Artículo de método

Direccionamiento de Cas9 para realizar experimentos de rescate en células HEK293 con knockout transducidas de forma estable

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DOI:

10.3791/72172

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28 de agosto de 2026

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1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

En este artículo

Resumen

Este protocolo elimina la proteína Cas9 después de la edición del genoma para facilitar experimentos de rescate robustos en líneas celulares knockout transducidas de forma estable.

Resumen

La tecnología de edición genética CRISPR-Cas9 ha revolucionado la biología molecular. A menudo, esta tecnología se utiliza para eliminar un gen que codifica una proteína de interés. El fenotipo resultante proporciona información valiosa sobre la función de la proteína. La importancia funcional de la proteína diana puede confirmarse mediante la reintroducción de la proteína para restaurar la función perdida (rescate). Esto se logra típicamente introduciendo el cDNA que codifica la proteína en trans mediante un vector de expresión. Sin embargo, en líneas celulares knockout que expresan establemente el sistema CRISPR-Cas9, el nuevo plásmido de expresión introducido también podría ser escindido por Cas9. El protocolo presentado aquí ofrece una estrategia para sortear esta barrera potencial en experimentos de rescate. Este enfoque se demuestra utilizando células HEK293 en las que el gen que codifica la proteína andamio del ligasa de ubiquitina E3, CUL4B, fue interrumpido mediante CRISPR-Cas9. La transducción de estas células con un ARN guía (gRNA) dirigido al transgen Cas9 integrado resultó en la pérdida de la proteína Cas9 detectable. La ablación de Cas9 permitió la restauración de la expresión y función de CUL4B tras la introducción de un plásmido de expresión de CUL4B. Estos resultados proporcionan una prueba de concepto para un enfoque ampliamente aplicable al estudio de la función proteica mediante experimentos de rescate.

Introducción

CRISPR-Cas9 es una poderosa herramienta de edición del genoma derivada de un sistema inmune adaptativo que ocurre naturalmente en los procariotas para defenderse contra la infección por bacteriófagos. Debido a su bajo costo, alta tasa de éxito y facilidad de uso, la tecnología CRISPR-Cas9 ha superado a otras herramientas de edición del genoma, como las nucleasas con dedos de zinc (ZFNs) y las nucleasas efectoras de activación transcripcional tipo ARN (TALENs), para realizar modificaciones genéticas precisas, especialmente en cultivos celulares. El sistema de dos componentes consta de una nucleasa Cas9 y un ARN guía (gRNA). Mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick, el gRNA dirige a Cas9 hacia una región genómica diana adyacente a un motivo adyacente al espaciador prototipo (PAM). La secuencia PAM actúa como un sitio de reconocimiento crítico que autoriza la actividad de la nucleasa. En ese sitio, Cas9 genera un corte de doble cadena (DSB). En ausencia de una plantilla de reparación homóloga, la célula repara el DSB mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Este mecanismo de reparación puede introducir inserciones o deleciones (indels), lo que provoca mutaciones por corrimiento del marco de lectura y la interrupción funcional del gen diana. Por lo tanto, la interrupción del gen diana se logra introduciendo Cas9 junto con un gRNA diseñado. La secuencia de 20 nucleótidos del gRNA es complementaria a una región genómica inmediatamente adyacente al PAM. La pérdida funcional resultante del gen diana revela los roles específicos de ese gen en los procesos celulares1.

Un experimento de rescate, o ensayo de complementación, implica la restauración de la proteína ausente para demostrar la reversión del fenotipo observado. Este enfoque sirve como un control riguroso para descartar efectos experimentales no deseados, como aquellos derivados de eliminaciones «fuera del blanco» mediante CRISPR-Cas9. El método más común para reintroducir una proteína de interés es mediante la transfección o transducción de un vector de expresión exógeno. Sin embargo, este ADN introducido es susceptible al mismo ataque por CRISPR-Cas9 que el locus endógeno. Este riesgo es particularmente alto en líneas celulares transducidas de forma estable, en las que la expresión constitutiva de Cas9 se combina con selección mediante antibióticos para garantizar una población homogénea y constante de células knock-out; una estrategia a menudo necesaria en líneas celulares difíciles de transfectar o transducir, como aquellas derivadas de linajes inmunitarios, hematopoyéticos o neuronales.

Un método para evitar la dirección del vector consiste en introducir ARNm exógeno que codifique la proteína de interés, evitando así el corte mediado por Cas9 y la necesidad de transcripción nuclear. Sin embargo, en comparación con el ADN plasmídico, el ARNm sintético es más costoso de producir, intrínsecamente menos estable y produce una expresión altamente transitoria. Además, requiere modificaciones químicas específicas para evitar activar las respuestas inmunitarias innatas citosólicas2.

Para evitar el direccionamiento del complejo Cas9/gARN hacia los plásmidos de expresión, se puede emplear la ingeniería de bases balanceadas en la secuencia codificante. Aprovechando la degeneración del código genético, se pueden introducir mutaciones sinónimas para eliminar la secuencia PAM requerida y/o interrumpir la complementariedad con el ARN-g sin alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Sin embargo, el uso de mutaciones sinónimas no está exento de riesgos. Estas alteraciones pueden introducir un uso subóptimo de codones, lo que podría interrumpir la cinética de traducción y provocar mal plegamiento proteico, reducción de la estabilidad del ARNm o cambios perjudiciales en la estructura secundaria del ARN3,4. Aunque con menor frecuencia, otras consecuencias potenciales incluyen la introducción de señales de poliadenilación crípticas, la alteración de motivos reguladores postranscripcionales y un aumento en la densidad de CpG5,6. Además, las secuencias modificadas podrían activar involuntariamente respuestas de estrés celular si la estructura del ARNm resultante interfiere con el avance ribosomal7,8.

