Microagujas Raman de dispersión superficial con respuesta redox para monitorizar respuestas de acupuntura en ratas con tolerancia a la glucosa deteriorada

Resumen

Este estudio exploratorio con ratas presenta una microaguja activa con dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) sensible a redox para intervención simultánea con acupuntura y seguimiento ratiométrico de índices SERS relacionados con la capacidad oxidativa local y el potencial redox en ratas con tolerancia a glucosa deteriorada.

Resumen

La tolerancia deteriorada a la glucosa (IGT) se asocia con una alteración de la homeostasis redox y un aumento del estrés oxidativo, pero el seguimiento dinámico in vivo de los cambios asociados a la redox durante la intervención de acupuntura sigue siendo técnicamente complicado. Este estudio desarrolló un sistema de microagujas activas con dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) sensible a redox para intervenciones simultáneas de acupuntura y seguimiento ratiométrico relativo de índices SERS relacionados con capacidad oxidativa (CO) y potencial redox (RP) en ratas con IGT. Se prepararon sondas SERS sensibles a la oxidación y redox funcionalizando nanocáscaras de oro (GNS) con p-fenilendiamina (p-PDA) para la respuesta al CO y antraquinona para la respuesta al RP, respectivamente. Las sondas se cargaban en dos ranuras grabadas en agujas de acupuntura para construir microagujas activas en SERS. En este estudio exploratorio se utilizaron ratas macho de Sprague–Dawley libres de patógenos específicos. Tres ratas actuaron como controles normales, y 20 ratas fueron alimentadas con una dieta alta en grasas y administradas estreptozotocinas (STZ) para inducir la IGT. Tras el cribado, 18 ratas IGT elegibles se dividieron en grupos de dieta alta en grasas y de dieta normal, con 9 ratas por grupo de dieta. Cada grupo dietético se dividió además en subgrupos de torsión por puntos de acupuntura, torsión no por sitio de acupuntura y subgrupos de inserción directa en puntos de acupuntura, con 3 ratas por subgrupo. Se realizó punción dos veces al día durante 7 días consecutivos, y se registraron la glucosa en ayunas (FPG), la glucosa postprandial de 2 horas (2hPG) y los índices SERS relacionados con OC y RP. Los resultados mostraron que el punción en puntos de acupuntura con torsión se asoció con valores más bajos de FPG y 2hPG y alteró los índices SERS relacionados con OC y RP en este modelo de rata IGT. Dado que no se incluyeron curvas de calibración externas, ensayos bioquímicos independientes de estrés oxidativo, pruebas de lixiviación con sonda ni ensayos de biocompatibilidad, las relaciones SERS deben interpretarse como índices ópticos relativos asociados a redox en lugar de concentraciones bioquímicas absolutas o valores absolutos de potencial redox. Estos hallazgos apoyan la viabilidad de las microagujas activas en SERS como plataforma preclínica exploratoria para combinar la intervención con acupuntura con seguimiento SERS ratiométrico local en ratas IGT.

Introducción

La tolerancia deteriorada a la glucosa (IGT), que es decir, una disminución en la capacidad del cuerpo para tolerar la glucosa, representa una etapa de transición entre la glucosa normal en sangre y la glucosa^{diabética 1}. La IGT es, por tanto, una señal clave de alerta temprana y una etapa reversible en el desarrollo de la diabetes^{tipo 2.} Los datos clínicos muestran que aproximadamente el 30% de la población con IGT progresará a diabetes tipo 2 en un plazo de 5–10^años; Sin embargo, con una intervención oportuna, este porcentaje puede reducirse a menos del 10^%.

La IGT es un proceso dinámico y complejo, y un entorno persistente con alta glucosa es un desencadenante clave para los trastornos del metabolismo^{oxidativo 5}. Cuando el cuerpo está en un estado prolongado de hiperglucemia, la cadena respiratoria mitocondrial funciona de forma anormal y la tasa de generación de especies reactivas de oxígeno aumenta entre un 30 y un 50%, aumentando directamente el poder oxidativo en^{el organismo 6}; Simultáneamente, los altos niveles de azúcar inhiben la actividad de enzimas clave, como la glutatión reductasa, impidiendo que el sistema antioxidante elimine el exceso de especies reactivas de oxígeno de forma oportuna y alterando aún más el equilibrio oxidación-reducción. Además, la IGT va acompañada de cambios patológicos, incluyendo resistencia a la insulina y un leve deterioro de la función β-celular, lo que da lugar a una variedad de respuestas biológicas y^{bioquímicas 7,8}. Junto con la evolución del estado redox, estos cambios agravan aún más la alteración del metabolismo de la glucosa y aumentan el riesgo potencial de complicaciones de la diabetes, incluyendo retinopatía, nefropatía y enfermedades^{cardiovasculares.} Por lo tanto, monitorizar la capacidad oxidativa (CO) y el potencial redox (RP) en individuos o modelos animales con IGT debería mejorar nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes al desarrollo de la IGT y guiar el diseño de estrategias terapéuticas específicas.

