Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Detección de antígenos de células inmunitarias intratumorales en un modelo de células semejantes a células madre de glioblastoma inmunocompetente mediante inmunohistoquímica basada en sustratos

71 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/72193

⸱

21 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

El estudio proporciona un protocolo detallado y reproducible basado en sustrato para inmunohistoquímica, destinado a la detección consistente de antígenos simples y dobles en secciones de tejido tumoral derivado de células madre de glioblastoma, fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE). El protocolo permite la identificación de diversos marcadores inmunitarios y tumorales, abordando al mismo tiempo desafíos técnicos, con posible aplicación en otros modelos de tumores.

Resumen

El glioblastoma (GBM) es la neoplasia cerebral primaria más común y letal, y carece de terapias efectivas. Se caracteriza por un microambiente tumoral profundamente inmunosupresor, impulsado en parte por células madre-like del GBM (GSC) resistentes al tratamiento. Aquí describimos protocolos reproducibles basados en sustrato de inmunohistoquímica (IHC) de un solo color y de doble color para detectar antígenos asociados a células inmunitarias infiltrantes en tumores, tanto de superficie como intracelulares, en secciones de tumores cerebrales fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE). Los tumores cerebrales se obtuvieron a partir de GSC de ratón, que fueron implantadas ortotópicamente en ratones inmunocompetentes. El protocolo de IHC de un solo color utiliza un sistema de detección cromogénico basado en peroxidasa de rábano picante (HRP) para la visualización de antígenos individuales de células inmunitarias, mientras que el protocolo de IHC de doble color emplea una estrategia de tinción secuencial basada en fosfatasa alcalina (AP) para la detección simultánea de dos antígenos de células inmunitarias dentro de la misma sección de tejido, incluyendo protocolos que utilizan anticuerpos primarios de la misma especie de origen. Estos métodos proporcionan un marco práctico y reproducible para el análisis cromogénico de antígenos asociados a células inmunitarias infiltrantes en tejidos de GBM y podrían adaptarse a otros modelos tumorales preclínicos y potencialmente a especímenes humanos FFPE.

Introducción

El glioblastoma (GBM) es un tumor cerebral primario maligno agresivo, altamente invasivo y heterogéneo, asociado con una baja supervivencia del paciente a pesar de las terapias estándar actuales1. Una característica definitoria del GBM es su microambiente tumoral (TME) profundamente inmunosupresor, que contribuye a la resistencia frente a las estrategias inmunoterapéuticas2,3. Múltiples mecanismos impulsan la inmunosupresión en el GBM, incluyendo la reducción de la infiltración de linfocitos T efector y la inducción de disfunción y agotamiento de los linfocitos T4. Además, las células madre-like del GBM (GSC), una subpoblación de células de GBM, promueven aún más el escape inmune al mantener un TME inmunológicamente «frío», caracterizado por una actividad inmune citotóxica limitada5. Estas características resaltan la importancia de caracterizar con precisión las poblaciones de células inmunitarias infiltradas en el tumor y sus estados funcionales dentro del TME del GBM.

La inmunohistoquímica (IHC) sigue siendo uno de los métodos más utilizados para evaluar la infiltración de células inmunitarias en tejidos tumorales, ya que conserva la arquitectura tisular mientras permite la visualización, localización y evaluación semicuantitativa de marcadores celulares in situ6,7,8,9,10,11,12. Estudios previos de inmunohistoquímica y perfilado inmunológico han avanzado considerablemente en nuestra comprensión del paisaje inmunitario del GBM e identificado poblaciones de células inmunitarias asociadas con la progresión tumoral y la respuesta terapéutica12,13,14,15,16. La IHC cromogénica de un solo color es particularmente útil para detectar marcadores inmunitarios individuales en secciones de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE)12,13,15,17,18,19,20. En contraste, la IHC cromogénica de doble color permite la visualización simultánea de dos marcadores dentro de la misma sección tisular, facilitando la evaluación del fenotipo celular, la proliferación o el estado de activación12,19,21.

A pesar de estos avances, los protocolos cromogénicos basados en sustratos prácticos y estandarizados aplicables a modelos de GBM derivados de CSG inmunocompetentes siguen siendo limitados. Además, la IHQ cromogénica sigue siendo más difícil en el GBM que en muchos otros tumores sólidos debido a la infiltración escasa y heterogénea de células inmunitarias, la amplia heterogeneidad intratumoral y el microambiente tumoral altamente inmunosupresor y complejo, lo que complica la visualización precisa e interpretación de múltiples poblaciones celulares dentro de la misma sección de tejido2,3,4. La IHQ cromogénica dual presenta desafíos técnicos adicionales, especialmente cuando ambos anticuerpos primarios se producen en la misma especie huésped, lo que requiere una optimización cuidadosa de la compatibilidad de los anticuerpos, una estrategia de tinción secuencial para la detección simultánea de dos antígenos dentro de la misma sección de tejido y la selección de un sustrato cromogénico que garantice una clara discriminación de los marcadores mediante microscopía óptica.

Aquí, describimos protocolos reproducibles basados en sustrato de inmunohistoquímica (IHC) de un solo color y de doble color que detectan con éxito antígenos representativos asociados a células inmunitarias infiltrantes en tumores, tanto en la superficie como intracelulares, en un modelo ortotópico inmunocompetente de GBM derivado de células madre gliomatosas 00522,23,24. Estos protocolos de IHC cromogénica basados en sustrato también pueden adaptarse a otros modelos tumorales preclínicos y potencialmente a muestras tumorales humanas en FFPE. Los tejidos cerebrales de ratón recolectados se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante la noche (~12 h) antes del procesamiento rutinario del tejido e inclusión en parafina, como se ha descrito previamente19. Los bloques en FFPE se seccionaron (5 µm de grosor19) sobre portaobjetos de vidrio microscópicos con carga positiva y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso. La IHC de un solo color utiliza un sistema de detección cromogénico basado en peroxidasa de rábano picante (HRP) con 3,3′-diaminobencidina (DAB) como sustrato para generar una señal marrón que permite la visualización de antígenos individuales mediante microscopía de luz. Este procedimiento es adecuado para detectar antígenos asociados a la membrana y antígenos intracelulares en secciones de tejido en FFPE.

La inmunohistoquímica de doble color permite la detección simultánea de dos antígenos dentro de la misma sección de tejido, pero requiere una optimización adicional para garantizar la compatibilidad de los anticuerpos y una clara separación de las señales cromogénicas. La tinción de inmunohistoquímica de doble color es relativamente sencilla cuando los anticuerpos primarios se producen en especies huésped diferentes, lo que permite el uso de anticuerpos secundarios específicos de especie. Sin embargo, la detección simultánea resulta más difícil técnicamente cuando ambos anticuerpos primarios provienen de la misma especie huésped. Para abordar este desafío, el protocolo de inmunohistoquímica de doble color descrito aquí emplea una estrategia secuencial de tinción cromogénica basada en fosfatasa alcalina (AP) utilizando sustratos distintos, lo que permite una clara discriminación visual entre las dos señales antigénicas mediante microscopía óptica.