Más allá de los desafíos asociados con el uso de ARNm sintéticos o la ingeniería de bases con oscilación, la expresión constitutiva de Cas9 tras la edición introduce varias variables confusas en los ensayos posteriores. Dado que la especificidad de Cas9 puede ser imperfecta, la expresión persistente aumenta la probabilidad de corte en sitios fuera del blanco, lo que lleva a la acumulación progresiva de mutaciones no deseadas con el tiempo9,10,11. Además, la vigilancia genómica crónica y las roturas de doble cadena (DSB) repetitivas pueden desencadenar una respuesta persistente al daño del ADN, conduciendo finalmente a la detención del ciclo celular, senescencia o apoptosis12,13. Esta producción constitutiva también impone una carga metabólica, potenciando así la deriva clonal en la que las células con baja expresión superan a las de alta expresión, lo que resulta en niveles inconsistentes del transgén en pases celulares sucesivos. Por último, al ser una proteína procariota grande, Cas9 puede inducir estrés mediante la señalización inmune innata o sobrecargar el sistema de proteostasis del huésped, induciendo la respuesta a proteínas mal plegadas14,15,16.

Para mitigar estas complicaciones, se han desarrollado varias estrategias de inhibición transitoria de Cas9, incluyendo proteínas Anti-CRISPR derivadas de fagos (Acrs)17,18, inhibidores de moléculas pequeñas o sistemas fusionados a degrón como los PROTACs19,20, y mecanismos de control optogenéticos19,21. Sin embargo, estos enfoques introducen dificultades prácticas que limitan su utilidad en ensayos de rescate. Las Acrs inhiben mediante simulación molecular y, por lo tanto, requieren una optimización estequiométrica para lograr precisión. Además, las Acrs pueden agravar los mismos estrés proteostáticos e inmunogénicos asociados con la sobreexpresión de Cas9. La modulación química introduce complejidades farmacocinéticas, citotoxicidad potencial y efectos de «gancho» asociados a los PROTAC, en los cuales concentraciones excesivas de ligando impiden paradójicamente la formación productiva del complejo ternario22. Las plataformas optogenéticas están limitadas por la fototoxicidad celular y la necesidad de hardware especializado para mantener una entrega constante de luz19,21. Es importante destacar que, dado que estos métodos solo proporcionan una inhibición temporal o reversible, a menudo resultan insuficientes para aplicaciones en las que Cas9 se expresa constitutivamente.

En contraste, los sistemas CRISPR autoinactivos ofrecen una solución permanente al interrumpir de forma autónoma y definitiva el transgén Cas9 inmediatamente después de la edición exitosa del gen diana. Al eliminar la actividad nucleasa residual, este enfoque protege de forma permanente a los vectores de rescate posteriores de la escisión, mientras simultáneamente reduce el estrés proteostático a largo plazo y la deriva genómica fuera del blanco. Aunque las ARN-g diana propias pueden administrarse mediante transfecciones transitorias de ribonucleoproteínas o basadas en lípidos23,24, estos métodos son propensos a la dilución y a la variación estocástica, lo que da lugar a una población «mosaico» en la que algunas células escapan a la inactivación25,26,27.

Para superar estas limitaciones, el protocolo descrito aquí aprovecha un sistema de entrega lentiviral para la autoinactivación de Cas9, ofreciendo ventajas prácticas distintas para la modificación de líneas celulares estables. La entrega lentiviral asegura la herencia enlazada del transgén Cas9 y su regulador autorregulado, evitando eficazmente el «escape por dilución» típico de poblaciones que se dividen rápidamente. Además, la mayor capacidad de carga de los vectores lentivirales permite la coexpresión de marcadores de selección para garantizar una población homogénea con eliminación de Cas9, mientras que su amplio tropismo, conferido por la pseudotipificación con VSV-G, facilita la entrega de alta eficiencia en tipos celulares difíciles de transfectar25,28,29.

Como demostración de prueba de concepto de este método, este protocolo detalla la autoinactivación de Cas9 para facilitar la recuperación fenotípica de la proteína reguladora del ligasa de ubiquitina E3, CUL4B, en células HEK293 con eliminación génica de CUL4B30.

Protocolo

Este estudio utilizó líneas celulares humanas inmortalizadas establecidas (HEK293 y HEK293FT) y no involucró participantes humanos, tejidos humanos primarios ni experimentos con animales. Por lo tanto, no se requirió aprobación ética institucional.

