Este estudio describe detalladamente un método de modelado para la espondilosis cervical en ratas y una estrategia de intervención con acupotomía, proporcionando un protocolo operativo visualizado para investigaciones relacionadas.
Artículo de método
Acupotomía para la espondilosis cervical en ratas: un protocolo visualizado para el establecimiento del modelo y la intervención
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La espondilosis cervical (EC) es una enfermedad degenerativa crónica. Los cambios degenerativos en los discos intervertebrales de la columna cervical, junto con alteraciones patológicas subsiguientes, afectan los tejidos y estructuras circundantes, provocando manifestaciones clínicas como dolor cervical, rigidez, movilidad limitada y, ocasionalmente, entumecimiento y síntomas irradiados en las extremidades superiores. Entre estas, la compresión de la raíz nerviosa es la más común. Por lo tanto, este estudio estableció un modelo de rata de EC inducida por compresión de la raíz nerviosa cervical. La terapia con acupotomía ha mostrado potencial en el tratamiento clínico de la EC al liberar adherencias del tejido blando local y aliviar la compresión nerviosa. Sin embargo, actualmente existe una falta de protocolos de procedimientos visualizados en experimentos con animales. Este estudio proporciona una descripción detallada de un método confiable para establecer un modelo de rata de EC y el protocolo correspondiente de intervención con acupotomía. En este procedimiento, se detalla el proceso de inducción del modelo, los pasos de la manipulación con acupotomía, la localización terapéutica, las técnicas de inmovilización de la rata y las precauciones críticas. Además, este estudio utilizó electromiografía (EMG) para confirmar el establecimiento exitoso del modelo de EC y evaluó la intervención mediante umbrales mecánicos de retirada, análisis de la marcha e histopatología de la raíz nerviosa. Esta investigación no solo proporciona una referencia para el establecimiento del modelo de rata con EC y la intervención con acupotomía, sino que también ofrece un marco experimental sistemático y factible para futuros estudios que investiguen los mecanismos de acción.
Introducción
La espondilosis cervical (EC) es una enfermedad espinal degenerativa común. Su proceso patológico principal se origina en la degeneración de los discos intervertebrales, lo que a su vez desencadena una serie de cambios patológicos secundarios, incluyendo estenosis del espacio intervertebral, formación de osteofitos e hipertrofia del ligamento1,2. Estas alteraciones patológicas provocan diversos síntomas clínicos, como dolor y molestias en el cuello y los hombros, y entumecimiento irradiado en las extremidades superiores. En casos graves, pueden presentarse déficits neurológicos, incluyendo disfunción motora e incluso tetraplejia2,3. Cabe destacar que en los últimos años la incidencia de espondilosis cervical ha aumentado progresivamente, con una edad de inicio cada vez más temprana, lo que representa una carga socioeconómica considerable4. La degeneración de los discos intervertebrales cervicales y la proliferación osteofítica pueden afectar estructuras óseas y de tejidos blandos adyacentes, provocando estenosis del canal espinal cervical o de los forámenes intervertebrales, y la consiguiente compresión de estructuras cercanas, incluyendo raíces nerviosas cervicales, la médula espinal y las arterias vertebrales1,2,3,4. Entre estas, la compresión de las raíces nerviosas cervicales es la más frecuente, representando aproximadamente entre el 60% y el 70% de todos los casos de EC5,6,7. Aunque existen múltiples enfoques terapéuticos disponibles en la práctica clínica, incluyendo fisioterapia, intervención farmacológica y cirugía, los tratamientos no quirúrgicos se han convertido en la opción preferida para la mayoría de los pacientes debido al alto costo, al trauma significativo y a los resultados postoperatorios inciertos asociados con los procedimientos quirúrgicos4. En la práctica médica actual, se emplean comúnmente fármacos antiinflamatorios no esteroideos y agentes neurotróficos. Aunque estos medicamentos pueden aliviar el dolor y retrasar la progresión de la enfermedad hasta cierto punto, conllevan reacciones adversas como lesión del sistema digestivo y daño renal8,9.
La terapia con acupotomía es una modalidad terapéutica característica desarrollada a partir de las teorías tradicionales chinas de acupuntura combinadas con técnicas quirúrgicas mínimamente invasivas modernas. Ejerce sus efectos mediante la disección y liberación de adherencias del tejido blando, la regulación de factores inflamatorios locales y la mejora de la microcirculación regional10,11,12. En los últimos años, la eficacia clínica de la acupotomía en la espondilosis cervical ha sido ampliamente reconocida, mostrando un potencial prometedor para aliviar la compresión nerviosa, reducir el dolor y mejorar la función motora cervical13,14. No obstante, cuando se aplica en experimentos con animales, las intervenciones con acupotomía enfrentan desafíos como una localización imprecisa y dificultad para controlar la profundidad de la manipulación. Mientras tanto, para traducir estas observaciones clínicas en conclusiones sólidas basadas en evidencia, el establecimiento de modelos animales estables y reproducibles es un requisito esencial. El método de sutura intravertebral con nylon induce una compresión mecánica directa mediante la inserción de suturas de nylon en el foramen intervertebral, imitando así de manera precisa el proceso fisiopatológico de la compresión clínica de la raíz nerviosa15. Este enfoque de modelado también ofrece ventajas, como un ciclo de modelado corto y segmentos de compresión controlables15. Sin embargo, su procedimiento quirúrgico depende en gran medida de la experiencia personal, y actualmente carece de descripciones operativas detalladas y visualizadas.