La acupuntura tiene una historia de más de 3.000 años y ha demostrado una buena eficacia clínica en el tratamiento de muchas enfermedades¹¹. Además, numerosos estudios experimentales en animales han demostrado que la acupuntura ejerce efectos beneficiosos en la regulación de los estados de estrés oxidativo en modelos animales al potenciar el sistema enzimático antioxidante y reducir la peroxidación^{lipídica 12}. Como práctica médica tradicional china, la acupuntura también ha demostrado beneficios significativos en el tratamiento de la diabetes y la IGT. Se ha informado que los puntos de acupuntura Guanyuan (CV4) y Sanyinjiao (SP6) activan la vía SIRT1/PGC-1α en el músculo esquelético, aliviando así la resistencia a la insulina en ratones diabéticos^{obesos 13}. Además, los puntos de acupuntura de Tianshu (ST25) modulan la actividad de las neuronas inhibidoras de la glucosa ubicadas en la región hipotalámica lateral y contribuyen a la regulación del metabolismo de los glicolípidos¹⁴. Sin embargo, la mayoría de los estudios sobre los mecanismos de la acupuntura intravascular se han centrado principalmente en los sistemas neuromodulador, inmunomodulador y gastrointestinal, en los que la acupuntura puede afectar el metabolismo de la glucosa mediante la modulación de la función autónoma o regular indirectamente los niveles de glucosa en sangre al mejorar el equilibrio de la flora intestinal^15,16. El mecanismo específico del efecto de la acupuntura en el tratamiento con IGT y sus efectos sobre el estrés oxidativo han carecido de investigación profunda y respaldo de datos experimentales.

La dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) proporciona gran sensibilidad y especificidad, lo que permite la detección de una amplia variedad de analitos. Las nanosondas SERS basadas en nanofibras ópticas¹⁷, membranas^{quitosanas 18} y estudios previos han demostrado que las agujas^{de acupuntura 19} pueden utilizarse para la detección de biomarcadores, neurotransmisores y otros aspectos de la bioquímica celular in vivo. Las agujas de acupuntura, en particular, representan herramientas prometedoras para la prueba de tejido profundo, permitiendo un monitoreo in situ mínimamente invasivo seguido de análisis ex vivo. La acupuntura, como método terapéutico bien establecido, tiene una gama extremadamente amplia de aplicaciones clínicas. Estudios recientes han demostrado que las fibras ópticas, los apósitos de heridas y los dispositivos de microaguja habilitados con SERS pueden soportar el seguimiento in situ o mínimamente invasivo de señales asociadas a redox en entornos biológicamente^{relevantes 20,21}. Paralelamente, las agujas de acupuntura activas con SERS y sistemas relacionados de microagujas han surgido como portadores prometedores para integrar la capacidad de detección con la intervención^{tisular 19}, resultando en microagujas activas en SERS con respuesta in vivo y capacidades de detección in vitro de SERS.

El presente estudio se basa en la estrategia previamente informada de microagujas activas SERS para detectar señales relacionadas con la capacidad oxidativa y el potencial redox en modelos de estrés inducido por glucosa. Sin embargo, el presente trabajo difiere del estudio anterior tanto en contexto biológico como en propósito experimental. Específicamente, este estudio aplica la plataforma de microagujas activa SERS a un modelo de rata con tolerancia deteriorada a la glucosa e integra el seguimiento local ratiométrico del SERS con intervención de acupuntura. El estudio actual compara además los puntos de acupuntura con sitios adyacentes no acupunturas, evalúa diferentes manipulaciones de punción y monitoriza los índices SERS asociados a redox durante un periodo de intervención de 7 días. En comparación con las fibras ópticas basadas en SERS, apósitos y microagujas activas para SERS diseñadas principalmente para la detección bioquímica de un solo sitio o de función única, la plataforma actual ofrece dos avances. Primero, las sondas sensibles a la OC y RP se integran en dos ranuras grabadas independientes en una sola aguja de acupuntura, permitiendo el monitoreo simultáneo de parámetros redox complementarios. En segundo lugar, la aguja de acupuntura funciona no solo como portadora de la sonda SERS, sino también como dispositivo terapéutico, permitiendo realizar monitorización redox durante la intervención de acupuntura en lugar de después del tratamiento. Como se muestra en la Figura 1, tras insertar las microagujas en los tejidos, se producen pequeñas heridas y las sondas en las dos ranuras reaccionan con los tejidos, permitiéndoles detectar niveles de CO y RP in vivo. El objetivo del estudio fue utilizar estas microagujas activas en SERS para examinar los cambios en el CO y RP en ratas con IGT y determinar los efectos de la acupuntura emparejada con puntos de acupuntura en estos animales, obteniendo así valiosos conocimientos sobre el mecanismo de efecto de la acupuntura en el tratamiento de la IGT y la relación entre los estados redox e hiperglucémicos anormales.

Protocolo

Animales y modelos de IGT

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Investigación de la Universidad del Sureste de Suzhou (número de aprobación). SEU-IACUC-20250318007) y se realizaron conforme a las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Las ratas fueron obtenidas y alojadas bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF) a 25 °C con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para procedimientos que requerían anestesia, las ratas eran anestesiadas usando isoflurano administrado en oxígeno a través de una cámara de inducción y mantenidas mediante un cono nasal. Se utilizó isoflurano al 3% para inducción y 1% para mantenimiento, ajustando la concentración según la frecuencia respiratoria y la respuesta del procedimiento.