Ambos protocolos incluyen desparafinización del tejido, rehidratación, recuperación de antígenos, bloqueo, tinción, deshidratación, aclaramiento y montaje. La preparación de los reactivos es fundamental para la calidad y la reproducibilidad de la tinción (véase el Archivo Suplementario 1). Asimismo, las diluciones adecuadas de los anticuerpos primarios también son cruciales para un protocolo de tinción exitoso, las cuales se realizan inmediatamente antes de su uso en suero normal de caballo o cabra al 2,5 %, según la especie de origen del anticuerpo secundario correspondiente (véase la Tabla 1). En la Tabla 2 también se presenta una lista de anticuerpos secundarios específicos para cada especie utilizados en tinciones monocromáticas y bicromáticas. La IHC monocromática utiliza reactivos de aclaramiento y montaje basados en xileno, mientras que la IHC bicromática requiere alternativas libres de xileno (por ejemplo, Histo-Clear), ya que el sustrato es parcialmente soluble en xileno (véase la lista de sustratos en la Tabla 3).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con todas las directrices reglamentarias e institucionales pertinentes, incluido el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (números de protocolo IACUC: 2004N000067 y LA24-0045).

NOTA: Varios pasos en los protocolos de IHC de un solo color y de doble color implican reactivos inflamables, incluyendo etanol y agentes desengrasantes de tejidos. Por lo tanto, los procedimientos que involucran sustancias químicas inflamables, como desparafinización, rehidratación, deshidratación, aclarado y montaje, deben realizarse en una campana extractora de gases químicos certificada, siguiendo las prácticas adecuadas de seguridad en el laboratorio. Los reactivos inflamables deben prepararse y almacenarse en recipientes de vidrio con tapa roscada, debidamente etiquetados, dentro de armarios designados para el almacenamiento de sustancias inflamables, de acuerdo con las directrices institucionales de seguridad. Los materiales y volúmenes de reactivos están configurados para el procesamiento por lotes de hasta 48 portaobjetos microscópicos (dos bastidores de tinción, 24 portaobjetos por bastidor), aunque el flujo de trabajo puede escalarse fácilmente según las necesidades experimentales.

1. Inmunohistoquímica de un solo color para secciones de tumor cerebral en FFPE

NOTA: El siguiente protocolo describe la IHC de un solo color basada en sustrato para la detección de antígenos superficiales e intracelulares representativos en secciones de tumores cerebrales en FFPE derivadas del modelo ortotópico de CSG 005.

