Estabilización de proteínas y condensados de ARN en hidrogeles de agarosa de baja fusión para mediciones biofísicas cuantitativas

Resumen

Aquí presentamos un método robusto para inmovilizar físicamente condensados separados en fase líquido-líquido dentro de una matriz porosa de hidrogel de agarosa de baja fusión sin alterar su dinámica interna de líquidos. El enfoque minimiza la sedimentación de gotas, la coalescencia y los artefactos de humectación superficial, permitiendo imágenes reproducibles y análisis biofísicos cuantitativos durante períodos de horas.

Resumen

Los condensados biomoleculares formados por separación de fases líquido-líquido son cada vez más reconocidos como unidades organizativas fundamentales de la célula, con funciones que van desde el procesamiento de ARN hasta el ensamblaje de gránulos de tensión. La reconstrucción in vitro de dichos condensados utilizando proteínas purificadas y ARN proporciona sistemas modelo, pero las gotas líquidas se engrosan, sedimentan y se dispersan en las superficies con el tiempo, introduciendo una variabilidad significativa en las mediciones cuantitativas a lo largo de los tiempos experimentales. Incrustar estos condensados en un hidrogel escaso, ópticamente transparente y químicamente inerte—aquí preparado a partir de agarosa de baja fusión (LMA) a 0,3–1,0% p/v—estabiliza las gotas en tres dimensiones, permitiendo el uso de metodologías con tiempos de medición más largos o montajes experimentales con mediciones repetidas. Este artículo presenta un protocolo detallado y paso a paso para la preparación de stocks de LMA, formación de gotas e incrustación, y proporciona ejemplos de lecturas biofísicas específicas posteriores. También mostramos que propiedades específicas de las gotas, como la difusión molecular, se preservan tras la incrustación de LMA en los sistemas representativos probados. Dado que el método es compatible con microscopía confocal, de campo amplio o de superresolución, recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo o espectroscopía de resonancia magnética nuclear, entre otros, puede apoyar la caracterización cuantitativa de condensados biomoleculares relevantes en salud y enfermedad.

Introducción

La separación en fase líquido-líquido (LLPS) impulsa la formación de orgánulos sin membrana y condensados biomoleculares en las células, incluyendo los gránulos de tensión, los cuerpos P y el nucleolo 1,2,3,4,5. Estos condensados concentran proteínas y ácidos nucleicos específicos manteniendo un intercambio rápido con el citoplasma o nucleoplasma circundante, una característica distintiva del comportamiento similar al^líquido 1,2,3,4,5. La desregulación de la LLPS se ha relacionado con diversas enfermedades, como los trastornos^{neurodegenerativos 3,6,7}, y también está implicada en la replicación de varios virus, como el SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12.

La reconstitución in vitro de condensados utilizando proteínas purificadas y ARN bajo condiciones de tampón definidas se ha convertido en un enfoque fundamental para estudiar los mecanismos^{LLPS 3,4}. Sin embargo, las gotas en un tubo de ensayo o sobre una superficie de vidrio son susceptibles a tres artefactos principales: (i) sedimentación gravitatoria, que provoca la acumulación de gotas en el fondo; (ii) coalescencia, donde las gotas se fusionan con el tiempo en estructuras menos grandes y más grandes; y (iii) humectación superficial, donde las gotas se dispersan y adsorben parcialmente sobre el abrigo. Estos fenómenos reducen la reproducibilidad de las mediciones cuantitativas y dificultan el seguimiento de gotas individuales en sus dimensiones fisiológicamente^{relevantes 13}. Estos fenómenos limitan aún más el uso de métodos que requieren tiempos de medición extendidos de minutos a horas (por ejemplo, espectroscopía de resonancia magnética nuclear [RMN] o técnicas de microscopía de superresolución como STORM) y prohíben mediciones repetidas en escalas de tiempo extendidas.