Se confirmó una profundidad anestésica adecuada antes de puncionar o inyección mediante la pérdida del reflejo de enderezamiento y la ausencia de respuesta al pellizco del dedo del pie. Durante la anestesia, se monitorizaba el patrón respiratorio, la posición corporal y la recuperación, y los animales se colocaban sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. Los animales se alojaban 2 por jaula con acceso libre a comida y agua, salvo que fuera necesario ayunar para la prueba de glucosa. Tras la llegada, las ratas se aclimataron durante una semana antes de la inducción del modelo. El bienestar animal se monitorizaba diariamente, incluyendo la actividad general, el aseo, la ingesta de alimentos, el peso corporal, la condición en el lugar de inyección y la recuperación tras la anestesia. Al final del estudio, las ratas fueron sacrificadas según el protocolo animal aprobado. La eutanasia se realizó mediante inhalación gradual de CO₂ de llenado, seguida de la confirmación de la muerte mediante el método de la luxación cervical. Los animales que cumplían los criterios humanos de desenlace, incluyendo pérdida de peso severa, inmovilidad persistente, respiración anormal, incapacidad para comer o beber, o malestar severo, fueron eutanasiados inmediatamente en lugar de mantenerse hasta el punto final programado. En este estudio se utilizaron ratas macho de Sprague–Dawley de grado específico libre de patógenos, que pesaban entre 200 ± 20 g. Tras una semana de aclimatación, las ratas se asignaron aleatoriamente en dos grupos: las tres ratas del grupo normal fueron alimentadas con comida normal, mientras que las 20 ratas del grupo modelo fueron alimentadas con comida alta en grasa (50% comida basal + 10% grasa + 25% sacarosa + 15% polvo de yema) durante 3 semanas. Los animales del grupo modelo recibieron inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de solución STZ al 2% (solubilizada en 0,1 mol/L, tampón de citrato pH 4,4) durante 12 horas, tras 12 horas de ayuno sin restricción de agua. Los del grupo normal recibieron una inyección intraperitoneal de la dosis correspondiente de solución tampón de citrato tras ser alimentados con comida normal. Una semana después se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT). Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

La glucosa en ayunas (FPG) se midió mediante la extracción de sangre en la punta de la cola de ratas de cada grupo tras 12 horas de ayuno sin restricción de agua, y se registró 2 horas de glucosa postprandial (2hPG) tras la inyección intraperitoneal de dextrosa al 20% 2 g/kg. En el grupo normal, el rango de FPG era de 5,1–6,6 mmol/L, y el rango de glucosa de 2hPG era de 7,3–9,4 mmol/L, en comparación con un FPG de ≤7,0 mmol/L y un rango de 2hPG de 10–16 mmol/L en el grupo modelo. De las 20 ratas asignadas a la inducción del modelo IGT, 18 cumplieron los criterios predefinidos de la IGT tras la IPGTT y fueron incluidas en el experimento de intervención posterior. Se excluyeron dos ratas porque sus valores de FPG o 2hPG estaban fuera del rango predefinido de IGT. Las 18 ratas elegibles fueron asignadas aleatoriamente a un grupo con dieta alta en grasas y otro a un grupo de dieta normal, con 9 ratas por grupo. Cada grupo de la dieta se dividió además en tres subgrupos: torsión por punto de acupuntura, torsión no por sitio de acupuntura e inserción directa por punto, con tres ratas por subgrupo. Se trató de un estudio exploratorio de desarrollo de métodos diseñado para evaluar la viabilidad de combinar la intervención con acupuntura con el seguimiento ratiométrico basado en SERS en un modelo preclínico de rata IGT. No se realizó ningún cálculo estadístico formal de potencia. El tamaño del subgrupo de tres ratas se seleccionó en función de la viabilidad, los estudios preliminares SERS-microaguja y el principio de reducción animal. Las ratas fueron asignadas aleatoriamente por el experimentador; no se realizaron ocultaciones formales ni cegamientos de asignación.

Los protocolos de tratamiento con acupuntura se analizaron con referencia a las directrices clínicas basadas en la evidencia para la medicina tradicional china y la viabilidad de los experimentos con^{animales 22}. Los puntos de acupuntura seleccionados fueron Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), Tianshu bilateral (ST25), Shuidao bilateral (ST28) y Zusanli bilateral (ST36). RN12, RN9 y RN7 se localizaron en la línea media anterior y se trataron como puntos de línea media individual, mientras que ST25, ST28 y ST36 se trataron bilateralmente. Los emparejamientos de puntos de acupuntura se basaron en los utilizados para el tratamiento clínico de IGT²³. La adaptación se basó en la literatura ^24,25, utilizando el método dicotómico. En las ratas, los puntos de acupuntura se localizaron según los puntos anatómicos y la conversión proporcional desde ubicaciones estándar de puntos de acupuntura humanos. Los puntos de enfermería abdominal/CV se identificaron a lo largo de la línea media anterior utilizando el proceso xifoides, el ombligo y la sínfisis púbica como hitos anatómicos. ST25 se marcó bilateralmente a nivel umbilical, y ST28 se marcó bilateralmente en la región abdominal inferior, a la misma distancia lateral de la línea media anterior. ST36 fue identificada en la extremidad posterior anterolateral de la región tibial anterior, lateral al tubérculo tibial. Los sitios de comparación adyacentes no relacionados con acupuntura se marcaron 5 mm laterales a los puntos de acupuntura correspondientes y fuera de la línea del meridiano reconocida, evitando vasos visibles, cicatrices y puntos de punción previos. Antes de punchar, las ratas eran anestesiadas con isoflurano según el protocolo animal aprobado y colocadas en posición supina sobre una almohadilla térmica. La piel abdominal y de las extremidades posteriores sobre cada zona objetivo fue afeitada y desinfectada con etanol al 75%. Se insertaron microagujas activas con SERS aproximadamente perpendiculares a la piel hasta una profundidad de aproximadamente 10 mm. Para los grupos de torsión de puntos de acupuntura, se insertaron microagujas activas en SERS en los puntos seleccionados y se rotaron suavemente en bidireccional durante el periodo de retención de 20 minutos. Para los grupos sin sitios de acupuntura, se realizó el mismo procedimiento en los puntos de comparación adyacentes de 5 mm sin acupuntura. Para los grupos de inserción directa, se insertaron microagujas activas SERS en los puntos de acupuntura y se retuvieron durante 20 minutos sin torcer. Todos los procedimientos de agujación fueron realizados por el mismo operador entrenado para minimizar la variación entre operadores.

