Interacción fármaco-fármaco entre eugenol y repaglinida en la diabetes mellitus tipo 2 y su posible mecanismo

Resumen

Este estudio tenía como objetivo explorar posibles interacciones fármaco-fármaco entre el eugenol (EUG) y la repaglinida (RPG) en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (DM2).

Resumen

Este estudio investigó la posible interacción fármaco-fármaco (DDI) entre el eugenol (EUG) y la repaglinida (RPG) en la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Se estableció un modelo de rata con diabetes tipo 2 utilizando una dieta alta en grasas y estreptozotocina (STZ). El grupo de dosis única recibió 0,4 mg/kg RPG, y los grupos de coadministración fueron pretratados con EUG (50, 100, 150 mg/kg) durante siete días antes de recibir una dosis única de RPG (0,4 mg/kg). Se evaluaron los parámetros de glucosa en sangre y farmacocinética del RPG en muestras de plasma de ratas. Se evaluó el efecto de la EUG sobre la estabilidad metabólica del RPG y la actividad del citocromo P3A (CYP3A) en microsomas hepáticos (RLM) de rata. En ratas con diabetes tipo 2, el tratamiento con RPG mostró un efecto hipoglucémico, que se vio promovido además por la coadministración de EUG de manera dosificada (p < 0,001). La coadministración de EUG afectó la farmacocinética de la RPG aumentando el área bajo la curva (AUC, incremento del 88,64%, 164,59% y 244,72% frente a RPG único, p < 0,001), concentración máxima plasmática (C_máxima, incremento 18,61%, 53,58% y 77,63% frente a RPG simple, p < 0,01), concentración máxima (T_máxima, 1,0 h para coadministración de EUG frente a 0,5 h para RPG único), vida media (t_1/2, prolongada 33,86%, 49,61% y 88,19% frente a RPG único, p < 0,01), tiempo medio de retención (MRT, prolongado 17,62%, 26,42%, 44,04% frente a RPG único, p < 0,001), y disminución de la tasa de resolución (Clz/F, disminución del 48,92%, 63,31% y 74,10% frente a RPG único, p < 0,001) de manera dependiente de dosis. In vitro El estudio RLM, EUG, mejoró la estabilidad metabólica de los RPG al prolongar la vida media (44,09 ± 3,25 min) y reducir la eliminación intrínseca (30,55 ± 3,69 μL/min/mg de proteína). La EUG también inhibió la actividad de CYP3A con un IC₅₀ de 7,90 ± 1,79 μM. La coadministración de EUG promovió el efecto hipoglucémico de la RPG al aumentar la exposición sistémica a RPG en ratas con diabetes tipo 2, potencialmente mejorando la estabilidad metabólica de RPG e inhibiendo la actividad de CYP3A.

Introducción

La diabetes mellitus tipo 2 (DT2) es un trastorno metabólico crónico caracterizado por resistencia a la insulina o eficacia reducida de la insulina, que afecta a millones de personas en^{todo el mundo 1}. Interacciones complejas con susceptibilidad genética y factores del estilo de vida están implicadas en la DT2, lo que resulta en una captación de glucosa deteriorada, gluconeogénesis hepática excesiva e inflamación crónica de bajo^{grado 2}. La diabetes tipo 2 puede provocar complicaciones graves si se trata de forma inadecuada, incluyendo enfermedades cardiovasculares, enfermedad renal, retinopatía y neuropatía, afectando significativamente la calidad de vida de los pacientes y aumentando la^{mortalidad 2}. Los tratamientos farmacológicos actuales para la DM2 incluyen metformina, fármacos sulfonilureos, agonistas del receptor GLP-1 e inhibidores de DPP-4, etc^{. 3}. La repaglinida (RPG) es un tipo de meglitinida de acción corta que actúa estimulando la secreción de insulina y tiene la característica de flexibilidad en la^{dosis 4}. En comparación con las sulfonilureas, las glinidas ofrecen un control superior de la hiperglucemia posprandial, reducen el riesgo de ciertos efectos adversos como la hipoglucemia y presentan un perfil de seguridad más favorable, especialmente en pacientes con insuficiencia^{renal 5,6}. La RPG se absorbe rápidamente tras la administración oral, alcanzando concentraciones plasmáticas máximas típicamente en 30–60 minutos, y su corta vida media provoca una breve estimulación de la liberación de insulina. Clínicamente, el RPG se utiliza ya sea como monoterapia o en combinación con otros agentes antihiperglucémicos orales para optimizar el control glucémico⁷. Sin embargo, su aplicación clínica está limitada por la baja biodisponibilidad oral (alrededor del 56%), el metabolismo acelerado del hígado y el riesgo potencial de hipoglucemia 8,9,10,11,12,13,14. Estos inconvenientes ponen de manifiesto la necesidad de una estrategia de tratamiento integral.