La inmovilización física dentro de una red de hidrogel aborda los tres artefactos simultáneamente. La agarosa forma un gel físicamente reticulado a temperaturas inferiores a 34–38 °C. A concentraciones de 0,3–1,0% w/v, el tamaño de la malla de la agarosa es lo suficientemente grande como para encapsular gotas intactas a escala micrométrica, manteniéndose lo suficientemente poroso como para no dificultar la dinámica molecular^{intra-gota 13}. Además, la porosidad de la matriz de agarosa permite la difusión de macromoléculas y pequeñas moléculas dentro y fuera de las gotas incrustadas. Para sistemas particularmente sensibles a la temperatura que involucran proteínas con dominios plegados o que siguen una separación de fases tipo UCST/LCST (temperatura de solución crítica superior/inferior), se puede usar agarosa de baja fusión (LMA) con un punto de gelificación de 26–30 °C. Enfoques alternativos anti-humectantes, como la pasivación superficial, pueden reducir la adhesión del condensado y, por tanto, el humectamiento, pero a menudo requieren una preparación especializada y no evitan la sedimentación de gotas ni la coalescencia. En cambio, la incrustación de agarosa proporciona un método sencillo y ampliamente accesible para inmovilizar espacialmente condensados. Es importante destacar que se ha validado la agarosa para no alterar el estado conformacional de la fusión en el sarcoma (FUS) y otras proteínas de unión al ARN al formarse gotas hasta concentraciones de agarosa del 1,0% w/^{v 13}. Este protocolo estandariza el enfoque de incrustación de agarosa para uso general con muchos sistemas de proteína separadora de fase o proteína-ARN de interés, proporcionando orientación paso a paso para la preparación de reactivos y la preparación de muestras.

Protocolo

1. Preparación de la planta de agarosa

IMPORTANTE: Prepara la base de agarosa en el mismo tampón que se utiliza para fabricar las muestras separadas por fase (en adelante llamada "tampón de gotas") para evitar desajustes de tampón¹⁴. Ejemplo: La muestra de nucleocapsid se prepara en el tampón A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), que también debe usarse para preparar el stock de agarosa.
NOTA: Las condiciones experimentales finales, que incluyen, pero no se limitan a, composición del tampón, concentración de proteínas, uso de aditivos y volúmenes finales de muestra, dependen en gran medida del sistema biológico específico bajo investigación y de la aplicación posterior específica. Del mismo modo, los parámetros de adquisición, la configuración del instrumento y el análisis de datos dependen en gran medida de la muestra y del experimento específico. Por ejemplo, la preparación del nucleocápside SARS-CoV-2 con poly(A) se describe en la Figura 1A (microscopía de fluorescencia confocal).

1. Pesa la cantidad adecuada de LMA o agarosa normal en un tubo de 1,5 mL que contenga un tampón de gotas. Ejemplo: Para un fondo al 2% en mano/v, disuelve 20 mg de agarosa en 1 mL de tampón A.
   NOTA: La concentración final de agarosa debe ser del 1–2% p/v, dependiendo de la concentración final deseada en la muestra. No se recomienda superar el 2% de peso y vapor, ya que cada vez es más difícil pipetear. Corta el extremo estrecho de la punta de la pipeta para facilitar el pipeteo, especialmente con porcentajes altos de agarosa. Consulta la sección de discusión para determinar si es necesario usar LMA o agarosa regular para las muestras.
2. Calienta la calza de agarosa a 80–90 °C en un bloque calefactor o baño maria y disuelve completamente la agarosa mediante vórtice (tarda aproximadamente 10 minutos).
   PRECAUCIÓN: La agarosa fundida es caliente. Maneja con cuidado.
3. Equilibrar el stock de agarosa a 37 °C (LMA) o 55 °C (agarosa regular) en el bloque calefactor o baño marea. Verifica que la solución se mantenga clara y líquida a esta temperatura. Verifica la temperatura de la culata de agarosa con un termómetro si es necesario.
   PUNTO DE PAUSA: Las plantas de agarosa fundida pueden mantenerse calientes durante 30–60 minutos.
   Se recomienda encarecidamente calentar la agarosa en baño maria para asegurar un calentamiento más homogéneo y mantener la temperatura objetivo con suficiente precisión. Esto es especialmente importante al trabajar con LMA, ya que pequeñas desviaciones de temperatura pueden causar una gelificación prematura.
4. Tras la preparación de la muestra (sección 2), almacenar los stocks de agarosa sobrantes a +4 °C. Sigue los pasos 1.2 y 1.3 anteriores para volver a fundir y reequilibrar la culata de agarosa antes de su uso.
   NOTA: Recomendamos mantener el fondo de agarosa durante un máximo de 2 semanas a +4 °C y someterlo a no más de 2–3 ciclos de solidificación/fusión. Utiliza buenas prácticas de fabricación para evitar la contaminación. Desecha las culatas antes si no se funden o no se solidifican de nuevo, o si se produce contaminación visible.