La punción se realizaba dos veces al día, a las 10:00 y a las 15:00, durante 7 días consecutivos. Antes de cada procedimiento diurno, se midió la FPG tras 8 horas de ayuno sin restricción de agua. Tras cada procedimiento diario de punción, se registraron las respuestas de OC y RP. Al día 7, tras el tratamiento de acupuntura, se realizó la IPGTT y se registraron valores de 2hPG.

Precauciones

La estreptozotocina es peligrosa y debe tratarse como un químico tóxico. Prepara la solución de estreptozotocina en una campana extractora química o en un armario certificado de bioseguridad, mientras llevas bata de laboratorio, guantes de nitrilo, gafas protectoras y mascarilla. Las jeringuillas, agujas, toallitas, camas, jaulas y residuos relacionados con animales contaminados con estreptozotocinas deben manipularse conforme a los procedimientos institucionales peligrosos de residuos biológicos y químicos. Las agujas y jeringuillas usadas deben desecharse inmediatamente en recipientes para punzantes resistentes a la perforación sin volver a tapar.

Fabricación de microagujas SERS activas para la detección de CO y RP

Se prepararon agujas de acupuntura como se había informado^{previamente en 26}. Las microagujas activas para SERS se fabricaron utilizando el mismo tipo de agujas de acupuntura de acero inoxidable comercial (0,25 mm × 26 mm) durante todo el estudio. Las agujas se insertaban aproximadamente perpendiculares a la piel hasta una profundidad de 10 mm. Para los grupos de torsión, la rotación bidireccional manual se aplicó suavemente y de forma constante durante 20 minutos durante el periodo de retención por el mismo operador entrenado. La manipulación no estaba controlada por instrumentos; por lo tanto, no se cuantificaron la frecuencia y amplitud exactas de la rotación. Esta limitación ha sido reconocida en la Discusión.

Inicialmente, las agujas se remojaron en una solución de PMMA al 20% (p/v) en MMA, seguidas de secado a temperatura ambiente (25 °C) durante 1 día. A continuación, se realizaron dos hendiduras paralelas de tamaño uniforme y forma y profundidad similares en la capa protectora de PMMA (separadas por 5 mm) utilizando una pequeña hoja de cuchillo artesanal que había sido limpiada con etanol; luego, las agujas se sumergían en ácido sulfúrico de 0,5 M, sirviendo como electrolito durante 10 segundos para someterse a un grabado electroquímico a un voltaje de 12 V, generando así dos ranuras casi circulares en los puntos de marcado. Tercero, tras enjuagar en tres ocasiones, las agujas se sumergieron a temperatura ambiente durante 24 horas en una solución de etanol que contenía 0,1 mol L⁻¹ MPTES y 0,3 mol L⁻¹ APTES, conferiendo así funcionalidad sulfhidril a las superficies ranuradas. Cuarto, el recubrimiento se eliminaba sumergiendo la aguja en MMA. Se prepararon microagujas activas SERS con respuesta al potencial redox basándose en un método^{previamente reportado 27}. El sustrato SERS se adsorció en una de las ranuras grabadas de cada aguja de acupuntura, tras lo cual las microagujas activas en SERS resultantes se sumergieron en una solución acuosa de p-PDA a una concentración de 1 × ^10-4 mol/L durante 60 minutos a 37 °C, produciendo microagujas SERS activas y sensibles a la oxidación. Se sintetizaron sustratos SERS basados en nanoconchas de oro como se describió^{anteriormente en 28}. En el trabajo presente, estas microagujas se goteaban en la otra ranura de cada aguja de acupuntura, que luego se dejaban secar de forma natural. Esto produjo microagujas activas en SERS con respuesta de CO y RP.

Evaluación ex vivo de la respuesta de CO y RP a microagujas activas en SERS

Las respuestas de las sondas OC y RP se evaluaron insertando las microagujas activas en SERS en tejido ex vivo. Para verificar la respuesta de la sonda OC a cambios oxidativos, se registraron espectros SERS de p-PDA antes y después de la oxidación. También se adquirieron espectros de las sondas redox SERS en una solución de_{NaBH 4} fuertemente reductora y una solución de HAuCl₄ fuertemente oxidante. La selectividad de la sonda OC se evaluó utilizando agentes reductores, incluyendo 1 × ^10-4 M_{FeSO 4}, 1 × 10-4 M_{Na 2}SO₄ y 1 × ^10-4 M ácido ascórbico, y agentes oxidantes, incluyendo 1 × ^10-4 M_{CuSO 4}, 1 × 10-4 M H_{2O 2}, 1 × ^10-4 M FeCl₃, y 1 × ^10-4 M_{HAuCl 4}. Todas las soluciones se prepararon en 20 mM PBS (pH 7,4), y las sondas se incubaron con cada solución durante 20 minutos a 37 °C. La robustez de las microagujas activas en SERS se evaluó registrando las respuestas de CO antes y después de la reacción con 1 × ^10-4 mol/L de FeCl₃ a temperatura ambiente. Estas pruebas ex vivo y basadas en solución se utilizaron para confirmar la respuesta de la sonda bajo condiciones controladas. Sin embargo, no reproducen completamente la complejidad del microambiente tisular in vivo, donde la variación local del pH, la adsorción de proteínas, los componentes de la matriz extracelular y otras sustancias biológicas pueden afectar a las señales SERS. Por lo tanto, las lecturas in vivo de OC y RP se interpretaron como índices SERS asociados a redox relativos en lugar de mediciones bioquímicas independientes de la matriz.