El eugenol (EUG), conocido químicamente como 4-alil-2-metoxifenol, es un compuesto orgánico con la fórmula química C₁₀H_{12O 2}¹⁵. El EUG es un líquido incoloro a amarillo pálido y es un compuesto fenólico activo que se encuentra principalmente en clavos de clavo (Eugenia caryophyllata Thunb.) y otras plantas^{aromáticas 16}. La EUG ha atraído mucha atención debido a sus diversas propiedades farmacológicas, incluyendo actividades antioxidantes, antiinflamatorias, antibacterianas, analgésicas y^{antitumorales} 17,18,19. Estudios recientes han demostrado que la EUG ha demostrado su potencial como terapia complementaria para la DT2DM, ya que tanto la evidencia experimental in vitro como in vivo indica que la EUG mejora la sensibilidad a la insulina, promueve la captación de glucosa en tejidos periféricos, inhibe la gluconeogénesis hepática y protege la función de las células β pancreáticas^20,21. Estas medidas multifacéticas, combinadas con una toxicidad^{relativamente baja 22}, sitúan la EUG como un candidato natural muy prometedor que puede complementar las deficiencias de los fármacos clínicos tradicionales y aliviar las complicaciones relacionadas con la diabetes tipo 2 mediante un mecanismo sinérgico.

Las enzimas citocromo P450 (P450) desempeñan un papel crucial en el proceso de metabolismo de fármacos y median las interacciones fármaco-fármaco (DDI) induciendo o inhibiendo subtipos específicos, lo cual es de vital importancia para un tratamiento farmacológico seguro^{y eficaz 23}. Cabe destacar que la RPG se metaboliza principalmente en el hígado por CYP2C8 y CYP3A4^24,25. Cuando se administra junto con quercetina (QCT), la QCT mejora la biodisponibilidad in vivo de la RPG al inhibir el metabolismo hepático de primer paso y sistémico a través de CYP450s²⁶. También se ha informado que la EUG suprime la actividad de los CYP450, incluyendo 1A2, 2C9, 2D6 y 3A4, de forma dependiente de la concentración, indicando posibles interacciones cuando la EUG se coadministra con fármacos metabolizados por estas^{enzimas 27}. A pesar del prometedor potencial de la EUG como terapia complementaria para la DMT2 y de la susceptibilidad conocida de la RPG a las DDI mediadas por CYP, sigue sin estar claro si la EUG altera la exposición sistémica, la estabilidad metabólica o el metabolismo mediado por CYP3A de la RPG. Dado que tanto la EUG como la RPG probablemente se administren conjuntamente en la práctica clínica o en entornos de suplementos dietéticos, la falta de datos DDI entre ambas supone un riesgo potencial de alteraciones no intencionadas en las concentraciones plasmáticas de RPG. Estas alteraciones podrían conducir a una reducción de la eficacia terapéutica o a un mayor riesgo de hipoglucemia. Por tanto, esta carencia de evidencia representa un obstáculo significativo para la combinación racional y segura de productos naturales con medicamentos antidiabéticos convencionales. Por ello, es esencial evaluar sistemáticamente el efecto de la EUG sobre la farmacocinética y farmacodinámica de la RPG y dilucidar el mecanismo metabólico subyacente, con especial atención a la actividad de CYP3A. Dadas las pruebas anteriores, se podría especular que la EUG podría influir en el metabolismo del RPG alterando la actividad del CYP450. Este es el primer estudio que investiga la interacción EUG–RPG en un entorno de DM T2. Se espera que los resultados cubran una laguna crítica de conocimiento y proporcionen una base mecanicista para optimizar la coadministración segura de EUG y RPG en la gestión de T2DM. Si se considera la coadministración, se debe considerar el potencial de mayor exposición al RPG y se deben monitorizar los signos de hipoglucemia, especialmente cuando la EUG se toma en dosis altas o como suplemento concentrado. Además, aunque las ratas expresan isoformas de CYP3A que son funcionalmente análogas a las de CYP3A4 humanas, la extrapolación directa de hallazgos cuantitativos a humanos requiere precaución debido a las diferencias entre especies en la expresión enzimática y la actividad catalítica.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Academia de Ciencias Médicas de Jilin (Fecha: 2024.11.21/No.2024112) en cumplimiento con las directrices^{ARRIVE 28}. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Condiciones de alojamiento animal

Los machos de rata Sprague-Dawley (200–250 g) fueron alojados en una sala de animales de laboratorio bajo las siguientes condiciones: temperatura: 22 °C ± 2 °C, humedad relativa: 40–60%, y un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, con acceso libre a comida y agua para permitir una semana de^{aclimatación 29,30}.