2. Preparación de muestras

1. Precalienta todos los materiales que entren en contacto directo con la agarosa (por ejemplo, puntas de pipeta, tubos, portaobjetos de microscopía) a aproximadamente 37 °C colocándolos sobre el bloque calefactor o en una incubadora durante 2–3 minutos.
2. Prepare la culata de agarosa según lo indicado en la Sección 1.
3. Preparar el tampón de gotas, los componentes separadores de fase (por ejemplo, reservas de proteínas o ARN) y cualquier otro aditivo (por ejemplo, agentes de apiñamiento, colorantes) para las muestras según el protocolo estándar. Equilibra a temperatura ambiente (RT). Ejemplo: Stock de proteína A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), stock de proteína nucleocápside (60 μM, en el tampón A), stock de poli(A) (30 μM, en el tampón A).
   NOTA: Para la recuperación de fluorescencia tras el fotoblanqueamiento (FRAP), la microscopía de fluorescencia confocal o la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), añadir una pequeña fracción de proteína o ARN marcado fluorescentemente a las reservas de proteína o ARN, respectivamente (recomendado: fracción marcada del <5%).
4. Calcula los volúmenes de tampón de gotas, stock de agarosa, los componentes separadores de fase (por ejemplo, proteína o ARN de interés) y cualquier aditivo suplementario (por ejemplo, agentes de apiñamiento) necesario para la muestra. Ejemplo: 6 μL de tampón A, 5 μL de stock de agarosa al 2% (0,5 final de cristal), 5 μL de proteína nucleocápside (15 μM final), 4 μL de poly(A) (6 μM finales). Volumen final 20 μL.
   NOTA: Aunque depende mucho del plato, tubo, placa u otro recipiente utilizado para el experimento, los volúmenes comúnmente usados son 150 μL para un tubo de RMN de 3 mm, 20 μL para experimentos de microscopía o FRAP en una portaobjetos de microscopía de 6 canales, y 20–30 μL para experimentos STORM en portaobjetos de microscopía de 18 pozos (véase la Tabla de Materiales).
   1. Como valores iniciales, se utiliza agarosa final del 0,3–0,5% en peso y en peso y en valor para ensayos biofísicos estándar y entre 0,8 y 1,0 % en mano/v para estabilización a largo plazo (por ejemplo, experimentos de envejecimiento).
      NOTA: Para la estabilización y almacenamiento a largo plazo de las muestras, deben tomarse medidas para evitar la deshidratación de la muestra (por ejemplo, sellar el recipiente de la muestra, almacenarlo en una cámara humidificada y añadir una barrera de evaporación) y asegurar que la composición y el pH del tampón se mantengan estables durante incubaciones prolongadas.
   2. Para muestras de RMN, añade el 5% final de D2O v/v a la muestra para el bloqueo.
      NOTA: La concentración de todos los demás componentes y el volumen total de la muestra dependen en gran medida de la aplicación específica y del montaje experimental.
5. Añadir los volúmenes correspondientes de tampón, componentes separadores de fase, culata de agarosa y aditivos en un tubo precalentado de 1,5 mL.
   NOTA: Recomendamos añadir primero el tampón y la agarosa, seguido de cualquier aditivo adicional. Además, recomendamos añadir los componentes separadores de fase al final para desencadenar la formación de condensados. Sin embargo, el orden óptimo de mezcla depende del sistema y debe determinarse de antemano. Esto es especialmente relevante para sistemas en los que la estequiometría y el orden de adición pueden influir fuertemente en el tamaño de las gotas o la compartimentación. Ejemplo: El orden de mezcla para la muestra de nucleocápside es primero el Buffer A, el segundo stock de agarosa, la tercera proteína nucleocapsídea y el último poly(A), usando los volúmenes indicados en el Paso 2.4. En esta muestra, LLPS se activa mediante la adición de poly(A). Para sistemas en los que LLPS produce turbidez visible, la turbidez puede servir como indicador cualitativo de control de calidad; sin embargo, el tiempo de inicio y la visibilidad dependen del sistema, y la falta de turbidez inmediata no indica por sí sola un fallo del protocolo.
   1. Mantén el tubo en el bloque calefactor o baño de agua mientras pipeteas varias veces. Evita introducir burbujas de aire.