  1. Desparafinización (20 min):
    1. Coloque los portaobjetos en una rejilla de polioximetileno (POM) e introduzca la rejilla en recipientes de tinción, primero en Xileno I y luego en Xileno II, durante 10 min cada uno en una campana extractora. Asegúrese de que las secciones de tejido permanezcan completamente sumergidas en xileno durante la desparafinización.
      ADVERTENCIA: Realice este paso bajo una campana extractora de gases con equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, gafas de seguridad, mascarilla facial y guantes. No permita que las secciones se sequen en esta etapa ni en ninguna de las siguientes, ya que esto puede causar daño tisular y pérdida de secciones. Almacene las soluciones de xileno en recipientes de vidrio herméticos y reutilícelas si se mantienen limpias.
  2. Rehidratación gradual (15 min):
    1. Rehidrate las secciones secuencialmente en etanol al 100 %, 90 % y 70 % durante 5 min cada uno. Para ello, sumerja los portaobjetos en etanol al 100 % en el recipiente de tinción durante 5 min (luego devuelva el etanol al 100 % al frasco de vidrio para reutilizarlo), seguido de etanol al 90 % durante 5 min (y devuélvalo al frasco), y finalmente en etanol al 70 % durante 5 min (y devuélvalo al frasco).
      ADVERTENCIA: Realice este paso bajo una campana extractora de gases y use EPP como en el paso 1.1. Estas soluciones de etanol pueden reutilizarse en diferentes experimentos si se almacenan en recipientes de vidrio herméticos, siempre que se mantengan limpias.
  3. Lavado con agua (5 min):
    1. Coloque los portaobjetos en agua destilada durante 5 min, completando así el proceso de rehidratación.
      NOTA: Mientras realiza este paso, prepare 600 mL (para 1 rejilla de portaobjetos) a 800 mL (para 2 rejillas de portaobjetos) de solución tampón 1× para recuperación de antígenos (tampón de citrato sódico 10 mM) en un vaso de precipitados de vidrio de 2 L apto para microondas, según las instrucciones indicadas en el Archivo Suplementario 1.
  4. Recuperación de antígenos (~20 min):
    1. Cubra el vaso de precipitados de 2 L que contiene la solución recién preparada de tampón de recuperación de antígenos de citrato sódico 10 mM con papel de plástico para evitar una evaporación excesiva durante el precalentamiento y el calentamiento prolongado en el microondas.
    2. Haga varios orificios en el papel de plástico para evitar que el tampón salga proyectado debido a la presión excesiva generada durante la ebullición de las secciones de tejido.
      NOTA: Use EPP como en el paso 1.1.
    3. Precaliente la solución recién preparada de tampón de recuperación de antígenos de citrato sódico 10 mM durante 3 min. Coloque la rejilla de portaobjetos con las secciones de tejido rehidratadas en la solución de recuperación de antígenos previamente calentada.
    4. Luego trate las secciones de tejido en el microondas durante 15 min a potencia máxima (por ejemplo, P10), vigilando cuidadosamente el vaso para asegurarse de que las secciones permanezcan sumergidas y no se sequen por evaporación.
      NOTA: Alternativamente, puede realizarse la recuperación de antígenos en una bandeja de tinción de plástico colocada dentro de una olla de vapor durante aproximadamente 15 min, lo cual proporciona un método de calentamiento más suave con menos necesidad de vigilancia. El tampón de citrato sódico (10 mM, pH 6,0) fue validado con éxito y utilizado como tampón de recuperación de antígenos para todos los anticuerpos primarios listados en Tabla 1. Dependiendo del anticuerpo primario y de las recomendaciones del fabricante, pueden requerirse otros tampones, como EDTA o Tris-EDTA, para anticuerpos no evaluados en este estudio. 
  5. Enfriamiento (10–20 min):
    1. Retire el vaso de precipitados del microondas, colóquelo sobre la mesa de trabajo y déjelo enfriar a temperatura ambiente durante 20 min. Para acelerar el enfriamiento, coloque el vaso en agua del grifo fría con hielo durante ~10 min.
      ADVERTENCIA: Estará extremadamente caliente; use guantes resistentes al calor o pinzas para manipularlo. Use EPP como en el paso 1.1.
  6. Lavado con solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco (DPBS) (~10 min):
    1. Retire la rejilla de portaobjetos del vaso y sumerja los portaobjetos en solución 1× DPBS en el recipiente de tinción.
    2. Lave las secciones dos veces en DPBS 1× durante 5 min cada vez, utilizando lavados suaves y estáticos para evitar la desprendimiento del tejido.
  7. Barrera hidrófoba (<1 min/portaobjetos):
    1. Durante el lavado con DPBS (paso 1.6), retire cuidadosamente cada portaobjetos individualmente, limpie suavemente alrededor de la sección de tejido con toallitas sin pelusa (por ejemplo, Kim Wipes), evitando el contacto con el tejido mismo.
    2. Utilice una barrera hidrófoba, como un bolígrafo peroxidasa-antiperoxidasa (PAP), para trazar una barrera repelente al líquido alrededor de cada sección de tejido, luego devuelva el portaobjetos a la solución de lavado DPBS 1× en el recipiente de tinción. Repita estos pasos para todos los portaobjetos.
      NOTA: Una barrera hidrófoba alrededor del tejido evita el desbordamiento de reactivos entre secciones y ayuda a retener los anticuerpos sobre el tejido.
  8. Bloqueo de peroxidasa endógena (5 min):
    1. Deseche el DPBS 1× del recipiente de tinción, luego añada solución de H₂O₂ al 3 %, asegurándose de que los portaobjetos o secciones de tejido queden completamente sumergidos durante 5 min.
      NOTA: Una incubación prolongada en H₂O₂ al 3 % puede dañar el tejido. El bloqueo de la actividad de peroxidasa endógena es un paso crucial para prevenir el fondo causado por la peroxidasa endógena durante el desarrollo del color. Use EPP como en el paso 1.1.
  9. Lavado con DPBS (~12 min):
    1. Deseche la solución de H₂O₂ al 3 % y lave nuevamente los portaobjetos en DPBS 1× dos veces durante 5 min cada vez.
    2. Después del segundo lavado, retire los portaobjetos de la rejilla, colóquelos planos en la cámara humidificada y añada agua destilada a los bordes de la cámara humidificada.
    3. No permita que las secciones se sequen; continúe inmediatamente al bloqueo en el paso 1.10.
      NOTA: Cada cámara humidificada listada en la Tabla de Materiales tiene espacio y puede acomodar 30 portaobjetos.
  10. Bloqueo con suero (~70 min):
    1. Añada 50 µL de solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 5 % por sección e incube durante 30 min a temperatura ambiente, manteniendo la tapa de la cámara humidificada colocada para evitar la evaporación del tampón de bloqueo de las secciones de tejido.
    2. Después de 30 min, sacuda suavemente los portaobjetos sobre toallitas sin pelusa colocadas en la mesa de trabajo para desechar la BSA.
    3. Luego, añada suero normal de caballo o cabra al 2,5 % (una gota por sección), coincidiendo con la especie de origen del anticuerpo secundario, e incube las secciones durante 30 min adicionales a temperatura ambiente con la tapa de la cámara humidificada colocada, sacuda suavemente los portaobjetos sobre papel absorbente o toallitas sin pelusa para eliminar el suero, y continúe inmediatamente al paso 1.11.
      NOTA: No permita que las secciones se sequen. Prepare los anticuerpos primarios diluidos en el tampón de bloqueo adecuado (véase Tabla 1) cerca del final del paso de bloqueo para que estén listos para usar en el paso 1.11 una vez completado el bloqueo.
  11. Incubación con anticuerpo primario (~16 h):
    1. Aplique ~50 µL de anticuerpos primarios, diluidos óptimamente en el tampón de bloqueo adecuado (véase Tabla 1), sobre las secciones de tejido e incube durante la noche (~16 h) a 4 °C en una cámara humidificada.
      NOTA: Asegúrese de que las áreas designadas de la cámara humidificada estén llenas de agua destilada para mantener la humedad durante la noche. Además, tome precauciones para garantizar que las áreas/cámaras designadas para los portaobjetos de tejido no se llenen de agua destilada, ya que esto podría causar inundación de las secciones de tejido.