2. Modelado animal, tratamiento y procesamiento de muestras

El tamaño de la muestra se determinó mediante un análisis de potencia utilizando la prueba F (G*Power 3.1.9.7). Se realizó un análisis de potencia a priori con un tamaño de efecto de 0,6, un nivel de α de 0,05 y una potencia deseada de 0,8, lo que dio un tamaño total de muestra de 55. Este cálculo indicó que se requerían al menos 9 ratas por grupo. Por lo tanto, se usaron diez ratas por grupo, logrando una potencia real de 0,86.

Antes de que se estableciera el modelo T2DM, todas las ratas estaban en ayunas durante 12 horas. Luego se dividieron aleatoriamente en dos grupos: el grupo de control (n = 10) y el grupo T2DM (n = 50). El establecimiento del modelo de rata T2DM se llevó a cabo según el método previamente^{reportado 31}. En resumen, las ratas del grupo con diabetes tipo 2 fueron alimentadas con una dieta alta en grasas (con un contenido de grasa del 60%) durante 4 semanas consecutivas y luego recibieron una única inyección intraperitoneal de 30 mg/kg de STZ disuelta en un tampón de citrato estéril (pH 4,4). Tres días después de la inyección STZ, se midió la glucosa en sangre de las venas caudales de las ratas usando un medidor de glucosa, y se consideró que las ratas con una concentración superior a 16,7 mmol/L habían establecido con éxito el DT2. En el grupo de control, las ratas recibieron una dieta normal y recibieron inyecciones intraperitoneales de 0,9% de solución salina normal en el mismo periodo que el grupo con diabetes tipo 2.

Las ratas T2DM se dividieron a su vez en cuatro grupos con 10 ratas en cada grupo: el grupo T2DM + RPG (RPG individual), el grupo T2DM + RPG + EUG (50 mg/kg) (co-RPG+EUG 50 mg/kg), el grupo T2DM + RPG + EUG (100 mg/kg) (co-RPG+EUG 100 mg/kg) y el grupo T2DM + RPG + EUG (150 mg/kg) (co-RPG+EUG 150 mg/kg). Tras ayunar durante 12 horas, a las ratas del grupo RPG único se les administraron oralmente 0,4 mg/kg RPG (suspendidas en solución salina normal) mediante una aguja^{gavage 26}. Las ratas en los grupos co-RPG+EUG recibieron por vía oral 50, 100 y 150 mg/kg de EUG, respectivamente, una vez al día durante siete días consecutivos, y al octavo día, tras un periodo adicional de ayuno de 12 horas, al grupo de coadministración se le administraron además 0,4 mg/kg RPG por gavage intragástrico. Posteriormente, se evaluaron los parámetros de glucosa en sangre utilizando muestras de sangre recogidas de la vena caudal.

Para el análisis farmacocinético, la muestra de sangre (0,2 mL) se recogió del plexo venoso orbitario posterior de las ratas en los tubos de microcentrífuga heparinizados en varios momentos (0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h y 8 h después de la dosis). Tras la recogida, las muestras se centrifugaron (1500 × g, 10 min, 4 °C) para separar el plasma (amarillo pálido, transparente), que se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Las muestras de plasma fueron posteriormente analizadas para obtener concentración de RPG utilizando el método HPLC descrito en el paso 4.

3. Estudio del metabolismo en los microsomas hepáticos de rata agrupados

Para investigar el mecanismo subyacente a los cambios farmacocinéticos in vivo , se evaluó el efecto de la EUG sobre la estabilidad metabólica del RPG y la actividad de CYP3A en RLM. RPG (3 μM) fue incubado con o sin EUG en un tampón PBS a 37 °C con un volumen total de 200 μL, incluyendo RLM (0,5 mg/mL de proteína microsomal y un sistema de regeneración de NADPH (1,3 mM de NADP, 3,54 mM de glucosa 6-fosfato, 0,4 U/mL de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y 3,3 mM de_{MgCl 2}). Tras una preincubación de 5 minutos a 37 °C sin NADPH, la reacción se inició añadiendo el sistema de regeneración de NADPH. La mezcla se incubaba a 37 °C en un baño maria agitado. En diferentes momentos de incubación (0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min), se recogieron muestras de 30 μL y se transfirieron a un tubo microcentrífuga con acetonitrilo helado para terminar la reacción. Las muestras se centrifugaron (12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C) para obtener el sobrenadante (transparente). Los sobrenadantes resultantes se analizaron entonces para la concentración de RPG utilizando el mismo método HPLC detallado en el paso 4.