Detección de OC y RP en sitios de acupuntura y no acupuntura

Para evaluar el rendimiento de las sondas OC y RP en puntos y puntos no acupuntura, se insertaron microagujas activas en SERS en ratas sanas en los puntos ST36 y RN12, y 5 mm adyacentes a cada uno de estos puntos, a una profundidad aproximada de 10 mm, durante el mismo periodo de tiempo.

Efectos de la torsión de aguja en la detección de OC y RP

Para evaluar la respuesta de las sondas OC y RP bajo diferentes técnicas de punción, se insertaron microagujas activas SERS en los puntos de acupuntura ST36 y RN12 y 5 mm adyacentes a estos puntos en ratas sanas hasta una profundidad de unos 10 mm. En cada punto de acupuntura se torcía una aguja, mientras que la aguja correspondiente adyacente al punto no lo estaba, y viceversa (una aguja adyacente al punto de acupuntura se torcía, mientras que su contraparte en el punto de acupuntura no). Las señales SERS de las sondas se recogían al mismo tiempo de inserción para cada aguja.

Cambios en el CO y RP en ratas con IGT respecto a puntos de acupuntura, giro de aguja y condiciones dietéticas

Para evaluar los efectos de los puntos de acupuntura, la torsión de aguja y las condiciones dietéticas sobre el CO y RP de ratas con IGT, las ratas del grupo de dieta alta en grasas fueron asignadas aleatoriamente a tres grupos (A1, A2 y A3; tres ratas en cada grupo), al igual que las del grupo de dieta normal (grupos B1, B2 y B3; tres ratas en cada grupo). En ratas de los grupos A1 y B1, se insertaron microagujas activas en SERS tras la sedación y se torcieron durante 20 minutos; el mismo procedimiento se realizó en ratas de los grupos A2 y B2, salvo que las microagujas se insertaron 5 mm junto a los puntos de acupuntura. En ratas en A3 y B3, las microagujas activas por SERS se insertaron en puntos de acupuntura sin girarlas; Las agujas se dejaron en su sitio durante 20 minutos. La punción se realizaba dos veces al día, a las 10:00 y a las 15:00, durante 7 días. Antes de cada procedimiento diario, se utilizaba un medidor de glucosa para registrar los valores de FPG de cada grupo de ratas (tras ayunar pero sin restricción de agua durante 8 horas). Tras cada día de punción, se midieron y registraron las respuestas de OC y RP. En el día 7, tras acupuntura, se realizó la IPGTT en cada grupo de ratas y se registraron los valores de 2hPG.

Caracterización y medición

La morfología de las microagujas activas en SERS se examinó mediante microscopía electrónica de barrido (MEB). Los espectros SERS se adquirieron a 25 °C, utilizando un espectrómetro Raman configurado con un objetivo de 50× larga distancia de trabajo (NA: 0,5) y un láser de 785 nm. Para todas las mediciones, el tiempo de adquisición fue de 10 s, y el sistema Raman funcionó a una potencia láser nominal de 600 μW bajo la misma configuración óptica. La potencia real del láser entregada en la superficie del tejido no se midió directamente en este estudio. Por ello, los espectros SERS se utilizaron para comparaciones relativas entre grupos bajo idénticos ajustes de adquisición, y no se sacaron conclusiones sobre la seguridad fototérmica absoluta del tejido. Las relaciones de intensidad de dos sondas SERS se calcularon usando el siguiente enfoque: la relación entre los valores de intensidad en 1450 cm⁻¹ y en 1500 ^cm−1 se designó como indicador para OC (I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ ^cm−1), tras restar la intensidad a 1700 cm⁻¹ (como fondo) de cada uno de los dos picos, respectivamente, como en informes anteriores^{, 17}; y usando I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ ^cm−1 como indicador de RP, la intensidad en 1700 ^cm−1 (como fondo ) se restó de cada uno de los dos picos, respectivamente. Los valores calculados de_{I 1450} ^cm−1/I₁₅₀₀ ^cm−1 e I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ ^cm−1 se analizaron como índices relativos derivados de SERS de respuestas asociadas a OC y RP, respectivamente. Estas proporciones se usaron para comparar cambios entre grupos y puntos temporales bajo configuraciones idénticas de adquisición.

No se estableció ninguna curva de calibración externa en el presente estudio para convertir estas proporciones en concentraciones absolutas de especies oxidativas o valores absolutos electroquímicos de potencial redox. Cada espectro se registró dos veces en cinco puntos diferentes de la sonda SERS en tres muestras replicadas. Origin se utilizaba para procesar datos y producir gráficos. Para minimizar la variabilidad relacionada con la adquisición, se aplicaron a todos los grupos la misma longitud de onda láser, objetivo, tiempo de adquisición, ajuste de potencia láser y flujo de trabajo de procesamiento espectral. Los posibles efectos fototérmicos o fotoquímicos causados por la irradiación láser no se cuantificaron de forma independiente y se reconocen como una limitación. Los datos estadísticos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). El tamaño de la muestra y la prueba estadística utilizada para cada experimento o panel de figuras se especifican en las leyendas correspondientes de las figuras. Para experimentos de validación de sondas ex vivo , se utilizaba la sonda SERS o microaguja preparada de forma independiente como unidad de análisis. Para análisis in vivo de glucosa en sangre e índice SERS, se utilizó la rata como unidad de análisis biológico. Los espectros recogidos de múltiples puntos de la misma sonda se trataron como mediciones técnicas y promediaron antes del análisis a nivel de grupo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS. Se realizaron comparaciones entre grupos utilizando las pruebas estadísticas indicadas en las leyendas de las figuras correspondientes. Las mediciones seriadas de glucosa en ayunas y del índice SERS durante el periodo de intervención de 7 días se interpretaron como tendencias longitudinales exploratorias debido al tamaño pequeño de los subgrupos, y no se aplicó un modelo formal de medidas repetidas ni de efectos mixtos. La significación estadística se definió como p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados

Fabricación de microagujas SERS activas para la detección de CO y RP

Para identificar cambios en el CO y la RP, se fabricaron microagujas activas SERS que contenían las sondas correspondientes. Imágenes representativas de SEM confirmaron la estructura de dos ranuras de las microagujas activas en SERS. La Figura 2A muestra el cuerpo de la aguja de acupuntura con dos ranuras grabadas, la Figura 2B muestra una ranura cargada con GNS, y la Figura 2C muestra una vista ampliada de GNS distribuida dentro de la ranura. Estas imágenes confirmaron que las ranuras grabadas podían servir como puntos de carga localizados para las sondas SERS sensibles a OC y RP. Se utilizó la razón de intensidades máximas I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ para representar el grado en que se oxidó la p-PDA. La Figura 3A muestra los espectros SERS de p-PDA antes y después de la interacción con 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, mientras que la Figura 3B presenta espectros para la sonda redox en 1 × 10⁻³ M NaBH4 y 1 × 10-4 M HAuCl₄ soluciones acuosas. La respuesta de la sonda RP se expresó como una relación de intensidad máxima (I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1), que disminuyó con el aumento de RP.

Para evaluar la selectividad de la sonda sensible a la capacidad oxidativa, se midió la relación I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ tras la exposición a diferentes agentes reductores y oxidantes. Se realizaron mediciones independientes con sonda y n = 3 por grupo, y se utilizó la sonda SERS o microaguja preparada de forma independiente como unidad de análisis (Figura 3C). En comparación con el grupo CK (prueba de Kruskal–Wallis seguida por la prueba de comparaciones múltiples de Dunn), los agentes reductores_{FeSO 4} y Na₂SO₄ no alteraron significativamente la proporción I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ cm⁻¹ (p > 0,05). El ácido ascórbico (AA, p < 0,001) también produjo una proporción aumentada bajo la condición actual del ensayo, a pesar de estar incluido como agente reductor. Por lo tanto, la respuesta AA se interpretó con cautela como una respuesta espectral específica de la sonda en este ensayo basado en solución en lugar de como evidencia de comportamiento oxidante. En cambio, los reactivos oxidantes o asociados a la oxidación aumentaron la proporción en distintos grados. La proporción aumentó tras la exposición a CuSO₄ (p < 0,0001), H₂O₂ (p < 0,0001), FeCl₃ (p < 0,0001) y HAuCl₄ (p < 0,0001). Para evaluar la estabilidad de la sonda OC a temperatura ambiente, se adquirieron espectros SERS a intervalos horarios durante un periodo de 6 horas antes de la reacción de la sonda con 1 × 10⁻⁴ M_{FeCl 3} (Figura 3D). y se calcularon las correspondientes relaciones I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ . Tras la adsorción por sonda, el valor inicial se mantuvo estable aproximadamente en 0,20 ± 0,02, al igual que el de la reacción con_{FeCl 3} en torno a 0,9 ± 0,10, durante el periodo de 6 horas. Estos resultados sugieren que el p-PDA en GNS es estable en el aire.

Respuestas OC y RP en puntos de acupuntura y no acupuntura

Estudios^{previos de 29} han demostrado que la sonda OC alcanza su respuesta máxima 10 minutos después de la inserción. Las figuras 4A y B ilustran la respuesta de las microagujas activas por SERS en ratas sanas colocadas en los puntos de acupuntura ST36 y RN12, así como en aquellas colocadas a 5 mm adyacentes a los puntos, durante 10 minutos. Para estos experimentos, n = 3 ratas por grupo y espectros recogidos de múltiples puntos de la misma sonda fueron tratados como réplicas técnicas y promediados antes del análisis a nivel de grupo. Las microagujas activas en SERS respondieron eficazmente a los cambios en el CO y RP in vivo, sin diferencias significativas en el CO y RP en el grupo de puntos de acupuntura en comparación con el grupo de puntos no acupunturas (test t de muestras independientes, p > 0,05).

Para determinar aún más los efectos de la torsión de la aguja sobre el OC y RP locales in vivo, se insertaron microagujas activas con SERS en ratas sanas en los puntos de acupuntura ST36 y RN12, y 5 mm más allá de estos puntos, hasta una profundidad de 10 mm. Durante la maniobra de giro en cada punto de acupuntura, la aguja adyacente al punto se destorció, y viceversa, y se registraron cambios en los valores de OC y RP en el punto de la punción (Figuras 4C–F). No hubo cambios significativos en el CO y RP según si se realizaba torsión en puntos de acupuntura o no en ratas sanas, ni hubo efecto de torcer en un punto adyacente (p > 0,05).