Este estudio presenta un protocolo experimental completo, detallado y visualizado que abarca el establecimiento de un modelo de rata de espondilosis cervical y todo el procedimiento de intervención con acupotomía. Dado que los agentes anestésicos pueden afectar la medición del umbral mecánico de retirada y, en consecuencia, interferir con los resultados experimentales16,17,18,19, en este estudio se utilizó un dispositivo especializado para inmovilizar a las ratas. Este artículo describe detalladamente el proceso de inducción del modelo en ratas, la manipulación paso a paso de la acupotomía, la localización precisa de los sitios de tratamiento, los métodos para la restricción e inmovilización de las ratas, así como otras precauciones experimentales clave. Se adoptaron múltiples dimensiones de evaluación, incluyendo la medición del umbral mecánico de retirada, grabaciones electrofisiológicas, análisis de la marcha y observación histopatológica de la raíz nerviosa. Este estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo visualizado para la inducción del modelo y la intervención con acupotomía en un modelo de rata de espondilosis cervical, aportando así apoyo metodológico para investigaciones sobre los mecanismos y la evaluación de la eficacia de la terapia con acupotomía en el tratamiento de la EC.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales fueron revisados, aprobados y rigurosamente supervisados por el Comité de Ética en Animales de Laboratorio de Beijing MDKN Biotech Company (ID de aprobación: MDKN-2025-096). Todos los protocolos se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio emitida por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Animales experimentales y grupos
- Seleccione ratas Sprague–Dawley (SD) macho adultas que pesen 230,0 g ± 20 g para su inclusión en el experimento.
- Aloje a los animales en una instalación dedicada para animales de laboratorio.
- Mantenga la temperatura ambiente a 24 °C ± 2 °C y la humedad relativa entre 50% y 60%, bajo un ciclo luz/oscuridad de 12 h. Proporcione acceso ad libitum a alimento estándar y agua durante todo el estudio.
- Después de un período de aclimatación de 7 días, asigne aleatoriamente 24 ratas a cuatro grupos (n = 6 por grupo): el grupo control normal (Control), el grupo falso-operado (Sham), el grupo modelo de CS (Modelo) y el grupo de acupotomía. La cronología del diseño experimental se ilustra en Figura 1.
2. Establecimiento del modelo de CS
NOTA: Retire la comida y el agua a todas las ratas durante 12 h antes del modelado. Pese y registre el peso corporal. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos mediante autoclave de vapor a alta presión (Figura 2A).
- Preparar el hilo de nailon 1 día antes de la cirugía cortándolo en segmentos con un diámetro de 0,5 mm y una longitud aproximada de 1 cm. Sumergir los filamentos en etanol al 75% durante 4 h, secarlos en condiciones estériles y luego sumergirlos en una solución de poli-L-lisina al 0,1% durante 8 h para mejorar la adhesividad tisular.
- Coloque la rata en una cámara de inducción. Induzca la anestesia con isoflurano al 4%, luego mantenga la anestesia con isoflurano al 1,5%–2,0%. vía una mascarilla facial. Sujete al animal en posición prona (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
- Afeite la región cervical dorsal para exponer completamente el campo quirúrgico. Desinfecte el área quirúrgica tres veces con yodopovidona de dentro hacia fuera, y repita el procedimiento de desinfección con etanol al 75 %.
- Palpe y marque el proceso espinoso más alto (T2) en el dorso de la rata. Realice una incisión cutánea dorsal en la línea media de aproximadamente 3 cm, extendiéndose cranealmente desde la punta del proceso espinoso de T2. Diseque por separación roma el tejido subcutáneo y la musculatura cervical posterior (Figura 2B).
- Exponga completamente el arco vertebral izquierdo desde C5 hasta T1, y raspe cuidadosamente los tejidos musculares y conectivos superpuestos (Figura 2C).
- Disecar suavemente el ligamento amarillo y los tejidos conectivos en los espacios intervertebrales C6-C7 y C7-T1 utilizando pinzas microquirúrgicas. Abrir el arco vertebral izquierdo de C7 con pinzas de mosquito para exponer la médula espinal.