4. Análisis HPLC

La concentración de RPG en plasma (desde el paso 2) y en las incubaciones microsómicas (desde el paso 3) se analizó utilizando el método HPLC reportado por Kim et ^al.26. Los pasos específicos de la operación son los siguientes: se mezclaron muestras (120 μL) con 300 μL de acetonitrilo que contienen ketoconazol (estándar interno, 100 ng/mL) para lograr la precipitación de proteínas. Luego, la mezcla se vórtice y centrifugó a 15.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a un tubo de microcolumna de centrífuga y se evaporó a 25 °C bajo una atmósfera de nitrógeno. El residuo tras el secado se volvió a disolver con una fase móvil de 50 μL, luego se volvió a volar y centrifugar. Posteriormente, se inyectaron 40 μL del sobrenadante en la columna HPLC (250 mm × 4,6 mm, tamaño de partícula 5 μm). La columna se eluía a 25 °C en modo de elución isocrática con un tampón de fosfato de 10 mM (pH 6,0) y acetonitrilo (relación volumétrica 46,4: 53,6), con un caudal de 1 mL/min. El eluente fue monitorizado mediante un detector de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 240 nm.

5. Análisis estadístico

Se utilizó software de análisis farmacocinético para calcular parámetros farmacocinéticos, incluyendo AUC, C_máx, T_máx, t_1/2, MRT y autorización. Se utilizaron software de análisis estadístico y gráficos para la generación de figuras y el análisis de datos. Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar. Las diferencias entre grupos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional (para comparaciones de niveles de glucosa) o ANOVA bidireccional (para comparaciones de parámetros farmacocinéticos), según correspondá, seguidas por la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. El efecto de la EUG sobre la actividad de CYP3A se evaluó mediante un análisis de regresión no lineal. Se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05.

La vida media de la EUG en la estabilidad metabólica RPG en la RLM se calculó por:
t_1/2 (min) = 0,693/ln(C_t/_{C 0} × 100).

Tasa de eliminación intrínseca (μL/min/mg de proteína) = v × 0,693/_{t 1/2};
v (μL/mg) = volumen de incubación/concentración de proteínas.

Resultados

La EUG promovió el efecto hipoglucémico del RPG en ratas con diabetes tipo 2
El nivel de glucosa en sangre de las ratas del grupo T2DM aumentó (p < 0,001, IC 95%: -13,90~-11,32) en comparación con el del grupo de control, lo que indica la conducción exitosa del modelo T2DM (Figura 1A). La administración de un solo RPG suprimió el nivel de glucosa en sangre en ratas con diabetes tipo 2 (p < 0,001, IC 95%: 5,26~7,84). La c...

Discusión

La diabetes tipo 2 es una enfermedad metabólica crónica que requiere tratamiento a largo plazo, y los pacientes a menudo necesitan tomar varios medicamentos debido a condiciones subyacentes como enfermedades cardiovasculares y^{renales 32}. El riesgo de DDI aumenta significativamente con la coadministración de fármacos, ya que puede afectar a la absorción, metabolismo o eficacia de fármacos hipoglucémicos, lo que puede conllevar riesgos agudos como coma hipoglucémico...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
acetonitrilo	Merck, Alemania	34851	≥99.9%
columna cromatográfica	Phenomenex, EE. UU.	00G-4041-E0	250 mm × 4.6 mm, tamaño de partícula 5 μm
DAS	Beijing Bozhiyin, China	-	3.0
EUG	MUST Bio-tecnología, China	A0074	pureza ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, EE. UU.	-	9.0.0
Cromatografía líquida de alta resolución	Shimadzu Corporation, Japón	228-45147-42	RF-20A
ketoconazol	Merck, Alemania	K1003	Pureza 99.0-101.0%
Ratones Sprague-Dawley machos	Centro de Animales de Shanghai, China	-	200–250 g
NADPH	Merck, Alemania	10107824001	97% (peso seco)
glucómetro OneTouch Ultra2	Life Scan Inc., EE. UU.	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, Alemania	P4474	pH 7.4
RLM	Merck, Alemania	M9066	-
RPG	Merck, Alemania	R9028	pureza ≥98%
STZ	Merck, Alemania	S0130	≥98% (HPLC)
EUG, eugenol; RPG, repaglinida; RLM, microsomas de hígado de rata; NADPH, β-Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato; STZ, estreptozocina; PBS, solución salina tamponada con fosfato.