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Artículo de método

Imagen del transporte del líquido cefalorraquídeo mediante resonancia magnética con contraste vía Infusión intraventricular en roedores

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DOI:

10.3791/72175

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28 de agosto de 2026

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1Department of Electrical, Computer, and Systems Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Radiology, Case Western Reserve University, 4Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un protocolo de canulación intraventricular y perfusión de trazador adaptado para estudios de resonancia magnética con contraste dinámico (DCE-MRI) en roedores. El protocolo permite la administración continua de trazador durante la adquisición de imágenes, lo que posibilita la obtención de mapas cerebrales completos del transporte del trazador y su eliminación desde el cerebro dentro de una única sesión de imagen continua e ininterrumpida.

Resumen

La canulación intraventricular (ICV) permite la administración de trazadores exógenos o agentes terapéuticos directamente en el ventrículo lateral, origen de la vía de circulación del líquido cefalorraquídeo (LCR). Las moléculas infundidas son transportadas por el flujo masal del LCR a través de los compartimentos ventriculares hacia el espacio subaracnoideo y posteriormente penetran en el parénquima cerebral. mediante el espacio perivascular. Sin embargo, los métodos convencionales de cannulación intraventricular (ICV) suelen utilizar cánulas ferromagnéticas, que son incompatibles con los estudios de resonancia magnética (RM) y, por lo tanto, requieren que la infusión se realice fuera del escáner y que la cánula se retire antes de la adquisición de imágenes. El tiempo necesario para el traslado del animal y la preparación del sistema de imagen suele provocar la pérdida de la fase inicial, y posiblemente más crítica, del transporte del trazador. Aquí describimos un protocolo de cannulación e infusión ICV compatible con RM para roedores, que permite la administración continua del trazador durante la adquisición dinámica de imágenes dentro del escáner. La línea de infusión está construida íntegramente con materiales no magnéticos, lo que posibilita la adquisición ininterrumpida de imágenes en una misma sesión. Este enfoque es especialmente adecuado para estudios de RM dinámica con contraste en la dinámica del líquido cefalorraquídeo (LCR), transporte gliatilinfático, eliminación de solutos y administración intratecal de fármacos.

Introducción

El cerebro es uno de los órganos más metabólicamente activos y dinámicos del cuerpo, generando continuamente productos de desecho que deben eliminarse eficientemente para mantener la función neural normal1. La acumulación de desechos metabólicos es una característica distintiva de la neurodegeneración y del envejecimiento cerebral2. El sistema gliofático desempeña un papel central en este proceso de eliminación, facilitando la remoción de subproductos metabólicos y desechos tóxicos mediante el flujo masivo de líquido cefalorraquídeo (LCR) y el intercambio entre el LCR y el líquido intersticial (LI)3,4,5, un proceso facilitado por los canales de agua acuaporina-4 (AQP4) localizados en los pies astrocíticos6. Se ha obtenido un conocimiento sustancial sobre la dinámica del LCR mediante el estudio del transporte de diversos trazadores de LCR. La resonancia magnética con contraste dinámico (DCE-MRI) utilizando agentes de contraste basados en gadolinio (GBCA) es especialmente adecuada para evaluar el transporte de trazadores en todo el cerebro7,8. La relevancia clínica de este enfoque se ha demostrado mediante estudios traslacionales en humanos. La administración intratecal de GBCA seguida de resonancias magnéticas seriadas se utilizó para evaluar la dinámica del LCR en el cerebro humano9. Trabajos posteriores demostraron el transporte de trazadores en todo el cerebro seguido de su eliminación durante la noche10. Este enfoque se aplicó recientemente para revelar un transporte periarterial de trazadores alterado en sujetos con capacidad reducida de reserva volumen-presión intracraneal, así como en pacientes con hidrocefalia de presión normal idiopática11. Estos estudios establecen la DCE-MRI del transporte de trazadores de LCR como un enfoque trasladable a la clínica y motivan el desarrollo de métodos preclínicos rigurosos y reproducibles para investigar mecanicistamente la regulación de la dinámica del LCR y la eliminación de desechos.