1. Generación de Cas9-construcción lentiviral de gRNA específica

  1. Inserte la secuencia de ARN guía específica para Cas9 (Tabla 1) en el vector lentiviral pLentiGuide-Puro.
  2. Sustituya el gen de resistencia al antibiótico por uno diferente al marcador de resistencia utilizado para seleccionar la línea celular CRISPR-Cas9 transducida de forma estable.
  3. Verifique la inserción exitosa y la fidelidad de la secuencia tanto del ARN guía específico para Cas9 como del gen de resistencia al antibiótico sustituido mediante secuenciación Sanger utilizando cebadores específicos del vector.
    NOTA: En este protocolo, el gen de resistencia a la puromicina (PuroR) fue sustituido por el gen de resistencia a la higromicina B (HygroR) para generar el vector Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro. Otros genes de resistencia a antibióticos alternativos incluyen la blasticidina S (BlastR), G418/Geneticina (NeoR) y la zeocina (ZeoR).

2. Producción del lentivirus que codifica la gRNA específica para Cas9

  1. Siembre 2,5 × 106  células HEK293FT en un plato de cultivo de tejidos tratado de 10 cm.
    NOTA: Mantenga las células en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; glucosa alta) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (en adelante denominado cDMEM) e incúbelas a 37 °C en una incubadora humificada que contenga 5% de CO2. Las células HEK293FT se utilizan porque generan títulos de lentivirus más altos que otras líneas celulares derivadas de HEK29331.
  2. Incube las células durante 12 h hasta que alcancen al menos 60% de confluencia antes de la transfección.
    ADVERTENCIA: Realice todos los procedimientos que involucren vectores lentivirales de tercera generación bajo condiciones de Nivel de Seguridad Biológica 2 (NSB-2), utilizando equipo de protección personal (EPP) adecuado y procedimientos de descontaminación aprobados (por ejemplo, una cabina de seguridad biológica de Clase II, contención secundaria y etanol al 70%), como se describe en Pauwels et al32.
  3. Prepare una mezcla estándar de transfección con fosfato cálcico (CaPhos). Diluya 20 µg de ADN plasmídico total en agua estéril de grado biología molecular hasta un volumen final de 450 µL. Añada 50 µL de CaCl2 2,5 M, seguido de 500 µL de solución salina tamponada con HEPES 2× (HBS; pH 7,05), para obtener un volumen final de 1 mL en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL.
    NOTA: Utilice ADN plasmídico predominantemente superenrollado y verificado por secuencia que cumpla con los siguientes criterios de calidad: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 y endotoxina <0,1 UE/µg. Prepare la mezcla de transfección utilizando una relación equimolar aproximada que consista en 5 µg de Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5,6 µg de pLP1 (Gag/Pol), 3,8 µg de pLP2 (Rev) y 5,6 µg de pLP/VSVG (glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular).
  4. Mezcle completamente la solución de transfección con fosfato cálcico mediante pipeteo suave.
  5. Añada gota a gota 1 mL de la mezcla de transfección con CaPhos al cultivo celular HEK293FT.
  6. Balace suavemente el plato de cultivo para distribuir uniformemente los complejos de transfección.
  7. Incube las células durante 12 h.
    NOTA: La transfección con fosfato cálcico generalmente no se ve afectada por los antibióticos de mantenimiento estándar33. Sin embargo, se recomienda utilizar medio sin antibióticos para métodos de transfección más sensibles, como la lipofección, ya que los antibióticos policatiónicos pueden interferir con la formación del complejo ADN-lípido34.
  8. Aspire y deseche el medio de cultivo.
  9. Lave las células una vez con 10 mL de PBS 1× estéril a temperatura ambiente.
  10. Aspire y deseche el PBS.
  11. Añada 10 mL de cDMEM fresco a temperatura ambiente.
  12. Devuelva las células a la incubadora y permita que las partículas lentivirales se acumulen en el medio de cultivo durante 36 h.
    NOTA: Bajo estas condiciones, se estima que el sobrenadante lentiviral no concentrado producirá aproximadamente 1,0 × 106 unidades transducentes (UT)/mL después de 48 h, aunque el título real debe determinarse experimentalmente según lo descrito por Kutner et al.35 o Barde et al.36. Almacene el sobrenadante lentiviral a −80 °C durante hasta 2 años. Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación, ya que pueden reducir el título viral en aproximadamente un 55%37,38,39,40.