      NOTA: Mientras la agarosa sigue líquida, las gotas pueden fusionarse. Por ello, variar el tiempo de preincubación en el bloque calefactor o en un baño maria antes de iniciar la gelificación puede ser una herramienta útil para investigar gotas de diferentes tamaños. Caracterizar la cinética de crecimiento de gotas en ausencia de agarosa antes de seleccionar el intervalo de tiempo previo a la incubación permite a los investigadores seleccionar de forma reproducible un rango específico de tamaño de gotas.
6. Para microscopía / muestras FRAP:
   1. Utiliza una pipeta normal para transferir rápidamente la muestra dentro/sobre la lámina de microscopía que prefieras (por ejemplo, lámina de microscopía de canal con fondo de cubierta).
   2. Permite la gelificación en RT durante 5–10 minutos (véase la nota en la sección de discusión).
      NOTA: No mueva la lámina de microscopía durante este periodo. Protege las muestras fluorescentes de la luz.
   3. Mide la muestra según el protocolo estándar. Ejemplo: microscopio confocal de disco giratorio, objetivo de aceite apo plano 100x 1,45, longitud de onda de excitación 561 nm para tinte Cy3, adquisición de 100 ms al 30% de potencia láser (Cy3) y 50 ms a 6% de intensidad de luz (campo brillante). Para FRAP: región de lejía de 1/10^{de parte} del diámetro de la gota colocada en el centro de la gota, 25 fotogramas de predecoloración (adquisición sin demora), 60 fotogramas post-decoloración (tomados en intervalos de 1 s), pulso láser para blanquear 15 ms al 70% de potencia láser. Analizar la recuperación FRAP mediante normalización a gran escala en software de acceso abierto; informa de los parámetros de ajuste cinético solo si se realiza el ajuste.
7. Para muestras de STORM:
   1. Utiliza una pipeta normal para transferir rápidamente la muestra al portaobjetos STORM que prefieras (por ejemplo, portaobjetos de cámara de 18 pozos con fondo de cobertura). Dispensa la muestra en forma de gota.
   2. Permite la gelificación en RT durante 5–10 minutos (véase la nota en la sección de discusión).
      NOTA: No mueva la lámina de microscopía durante este periodo. Protege las muestras fluorescentes de la luz.
   3. Llena todo el pozo con el buffer STORM. Sella el pozo según el protocolo estándar.
   4. Equilibrar la muestra durante al menos 1–2 horas antes de la medición para permitir que el tampón STORM se difunda en el hidrogel de agarosa.
      NOTA: La difusión exitosa del buffer STORM en la muestra puede verificarse fácilmente si los tintes fluorescentes parpadean durante la adquisición de STORM. Dependiendo de las especificaciones de la muestra, pueden ser necesarios tiempos de equilibrio más largos.
   5. Mide la muestra según el protocolo estándar utilizado. Ejemplo: microscopio invertido Ti2, SR apocromático TIRF 100x 1,49 objetivo de aceite, iluminación fina muy inclinada. Adquisición de 20.000 fotogramas por muestra, campo de visión de 64 x 64 píxeles, tiempo de exposición de 10 ms con un láser de 125 mW de 647 nm para tinte Cy5, y uso de un láser de 20 mW de 405 nm para ayudar en la transición del estado oscuro de larga duración al estado fundamental. Las imágenes se procesaron usando estimación de máxima verosimilitud con ajuste multiemisor. Se aplicó corrección por deriva, y solo se incluyeron puntos de datos con precisión de localización de 25 nm o superior en la visualización final. Las imágenes finales se producen utilizando el método de histogramas desplazados medios a una ampliación de 20x (1 píxel = 8 nm en la imagen final).
8. Para muestras de RMN:
   1. Utiliza una pipeta larga y fina de cristal (precalentada) para transferir rápidamente la muestra al tubo de RMN. Dispensa la muestra en el fondo del tubo.
   2. Permite la gelificación en RT durante 5–10 minutos (véase la nota en la sección de discusión).
      NOTA: No agites el tubo de RMN durante este periodo.
   3. Mide la muestra según el protocolo estándar utilizado. Ejemplo: intensidad de campo de RMN 750 MHz con sonda PATXI a temperatura ambiente, tubo de 3 mm, adquisición a 25 °C, secuencia estándar de pulsos (stebpgp1s19) para experimentos de difusión (DOSY), parámetros: 4.096 puntos con 32 escaneos, intensidad de gradiente 2–95%, tiempo de difusión 0,08 s, pulso de gradiente 12 ms, retardo de relajación (d1) 5 s.