La canulación de la cisterna magna intra (ICM) se utiliza comúnmente en estudios del sistema glinfático para la administración de trazadores12. Sin embargo, solo aproximadamente el 20 % de los agentes de contraste con base de gadolinio (GBCA) administrados mediante esta vía son transportados al parénquima cerebral, mientras que la mayoría drena directamente hacia la médula espinal o los sistemas linfáticos8. Este enfoque también conlleva el riesgo de dañar el cerebelo o el tronco encefálico, y asegurar la cánula para estudios longitudinales sigue siendo técnicamente difícil. La canulación intraventricular (ICV) ha surgido como una alternativa más robusta13,14,15. Un estudio reciente demostró su reproducibilidad y ventajas clave en la administración de trazadores fluorescentes, incluyendo una fijación estable de la cánula que permite el movimiento libre del animal y soporta inyecciones repetidas de trazadores en estudios longitudinales13.

A pesar de estas ventajas, los protocolos existentes de canulación ICV no son directamente compatibles con estudios de RM16. Dado que la canulación ICV requiere la penetración del parénquima cerebral, normalmente se utilizan cánulas ferromagnéticas que generan artefactos de susceptibilidad severos en las imágenes de RM. Como resultado, la infusión del trazador debe realizarse fuera del escáner, retirando la cánula antes de trasladar al animal para la obtención de imágenes. Un flujo de trabajo típico implica adquirir una exploración basal, retirar al animal para la canulación y la infusión del trazador, y luego reposicionar al animal para exploraciones dinámicas posteriores. Este flujo de trabajo interrumpido impide la adquisición continua referenciada a la línea basal e introduce desalineaciones por reposicionamiento que pueden dificultar el análisis cinético por vóxeles. Más importante aún, dado que la fase temprana de captación suele ser la porción más dinámica y transitoria de la cinética del trazador, realizar el traslado del animal y la configuración del escáner durante este período provoca la pérdida de los datos más informativos.

Aquí presentamos un protocolo que aborda estas limitaciones mediante la integración de una línea de infusión intracerebroventricular compatible con RM con capacidad de administración de agente de contraste dentro del escáner, lo que permite la adquisición continua y dinámica de imágenes por RM en roedores. Este enfoque permite la obtención de mapas cuantitativos de todo el cerebro del transporte de trazadores en el LCR durante una única sesión de imagen sin interrupciones. Este protocolo es adecuado para estudiar la dinámica del LCR en todo el cerebro, el transporte gliofático y la cinética de eliminación de solutos. Aunque aquí se describe para ratas adultas, el protocolo puede adaptarse para ratones con ajustes apropiados en las coordenadas de canulación y los parámetros de infusión15.

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Protocolo

El protocolo descrito a continuación fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC) de la Universidad Case Western Reserve (A-3145-01-2023-0015), de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio. Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la línea de infusión

  1. Corte un segmento de 30 mm de una cánula de cobre y un tramo de 2 m de tubo de polietileno (PE) utilizando tijeras dentadas.
  2. Bajo un microscopio, ensanche suavemente un extremo del tubo de PE con una aguja de 30 G, luego inserte la cánula de cobre en el extremo ensanchado y asegure la unión con adhesivo de cianocrilato. Conecte el extremo opuesto del tubo de PE a una aguja de 30 G.
    NOTA: El cobre es altamente dúctil; tenga cuidado de no colapsar la luz durante el corte. Evite deformar la cánula o perforar el tubo durante el ensamblaje. La longitud del tubo de PE debe permitir colocar la bomba de jeringa fuera del campo magnético periférico del escáner.
  3. Llene el ensamblaje de cánula y tubo con solución trazadora desgasificada y conéctelo a una jeringa Hamilton de 50 µL. Envuelva la punta de la jeringa con cinta selladora de politetrafluoroetileno (PTFE) para evitar fugas. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire durante este procedimiento.
  4. Monte la jeringa Hamilton en la bomba de jeringa y extraiga adicionales 30 µL de solución trazadora dentro de la jeringa.