- Retraiga suavemente la médula espinal hacia el lado derecho utilizando un disector nervioso oftálmico. Coloque el hilo de nailon esterilizado debajo de las raíces nerviosas C6-C7 y C7-T1 a lo largo del eje longitudinal de la médula espinal con pinzas microquirúrgicas; evite una compresión excesiva para prevenir lesiones venosas vertebrales.
NOTA: Exponga la médula espinal en el mismo sitio anatómico en el grupo control falso sin insertar el hilo de nylon. - Cierre y suture la incisión capa por capa al finalizar el procedimiento.
- Transfiera las ratas a una placa calefactora con control termostático mantenida a 37 °Cy monitorice los signos vitales hasta la recuperación completa de la conciencia.
- Administre una inyección intramuscular de 50.000 unidades de solución de penicilina sódica en la extremidad trasera para profilaxis antiinfecciosa postoperatoria. Devuelva los animales a sus jaulas de origen para la recuperación postoperatoria.
3. Procedimiento de inmovilización
- Sujete la rata en una funda de malla negra de restricción.
- Ajuste dos bridas de nailon en un marco de plástico. Coloque la brida superior en la región axilar y la brida inferior alrededor de la región pélvica (Figura 3B).
NOTA: Utilice una placa de plástico que mida 200 mm × 300 mm × 5 mm, perforada con ranuras de 20 mm × 4 mm espaciadas a intervalos de 10 mm a lo largo de los bordes largos y a intervalos de 3 mm a lo largo de los bordes cortos, y equipada con cinco pies de soporte ubicados en el centro y en las cuatro esquinas (Figura 3A). - Después de la inducción del modelo, repita el procedimiento de restricción anterior para cada rata en todos los grupos durante tres días consecutivos para asegurar una habituación adecuada. Mantenga cada sesión de restricción durante un mínimo de 5 min por día.
4. Tratamiento con acupotomía
- Iniciar la intervención con acupotomía el 4º día tras el establecimiento del modelo.
- Preparar agujas desechables estériles para acupotomía (diámetro: 0,40 mm; longitud: 40 mm).
- Eliminar el vello de la región cervical para exponer completamente el campo operatorio.
- Palpar los tejidos blandos a ambos lados de los apófisis espinosos cervicales para identificar nódulos endurecidos o estructuras en forma de cuerda. Determinar un punto sobre el apófisis espinoso de C6 o C7, y luego localizar otros dos puntos adicionales aproximadamente a 0,5 cm de distancia lateral a cada lado de este apófisis espinoso.
- Designar estos tres sitios como los puntos de inserción para la acupotomía y marcarlos (Figura 3C).
- Desinfectar los sitios de inserción marcados con yodo-povidona médica seguido de etanol medicinal al 75 %.
- Orientar el filo cortante de la aguja de acupotomía paralelo a la línea media posterior y mantener el eje de la aguja perpendicular al plano coronal posterior del cuello durante la inserción.
- Aplicar una compresión suave sobre el sitio de inserción con el pulgar izquierdo, mientras se sostiene la aguja de acupotomía firmemente entre el pulgar y el índice derechos. Penetrar rápidamente a través del tejido subcutáneo en dirección perpendicular, luego avanzar lentamente la aguja hasta alcanzar la superficie ósea.
- Realizar tres cortes longitudinales localizados y dos liberaciones transversales del tejido blando dentro del área lesionada, limitando el rango de la operación a 1 mm. Retirar la aguja tras completar la maniobra (Figura 3D).
- Aplicar presión firme sobre el sitio de inserción durante 3 min para lograr la hemostasia. Administrar la intervención con acupotomía una vez cada 5 días, para un total de tres sesiones.
NOTA: Excepto el grupo de acupotomía, los otros tres grupos no reciben ninguna intervención terapéutica. Sin embargo, los animales de estos grupos se inmovilizan de la misma manera y durante la misma duración que los del grupo de acupotomía.
Prueba del umbral mecánico de retirada (MWT)
NOTA: Realice la medición el día anterior a la cirugía de establecimiento del modelo, el día 3rd día, y el 14th día después de la cirugía, utilizando un estimulador mecánico de dolor plantar para ratas y ratones.
- Coloque cada rata en una cámara de prueba transparente situada sobre un piso de malla metálica, en un ambiente silencioso mantenido a 24 °C ± 2 °C.
- Permita que la rata se aclimate dentro de la cámara durante al menos 5 min, o hasta que los comportamientos de exploración y aseo hayan disminuido considerablemente.
- Coloque la punta del filamento de von Frey perpendicularmente a la superficie plantar de la pata delantera izquierda, entre el tercer y cuarto metacarpiano. Aplique el estímulo desde abajo a través de la malla metálica hasta que se observe una respuesta de retirada rápida de la pata, lamido o sacudida.
- Registre el valor mostrado en el momento de la retirada como el umbral de dolor mecánico.