Cambios en el CO y RP en ratas con IGT asociados a acupuntura, giro de aguja y condiciones dietéticas

Para confirmar el establecimiento exitoso de un modelo de rata de IGT, se registraron valores de FPG y 2hPG utilizando un ensayo IPGTT en ratas modelo y de control, respectivamente. El grupo de control incluyó n = 3 ratas, y el grupo modelo incluyó n = 18 ratas que cumplían los criterios predefinidos para tolerancia deteriorada a la glucosa. Las ratas modelo mostraron una glucosa en ayunas más alta que las ratas control (6,92 mmol/L frente a 5,54 mmol/L; prueba U de Mann–Whitney, p < 0,01) y una glucosa en sangre postprandial más alta en 2 horas que en ratas control (11,52 mmol/L frente a 7,92 mmol/L; Prueba U de Mann–Whitney, p < 0,001) (Figura 5), indicando la inducción exitosa de IGT en animales modelo.

Para verificar los efectos de la combinación de puntos de acupuntura, torsión de aguja y condiciones dietéticas en ratas IGT, se seleccionó un conjunto típico de pares de puntos de acupuntura. Las 18 ratas modelo elegibles se dividieron entonces en grupos de dieta alta en grasas y de dieta normal, con n = 9 ratas por grupo de dieta. Cada grupo dietético se dividió además en tres subgrupos de intervención: torsión por puntos de acupuntura, torsión por sitio no acupuntura e inserción directa por puntos, con n = 3 ratas por subgrupo. Los valores de FPG se registraron antes de cada día de punción (Figuras 6A–C), y los valores de 2hPG (Figura 6D) se midieron después de 7 días de punción mediante ensayo IPGTT en cada grupo. En este conjunto de datos exploratorio no se observó una diferencia clara en FPG o 2hPG entre los grupos modelo de dieta alta en grasas y normal tras la punción en puntos de acupuntura. Las comparaciones entre punción en puntos de acupuntura y no en el sitio sugirieron que la torsión en puntos de acupuntura se asociaba con valores más bajos de glucosa en sangre bajo las condiciones experimentales actuales (pruebas t de muestras independientes, p < 0,05). Debido a que el tamaño del subgrupo era pequeño y la dieta, la localización de puntos de acupuntura y la manipulación de torsiones no podían separarse completamente estadísticamente, estos hallazgos se interpretaron como observaciones preliminares de modelos animales.

Se monitorizaron cambios en los índices SERS relacionados con la capacidad oxidativa y el potencial redox durante una semana de intervención de acupuntura en ratas IGT. Para estos análisis, se incluyeron n = 3 ratas por subgrupo, y cada rata fue tratada como la unidad de análisis biológico. En ratas con dieta alta en grasas, el índice SERS relacionado con la capacidad oxidativa disminuyó con el tiempo en los grupos de torsión en puntos de acupuntura y inserción directa en puntos, mientras que se mantuvo relativamente más alto en el grupo de torsión no en sitios de acupuntura (Figura 7A). El índice SERS relacionado con el potencial redox aumentó con el tiempo en los grupos de torsión en puntos de acupuntura y en los grupos de inserción directa en puntos, mientras que el grupo de torsión sin sitio de acupuntura mostró un aumento comparativamente más débil (Figura 7B). Se observaron tendencias similares en ratas IGT de dieta normal. El índice SERS relacionado con la capacidad oxidativa disminuyó con el tiempo en los grupos de torsión en puntos de acupuntura y inserción directa en puntos, con un cambio menor en el grupo de torsión no en el sitio de acupuntura (Figura 7C). El índice SERS relacionado con el potencial redox aumentó con el tiempo en los grupos de torsión en puntos de acupuntura e inserción directa en puntos, mientras que el grupo de torsión sin sitio de acupuntura se mantuvo comparativamente más bajo (Figura 7D).

Para comparar aún más las condiciones dietéticas bajo la misma manipulación de acupuntura, se compararon los subgrupos de torsión de puntos de acupuntura de los grupos de dieta alta en grasas y de dieta normal. En esta comparación, el índice SERS relacionado con la capacidad oxidativa disminuyó con el tiempo en ambas condiciones de la dieta, observándose una disminución mayor en el subgrupo de la curvatura de puntos de acupuntura de la dieta normal al día 7 (Figura 7E). El índice SERS relacionado con el potencial redox aumentó con el tiempo en ambas condiciones dietéticas, con un valor más alto en el día 7 en el subgrupo de la curvatura de puntos de acupuntura de la dieta normal (Figura 7F). Estos hallazgos sugieren que la torsión de puntos de acupuntura y la normalización dietética se asociaron con cambios en los índices locales de SERS asociados a redox en ratas IGT. Dado que cada subgrupo contenía solo tres ratas y no se realizaron ensayos bioquímicos independientes de estrés oxidativo, estos resultados deben interpretarse como observaciones exploratorias de modelos animales más que como evidencia bioquímica definitiva de mejora del estrés oxidativo.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

Todos los datos numéricos en bruto utilizados para la generación de figuras y el análisis estadístico, incluyendo mediciones de glucosa en sangre, valores de razón derivados de SERS y datos fuente para paneles de figuras cuantitativas, han sido organizados y subidos como Tabla Suplementaria 1. Para experimentos de monitorización continua de la sonda generados directamente por el instrumento analítico, los valores exportados y las salidas representativas generadas por el instrumento utilizadas para evaluar el rendimiento de la sonda se incluyen en el Archivo Suplementario 1.