2. Procedimiento de canulación

  1. Pese la rata y anestésiela con una inyección intraperitoneal de ketamina (90 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Confirme la profundidad adecuada del anestésico mediante el reflejo de pellizco en el dedo del pie. Suplemente con un tercio de la dosis inicial si es necesario y vuelva a verificar antes de continuar.
  2. Afeite la cabeza y el cuello, retire el pelo suelto y esterilice la piel expuesta con toallitas de etanol al 70 %.
  3. Sujete la rata en un marco estereotáxico y coloque una almohadilla térmica cubierta con papel absorbente debajo del animal. Aplique una pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir el secado corneal.
  4. Ajuste la pinza nasal para nivelar el cráneo. Realice una incisión en la línea media y retraja la piel con cuatro pinzas hemostáticas para exponer el bregma y lambda. Aplique peróxido de hidrógeno al 3 % sobre el cráneo para eliminar el periostio residual y mejorar la visibilidad de los puntos de referencia.
    NOTA: El nivelado preciso del cráneo es fundamental para una colocación reproducible de la cánula. Como medida práctica de control de calidad, compare las coordenadas mediolaterales (ML) y dorsoventrales (DV) en el bregma y lambda: si el cráneo está correctamente nivelado, la diferencia entre ambos puntos de referencia no debe exceder 0,2 mm en ninguno de los ejes ML o DV.
  5. Monte el taladro eléctrico con una broca fina en el brazo estereotáxico y asegúrese de que el brazo esté firmemente fijado.
  6. Coloque la broca en el bregma, luego muévala 0,7 mm hacia posterior y 1,4 mm hacia lateral derecho. Baje la broca hasta que haga contacto con la superficie del cráneo y registre la coordenada DV.
  7. Bajo observación microscópica, avance el taladro en incrementos de 0,1 mm. Deténgase inmediatamente al atravesar el cráneo (el espesor típico del cráneo en ratas adultas es de 0,3–0,4 mm).
  8. Reemplace el taladro por la cánula precargada en el brazo estereotáxico. Avance brevemente la bomba de infusión hasta que el líquido apenas emerja de la punta de la cánula, confirmando un trayecto libre de obstrucciones.
  9. Asegúrese de que la cánula esté montada perpendicularmente a la superficie del cráneo, luego alinéela sobre el orificio practicado. Avance la cánula a 0,1 mm/s hasta una profundidad final objetivo de 3,5 mm por debajo de la superficie dural.
  10. Aplique una gota de adhesivo tisular en la interfaz entre la cánula y el cráneo. Una vez curado, cierre la incisión del cuero cabelludo con puntos de sutura y doble suavemente la cánula de cobre paralela a la superficie del cráneo para evitar el contacto con la bobina de RM.

3. Configuración de la RM y adquisición dinámica

  1. Coloque la bobina transmisora de volumen en el isocentro del escáner.
  2. Transfiera al animal a una camilla compatible con MRI en posición prona. Conecte el sistema de monitoreo fisiológico, que incluye el sensor respiratorio y la sonda de temperatura rectal. Encienda el baño de agua tibia circulante para mantener la temperatura corporal en ~37 °C.
  3. Mantenga una anestesia adecuada durante toda la sesión de escaneo utilizando isoflurano suplementario administrado mediante cono nasal. Ajuste la concentración de isoflurano entre 0,25 % y 1,0 % para mantener una frecuencia respiratoria de 50 a 70 respiraciones/min.
    NOTA: La anestesia con ketamina-xilacina administrada antes de la cirugía de canalización proporcionará sedación residual durante la transferencia inicial a la camilla de RM. Introduzca isoflurano gradualmente y supervise continuamente la frecuencia respiratoria durante el escaneo.
    PRECAUCIÓN: El isoflurano es un agente volátil que representa un riesgo por inhalación; utilice un sistema de captación activa y minimice la exposición del personal.
  4. Coloque la bomba de infusión fuera del campo magnético periférico, y ajuste la velocidad de infusión a 1 µL/min y la duración de la infusión a 20 min, lo que corresponde a un volumen total de infusión de 20 µL. Organice y asegure cuidadosamente la línea de infusión a lo largo del soporte para evitar tensión y desplazamiento.
    PRECAUCIÓN: Los objetos ferromagnéticos pueden convertirse en proyectiles peligrosos cuando se colocan cerca de un escáner de MRI. Mantenga todo el equipo incompatible con MRI fuera del campo periférico.
  5. Coloque la bobina de matriz superficial directamente sobre el cráneo dorsal, centrada en el cerebro. Coloque un pequeño trozo de papel absorbente entre la bobina y el sitio de incisión para absorber cualquier exudado de la herida.
  6. Avance la camilla hacia el imán hasta que el cerebro se encuentre en el isocentro. Verifique que la línea de infusión y los cables de monitoreo fisiológico permanezcan sin obstrucciones.
  7. Realice la configuración inicial del escáner y adquiera imágenes anatómicas para confirmar la colocación exitosa de la cánula.
  8. Después de adquirir las imágenes de línea base, inicie simultáneamente la bomba de infusión y el escaneo dinámico, y continúe la adquisición durante un total de 3 h (ver Tabla 1 para detalles de adquisición).