- Después de probar cada rata, limpie cuidadosamente la malla metálica y las paredes internas de la cámara con alcohol médico al 75%, luego seque con gasa limpia para eliminar olores residuales que puedan influir en pruebas conductuales posteriores. Introduzca la siguiente rata solo después de que el equipo se haya secado completamente.
NOTA: Pruebe todas las ratas secuencialmente en orden rotatorio durante tres rondas. Mantenga un intervalo de al menos 10 min entre dos mediciones sucesivas de MWT en la misma rata. Utilice el promedio de las tres mediciones como valor final de MWT para cada rata.
6. Registro de electromiografía (EMG)
NOTA: Realice un EMG de estado de reposo el día 3 después del establecimiento del modelo utilizando un sistema de adquisición y análisis de señales biológicas.
- Anestesiar la rata mediante inhalación de isoflurano (concentración de inducción 3%–4%, concentración de mantenimiento 1,5%–2,0%). Sujete al animal en posición prona sobre la plataforma experimental y exponga completamente la extremidad anterior izquierda.
- Conecte los cables de los electrodos de registro a los canales de adquisición designados. Inicie el software de adquisición, seleccione el modo de señal EMG y configure la frecuencia de muestreo a 20 kHz con un rango de filtro pasa-banda de 15 Hz–5 kHz.
- Desinfecte los músculos de la extremidad anterior izquierda (flexor radial del carpo, flexor cubital del carpo, bíceps braquial y tríceps braquial) utilizando bolas de algodón desengrasado empapadas en etanol médico al 75%.
- Introduzca el electrodo de aguja para registro perpendicularmente en el vientre muscular, orientado ortogonalmente respecto a la dirección de las fibras musculares. Inserte una segunda aguja a 3–5 mm de distancia como electrodo de referencia e introduzca el electrodo de tierra en la base de la cola.
- Observe la actividad de inserción inmediatamente después de insertar la aguja. Una vez que los potenciales de inserción hayan desaparecido y el músculo esté completamente relajado, registre la señal EMG en reposo durante 1 minuto para cada rata.
NOTA: Mantenga un ambiente silencioso durante todo el registro y minimice las interferencias electromagnéticas externas. Las interferencias comunes incluyen ruido de frecuencia de red proveniente de corriente alterna y ruido de alta frecuencia procedente de otros equipos de laboratorio, que se manifiestan como ondas sinusoidales regulares superpuestas en los electromiogramas. Estas interferencias pueden reducirse mediante conexión a tierra, ajustes de filtros y manejo del entorno. - Retire cuidadosamente todos los electrodos de aguja y devuelva la rata a su jaula de alojamiento, permitiéndole recuperarse espontáneamente de la anestesia.
- Después de completar el registro EMG para cada rata, limpie los electrodos de aguja con etanol médico al 75% utilizando bolas de algodón desengrasado y séquelos completamente con gasa estéril para prevenir la contaminación cruzada.
7. Análisis de la marcha en ratas
NOTA: Realice el análisis de la marcha el primer día después de finalizar la intervención con acupotomía (día 15 posterior a la cirugía del modelo). El sistema de análisis de la marcha consta de una cinta rodante equipada con una correa transparente, una cámara digital de alta velocidad colocada debajo de la correa y una estación de trabajo informática.
- Coloque la rata sobre la cinta de la caminadora y permita que se aclimate libremente durante 3 min.
- Active la cinta de la caminadora y aumente gradualmente la velocidad desde 5,0 cm/s hasta que la rata exhiba una marcha estable sin comportamiento exploratorio.
- Obtenga un video de 10 s de la marcha de la rata desde una vista ventral (vista inferior) utilizando la cámara de alta velocidad.
- Tras completar la prueba para cada rata, limpie cuidadosamente la cinta de la caminadora y la cámara de prueba con etanol al 75 % para eliminar olores residuales que puedan afectar evaluaciones conductuales posteriores. Permita que la cinta se seque completamente antes de introducir la siguiente rata.
- Importe los videos grabados al software de análisis. Utilice el software para identificar la colocación de las patas de cada miembro y extraer una serie de parámetros de la marcha.
- Una vez finalizado el análisis automatizado, exporte los datos de los parámetros de la marcha para su posterior análisis estadístico.
- Incluya los siguientes parámetros de la marcha en el presente estudio: área impresa promedio de la pata delantera izquierda (el promedio del tamaño de la huella de la pata durante toda la fase de apoyo), área máxima de apoyo de la pata delantera izquierda (el tamaño máximo de la huella de la pata durante toda la fase de apoyo) y presión de apoyo de la pata delantera izquierda (que refleja la intensidad relativa de la presión de la pata durante la fase de apoyo según lo registrado por el sistema de análisis de la marcha).