  12. Lavado con DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min):
    1. Coloque una rejilla de portaobjetos en un recipiente de tinción y llénelo con tampón de lavado (DPBS 1×, 0,1 % Tween 20).
    2. Después de la incubación nocturna, retire los portaobjetos de la cámara humidificada, deseche los anticuerpos primarios sacudiendo suavemente los portaobjetos sobre papel absorbente, luego coloque los portaobjetos en una rejilla sumergida en tampón de lavado (DPBS 1×, 0,1 % Tween 20) en un recipiente de tinción, y deseche el tampón de lavado.
    3. Luego, lave las secciones en DPBS 1× (0,1 % Tween 20) tres veces, durante 5 min cada vez, y luego retire los portaobjetos de la rejilla y colóquelos planos en la cámara humidificada, y continúe inmediatamente al paso 1.13.
      NOTA: Cada tiempo de lavado puede extenderse a 10–15 min si se observa un fondo de tinción elevado tras el desarrollo del color en el paso 1.15. Los lavados deben ser suaves y estáticos (sin agitación ni balanceo) para evitar el desprendimiento del tejido de los portaobjetos.
  13. Incubación con anticuerpo secundario (~32–35 min):
    1. Añada una gota/sección del anticuerpo secundario conjugado con HRP adecuado (anti-conejo o anti-rata IgG, según corresponda; véase Tabla 2) e incube las secciones de tejido durante 30 min a temperatura ambiente con la tapa de la cámara humidificada colocada.
      NOTA: El anticuerpo secundario puede diluirse 1:1 en PBS para reducir el fondo en el paso 1.15.
  14. Lavado con DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min):
    1. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, retire los portaobjetos de la cámara humidificada y sacuda suavemente sobre papel absorbente para desechar los anticuerpos secundarios.
    2. Luego, coloque los portaobjetos en una rejilla sumergida en tampón de lavado (DPBS 1× con 0,1 % Tween 20) dentro de un recipiente de tinción para un lavado breve, y deseche el tampón de lavado.
    3. Luego, lave las secciones de tejido tres veces con DPBS 1× (0,1 % Tween 20) durante 5 min cada vez.
      1. Antes de iniciar el paso de desarrollo del cromógeno (es decir, paso 1.15), coloque una rejilla de portaobjetos separada en un recipiente de tinción lleno de agua destilada, un paso preparatorio para el paso 1.16, para detener la reacción cromogénica.
      2. Durante el lavado final, prepare frescamente la solución de trabajo de DAB (1 gota de cromógeno por 1 mL de sustrato; véase Archivo Suplementario 1).
  15. Desarrollo del cromógeno (30 s–5 min):
    1. Después del tercer lavado en el paso 1.14, retire los portaobjetos de la rejilla y colóquelos planos sobre la mesa de trabajo con un fondo blanco.
    2. Aplique 50 µL de solución de trabajo de DAB a cada sección y observe visualmente el desarrollo del color marrón sobre un fondo blanco o bajo un microscopio de luz.
      NOTA: Use EPP como en el paso 1.1. El uso de papel absorbente blanco ayuda a visualizar el desarrollo del color marrón durante la etapa de cromógeno DAB. El desarrollo del color puede tardar de 20 a 60 s para algunos marcadores y de 2 a 5 min para otros (véanse detalles en el paso 1.16).
  16. Detención de la reacción (1–2 min):
    1. En cuanto aparezca la señal de color marrón deseada en el paso 1.15, detenga inmediatamente la reacción sumergiendo el portaobjetos en un recipiente con agua destilada preparado en el paso 1.14.3.1.
    2. Mantenga los portaobjetos enjuagados en agua destilada durante 1 min. Deseche el agua destilada y continúe al paso 1.17 (contratinción).
      NOTA: Los portaobjetos pueden permanecer en agua destilada hasta 1 h sin afectar la tinción. El tiempo requerido para el desarrollo del color determina cuándo iniciar el paso de detención de la reacción. Además, si hay 2–3 marcadores (como CD3, CD4, CD8 u otros) en el mismo portaobjetos (como es el caso en este estudio), los tiempos de reacción pueden variar; por ejemplo, en el sistema descrito aquí, el desarrollo del color generalmente toma alrededor de 30 s para células CD8+, 1–3 min para células CD3+ o CD4+, o más tiempo (3–5 min) para células Granzima B+ y Ki67+. Debido a las diferencias en los tiempos de desarrollo del color, no se puede sumergir toda la lámina en agua destilada para detener la reacción. En su lugar, detenga cada reacción individualmente para cada sección añadiendo 200–300 µL de agua destilada directamente sobre cada sección.
  17. Contratinción (<1 min):
    1. Para mejorar el contraste con la tinción marrón, añada hematoxilina diluida (1:3 en agua destilada) al recipiente de tinción, asegurándose de que los portaobjetos permanezcan sumergidos en hematoxilina diluida durante ~10–20 s.
      NOTA: Si el fondo de DAB es intenso, realice una contratinción más prolongada (hasta 1 min) o use hematoxilina sin diluir brevemente.
  18. Lavado con agua del grifo (6 min):
    1. Deseche la hematoxilina del recipiente de tinción y devuélvala al frasco de vidrio para reutilizarla.
    2. Lave los portaobjetos en agua del grifo durante 1 min, luego enjuáguelos con agua del grifo corriente lenta durante 5 min, manteniendo las secciones orientadas lejos del flujo directo de agua. Deseche el agua del grifo y continúe al paso 1.19.
      NOTA: Los pasos restantes hasta el montaje se realizan en una campana extractora.
  19. Deshidratación gradual (15–17 min):
    1. Sumerja los portaobjetos en etanol al 70 % en el recipiente de tinción durante 5 min (luego devuelva el etanol al 70 % al frasco de vidrio para reutilizarlo), seguido de etanol al 90 % durante 5 min (y devuélvalo al frasco), y finalmente en etanol al 100 % durante 5 min (y devuélvalo al frasco).
    2. Continúe al paso 1.20.
      NOTA: Realice este paso en una campana extractora de gases. Las mismas soluciones de etanol del paso 1.2 se utilizan en este paso de deshidratación y pueden reutilizarse muchas veces si se mantienen limpias.
  20. Clarificación:
    1. Utilice las mismas soluciones de Xileno I y II empleadas para la desparafinización (paso 1.1) para limpiar las secciones de tejido/portaobjetos.
    2. Primero, sumerja los portaobjetos en la solución de Xileno I en el recipiente de tinción durante 10 min (luego devuelva el Xileno I al frasco de vidrio para reutilizarlo) y luego en la solución de Xileno II durante 10 min adicionales.
    3. Mantenga los portaobjetos en Xileno II hasta que finalice el montaje (es decir, paso 1.21).
      NOTA: Nunca permita que las secciones se sequen durante este paso, ya que las secciones secas se vuelven frágiles; por lo tanto, si es necesario, las secciones pueden permanecer más tiempo en Xileno II para el montaje.
  21. Montaje:
    1. Retire los portaobjetos uno por uno del Xileno II y colóquelos planos en una campana extractora de gases. Coloque una gota de medio de montaje a base de xileno sobre un cubreobjetos del tamaño adecuado, luego coloque el cubreobjetos sobre el portaobjetos, con el medio de montaje enfrentado a las secciones de tejido.
    2. Presione suavemente el cubreobjetos con el pulgar para distribuir uniformemente el medio de montaje sobre las tres secciones y eliminar burbujas de aire.
      NOTA: Se requiere un cubreobjetos de 24 × 50 mm para cubrir tres secciones en un portaobjetos; un cubreobjetos de 24 × 40 mm para dos secciones; y un cubreobjetos de 24 × 24 mm para una sección. Es importante completar el montaje dentro de los 30 s por portaobjetos porque el medio de montaje puede secarse rápidamente debido al flujo constante de aire en la campana extractora, haciendo que el Xileno II se evapore rápidamente del portaobjetos y las secciones se vuelvan frágiles.
  22. Secado al aire y microscopía de luz:
    1. Deje secar los portaobjetos al aire en la campana extractora durante al menos 2 h antes de evaluarlos e imaginarlos mediante microscopía de luz. Una vez secos, almacene los portaobjetos montados en cajas de portaobjetos a temperatura ambiente durante años.