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Resultados

La estación de trabajo quirúrgica se configura para permitir una colocación precisa de la fresa con el fin de dirigirse al ventrículo lateral (0,7 mm posterior y 1,4 mm lateral al bregma; Figura 1A,D). La línea de infusión consta de una cánula de cobre de 30 mm, un segmento de 2 m de tubo de PE y una aguja de calibre 30 conectada a una jeringa Hamilton (Figura 1B). La longitud extendida del tubo permite colocar la bomba de jeringa fuera del camp...

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Discusión

El protocolo descrito aquí integra la canulación ICV con la infusión durante la adquisición de imágenes por resonancia magnética dinámica, lo que permite una evaluación cuantitativa de todo el cerebro del transporte de trazadores en el LCR dentro de una sola sesión de imagen. Los valores, así como las limitaciones, de la infusión ICV se evalúan mejor en comparación con la infusión ICM. La infusión ICM evita la canulación transparénquimatosa y, por lo tanto, es menos invasiva. Sin embargo, dado que la cisterna magna se en...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue respaldado por los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de concesión R01NS124206 y RF1AG094791. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. La figura 4 fue creada con BioRender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja hipodérmica de 30 G × 1 pulgada con cono de plásticoExel26439
Jeringa gastight de 50 µL, punta Luer (LT)Hamilton80901
Pinzas anatómicas estrechasFine Science Tools11003-12
LCR artificialTOCRIS3525
Attane Isoflurano 1000 mg/gScanVet55226
Tubo capilar de cobre 0,32 mm de diámetro externo × 0,16 mm de diámetro internoNippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd.C1220-11-109
Clip de cobreIEUYOFEBA 1801
Hisopo de algodónPuritan868-WCS
Dotarem (inyección de gadoterato meglumina), 0,5 mmol/mLGuerbetNDC 67684-2001-1
TaladroForedomModelo SR
BrocaFine Science Tools19007-05
Soporte para taladroStoelting51630
Pinzas médicas DumontFine Science Tools11252-00, 11253-20
Pomada ocularRugbyNDC 0536
Sistema clásico de anestesia E-Z Anesthesia EZ-7000E-Z SystemsEZ-7000
Pinzas de GraefeFine Science Tools11052-10,11152-10
Almohadilla térmicaBraintree Scientific5381
Kit de cauterización de alta temperaturaFine Science Tools18010-00
Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamina)Intervet International BV511519
Adhesivo de silicona KWIK-SIL, baja toxicidad, kitWorld Precision InstrumentsKWIK-SIL
Aguja de un solo uso, estéril, 26 G, 5/8 pulgadasBD305115
Tubo de polietileno 0,61 mm de diámetro externo × 0,28 mm de diámetro internoScandidactSKU252
Rompin Vet 20 mg/mL (xilazina)KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH148999
Cuchillas de bisturíFine Science Tools10023-00
TijerasFine Science Tools91460-11, 14007-14
EspátulaFine Science Tools10090-13
Marco estereotáxicoStoelting51600U
Portaagujas quirúrgicoAgnTho’s12502-12
Bomba de jeringaNew era pump systemNE-4000
Xylocain 20 mg/mL (lidocaína)AstraZeneca158543

Referencias

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