NOTA: Obtenga tres secuencias válidas de la marcha para cada rata y utilice el promedio de las tres mediciones para el análisis.
8. Tinción con H&E de los tejidos de la raíz nerviosa
NOTA: Después de las pruebas conductuales en el día 15 postoperatorio tras la cirugía del modelo, recolecte muestras de tejido de la raíz nerviosa para tinción con HE.
- Anestesiar ratas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2% (0,3 mL/100 g) y realizar perfusión transcardíaca con paraformaldehído.
- Disecar las raíces nerviosas espinales C6–T1 e inmergir el tejido en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 48 h para la postfijación.
ADVERTENCIA: Manipular el paraformaldehído como un irritante en un ambiente bien ventilado o en cabina de gases químicos. - Lavar el tejido de la raíz nerviosa fijado bajo agua corriente durante 1 h para eliminar el fijador residual.
- Someter el tejido a deshidratación con etanol en gradiente, aclarar sucesivamente en xileno (I) y xileno (II), incluir en parafina y cortar con un grosor de 3–5 µm. Incubar los cortes a 65 °C.
- Desparafinar los cortes sucesivamente en xileno (I) y xileno (II), 8 min cada uno. Hidratar los cortes mediante una serie de etanol en gradiente (100% durante 15 min, 95% durante 5 min, 80% durante 5 min, 70% durante 3 min) e inmergir luego en agua destilada durante 2 min.
- Tincionar los cortes con solución de hematoxilina durante 5 s y luego lavar con agua corriente durante 2 min para eliminar el exceso de colorante.
- Diferenciar los cortes en agua destilada durante 30 s. Inmergir los cortes en etanol al 70% durante 10 s, seguido de etanol al 80% durante 10 s.
- Tincionar los cortes con solución de eosina durante 4 min, luego lavar bajo agua corriente para eliminar el colorante superficial. Deshidratar los cortes mediante etanol en gradiente (70% durante 10 s, 80% durante 10 s, 95% durante 10 s, 100% durante 160 s) y aclarar en xileno durante 4 min.
- Montar las laminillas con resina neutra.
- Examinar las alteraciones patológicas y morfológicas del tejido de la raíz nerviosa espinal bajo un microscopio óptico a un aumento de 400× y obtener imágenes microscópicas de campos objetivo representativos.
9. Análisis estadístico
- Realice análisis estadísticos utilizando el software SPSS. Exprese las variables continuas que se ajustan a una distribución normal como media ± desviación estándar.
- Bajo los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza, analice los umbrales mecánicos de retirada mediante un análisis de varianza de medidas repetidas, y analice los parámetros de la marcha mediante un ANOVA unidireccional. Realice comparaciones por pares post hoc entre grupos utilizando la prueba de Diferencia Mínima Significativa (LSD).
- Utilice pruebas no paramétricas si no se cumplen los supuestos de distribución normal o de homogeneidad de varianza.
- Considere que las diferencias son estadísticamente significativas cuando p < 0,05.
Resultados
Las evaluaciones del umbral mecánico de retirada (MWT) mostraron valores basales comparables en todos los grupos antes de la inducción del modelo. Al tercer día después de la modelización y la operación simulada, no se observó ninguna diferencia significativa entre el grupo simulado y el grupo control (p > 0,05). En contraste, tanto el grupo modelo como el grupo de acupotomía mostraron una reducción marcada del MWT en comparación con el grupo simulado (p < 0,01, Figura 4). Tras la finalización del tratamiento, el grupo de acupotomía mostró un aumento significativo del MWT en comparación con el grupo modelo (p < 0,05, Figura 4).
Las grabaciones de electromiografía (EMG) revelaron que en el día 3rd al día siguiente al modelado y a la operación simulada, se detectaron actividades espontáneas anormales, como potenciales de fibrilación y ondas positivas agudas, en reposo en el EMG con aguja de los grupos modelo y de acupotomía. En contraste, no se observaron descargas espontáneas anormales en los trazados de EMG con aguja en reposo de los grupos control o simuladoFigura 5). Si no están presentes potenciales espontáneos anormales en el lado afectado, sugiere que es posible que el modelo no haya dañado con éxito la raíz nerviosa objetivo, y es necesario revisar nuevamente el procedimiento quirúrgico.
El análisis de la marcha reveló que, tras la finalización del tratamiento, el área media de la huella, el área máxima de apoyo y la presión de apoyo en el grupo simulado no difirieron significativamente de los valores en el grupo control (p > 0,05). En contraste, todos los parámetros de la marcha se redujeron marcadamente en el grupo modelo en comparación con el grupo simulado (p < 0,001). En comparación con el grupo modelo, el grupo tratado con acupotomía mostró aumentos significativos en cada uno de estos índices de la marcha (p < 0,05, Figura 6). El área media de la huella es el promedio del tamaño de la huella durante toda la fase de apoyo. El área máxima de apoyo es el tamaño máximo de la huella durante toda la fase de apoyo. La presión de apoyo refleja la intensidad relativa de la presión de la pata durante la fase de apoyo, tal como fue registrada por el sistema de análisis de la marcha.