2. Inmunohistoquímica de doble color para secciones de tumor cerebral en FFPE

NOTA: El siguiente protocolo describe un procedimiento de inmunohistoquímica cromogénica de dos colores basado en sustrato para la detección simultánea de dos antígenos dentro de la misma sección de tumor cerebral incluido en parafina (FFPE). En comparación con la inmunohistoquímica de un solo color, el procedimiento de dos colores requiere más tiempo porque implica ciclos de tinción secuenciales con incubaciones independientes de anticuerpos primarios, incluyendo pasos de incubación nocturna para cada ronda de tinción. Sin embargo, este procedimiento prolongado permite una detección simultánea confiable de antígenos dentro de la misma sección de tejido, preservando la morfología tisular y manteniendo una clara separación de las señales cromogénicas mediante microscopía óptica.

  1. Desparafinización (20 min):
    1. Siga el mismo proceso de desparafinización descrito anteriormente para IHC de un solo color en el paso 1.1 en una campana extractora de gases, pero utilice agentes desengrasantes que no contengan xileno (por ejemplo, Histo-Clear I y Histo-Clear II en lugar de xileno).
      ADVERTENCIA: Use EPP como en el paso 1.1 y realice este paso bajo una campana extractora de gases. Se recomienda Histo-Clear porque el cromógeno es parcialmente soluble en xileno, y el procesamiento libre de xileno ayuda a preservar la intensidad de la tinción durante la IHC de doble color. No permita que los cortes se sequen. Estas soluciones desengrasantes pueden reutilizarse si se almacenan en recipientes de vidrio herméticos y se mantienen limpias.
  2. Rehidratación gradual (15 min):
    1. Igual que en IHC de un solo color según lo descrito en el paso 1.2. Rehidrate los cortes secuencialmente con una disminución gradual de la concentración de etanol (100 %, 90 % y 70 %) durante 5 min en cada paso.
      ​NOTA: Aquí se utiliza un conjunto separado de etanol graduado sin xileno, ya que el etanol graduado usado para IHC de un solo color en el paso 1.2 probablemente esté contaminado con Xileno II.
  3. Lavado con agua (5 min):
    1. Igual que en IHC de un solo color en el paso 1.3; coloque los portaobjetos en agua destilada durante 5 min para completar el proceso de rehidratación.
      ​NOTA: Igual que en el paso 1.3; prepare la solución de recuperación de antígenos durante este período de 5 min.
  4. Recuperación de antígenos (~20 min): Siga el mismo procedimiento de recuperación de antígenos descrito para IHC de un solo color en el paso 1.4.
  5. Enfriamiento (10–20 min): Siga el mismo proceso de enfriamiento descrito para IHC de un solo color en el paso 1.5.
  6. Lavado con DPBS (10 min): Siga el proceso de lavado de la solución de recuperación de antígenos descrito para IHC de un solo color en el paso 1.6.
  7. Barrera hidrófoba (<1 min/portaobjetos):
    1. Durante el lavado con DPBS en el paso 2.6, cree una barrera hidrófoba alrededor de los cortes de tejido siguiendo el mismo proceso/protocolo que en el paso 1.7.
    2. Utilice un rotulador de barrera hidrófoba para trazar una barrera repelente de líquidos alrededor de cada corte de tejido, luego devuelva el portaobjetos a la solución de lavado en el recipiente de tinción. Repita estos pasos para todos los portaobjetos.
  8. Bloqueo de fosfatasa alcalina (5 min):
    1. Después de completar las barreras hidrófobas en todos los cortes de tejido, retire los portaobjetos del recipiente de tinción, colóquelos planos en la cámara humidificada, añada una gota de solución bloqueadora de fosfatasa alcalina endógena (por ejemplo, BLOXALL) por corte y incube los cortes durante 5 min. Pase inmediatamente al paso 2.9.
      ​NOTA: Dado que en el protocolo de IHC de doble color se utilizan anticuerpos secundarios conjugados con AP, es esencial bloquear la actividad de la fosfatasa alcalina endógena para reducir la señal de fondo durante el desarrollo del color rojo o azul. Aquí se utiliza la solución bloqueadora BLOXALL para inhibir la fosfatasa alcalina endógena. También inhibe la peroxidasa endógena, por lo que esta solución bloqueadora puede utilizarse también en el protocolo de IHC de un solo color para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, en lugar de la solución de H₂O₂ al 3 %.
  9. Lavado con DPBS (10 min):
    1. Lave los portaobjetos en solución DPBS 1× en el recipiente de tinción dos veces durante 5 min cada vez.
    2. Después del segundo lavado, retire los portaobjetos del recipiente de tinción, colóquelos planos en la cámara humidificada y añada agua destilada a los bordes de la cámara humidificada.
      NOTA: No permita que los cortes se sequen; pase inmediatamente al bloqueo de la unión no específica antígeno-anticuerpo en el paso 2.10.
  10. Bloqueo con suero (~70 min):
    1. Siga el mismo proceso de bloqueo con suero que en el protocolo de IHC de un solo color descrito en el paso 1.10.
      1. Primero, bloquee con tampón bloqueador universal (BSA al 5 %; 50 µL/corte) durante 30 min a temperatura ambiente y luego con suero de caballo normal al 2,5 % (una gota/corte), que coincida con la especie huésped del anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con AP, durante otros 30 min a temperatura ambiente con la tapa de la cámara humidificada colocada.
      2. Después de este período, sacuda suavemente los portaobjetos sobre papel absorbente para desechar el suero y pase al paso 2.11.
        NOTA: Prepare el anticuerpo primario I (véase Tabla 1) durante el último minuto del paso de bloqueo, como se describe en el paso 1.10.
  11. Incubación con anticuerpo primario I (~16 h):
    1. Siga el mismo proceso de incubación con el anticuerpo primario que en el paso 1.11. Por ejemplo, añada aproximadamente 50 µL de anticuerpo anti-CD3 de conejo, diluido 1:100 en suero de caballo normal al 2,5 % (véase Tabla 1), a cada corte de tejido.
    2. Incube durante la noche (~16 h) a 4 °C en una cámara humidificada.
  12. Lavado con DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min):
    1. Siga el mismo procedimiento de lavado (3 pasos de lavado, 5 min cada uno) descrito para el protocolo de IHC de un solo color en el paso 1.12.
    2. Después del tercer lavado, coloque los portaobjetos planos dentro de la cámara humidificada. Pase inmediatamente al paso 2.13.
      NOTA: Mismas notas que en el paso 1.12, por ejemplo, cada tiempo de lavado puede extenderse a 10–15 min, y el lavado debe ser suave y estático. No permita que los cortes se sequen.
  13. Incubación con anticuerpo secundario I (~32–35 min):
    1. Añada una gota por corte del anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con AP (véase Tabla 2) e incube los cortes de tejido durante 30 min a temperatura ambiente con la tapa de la cámara humidificada colocada.
      NOTA: El anticuerpo secundario puede diluirse 1:1 en PBS para reducir el fondo en el paso 2.15.
  14. Lavado con DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min):
    1. Siga el mismo procedimiento de lavado con DPBS 1×/0,1 % Tween 20, como en el paso 1.14.
    2. NOTA: Durante el último paso de lavado, prepare fresca la solución de trabajo del sustrato (5 mL, como se recomienda; véase Tabla 3) según las instrucciones del fabricante (véase preparación de reactivos en Archivo Suplementario 1).
  15. Desarrollo del color rojo (12–15 min):