3. Recolección del lentivirus que codifica la gRNA específica para Cas9 y transducción de células diana

  1. Siembre 1,0 × 106 células diana adherentes en un recipiente de cultivo de tejidos de 10 cm tratado para cultivo celular.
  2. Incube las células diana durante 12 h antes de la transducción lentiviral.
    NOTA: Las células diana son células HEK293 que expresan establemente la Cas9 de Streptococcus pyogenes, un ARN guía (gRNA) dirigido contra CUL4B (Tabla 1) y un gen de resistencia a puromicina (PuroR). Mantenga las células en cDMEM que contenga 10 µg/mL de puromicina y verifique la interrupción de CUL4B mediante análisis por inmunotransferencia antes de la autoinactivación de Cas9. Realice todos los experimentos subsiguientes utilizando células HEK293ΔCUL4B de pasajes tempranos.
  3. Recolecte el medio que contiene lentivirus transfiriendo cuidadosamente el sobrenadante de las células productoras HEK293FT a un tubo cónico estéril de 15 mL, teniendo cuidado de no perturbar la monocapa celular.
    NOTA: Deseche las células productoras HEK293FT según las normas establecidas de bioseguridad32.
  4. Centrifugue el sobrenadante recolectado a 1.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente (TA) para sedimentar cualquier célula productora residual de HEK293FT.
  5. Aspire y deseche el medio de cultivo de las células HEK293ΔCUL4B previamente sembradas.
  6. Transfiera 7 mL del sobrenadante lentiviral clarificado al recipiente de 10 cm que contiene las células HEK293ΔCUL4B. Evite perturbar el precipitado en el fondo del tubo de centrífuga y deje al menos 1 mL de sobrenadante residual para minimizar la transferencia de células productoras.
    NOTA: Si se desea, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 µm para eliminar aún más las células productoras residuales. Deseche el sobrenadante restante de acuerdo con las normas de bioseguridad32. Con un título estimado de 1,0 × 106 UT/mL, se espera que una inoculación de 7 mL produzca una multiplicidad de infección (MOI) entre 3,5 y 5,541.
  7. Incube las células HEK293ΔCUL4B transducidas durante 24 h para permitir la transducción y la integración completas del lentivirus.
  8. Aspire y deseche el sobrenadante viral.
  9. Lave las células una vez con 10 mL de PBS 1× estéril a temperatura ambiente.
  10. Aspire y deseche el PBS.
  11. Añada 10 mL de cDMEM fresco a temperatura ambiente.
  12. Devuelva las células al incubador y cultívelas durante cuatro días para permitir la expresión del transgen y la interrupción de Cas9.
    NOTA: Si el vector lentiviral de ARN guía de Cas9 no codifica un reportero fluorescente, transduzca una cultura centinela paralela con un vector lentiviral generado de forma similar que exprese un reportero fluorescente. Utilice la cultura centinela para estimar la eficiencia de transducción y el momento de agotamiento del gen diana mediante microscopía de fluorescencia cualitativa o citometría de flujo cuantitativa. En este estudio, la expresión de GFP fue detectada fácilmente por microscopía de fluorescencia cuatro días después de la transducción.

4. Selección con antibiótico de transductantes con gRNA específica para Cas9

NOTA: Cuatro días después de la transducción, las células diana deben estar en confluencia o cerca de ella y requieren su transferencia a un recipiente de cultivo más grande. Realice la transferencia de células simultáneamente con el inicio de la selección con antibiótico.

  1. Aspire y deseche el medio de cultivo de las células HEK293ΔCUL4B .
  2. Lave las células una vez con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril a temperatura ambiente 1×.
  3. Aspire y deseche el PBS.
  4. Añada 2 mL de solución estéril de tripsina-EDTA a temperatura ambiente al recipiente de cultivo.
  5. Incube las células durante 5 min para favorecer la desagregación.
  6. Añada 8 mL de cDMEM a temperatura ambiente para neutralizar la tripsina.
  7. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico estéril de 15 mL.
  8. Pipete la suspensión celular 15–20 veces para disociar completamente los agregados celulares.
  9. Centrifugue las células a 200 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
  10. Mientras las células están centrifugando, prepare un frasco de cultivo de tejidos T150 tratado conteniendo 20 mL de cDMEM suplementado con 250 µg/mL de higromicina B.
    NOTA: La concentración de higromicina B necesaria para la selección puede variar entre tipos celulares. Realice una curva de selección utilizando 50–500 µg/mL de higromicina B para determinar la concentración mínima necesaria para eliminar todas las células no transducidas en 7–10 días. Si se utiliza un marcador de resistencia a un antibiótico alternativo en el vector de ARN-g de Cas9, realice una curva de selección utilizando 2–10 µg/mL de blasticidina S, 400–800 µg/mL de G418/Geneticina o 50–400 µg/mL de zeocina.
  11. Aspire y deseche el sobrenadante sin perturbar el botón celular.
  12. Resuspenda el botón celular en 10 mL de cDMEM suplementado con 250 µg/mL de higromicina B.
  13. Transfiera la suspensión celular de 10 mL al frasco T150 preparado que contiene 20 mL de medio de selección.
  14. Agite suavemente el frasco para distribuir las células de manera uniforme.
  15. Incube las células bajo selección durante tres días.
  16. Al tercer día de selección, aspire el medio de selección y reemplácelo con 30 mL de cDMEM fresco suplementado con 250 µg/mL de higromicina B.
    NOTA: El reemplazo del medio de selección elimina las células muertas no adherentes, reabastece los nutrientes y mantiene la actividad del antibiótico.
  17. Continúe la incubación hasta que la monocapa de células sobrevivientes alcance aproximadamente un 90 % de confluencia, generalmente tras cuatro días adicionales.

5. Validación de la eliminación de Cas9 y la recuperación in trans de CUL4B

NOTA: Una vez que las células alcancen aproximadamente el 90 % de confluencia, confirme la ablación de Cas9 en los experimentos iniciales e inmediatamente criopresérvese la población celular restante42. Este enfoque minimiza el desarrollo de mecanismos compensatorios secundarios.