La tinción con HE del tejido de la raíz nerviosa cervical demostró que, en los grupos control y sham, la morfología del tejido nervioso aparecía esencialmente normal. Las fibras nerviosas y los cuerpos celulares neuronales se disponían de manera relativamente ordenada y compacta, con límites estructurales bien definidos y sin edema intersticial evidente. En contraste con el grupo sham, el grupo modelo exhibió alteraciones patológicas pronunciadas indicativas de lesión de la raíz nerviosa, caracterizadas por una disposición desorganizada y laxa de las fibras nerviosas y los cuerpos celulares, ruptura y deformación de un subconjunto de células neuronales, fragmentación parcial de las fibras y edema intersticial marcado. En comparación con el grupo modelo, el tratamiento con acupotomía mejoró notablemente estas lesiones patológicas, evidenciado por una alineación más regular de las fibras nerviosas y los cuerpos celulares, atenuación del edema intersticial y restauración parcial de la integridad estructural del tejido neural (Figura 7).
Figura 1: Diagrama del eje temporal del diseño experimental. Después de un período de adaptación alimenticia de 7 días, se establecieron los modelos de CS tanto en el grupo modelo como en el grupo de acupotomía de ratas. Al grupo simulado se le expuso la misma región de la médula espinal que al grupo modelo, pero sin la colocación del hilo de pescado. La intervención con acupotomía comenzó el día 4º después de la modelización exitosa en el grupo de acupotomía. Los umbrales de dolor mecánico de las ratas se midieron el día anterior a la modelización, el día 3 posoperatorio y al final de la intervención, el día 14 posoperatorio. La evaluación mediante electromiografía se realizó el día 3 posoperatorio para evaluar la compresión de la raíz nerviosa. El análisis de la marcha se llevó a cabo el día 15 posoperatorio, tras la intervención, para evaluar la función de coordinación motora de las ratas. Las muestras para detección se recogieron después de las pruebas conductuales el día 15 posoperatorio. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 2: Establecimiento del modelo de rata con CS. (A) Instrumentos quirúrgicos utilizados para la inducción del modelo. (B) Incisión cervical dorsal y disección del tejido. (C) Láminas vertebrales cervicales izquierdas C5–T1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procedimiento de la intervención con acupotomía. (A) Tabla de plástico utilizada para la restricción de la rata. (B) Ilustración esquemática de la restricción de la rata. (C) Puntos anatómicos superficiales correspondientes a los procesos espinosos C6 y C7 en ratas. (D) Representación esquemática del tratamiento con acupotomía en ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación del umbral de retirada mecánica entre los cuatro grupos experimentales de ratas (n = 6 por grupo). **p < 0,01 frente al grupo con operación simulada; #p < 0,05 frente al grupo modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Electromiogramas del miembro anterior en estado de reposo en los cuatro grupos experimentales tras la inducción del modelo. (A) Electromiograma del miembro anterior en el grupo modelo. (B) Electromiograma del miembro anterior en el grupo acupotomía. (C) Electromiograma del miembro anterior en el grupo control. (D) Electromiograma del miembro anterior en el grupo simulado. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 6: Comparación de los parámetros de la marcha entre los cuatro grupos experimentales de ratas (n = 6 por grupo). (A) Comparación del área promedio de la huella. (B) Comparación del área máxima de apoyo. (C) Comparación de la presión de apoyo. ***p < 0,001 frente al grupo con operación simulada; #p < 0,05 frente al grupo modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Tinción con HE de tejido de raíz nerviosa de los cuatro grupos de ratas experimentales a un aumento de 400×. (A) Tinción con HE del grupo control. (B) Tinción con HE del grupo simulado. (C) Tinción con HE del grupo modelo. (D) Tinción con HE del grupo acupotomía. Barra de escala = 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
La selección de un modelo animal adecuado es un requisito previo para elucidar la patogénesis de la espondilosis cervical (EC) y para evaluar rigurosamente las intervenciones terapéuticas. Actualmente, el método de sutura de nailon intravertebral se utiliza ampliamente debido a sus ventajas de relativa simplicidad, ciclo de modelado corto y alta reproducibilidad y fiabilidad15,20. En este enfoque, se implanta un material compresivo en el canal espinal de la rata para ejercer una compresión continua sobre las raíces nerviosas cervicales, recapitulando así la condición patológica de atrapamiento de la raíz nerviosa causada por hernia del disco intervertebral o hiperplasia osteofítica en entornos clínicos. Entre las lesiones secundarias asociadas con la espondilosis cervical, la compresión de la raíz nerviosa es la más común y constituye una causa principal de manifestaciones clínicas pronunciadas, que generalmente se presentan como dolor cervical, rigidez y síntomas irradiados en las extremidades superiores5,7,21. Por consiguiente, este estudio adoptó el método de sutura de nailon intravertebral para establecer un modelo de rata de EC y proporcionó un protocolo operativo visualizado para el establecimiento del modelo y la intervención con acupotomía en ratas con EC.