    1. Después de completar el paso 2.14, coloque los portaobjetos planos sobre la mesa de trabajo con un fondo blanco, como papel absorbente blanco, como se describe en el paso 1.15.
    2. Mezcle bien la solución de trabajo del sustrato rojo recién preparada, luego añada 50 µL a cada corte de tejido (deseche cualquier solución sobrante).
    3. Incube los cortes de tejido a temperatura ambiente hasta que aparezca el color rojo, revisando periódicamente cada 2–3 min frente a un fondo blanco o bajo microscopía de luz.
      NOTA: El tiempo necesario para el desarrollo del color rojo varía según los marcadores y puede tardar entre 20 y 30 min. Sin embargo, para la tinción de células CD3+ en cortes de tumores cerebrales 005 con el sistema de detección AP, el desarrollo del color rojo suele ocurrir dentro de los 12–15 min.
  16. Lavado con tampón (5 min):
    1. En cuanto aparezca la señal de color rojo deseada en el paso 2.15, lave los cortes en DPBS 1×/0,1 % Tween 20 durante 5 min en un recipiente de tinción.
    2. Durante este tiempo de lavado, prepare fresco el anticuerpo primario II en un tampón bloqueador adecuado (por ejemplo, anticuerpo anti-Ki67 de conejo diluido 1:100 en suero de caballo normal al 2,5 %; véase Tabla 1).
      NOTA: A diferencia del lavado con agua destilada usado en IHC de un solo color (paso 1.16), aquí se utiliza DPBS/0,1 % Tween 20 no solo para detener la reacción, sino también para lavar rigurosamente el exceso de cromógeno y preparar el segundo ciclo de tinción.
  17. Incubación con anticuerpo primario II (~16 h):
    1. Lleve los portaobjetos a una cámara humidificada y añada aproximadamente 50 µL de anticuerpo anti-Ki67 de conejo recién preparado a cada corte de tejido. Incube durante la noche (~16 h) a 4 °C.
  18. Lavado con DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min):
    1. Siga el mismo procedimiento que en el paso 1.12.
    2. Después del tercer lavado, retire los portaobjetos del recipiente de tinción y colóquelos planos en la cámara humidificada. Pase inmediatamente al paso 2.19.
  19. Incubación con anticuerpo secundario II (~32–35 min):
    1. Siga el mismo procedimiento que en el paso 2.13. Añada una gota por corte del anti-IgG de conejo conjugado con AP (véase Tabla 2) e incube los cortes de tejido durante 30 min a temperatura ambiente con la tapa de la cámara humidificada colocada.
  20. Lavado con DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min):
    1. Siga el mismo procedimiento de lavado con DPBS 1×/0,1 % Tween 20, como en el paso 1.14.
      NOTA: Durante el último paso de lavado, prepare fresca la solución de trabajo del sustrato (5 mL, como se recomienda; véase Tabla 3) según las instrucciones del fabricante (véase preparación de reactivos en Archivo Suplementario 1).
  21. Desarrollo del color azul (10–12 min):
    1. Después de completar el paso 2.20, coloque los portaobjetos planos sobre la mesa de trabajo con un fondo blanco.
    2. Mezcle bien la solución de trabajo del sustrato azul recién preparada, luego añada 50 µL a cada corte de tejido (deseche cualquier solución sobrante).
    3. Incube los cortes de tejido a temperatura ambiente hasta que aparezca el color azul, revisando periódicamente cada 2–3 min frente a un fondo blanco o bajo microscopía de luz.
      NOTA: Al igual que el desarrollo del color rojo en el paso 2.15, el tiempo necesario para el desarrollo del color azul puede tardar entre 20 y 30 min. Sin embargo, para la tinción de células Ki67+ en cortes de tumores cerebrales 005 con el sistema de detección AP, el color azul se desarrolla dentro de los 10–12 min.
  22. Lavado con tampón (5 min):
    1. En cuanto aparezca la señal de color azul deseada en el paso 2.21, sumerja los cortes en DPBS 1×/0,1 % Tween 20 durante 5 min en un recipiente de tinción. Deseche la solución de lavado.
  23. Lavado con agua (1 min): Lave los cortes en agua destilada durante 1 min. Deseche el agua destilada después del lavado.
  24. Desecación gradual (15–17 min):
    1. Sumerja los portaobjetos en etanol al 70 % en el recipiente de tinción durante 5 min (luego devuelva el etanol al 70 % al frasco de vidrio para reutilizarlo), seguido de etanol al 90 % durante 5 min (luego devuélvalo al frasco) y finalmente en etanol al 100 % durante 5 min (luego devuélvalo al frasco).
    2. Repita cada paso en una campana extractora. Pase al paso 2.25.
      NOTA: Se utilizan las mismas soluciones de etanol (sin xileno) del paso 2.2 en este paso de desecación y pueden reutilizarse muchas veces si se mantienen limpias.
  25. Clarificación sin xileno:
    1. Utilice las mismas soluciones sin xileno (es decir, Histo-Clear) usadas en el paso 2.1 para limpiar los cortes/porteobjetos.
      1. Primero, sumerja los portaobjetos en la solución sin xileno I en el recipiente de tinción durante 10 min (luego devuelva la solución sin xileno I al frasco de vidrio para reutilizarla) y luego en la solución sin xileno II durante otros 10 min.
      2. Mantenga los portaobjetos en la solución sin xileno II hasta que finalice el montaje (es decir, el paso 2.26).
        NOTA: Los cortes pueden permanecer más tiempo en la solución sin xileno II, si es necesario, para el montaje.
        ADVERTENCIA: Use EPP como en el paso 1.1 y realice este paso bajo una campana extractora de gases.
  26. Montaje sin xileno:
    1. Retire los portaobjetos uno por uno de la solución sin xileno II y colóquelos planos en una campana extractora. Coloque una gota de medio de montaje sin xileno sobre un cubreobjetos del tamaño adecuado, luego coloque el cubreobjetos sobre el portaobjetos, con el medio de montaje enfrentado hacia los cortes de tejido.
    2. Presione suavemente el cubreobjetos con el pulgar para distribuir uniformemente el medio de montaje en los tres cortes y eliminar burbujas de aire.
      NOTA: Complete el montaje en menos de 30 s por portaobjetos, ya que el medio de montaje puede secarse rápidamente. Use EPP como en el paso 1.1 y realice este paso bajo una campana extractora de gases.
  27. Secado al aire y microscopía de luz: Deje secar los portaobjetos al aire en la campana extractora durante al menos 2 h antes de evaluarlos e imaginarlos mediante microscopía de luz. Una vez secos, los portaobjetos montados pueden almacenarse en cajas de portaobjetos a temperatura ambiente durante años.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La IHC de un solo color utilizando el sistema de detección cromogénico basado en HRP produjo una tinción clara y reproducible en secciones de tumor cerebral FFPE 005. En la Figura 1 se muestran imágenes representativas de la tinción de antígenos de superficie, que demuestran la detección exitosa de marcadores de linfocitos T (CD3, CD4, CD8), marcadores de macrófagos asociados al tumor (TAM) (CD68, F4/80) y la molécula del punto de control inmunitario ligando 1 de muerte programada (PD-L1). E...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este estudio describe un protocolo cromogénico inmunohistoquímico basado en sustrato detallado y reproducible para la detección monocromática y bicromática de antígenos superficiales e intracelulares en tejidos de tumores cerebrales incluidos en parafina (FFPE) derivados de un modelo ortotópico de CSG. El objetivo principal de este estudio fue metodológico, con el fin de establecer un protocolo práctico, paso a paso, para la detección fiable de antígenos mediante técnica cromogénica en tejidos de GBM inmunocompetentes.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