Resultados

El protocolo se aplicó a condensados formados por el dominio N-TERMINAL FUS (FUS NTD) o por la proteína nucleocápside (N) del SARS-CoV-2 con ARN poli(A) o s2m como ejemplos representativos tanto de gotas solo proteicas como de ARN proteínico. Para evaluar si la agarosa afecta detectablemente a la formación de condensados bajo las condiciones probadas, formamos gotas con la proteína N y el poli(A) en presencia y ausencia de LMA del 0,5% en forma y diferencia. Dado que la LMA se solidifica tras aproximadamente 5 minutos en RT, registramos imágenes de microscopía de fluorescencia en este momento y observamos que las gotas tenían un tamaño similar en ambos casos (Figuras 1A,B). Para demostrar el efecto preventivo de la agarosa en la humectación y fusión de gotas, registramos otro conjunto de imágenes 60 minutos después de la preparación de la muestra. Aunque las gotas incrustadas en agarosa no cambiaron de tamaño, los condensados en ausencia de LMA mostraron un aumento drástico de tamaño debido a la fusión y la humectación superficial (Figura 1A,B). Aunque incrustamos las gotas relativamente pronto después de la nucleación, se pueden incrustar gotas de diferentes tamaños variando el tiempo de incubación previa a la incrustación. A pesar de incrustar las gotas en el hidrogel de agarosa, la dinámica del condensado medida no se alteró de manera detectable. La recuperación FRAP y, por tanto, la aparente difusión de gotas fueron muy similares con y sin LMA en la muestra (Figura 1C). Además, experimentos previos con espectroscopía RMN ordenada por difusión (DOSY) con condensados FUS NTD han demostrado que las tasas de difusión no fueron detectables influenciadas por la concentración de agarosa, al menos en el rango de 0,25–1% w/v (Figura 1D) (adaptado de Emmanouilidis et ^al.13). Estos resultados demuestran que un hidrogel de agarosa es adecuado para atrapar condensados separados en fase en el espacio y el tiempo, permitiendo mediciones repetidas durante períodos de tiempo prolongados.

Aunque tanto las mediciones por microscopía como por FRAP se registran bastante rápido (de segundos a minutos), algunos experimentos requieren varios minutos (por ejemplo, STORM, RMN ^{1D 1}H) o incluso horas (por ejemplo, RMN 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR) para adquirirse. Para estos experimentos, es crucial que las gotas permanezcan estacionarias durante toda la adquisición y no sedimenten con el tiempo. Aquí mostramos que estabilizamos las gotas de proteína N + ARN s2m en LMA durante el tiempo suficiente para adquirir imágenes STORM (Figura 1E). Además, los espectros de RMN de las gotas de DTN de FUS en presencia y ausencia de agarosa tenían anchos de línea comparables, lo que sugiere que no hay interacción detectable entre los hidrogeles de agarosa y la proteína bajo estas condiciones (Figura 1F) (adaptado de Emmanouilidis et ^al.13). En cambio, los espectros de condensados incrustados en agarosa mostraron una mayor intensidad de señal, probablemente porque gotas no estabilizadas sedimentadas en el tubo de RMN durante la adquisición ya no estaban disponibles para su medición (Figura 1F) (adaptada de Emmanouilidis et ^al.13). En conclusión, la estabilización de condensados en hidrogeles de agarosa no solo permite experimentos con curso temporal, sino que también permite el uso de metodologías con tiempos de adquisición extendidos, preservando al mismo tiempo las propiedades de gotas medidas en los sistemas representativos probados.

