS 24.0 | IBM Corp/USA | https://spssau.com/index.html | |
| SYBR Green Supermix | Bio-Rad/USA | 1725121 | |
| TNF-α ELISA kit | Nanjing Jiancheng/China | H052-1-2 | |
| Transwell chamber | Corning/USA | 3422 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher Scientific/USA | 15596026 | Reactivo de aislamiento de ARN |
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