  1. Sembrar HEK293 de bajo paseΔCUL4B células que expresan establemente un ARN-g dirigido a Cas9 (en lo sucesivo denominadas HEK293ΔCUL4BΔcas9) en cuatro pocillos de una placa de cultivo celular de 6 pocillos tratada, a una densidad de 2,5 × 105 células por pocillo
  2. Sembrar HEK293ΔCUL4B células en cuatro pocillos de una placa de 6 pocillos separada. Siembre células parentales HEK293 en al menos un pocillo adicional para utilizar como control.
    NOTA: Utilice el HEK293ΔCUL4B y cultivos parentales de HEK293 como controles para la expresión de Cas9 y CUL4B, respectivamente.
  3. Incubar todos los cultivos durante 12 h para permitir la adhesión completa de las células y la proliferación activa.
  4. Preparar mezclas de transfección con fosfato de calcio (CaPhos) que contengan 0, 0,5, 1,0 o 2.0 µg de pCMV-FLAG-CUL4B. Ajustar cada mezcla a un total constante de 10 µg ADN plasmídico añadiendo un vector pCMV vacío.
  5. Diluir cada mezcla de ADN en agua estéril de grado biología molecular hasta un volumen final de 180 µL, añadir 20 µL de 2,5 M de CaCl₂2, y luego añada 200 µL de 2× salino tamponado con HEPES (HBS; pH 7,05) para obtener un volumen final de 400 µL en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL.
    NOTA: Al utilizar plásmidos de expresión controlados por promotores fuertes (por ejemplo, CMV), realice una titulación del ADN para lograr niveles de expresión proteica comparables a la expresión endógena. Utilice ADN plasmídico predominantemente superenrollado y verificado por secuenciación, con valores de A260/A280 de 1,8–2,0, valores de A260/A230 de 2,0–2,2 y un nivel de endotoxinas de <0,1 UE/µg.
  6. Mezcle cada solución de transfección CaPhos cuidadosamente mediante pipeteo suave.
  7. Añadir 200 µL de cada mezcla de transfección gota a gota al pozo designado que contiene HEK293ΔCUL4BΔcas9 células. Cambie las puntas de pipeta entre muestras para evitar la contaminación cruzada.
  8. Añada el resto 200 µL de cada mezcla de transfección correspondiente, gota a gota, al pozo designado que contiene HEK293ΔCUL4B células
  9. Incubar las culturas transfectadas durante 12 h.
  10. Aspire el medio de cultivo de cada pocillo.
  11. Lavar las células una vez con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato estéril a temperatura ambiente× PBS.
  12. Aspire y deseche el PBS.
  13. Añada 2 mL de cDMEM fresco a temperatura ambiente a cada pocillo.
  14. Incube las culturas durante 24 h adicionales para permitir la expresión de CUL4B y las respuestas funcionales downstream.
  15. Recoger las células utilizando procedimientos estándar de tripsinización.
  16. Transferir cada suspensión celular a un tubo individual de microcentrífuga de 1,5 mL.
  17. Lave cada suspensión celular una vez con 1× PBS.
  18. Pulse brevemente las muestras a 14.000 × g a temperatura ambiente para sedimentar las células.
  19. Aspire y deseche el sobrenadante de PBS.
    PRECAUCIÓN: βEl -mercaptoetanol es un irritante volátil de la piel y las vías respiratorias con un olor fuerte. Manipule las soluciones stock en una campana extractora de gases químicos certificada, utilizando equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes resistentes a productos químicos, bata de laboratorio y gafas de seguridad. Deseche las puntas, tubos y residuos contaminados de acuerdo con las directrices institucionales para residuos peligrosos.
  20. Lise cada pellet celular directamente en 200 µL Tampón de muestra de Laemmli suplementado con 5 % (v/v) β-mercaptoetanol.
  21. Desnaturalice las proteínas calentando las muestras a 95 °C durante 15 min.
  22. Resolver 20–40 µg de proteína total por carril mediante electroforesis estándar en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE).
  23. Transfiera las proteínas resueltas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF).
  24. Bloquee la membrana durante 30 min a temperatura ambiente utilizando tampón de bloqueo.
    NOTA: Prepare el tampón de bloqueo utilizando leche descremada en polvo al 5 % (p/v) o albúmina sérica bovina (BSA) al 5 % (p/v), disueltos en tampón de lavado estándar (Tween 20 al 0,1 % en tampón TBS o PBS)× Salina tamponada con Tris o 1× PBS).
  25. Lave la membrana tres veces durante 10 min cada vez utilizando tampón de lavado estándar.
  26. Incubar la membrana con anticuerpos primarios contra CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6, o α-TUBULINA durante 12 h a 4 °C con agitación suave.
    NOTA: Diluir los anticuerpos primarios 1:1.000 en tampón de lavado estándar.
  27. Retire la solución de anticuerpo primario y lave la membrana tres veces durante 10 min cada una usando tampón de lavado estándar.
  28. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario anti-ratón o anti-conejo IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) adecuado durante 12 h a 4 °C con agitación suave.
    NOTA: Diluir los anticuerpos secundarios 1:3.000 en tampón de bloqueo.
  29. Retire la solución de anticuerpo secundario y lave la membrana tres veces durante 10 min cada vez utilizando tampón de lavado estándar.
  30. Aplique el sustrato quimioluminiscente mejorado (ECL) uniformemente sobre la membrana e incube durante 1 min.
  31. Capture las señales quimioluminiscentes utilizando un sistema de imagen digital.
    NOTA: Si se desea, confirme la interrupción génica exitosa mediante secuenciación de Sanger de la región genómica diana tras la amplificación por PCR del ADN genómico aislado43.