Figura 1: Estabilización de condensados mediante incrustación de agarosa sin perturbar detectablemente las propiedades de las gotas medidas. (A) Microscopía de fluorescencia de la proteína nucleocápside de 15 μM con 6 μM de Cy3-poli(A) (5% marcado) en el tampón A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2) en presencia (+ agarosa) o ausencia (sin agarosa) de 0,5% de LMA en forma de año. Las imágenes se adquirieron 5 o 60 minutos después de mezclar o incrustar agarosa. Las imágenes representan 7 imágenes adquiridas en n = 2 experimentos independientes. Barra de escala = 5 μm. (B) Cuantificación de los radios de gotas de los condensados mostrados en (A). Los datos se muestran como diagramas de caja (caja = rango intercuartílico, línea central = mediana, bigotes = rango de datos restantes, punto = valores atípicos). El radio medio ± desviación estándar (SD) y el número de gotas analizadas en cada condición se muestran directamente en el gráfico. Los datos siguen una distribución normal. Las gotas individuales no se trataron como réplicas biológicas independientes para la inferencia estadística. No se realizó ninguna prueba estadística; las distribuciones se muestran de forma descriptiva. (C) FRAP de las gotas mostradas en (A) en el punto de tiempo 5 minutos. El fotoblanqueo se realizó con el láser de 561 nm (Cy3). Los datos muestran la intensidad normalizada (media ± sd de n = 3 réplicas independientes por condición), que se obtiene normalizando la señal blanqueada a los valores previos al blanqueador, una zona no blanqueada de la misma muestra y la fluorescencia de fondo. (D) Señal DOSY no atenuada de 200 μM FUS NTD proteína en el tampón B (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM urea, pH 7,3) en presencia de 0,25, 0,5 o 1,0% w/v de agarosa regular. N = 1. (E) Microscopía de fluorescencia confocal e imágenes STORM de la proteína nucleocapsídea Cy5 de 15 μM (marcada al 5%) con ARN viral S2M de 6 μM en el tampón A que contiene 0,5% en peso y peso del LMA. Representativo de n = 3 experimentos independientes. Barra de escala = 1 μm en ambas imágenes. (F) espectros RMN 1D ¹H (izquierda) y espectros NMR 2D [¹⁵N ¹H] hsqc (derecha) de 200 μM FUS NTD en el buffer B en presencia o ausencia de 0,5% de agasosa regular w/v. N = 1. Los paneles (D) y (F) se reproducen de Emmanouilidis et ^al.13. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

El éxito de la incrustación de condensados biomoleculares en agarosa depende de varios factores. Primero, la agarosa debe mantenerse a temperaturas lo suficientemente altas para evitar la gelificación prematura y, al mismo tiempo, lo suficientemente bajas para no alterar estructuras biomoleculares o interacciones. La agarosa de fusión baja tiene un punto de gelificación de 26–30 °C y un punto de fusión de 60–65 °C, mientras que la agarosa regular tiene un punto de gelificación de 34–38 °C y un punto de fusión de 90–95 °C. En segundo lugar, la mezcla rápida y la transferencia al recipiente final de reacción (por ejemplo, el tubo de RMN) son críticas, ya que pequeñas desviaciones en el tiempo o la temperatura pueden provocar incrustaciones desiguales y, por tanto, una reproducibilidad comprometida.

A pesar de estos puntos críticos, el método puede adaptarse fácilmente a diferentes necesidades experimentales. Para sistemas de separación de fase con proteínas intrínsecamente desordenadas o sistemas que no son propensos a la desnaturalización térmica, se puede usar agarosa regular en lugar de LMA para ahorrar costes. Al preparar muestras que contienen proteínas con dominios plegados, o cualquier otra (bio-)molécula sensible a la temperatura propensa a la desnaturalización térmica, debe utilizarse LMA para evitar la desnaturalización. Se puede preparar una muestra de control solo por calor/sin agarosa para separar los efectos de la incrustación de agarosa de los efectos del calentamiento transitorio de la muestra. Para reducir el riesgo de esos efectos de desnaturalización dependientes de la temperatura, la agarosa de baja fusión es especialmente adecuada para muestras sensibles a la temperatura, mientras que la concentración de agarosa puede ajustarse para modular el tamaño de la malla y el grado de confinamiento mecánico. Para mediciones de difusión altamente sensibles, como el método de RMN desarrollado recientemente llamado LLPS REDIFINE^15,16, la concentración de agarosa más baja que previene la sedimentación suele ser preferible, típicamente entre 0,3 y 0,5% en peso y volta. Para experimentos de maduración que requieren semanas o meses de estabilidad, se prefere entre 0,8 y 1% w/v. Estos parámetros deben optimizarse para asegurar una estabilización efectiva sin alterar detectablemente la morfología o dinámica del condensado y siempre deben adaptarse al sistema específico. Esta validación requiere la comparación de muestras con y sin incrustación de agarosa (y condiciones idénticas en otros aspectos) o comparación de diferentes concentraciones de agarosa (para excluir efectos de malla dependientes de la concentración), por ejemplo, el uso de microscopía para evaluar la morfología de las gotas, FRAP para evaluar la difusión o cualquier otro método adecuado para evaluar propiedades de las gotas importantes para el investigador.