S.D.R. es coinventor de patentes relacionadas con virus oncolíticos del herpes simple, propiedad y gestión de la Universidad de Georgetown y el Hospital General de Massachusetts, que han recibido regalías de Amgen y Acti\Vec Inc., y que ha actuado como consultor y ha recibido honorarios de Replimune, Cellinta y Greenfire Bio, así como honorarios y acciones de EG 427. Los demás autores declaran que este manuscrito fue preparado en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

D.S. recibió apoyo parcialmente por medio de un fondo del Colegio de Ciencia y Tecnología de la Universidad Estatal Agrícola y Técnica de Carolina del Norte (NCA&T), una beca de la Cátedra de Facultad (GRADS-4C) en NCA&T, y una subvención del NIH (1R16NS147983-01). Asimismo, S.D.R. recibió apoyo parcialmente por la Cátedra Thomas A. Pappas en Neurociencias, mientras que R.H.N. recibió apoyo parcialmente por una subvención del NIH (1R35GM153737). Agradecemos al Dr. Inder Verma y al Dr. Yasushi Soda por los GSC 005.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Botellas de vidrio de 2 L CorningCORN1395-2LUtilizadas para la preparación y almacenamiento de DPBS 10×, DPBS 1×, agua destilada y tampón de citrato sódico
Probeta de vidrio Pyrex de 2 L Corning1000-2LUtilizada para la recuperación de antígenos mediada por microondas en tampón de citrato sódico (volumen de trabajo de 600–800 mL)
Suero normal de caballo al 2,5% o suero normal de cabraSe suministran preparados junto con los anticuerpos secundarios de Vector Laboratories. Se utilizan para bloqueo específico de especie y dilución de anticuerpos, dependiendo de la especie huésped del anticuerpo secundario (IgG anti-conejo o anti-rata), con el fin de minimizar la unión no específica y la tinción de fondo
Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30%Fisher ScientificBP2633500
Botellas de vidrio de 500 mLVWR InternationalVWRU10754-818Utilizadas para la preparación y almacenamiento de reactivos inflamables para IHC de un solo color y reactivos libres de xileno para IHC de doble color
Papel absorbente para banco con KimwipesUtilizado durante los procedimientos de tinción para eliminar el exceso de anticuerpo o solución de lavado de las secciones de tejido antes de las incubaciones posteriores, minimizando el arrastre de reactivos y la contaminación cruzada
Anti-CD3eAbcamab5690
Anti-CD4 eBioscience14-9766-80
Anti-CD68Abcamab125212
Anti-CD8a eBioscience14-0808-80
Anti-Caspasa-3 escindidaCST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
Anti-GFPAbcamab183734
Anti-Granzima BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
Anti-PD-L1Abcamab205921
Anti-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP anti-IgG de conejoVector LaboratoriesMP-5401
AP anti-IgG de rataVector LaboratoriesMP-5404-15
Solución bloqueante BLOXALLVector LaboratoriesSP-6000-100Utilizada principalmente en IHC de doble color para inhibir la actividad de peroxidasa y fosfatasa alcalina endógenas
Albúmina sérica bovina (BSA)Bioworld22070007-2Utilizada para preparar un tampón bloqueante universal al 5% para reducir la unión no específica
Medio de montaje permanente Cytoseal 60 Electron Microscopy Sciences18006Medio de montaje compatible con xileno, utilizado para IHC de un solo color
Sustrato y cromógeno DABDAKOK346811-2Utilizado para la detección cromogénica de un solo color basada en HRP. Preparar inmediatamente antes de usar, añadiendo 1 gota de cromógeno a 1 mL de sustrato DAB según las instrucciones del fabricante’s. La solución de trabajo no utilizada debe desecharse tras la preparación. El DAB es un posible carcinógeno y debe manipularse de acuerdo con las directrices institucionales de bioseguridad y seguridad química
Agua destiladaUtilizada para la preparación de reactivos, lavados y preparación de tampones. También puede utilizarse agua ultrapura o Milli-Q
DPBS (salina tamponada con fosfato de Dulbecco’s) Corning55-031-PC
Etileno, 200 pruebas Decon Labs2701
Portaobjetos microscópicos Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Portaobjetos de vidrio con carga positiva para secciones de tejido
Cubreobjetos de vidrioCorning o Milipore SigmaSe deben seleccionar tamaños adecuados según el número de secciones de tejido por portaobjeto. Los tamaños comunes incluyen: 24 mm × 24 mm (una sección de tejido), 24 mm × 40 mm (dos secciones de tejido), 24 mm × 50 mm (tres secciones de tejido)
HematoxilinaFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)Electron Microscopy Sciences64111-01Agente de aclarado libre de xileno utilizado para IHC de doble color. Preparar dos botellas de 500 mL etiquetadas como Histo-Clear I y Histo-Clear II
HRP anti-IgG de ratónVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP anti-IgG de conejoVector LaboratoriesMP-7401
HRP anti-IgG de rataVector LaboratoriesMP-7444-15
Cámaras humedecidas Stellar ScientificHS-120879Para la incubación de secciones de tejido con anticuerpos primarios y secundarios
Pluma de barrera hidrófoba (pluma PAP)Vector LaboratoriesH-4000Utilizada para crear una barrera repelente al agua alrededor de las secciones de tejido para retener anticuerpos y reactivos durante la incubación y prevenir la contaminación cruzada entre múltiples secciones de tejido en el mismo portaobjeto
KimwipesKimtech Science34155Utilizados para la eliminación suave de reactivos residuales y tampón de lavado de las secciones de tejido
Agitador magnético IKAI-10001529Para la preparación de soluciones stock de citrato sódico y DPBS
Horno de microondasPanasonic (Modelo: NN-L931BF)SN: 6H61050036Capacidad de 2,2 pies cúbicos. Requerido para la recuperación de antígenos mediada por calor utilizando una probeta de vidrio de 2 L
Microscopio de luz Nikon NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798, Sola light engine 5M5-LCR-VA sn: 11787, Software: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Cámaras: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (color) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (B/N)
Medidor de pH VWR International77619-152Para ajustar el pH del tampón de recuperación de antígenos
Papel plásticoFisher Scientific01810Utilizado para cubrir ligeramente el tampón de recuperación de antígenos durante el calentamiento en microondas para minimizar la evaporación y prevenir el secado del tejido
Portaportaobjetos de polioximetileno (POM) MopecSP234Compatible con los recipientes de tinción anteriores; cada soporte sostiene hasta 24 portaobjetos
Balanza de precisión Mettler Toledo30697420Para pesar citrato sódico y polvo de DPBS
RefrigeradorThermo ScientificTSG3005CAPara el almacenamiento de reactivos y anticuerpos sensibles a la temperatura
Cajas de almacenamiento de portaobjetosFisher Scientific22-267294
Recipientes o platos de tinción MopecSP233Cada recipiente acomoda un soporte de tinción de 24 portaobjetos
Varillas de agitación Fisher Scientific14-512-128Para la preparación de soluciones stock de citrato sódico y DPBS
Dihidrato de citrato trisódico Thermo Scientific ChemicalsAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
Medio de montaje permanente VectaMount PT Vector LaboratoriesH-5600-60Medio de montaje permanente libre de xileno utilizado para IHC de doble color
Kit de sustrato de fosfatasa alcalina Vector Blue Vector LaboratoriesSK-5300Utilizado para el desarrollo de señal cromogénica azul durante IHC de doble color basada en AP. Dado que Vector Blue es parcialmente soluble en xileno, deben utilizarse agentes de aclarado y medios de montaje libres de xileno en los protocolos de tinción de doble color
Kit de sustrato de fosfatasa alcalina Vector RedVector LaboratoriesSK-5100Utilizado para el desarrollo de señal cromogénica roja durante IHC de doble color basada en AP
Xileno (1 L) StatLab8400-1Utilizado como agente de desparafinización y aclarado para IHC de un solo color. Preparar dos botellas de 500 mL etiquetadas como Xileno I y Xileno II