Resultados

Para generar líneas de eliminación con Cas9 para la reconstrucción experimental, se produjo en células HEK293FT un lentivirus que codifica un ARN guía dirigido contra Cas9 (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro) utilizando plásmidos de empaquetamiento estándar (pLP1, pLP2 y pLP/VSVG). Se recolectó el sobrenadante viral resultante y se utilizó para transducir las células diana. La supervivencia durante la selección con higromicina B confirmó la transducción lentiviral exitosa, y un análisis posterior mediante inmunotransferencia confirmó la ablación de Cas9 (Figura 1).

La proteína CUL4B fue fácilmente detectada en las células HEK293 parentales, pero estuvo ausente en las células HEK293 transfectadas con el vector vacío.ΔCUL4B y HEK293ΔCUL4BΔcas9 células. De acuerdo con la pérdida de CUL4B, WDR5 y CDC6 mostraron los aumentos y disminuciones esperados en la expresión en estado estacionario, respectivamente, lo que confirma la alteración de la función de CUL4B. La proteína Cas9 fue detectada en HEK293ΔCUL4B células, pero fue indetectable en las células parentales HEK293 y HEK293ΔCUL4BΔcas9 células, confirmando la ablación exitosa de Cas9. Como se esperaba, la transfección del plásmido de expresión de CUL4B en HEK293ΔCUL4B las células resultó en una restauración mínima de la expresión de la proteína CUL4B. En contraste, se observó una expresión robusta de CUL4B tras la transfección de HEK293ΔCUL4BΔcas9 células, junto con la recuperación de la expresión proteica descendente, evidenciada por niveles reducidos de WDR5 y aumentados de CDC6. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la ablación de Cas9 permite la restauración eficiente de la expresión y función de CUL4B al prevenir el corte mediado por Cas9 del plásmido de rescate (Figura 2).

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Figura 1: Flujo experimental para la ablación estratégica de Cas9 y validación de la recuperación mediante CUL4B. Este flujo describe la generación de células knockout CRISPR con ablación de Cas9 mediante la co-transfección de células productoras HEK293FT con pLP1, pLP2, pLP/VSVG y un constructo Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro mediante transfección con fosfato de calcio. El sobrenadante lentiviral resultante se recoge, centrifuga para eliminar las células productoras residuales y se utiliza para transducir las células diana. Tras la selección, se confirma la ablación exitosa de Cas9 mediante análisis por inmunotransferencia (western blot) para establecer una línea celular knockout limpia, lista para la reintegración experimental de CUL4B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Recuperación de la expresión y función de CUL4B en células HEK293 editadas con CRISPR-Cas9. (A) Esquema experimental del protocolo de transfección. Las células HEK293ΔCUL4B   y HEK293ΔCUL4BΔcas9 se transfectaron con un vector vacío o con cantidades crecientes de pCMV-FLAG-CUL4B. Las células se recolectaron 36 h después de la transfección y las proteínas del lisado se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE. (B) Análisis por inmunotransferencia de la eficiencia de rescate y controles funcionales descendentes. Las proteínas indicadas se visualizaron mediante inmunotransferencia. WDR5 y CDC6 sirvieron como controles de la función de CUL4B. α-TUBULINA sirvió como control de carga. Las células HEK293 parentales sirvieron como control para la expresión basal. Las imágenes son representativas de experimentos replicados (n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gen blancoSecuencia de gRNA (5′→3′)PAM (5′→3′)Ubicación del blancoDescripción del blanco
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Exón 3Región N-terminal del ORF humano de CUL4B para generar una interrupción del marco de lectura
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)Región interna conservada del transgén cas9 para inducir indels de autoinactivación

Tabla 1: Secuencias de ARN guía CRISPR-Cas9 y especificaciones del blanco genómico.

Discusión

Este protocolo permitió la restauración robusta de la expresión y función de la proteína diana en líneas celulares knock-out editadas con CRISPR-Cas9 en las que Cas9 fue eliminada tras la edición. Una observación destacable de este trabajo es el grado sustancial en que la expresión constitutiva de Cas9 suprime la expresión del transgén impulsada por plásmidos. La fortaleza de este protocolo radica en su capacidad para recuperar tanto la proteína perdida como su fenotipo asociado. Este método también establece un marco para la exploración fenotípica de una amplia variedad de alteraciones proteicas. Por ejemplo, la introducción de una variante fosfomimética (por ejemplo, serina a ácido aspártico) puede proporcionar información valiosa sobre el papel de esa modificación postraduccional sin la interferencia del fondo de la proteína nativa.

Por consiguiente, este protocolo es ampliamente aplicable a líneas celulares adherentes estándar (por ejemplo, HeLa, A549) y en suspensión (por ejemplo, Jurkat, THP-1). Sin embargo, este marco de selección secuencial podría resultar poco práctico para células primarias o no divididas (por ejemplo, neuronas primarias o macrófagos). En estos sistemas sensibles, la eliminación rápida de células espectadoras no transducidas libera restos citotóxicos y señales de estrés proapoptóticas al microambiente compartido, induciendo toxicidad indirecta46,47. De manera similar, podría fallar en líneas tumorales altamente adaptables y aneuploides (por ejemplo, glioblastoma U87 o melanoma A375) que tienden a escapar de los fenotipos mediados por CRISPR mediante reordenamientos cromosómicos rápidos o la selección rápida de clones resistentes preexistentes48,49. En última instancia, la idoneidad depende de la capacidad de una línea celular para tolerar la carga metabólica de la expresión con vectores duales, resistir estas presiones selectivas indirectas y mantener una cinética de crecimiento estable durante todo el protocolo de varias semanas.