El tiempo de gelificación es otra consideración importante. El tiempo que tarda la agarosa en solidificarse depende de varios factores, como el tipo de tampón, el pH, la concentración final de agarosa, la temperatura inicial y si se utiliza agarosa de baja fusión o regular. Normalmente, la agarosa se solidifica en 5–10 minutos. La gelificación del fondo de agarosa puede utilizarse como indicación de la gelificación de la muestra. De manera similar, variar los tiempos de preincubación antes de la incrustación de agarosa permite caracterizar reproduciblemente diferentes tamaños de gotas. La elección del buffer también es crítica¹⁴. Es vital que el material de agarosa se prepare en el mismo tampón utilizado para preparar las muestras y así evitar desajustes en el tampón. El buffer debe ser uno en el que el sistema se sepa que se separa de fase.

Se debe tener en cuenta la sensibilidad a la temperatura para cada sistema. Muchos sistemas de separación de fase presentan un comportamiento de fase termorreversible, conocido como LLPS tipo UCST/LCST. Por lo tanto, una exposición breve a temperaturas ligeramente elevadas durante la mezcla de agarosa debe validarse para asegurar que no altere el comportamiento de las fases ni las propiedades de las gotas medidas. Si surgen problemas, normalmente pueden abordarse refinando las condiciones de temperatura, minimizando el tiempo de manipulación o ajustando la concentración de agarosa. Por ejemplo, aunque el stock LMA idealmente se calienta a 37 °C, los stocks LMA seguirán siendo líquidos a 33–35 °C.

La resolución de problemas es importante porque pueden surgir diferentes modos de fallo dependiendo de la muestra y la configuración experimental. Si las gotas se disuelven al mezclarse con agarosa, esto puede deberse a que la LMA esté demasiado caliente o a un desajuste del buffer. En este caso, el stock de LMA debe mantenerse exactamente a la temperatura objetivo o unos grados por debajo de la temperatura objetivo, y prepararse en un tampón idéntico a la proteína/ARN de interés. Si se produce una gelificación prematura en la punta de la pipeta, puede deberse a que la LMA está demasiado fría o a que las puntas no están precalentadas. Para evitar esto, las puntas y tubos deben calentarse previamente a 37 °C, el operador debe trabajar rápidamente y el bloque calefactor debe mantenerse a la temperatura objetivo. Si el moje, la coalescencia o la sedimentación ocurren con el tiempo, puede deberse a que el gel es demasiado escaso o a una gelificación desigual. En este caso, la concentración de LMA puede aumentarse, e incluso se debe garantizar la gelificación a temperatura ambiente. Si la solución de agarosa contiene partículas visibles, puede deberse a una disolución incompleta de agarosa. En este caso, la agarosa debe calentarse hasta que sea completamente transparente y mezclarse bien antes de usarla (por ejemplo, en vórtice). Si se introducen burbujas de aire durante la mezcla o pipeteo, estas pueden interferir con la imagen y provocar una distribución desigual del condensado. Para minimizar la formación de burbujas, las soluciones deben mezclarse suavemente pipeteando lentamente arriba y abajo. Si se observa una gelificación heterogénea o una distribución desigual del condensado, puede deberse a una mezcla insuficiente o a gradientes locales de temperatura durante la gelificación. En este caso, las muestras deben mantenerse en el bloque calefactor (o baño de agua) hasta que se añadan todos los componentes, mezclarse de inmediato pero con suavidad y dejarse solidificar bajo condiciones de temperatura uniforme. Se deben evitar los gradientes de temperatura pronunciados; Se recomienda solidificar a temperatura ambiente (y evitar la solidificación en la nevera). En experimentos a largo plazo, la evaporación de la muestra puede alterar las concentraciones de soluto y las propiedades del condensado. Para minimizar la evaporación, las muestras deben sellarse adecuadamente y mantenerse en un entorno controlado por la humedad siempre que sea posible.