Tras la compresión de la raíz nerviosa, la isquemia local, las respuestas inflamatorias y la irritación mecánica pueden inducir tanto sensibilización periférica como central, conduciendo finalmente a la hiperalgesia22,23,24,25,26. Los hallazgos actuales demostraron una reducción marcada del umbral de dolor mecánico en la pata anterior ipsilateral de las ratas tras la inducción del modelo, lo que indica que el procedimiento provocó con éxito hiperalgesia mecánica. En las ratas que recibieron la intervención con acupotomía, el umbral mecánico de retirada se restauró significativamente, lo que sugiere que la liberación mediante acupotomía atenúa eficazmente el estado de sensibilización al dolor. El dolor no solo afecta los umbrales sensoriales, sino que también altera los patrones espontáneos de movimiento de los animales. Los sistemas de análisis de la marcha, al capturar parámetros espacio-temporales de las huellas de las patas durante la locomoción, permiten una cuantificación objetiva de las alteraciones compensatorias de la marcha inducidas por el dolor, superando así la marcada subjetividad inherente a los métodos tradicionales de puntuación conductual27. En este estudio, las ratas del grupo modelo mostraron una disminución del área media de la huella, del área máxima de apoyo y de la presión de apoyo de la pata anterior ipsilateral, lo que refleja un comportamiento de evitación de carga y cambios protectores en la marcha secundarios al dolor. En contraste, las ratas sometidas a la intervención con acupotomía mostraron una tendencia hacia la normalización de estos parámetros de la marcha, lo que indica que el tratamiento con acupotomía, además de aliviar el dolor, también mejora la coordinación locomotora. Las observaciones histomorfológicas revelaron asimismo diferencias entre grupos en la disposición y morfología de las fibras nerviosas y los cuerpos celulares neuronales dentro de la raíz nerviosa, así como en el grado de edema intersticial. Estos hallazgos sugieren que la terapia con acupotomía podría atenuar las alteraciones patológicas de la raíz nerviosa.
La compresión de la raíz nerviosa no solo induce alteraciones en la conducción sensorial, sino que también puede provocar desinervación o hiperexcitabilidad anómala de la musculatura inervada. La electromiografía (EMG), al registrar la actividad eléctrica espontánea (como potenciales de fibrilación y ondas positivas agudas) en un músculo completamente relajado, proporciona un indicador sensible de la excitabilidad sarcolemal anormal secundaria a una lesión neurogénica y constituye una modalidad electrofisiológica fundamental para evaluar las radiculopatías tanto en entornos clínicos como experimentales28,29,30. Bajo condiciones fisiológicas, un músculo completamente relajado presenta silencio eléctrico, sin presencia de descargas espontáneas. En este estudio, se detectaron descargas espontáneas pronunciadas en los músculos en reposo de la extremidad anterior ipsilateral en ratas tras la inducción del modelo. Esta actividad EMG anormal en reposo es una manifestación característica del daño neurogénico y sugiere que las raíces nerviosas cervicales de estas ratas podrían estar sometidas a una compresión sostenida31. Los hallazgos EMG anormales en los grupos modelo y de acupotomía tras la inducción del modelo confirmaron además el establecimiento exitoso del modelo de ratas con EC desde una perspectiva electrofisiológica.
Para evitar que los efectos acumulativos de la anestesia repetida afecten las evaluaciones conductuales, la intervención con acupotomía en este estudio se realizó utilizando un aparato de inmovilización en animales despiertos32. Informes previos han demostrado que un entrenamiento adecuado de habituación y exposiciones repetidas pueden atenuar notablemente las respuestas al estrés inducidas por la inmovilización33,34,35,36. Esto sugiere que el entrenamiento de habituación antes de la intervención en este protocolo puede minimizar eficazmente la interferencia del estrés agudo por inmovilización en los indicadores experimentales.
Este estudio no está exento de limitaciones. En primer lugar, el método de sutura de nailon intravertebral reproduce principalmente una compresión mecánica aguda o subaguda, mientras que la mielopatía cervicobraquial humana suele seguir un curso crónico degenerativo. En segundo lugar, aunque el protocolo de inmovilización actual fue diseñado para minimizar el estrés, investigaciones futuras deberían evaluar biomarcadores relacionados con el estrés, como el cortisol sérico, para evaluar de manera más completa el impacto del dispositivo de inmovilización.