Si bien este enfoque sirve como una prueba de concepto versátil para la mayoría de las líneas celulares, su implementación requiere un equilibrio cuidadoso entre la eficiencia de entrega y la integridad genómica. Como se indicó, el uso de la entrega lentiviral para el ARN-g de «auto»-dirigido garantiza una población homogénea con Cas9 inactivada, especialmente en células difíciles de transfectar. Sin embargo, el riesgo de mutagénesis por inserción debido a la integración semialeatoria sigue siendo una preocupación. Estos riesgos pueden controlarse mediante la optimización de la MOI. En líneas permisivas como HEK293, una MOI de 1–5 logra una alta saturación mientras minimiza la mutagénesis y la citotoxicidad inducidas por integración41. En contraste, las células inmunitarias o neuronales refractarias generalmente requieren MOIs de 10–50, lo que a menudo exige el uso de potenciadores como polibreno y/o espinoculación para alcanzar eficiencias similares50,51,52,53,54,55.

Este compromiso técnico se extiende a la elección entre poblaciones policlonales y monoclonales. Las células HEK293ΔCUL4BΔcas9 generadas aquí son policlonales, una decisión que acelera los plazos experimentales al evitar la expansión, que requiere semanas, necesaria para el subclonado de una sola célula. Además, un pool policlonal captura el fenotipo promedio de la cultura, amortiguando eficazmente los artefactos clonales o los problemas específicos del sitio de integración. Aunque las líneas monoclonales tienen mayor probabilidad de producir resultados consistentes debido a la homogeneidad genética, los resultados presentados aquí sugieren que la selección policlonal es una alternativa viable y a menudo mejor cuando se priorizan la rapidez y la representación de la población.

La estabilidad temporal del fenotipo resultante también puede ser una variable crítica. En el sistema presentado aquí, el impacto regulatorio de CUL4B sobre WDR5 y CDC6 disminuyó con sucesivos pases de las líneas celulares knockout, lo que se correlaciona con una regulación compensatoria ascendente del parólogo CUL4A (datos no mostrados). Esto refleja los hallazgos de Nakagawa et al., quienes demostraron que CUL4A puede restaurar parcialmente la función de CUL4B en células con depleción de CUL4B44. Dicha compensación homeostática es común en la biología celular, particularmente al dirigirse a una proteína con alta homología estructural y redundancia funcional respecto a otras proteínas celulares.

Para abordar estos mecanismos compensatorios secundarios, se pueden emplear dos enfoques estratégicos distintos, dependiendo de los objetivos experimentales y de la línea celular utilizada. Para investigadores que priorizan la eficiencia o que trabajan con líneas celulares altamente adaptables, es esencial un cronograma experimental condensado. Esta estrategia implica la validación inmediata de la pérdida de la proteína diana, idealmente cuando el cultivo alcanza el 90 % de confluencia tras la selección, seguida rápidamente por la inactivación dirigida del Cas9 y por ensayos funcionales. Al adoptar este flujo de trabajo acelerado, es más probable capturar las consecuencias biológicas primarias del knockout antes de que la maquinaria homeostática celular tenga tiempo suficiente para sobreexpresar parálogos redundantes o de otro modo enmascarar el fenotipo resultante.

Alternativamente, para estudios que requieren estabilidad a largo plazo o experimentos de rescate de alta precisión, particularmente en modelos refractarios a la transfección como células inmunitarias y neuronales, un sistema controlado por tetraciclina (Tet-On/Apagado) ofrece una solución viable56,57. Aunque la implementación de este marco inducible requiere rondas adicionales de transducción lentiviral y el uso de marcadores de resistencia a antibióticos distintos, proporciona un mecanismo para la restauración sostenida de la proteína diana y la estabilización del entorno celular antes de desencadenar eventos transitorios de «pérdida y rescate» mediados por doxiciclina57.