Referencias

  1. Sipos D, et al. Glioblastoma: Clinical presentation, multidisciplinary management, and long-term outcomes. Cancers (Basel). 2025;17(1):146.
  2. Himes BT, et al. Immunosuppression in glioblastoma: Current understanding and therapeutic implications. Front Oncol. 2021;11:770561.
  3. Lin H, et al. Understanding the immunosuppressive microenvironment of glioma: mechanistic insights and clinical perspectives. J Hematol Oncol. 2024;17(1):31.
  4. Puviindran BJ, et al. Within and beyond the tumor: Mechanisms of glioblastoma-induced immunosuppression. Neurooncol Adv. 2025;7(Suppl 4):iv4-iv18.
  5. He J, Yan X, Hu S. Glioma stem cells: drivers of tumor progression and recurrence. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):293.
  6. Dharmapuri S, et al. Multiplexed immunohistochemical analysis of the immune microenvironment of biliary tract cancers pre- & post-neoadjuvant chemotherapy: case series. Ann Transl Med. 2024;12(4):78.
  7. Hatogai K, et al. Comprehensive immunohistochemical analysis of tumor microenvironment immune status in esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(30):47252-64.
  8. Liu X, et al. Spatial heterogeneity of infiltrating immune cells in the tumor microenvironment of non-small cell lung cancer. Transl Oncol. 2024;50:102143.
  9. Kazama A, et al. Tumor-infiltrating immune cell status predicts successful response to immune checkpoint inhibitors in renal cell carcinoma. Sci Rep. 2022;12(1):20386.
  10. Park DH, Kim YZ. Simple analysis using immunohistochemical staining for tumor-infiltrating lymphocytes in brain metastasis of small cell lung cancer. J Neurointensive Care. 2024;7(2):49-55.
  11. Bogajewska-Rylko E, et al. When is immunohistochemistry useful in assessing tumor necrotic tissue? Anticancer Res. 2021;41(1):197-201.
  12. Saha D, Rabkin SD. Immunohistochemistry for tumor-infiltrating immune cells after oncolytic virotherapy. Methods Mol Biol. 2020;2058:179-90.
  13. Saha D, et al. combinatorial effects of VEGFR kinase inhibitor Axitinib and oncolytic virotherapy in mouse and human glioblastoma stem-like cell models. Clin Cancer Res. 2018;24(14):3409-22.
  14. Li M, et al. Characterization and oncolytic virus targeting of FAP-expressing tumor-associated pericytes in glioblastoma. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):221.
  15. Bommareddy PK, et al. Oncolytic herpes simplex virus expressing IL-2 controls glioblastoma growth and improves survival. J Immunother Cancer. 2024;12(4):e008880.
  16. Chernov A, Chutko A, Alaverdian D, Kashuro V, Galimova E. Chemotherapy sensitivity of primary glioblastoma cells and immunohistochemical markers to predict survival of patients with glioblastoma. Clin Transl Oncol. 2026;28(3):974-85.
  17. Saha D, Rabkin SD, Martuza RL. Temozolomide antagonizes oncolytic immunovirotherapy in glioblastoma. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000345.
  18. Jahan N, Talat H, Alonso A, Saha D, Curry WT. Triple combination immunotherapy with GVAX, anti-PD-1 monoclonal antibody, and agonist anti-OX40 monoclonal antibody is highly effective against murine intracranial glioma. Oncoimmunology. 2019;8(5):e1577108.
  19. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Macrophage polarization contributes to glioblastoma eradication by combination immunovirotherapy and immune checkpoint blockade. Cancer Cell. 2017;32(2):253-67.e5.
  20. Lu L, Saha D, Martuza RL, Rabkin SD, Wakimoto H. Single agent efficacy of the VEGFR kinase inhibitor axitinib in preclinical models of glioblastoma. J Neurooncol. 2015;121(1):91-100.
  21. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Oncolytic herpes simplex virus immunovirotherapy in combination with immune checkpoint blockade to treat glioblastoma. Immunotherapy. 2018;10(9):779-86.
  22. Marumoto T, et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 2009;15(1):110-6.
  23. Cheema TA, et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(29):12006-11.
  24. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Curing glioblastoma: oncolytic HSV-IL12 and checkpoint blockade. Oncoscience. 2017;4(7-8):67-9.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Células madre de glioblastomamicroambiente tumoralprotocolo de inmunohistoquímicadetección cromogénicaIHC de doble colortumor cerebral FFPEcélulas inmunitarias infiltrantes del tumorimplantación ortotópicatinción con fosfatasa alcalina

Este artículo ha sido publicado

Video próximamente

Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.