En conclusión, este estudio proporciona un procedimiento operativo detallado para establecer un modelo de rata de CS y posteriormente tratarlo con acupotomía. Los resultados indican que la liberación mediante acupotomía eleva significativamente los umbrales de dolor mecánico, mejora los patrones de marcha evitativos del dolor y atenúa las alteraciones patológicas de la raíz nerviosa. Este trabajo proporciona así un marco experimental sistemático y práctico para elucidar los mecanismos subyacentes a la terapia con acupotomía en el tratamiento de CS.
Divulgaciones
Todos los autores han declarado que no existen conflictos de intereses potenciales.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (número de concesión 2023YFC3502703) y por el Proyecto Clave del Fondo Conjunto de Innovación y Desarrollo de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hubei (número de concesión 2024AFD271).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| jeringa de 0,5 mL | Hebei Yunsheng Biotechnology Co., Ltd | SN-04442 | |
| jeringa de 1 mL | Shanghai Zhiyu Medical Equipment Co., LTD | ZSQ-1 | |
| Sutura 4-0 con aguja, de un solo brazo (4×12) | GLASS | JZZSX193 | |
| alcohol al 75 % | Shandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTD | 75-500ml | |
| Aguja de acupuntomía | Beijing Huaxia Blue Chip Biotechnology Co., Ltd. | HY0440 | |
| portaobjetos adhesivo | CITOTEST | 188105 | |
| Sistema de adquisición y análisis de señales biológicas | Techman | BL-420N | |
| Sistema de adquisición y análisis de señales biológicas (software) | Techman | BL-420N Versión 3.0.0.237 | |
| cubreobjetos | Citotest Labware Manufacturing Co.,Ltd | 10212432C | |
| Deshidratador | DIAPATH | Donatello | |
| Balanza electrónica | Mettler-Toledo | ME203E/02 | |
| Horno de secado electrotermal por aire forzado | Labotery | GEL-70 | |
| Máquina de inclusión | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Líquido transparente ecológico para desparafinado | Servicebio | G1128-1L | |
| Pinzas de acero inoxidable negras seguras contra descargas electrostáticas (punta curva) | solomen | ESD-15 | |
| Etanol | SCRC | 100092683 | |
| bola de algodón libre de grasa | Caoxian Hualu Sanitary Material Co. LTD | TZMQ-500 | |
| Kit de tinción constante de hematoxilina-eosina (HE) HD | Servicebio | G1076 | |
| Pinzas hemostáticas | solomen | B0557 | |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corporation | Versión 22.0 | |
| Sistema de imágenes | Nikon | NIKON DS-U3 | |
| Yodóforo | Shandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTD | DF-500 | |
| Isoflurano | RWD life science | R510-22-10 | |
| Guantes de látex | Beijing Ruijing Latex Products Co. LTD | RJJC-S | |
| Dispositivo mecánico para prueba de punción de pata | Kew basis | KW-CT-1 | |
| Pinzas médicas | AIZANCHENG | AZN00008 | |
| Pinzas hemostáticas de mosquito | Servicebio | QX1310D | |
| Goma neutra | SCRC | 10004160 | |
| Solución salina normal | SHIMEN | SLYS-500ml | |
| Tijeras oftálmicas | solomen | B0754 | |
| Líquido de parafina | Macklin | 8012-95-1 | |
| Fijador de paraformaldehído (neutro) | Servicebio | G1101 | |
| Cortador de patología | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| Penicilina G sódica para inyección | Jilin Huamu Animal Health Product Co., Ltd. | Número de aprobación de medicamento veterinario 070011248 | |
| Solución de poli-L-lisina | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R23126-50ml | |
| Afeitadora para roedores | solomen | B1564 | |
| Sistema de imagen y análisis de la marcha en roedores | Clever | TreadScan; BCamCapture | |
| Sistema de imagen y análisis de la marcha en roedores (software) | Clever | TreadScan Versión 4.00; BCamCapture Versión 3.00 | |
| Ratas SD | Beijing Sibefei Biotechnology Co., Ltd | A102 | |
| Máquina de anestesia para animales pequeños | YuYAN | ABM | |
| Esterilizador por vapor (autoclave) | Yamato | SQ810C | |
| Cuchilla quirúrgica | solomen | B1177 | |
| Mascarilla quirúrgica | winner | WJKZ-1 | |
| Portaagujas quirúrgico | solomen | B0772 | |
| Tijeras quirúrgicas | GLASS | JZZSX-ZC544R | |
| Espátula para tejidos | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | |
| Sistema de pulido de agua ultrapura | Aiken water El | AK-RO-C2 | |
| Fijador universal para tejidos (neutro) | Servicebio | G1101-15ML | |
| Microscopio óptico vertical | Nikon | NIKON ECLIPSE E100 | |
| Xileno | SCRC | 10023418 |
Referencias
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