Divulgaciones

Los autores utilizaron Google Gemini para ayudar a perfeccionar la terminología técnica y editar el manuscrito. La inteligencia artificial se utilizó como una herramienta para mejorar el lenguaje y no contribuyó a la síntesis original de datos, la conceptualización del estudio ni al redactado primario del texto. Los autores revisaron y editaron el resultado y asumen total responsabilidad por el contenido del manuscrito final. Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue respaldado por fondos iniciales proporcionados por Le Moyne College, el Comité de Investigación y Desarrollo de Le Moyne College, el Comité Estudiantil de Investigación de Le Moyne College, el Fondo del Centro Jesuita Walter L. '66 y MaryAnne Poland para la Innovación en Investigación y Enseñanza, y el Departamento de Ciencias Biológicas y Ambientales de Le Moyne College. Los autores agradecen el uso de BioRender.com para la elaboración de las ilustraciones gráficas. La figura 1 fue creada en BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3), y el panel superior de la figura 2 fue creado en BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
anticuerpo anti-Cas9Cell Signaling65832Este anticuerpo monoclonal de ratón permite la detección específica de Cas9 de S. pyogenes en lisados humanos, lo que lo hace ideal para verificar la eliminación de Cas9 mediada por ARg autodirigido.
anticuerpo anti-CDC6Cell Signaling3387Este anticuerpo monoclonal de conejo proporciona detección específica de CDC6 humano, lo que lo hace ideal para monitorear los efectos funcionales downstream de CUL4B.
anticuerpo anti-CUL4BSigma-AldrichC9995Este anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad permite la detección específica de CUL4B humano sin reacción cruzada con su parálogo estrechamente relacionado CUL4A.
anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRPCell Signaling7076Este anticuerpo de caballo anti-IgG de ratón está conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y está optimizado para la detección quimioluminiscente de anticuerpos primarios monoclonales de ratón.
anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con HRPCell Signaling7074Este anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo está conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y está optimizado para la detección quimioluminiscente de anticuerpos primarios policlonales y monoclonales de conejo.
anticuerpo anti-WDR5Cell Signaling13105Este anticuerpo monoclonal de conejo permite la detección específica de WDR5 humano, lo que lo hace ideal para monitorear los efectos funcionales downstream de CUL4B.
anticuerpo anti-α-TUBULINACell Signaling3873Este anticuerpo monoclonal de ratón se dirige contra alfa-tubulina humana y es ideal como control de carga uniforme para la normalización en análisis de inmunotransferencia.
Kit de transfección con fosfato de calcioThermoFisher ScientificK278001Este kit proporciona reactivos para transfección transitoria eficiente, optimizados para la producción escalable y rentable de vectores lentivirales en células productoras adherentes HEK293FT.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation synthesis personalizadasecuencia de ARg de Cas9: CGTGATCACCGACGAGTACA, secuencia PAM: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation synthesis personalizadasecuencia de ARg de Cas9: CGTGATCACCGACGAGTACA, secuencia PAM: AGG
Medio de Eagle modificado de Dulbecco GibcoD5796Este medio de alta glucosa suplementado con L-glutamina y piruvato de sodio está optimizado para mantener el crecimiento, viabilidad y estabilidad metabólica en líneas celulares mamíferas de rápida proliferación (por ejemplo, HEK293FT).
Suero bovino fetal premium (inactivado por calor)Corning35-016-CVEste suero de grado premium, inactivado por calor, proporciona factores de crecimiento y hormonas esenciales, mientras minimiza la citotoxicidad mediada por el complemento en líneas celulares mamíferas.
HEK293Colección Estándar Americana de Tipos CelularesCRL-1573Esta línea celular bien caracterizada de riñón embrionario humano es altamente transfectable y sirve como un modelo robusto y estándar para investigar fenotipos de interrupción génica y marcos de rescate proteico.
Células HEK293FT ThermoFisher ScientificR70007Esta variante de crecimiento rápido y alta transfectabilidad de la línea de riñón embrionario humano expresa establemente el antígeno T grande de SV40, lo que la optimiza para maximizar los títulos virales durante la producción de vectores lentivirales.
Higromicina BsigmaaldrichH7772Este antibiótico aminonucleósido se utiliza como agente selectivo en cultivo celular mamífero para aislar transductantes estables que expresan el marcador de resistencia a higromicina.
plásmido pCLIP-All-hCMV-Puro (ARg de CUL4B)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bsecuencia de ARg de CUL4B: ATCAAACCCTACAAACTCCA, secuencia PAM: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/AEste plásmido de expresión mamífera utiliza un promotor de citomegalovirus (CMV) para inducir la expresión constitutiva de una proteína Cullin 4B (CUL4B) marcada con FLAG, y es un obsequio de Jianping Jin.
Vector de expresión mamífera pCMV-M1Addgene23007Control de vector de expresión vacío (un obsequio de Linda Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Este vector de transferencia lentiviral induce la expresión de un ARg personalizable bajo el promotor U6 humano junto con un marcador de resistencia a puromicina controlado por el promotor EF-alfa, para direccionamiento CRISPR en células que expresan Cas9, y es un obsequio de Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 Vector lentiviral que codifica GFP para evaluar la eficiencia de transducción (un obsequio de Kevin Janes)
PuromicinaSigma-AldrichP8833Este antibiótico aminonucleósido se utiliza como agente selectivo en cultivo celular mamífero para aislar transductantes estables que expresan el marcador de resistencia a puromicina.
Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS)Corning21-040-CVEsta solución salina equilibrada estándar se utiliza para lavar monocapas celulares con el fin de eliminar eficazmente restos de medio de cultivo, proteínas séricas o enzimas sin alterar la presión osmótica ni la viabilidad celular.
Tripsina EDTA 1XCorning25-051-CIEsta solución enzimática de disociación estándar se utiliza para desprender células mamíferas adherentes de los recipientes de cultivo mediante la escisión de enlaces peptídicos, mientras que el EDTA quelata cationes divalentes para interrumpir la adhesión intercelular.
Mezcla de empaquetamiento lentiviral ViraPowerThermoFisher ScientificK497500Esta mezcla optimizada de plásmidos de empaquetamiento (pLP1, pLP2 y pLP/VSVG) se utiliza para la co-transfección en células productoras con el fin de facilitar el ensamblaje de alto título y la producción incompetente para replicación de vectores de expresión lentivirales.

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