A diferencia de métodos como la fijación de paraformaldehído, la incrustación de agarosa no fija químicamente las muestras. Por lo tanto, los condensados permanecen dinámicos, lo cual es ventajoso para estudios funcionales pero limita el almacenamiento a largo plazo. Durante periodos experimentales prolongados, deben tomarse precauciones para evitar la evaporación y cambios en el tampón, como cambios de pH. Además, aunque la agarosa suele ser de baja interacción en estos ensayos, deben considerarse posibles efectos indirectos sobre la difusión o el entorno local. Si se sospechan interacciones entre agarosa y biomolécula, como la unión inespecífica de la proteína a la agarosa, se pueden considerar matrices hidrogeles alternativas como el polietileno glicol diacrilato fotocruzado (PEG-DA), con tamaño y porosidad de malla coincidentes. La ausencia de interacciones debe validarse midiendo FRAP en la presencia y ausencia de la matriz.

Además de la fijación química, se utilizan comúnmente estrategias de pasivación superficial como superficies recubiertas de BSA, PEG o surfactante y bicapas lipídicas soportadas para reducir la adhesión y humectación de condensados. Aunque estos enfoques minimizan eficazmente las interacciones superficiales, no impiden el movimiento de condensados, la sedimentación o la fusión. Por tanto, la incrustación de agarosa complementa estos métodos proporcionando inmovilización física manteniendo la dinámica del condensado, lo que la hace especialmente útil para experimentos prolongados, imágenes tridimensionales y mediciones cuantitativas que requieren una posición estable de la muestra. Por tanto, la elección del método debe guiarse por el objetivo experimental.

En general, los hidrogeles de agarosa proporcionan un medio sencillo pero eficaz para estabilizar condensados en tres dimensiones. Esto evita la humectación y fusión de gotas sin alterar de forma detectable las propiedades intrínsecas medidas en los sistemas representativos probados, permitiendo experimentos y técnicas de curso temporal que requieren tiempos de adquisición largos, como la espectroscopía^{RMN 15}. Aunque este método puede no ser adecuado para todos los sistemas separadores de fase por varias razones, el método presentado aquí es aplicable al estudio de varios condensados biomoleculares y puede ser especialmente útil para investigar procesos de maduración relevantes para los mecanismos de enfermedades^{neurodegenerativas 17}.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.5 mL tubes	cualquier marca está bien	N/A
18-well chamber slides	ibidi	81816	para STORM
agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	grado de biología molecular
agarose, ultra pure	Invitrogen	16500500
channel slides	ibidi	80606	para microscopía
confocal microscope	Nikon	N/A
Cy5-dye, NHS chemistry	Jena Biosciences	FP-201-CY5	para el etiquetado de proteínas
D2O (deuterium oxide)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM buffer	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD protein	N/A	N/A	expresado recombinantemente en nuestro laboratorio, como se describe en la referencia 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
heating block or water bath	cualquier marca está bien	N/A	cualquier marca o modelo servirá
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
image analysis software	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR spectrometer	Bruker	N/A	750 MHz, sonda de temperatura ambiente PATXI, ver referencia 13 para más detalles (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR tube	Bruker	N/A	3 mm, de vidrio
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	cualquier marca está bien	N/A
pCp-Cy3-dye	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	para el etiquetado de ARN
poly(A) RNA	N/A	N/A	transcrito in vitro in-house en nuestro laboratorio, longitud aprox 50 nucleótidos, como se describe en Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
s2m RNA	N/A	N/A	transcrito in vitro in-house en nuestro laboratorio, longitud 45 nucleótidos, secuencia: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', como se describe en Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
SARS-CoV-2 nucleocapsid protein	N/A	N/A	expresado recombinantemente en nuestro laboratorio, como se describe en Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
software for plotting (e.g. R)	R-Project	Versión 4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM microscope	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORM plugin	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
tips for the used pipettes	cualquier marca está bien	N/A
TopSpin	Bruker	Versión 3.2 y 4.1
urea	Sigma-Aldrich	U5128