Figura 1: Flujo de trabajo metodológico para la intervención con acupuntura y seguimiento local ratiométrico del SERS utilizando una microaguja activa SERS de doble surco. El esquema ilustra la inserción de la microaguja SERS activa de dos surcos en un punto de acupuntura o en un sitio adyacente no acupuntura, seguida de la adquisición espectral Raman. Los autores crearon esta figura utilizando el software WPS, y no se requiere ninguna licencia de derechos de autor. Abreviaturas: SERS = dispersión Raman mejorada en superficie. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de SEM de microagujas activas en SERS. (A) Cuerpo de aguja de acupuntura con dos ranuras; barra de escala = 200 μm; aumento = 77×. (B) Una ranura integrada con GNS; barra de escala = 20 μm; aumento = 1.000×. (C) Una imagen ampliada de la ranura en B; barra de escala = 2 μm; aumento = 30.000×. Abreviaturas: SEM = microscopía electrónica de barrido; GNS = nanoconchas de oro. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Caracterización de sondas SERS sensibles a OC y RP. (A) Espectros normalizados de p-PDA antes y después de la interacción con FeCl₃. (B) Espectros SERS normalizados de sondas RP en soluciones de NaBH₄ y HAuCl₄, respectivamente. (C) I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 proporciones para sondas OC en diversas soluciones oxidantes y reductoras. n=3 mediciones independientes por grupo. Test de Kruskal–Wallis seguido por la prueba de comparaciones múltiples de Dunn frente al grupo CK. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). (D) Evaluación de estabilidad a seis horas de la sonda sensible a la OC antes y después de la reacción con FeCl₃. Abreviaturas: SERS = dispersión Raman mejorada en superficie; CK = comprobación de control; p-PDA = p-fenilediamina; AA = ácido ascórbico. p < 0,001, ****p < 0,0001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Índices SERS relacionados con OC y RP medidos con diferentes métodos de punción en sitios de acupuntura y no acupuntura en ratas sanas. (A) Índice SERS relacionado con OC tras la inserción directa en puntos de acupuntura y sitios adyacentes no acupunturas. (B) Índice SERS relacionado con RP tras la inserción directa en puntos de acupuntura y sitios adyacentes no acupunturas. (C) Índice SERS relacionado con el OC tras la inserción directa en sitios no acupunturas y la torsión de la aguja en los puntos de acupuntura. (D) Índice SERS relacionado con RP tras la inserción directa en sitios no acupunturas y giro de aguja en los puntos de acupuntura. (E) Índice SERS relacionado con OC tras la inserción directa en puntos de acupuntura y la torsión de la aguja en sitios adyacentes no acupunturas. (F) Índice SERS relacionado con RP tras la inserción directa en puntos de acupuntura y la torsión de la aguja en sitios adyacentes no acupunturas. OC se calculó como_{I 1450} ^cm-1/I₁₅₀₀ ^cm-1, y RP como_{I 1606} ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1. n=3 por grupo. Los datos se presentan como media ± SEM. No se observaron diferencias significativas entre las comparaciones emparejadas. Abreviaturas: OC = capacidad oxidativa; RP = potencial redox. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Valores de FPG y 2hPG según el ensayo IPGTT en ratas modelo y control (CK). Se midieron FPG y 2hPG para verificar el establecimiento del modelo de ratas con tolerancia a la glucosa alterada. n = 3 ratas en el grupo de control y n = 18 ratas en el grupo modelo. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba U de Mann–Whitney, y los resultados se presentan como la media ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Valores de FPG y 2hPG para ratas IGT durante procedimientos de acupuntura. (A) Valores de FPG para el grupo que recibe acupuntura con torsión de aguja en los puntos de acupuntura e inserción directa de agujas en los puntos de acupuntura (n = 3 por grupo). (B) Valores FPG para grupos que reciben punción con torsión en puntos de acupuntura y puntos no acupunturas (n = 3 por grupo). (C) Valores FPG para los grupos de dieta alta en grasa y normales (n = 3 por grupo). (D) Día 7 Valores de 2hPG en ratas con alta y dieta normal bajo las condiciones de torsión en puntos de acupuntura, torsión no en el sitio de acupuntura e inserción directa en puntos. (n = 3 por grupo). Los resultados se presentan como la media ± SEM. Las comparaciones por pares de puntos finales planificadas en el panel D se analizaron utilizando un test t de Student bilatéral no emparejado. *p < 0,05. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Cambios en el CO y RP de las ratas en cada grupo durante una semana de acupuntura. (A) Cambios en el CO en ratas IGT con alta grasa en la dieta. (B) Cambios en la RP en ratas IGT con dieta alta en grasas. (C) Cambios en el CO en ratas IGT de dieta normal. (D) Cambios en la RP en ratas IGT de dieta normal. (E) Comparación del índice SERS relacionado con la OC entre las condiciones de dieta alta en grasas y la dieta normal dentro del subgrupo de torsión de puntos de acupuntura; (F) Comparación del índice SERS relacionado con RP entre las condiciones de dieta alta en grasas y la dieta normal dentro del subgrupo de torsión de puntos de acupuntura. n = 3 ratas por subgrupo. Los datos se presentan como media ± SEM. Las mediciones seriadas se interpretaron como tendencias longitudinales exploratorias. Abreviaturas: OC = capacidad oxidativa; RP = potencial redox. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Salidas representativas generadas por instrumentos para la evaluación de la respuesta de la sonda. Este archivo contiene resultados representativos de monitorización continua generados directamente por el instrumento analítico y utilizados para evaluar el rendimiento de la respuesta de la sonda. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Tabla de datos en bruto para análisis cuantitativos. Este archivo contiene los datos numéricos de origen utilizados para la generación de figuras y el análisis estadístico, incluyendo mediciones de glucosa en sangre, valores de razones derivados de SERS y datos de panel de figuras cuantitativas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La tolerancia deteriorada a la glucosa representa una etapa de transición reversible antes de la diabetes tipo 2 y está estrechamente asociada con un desequilibrio metabólico, resistencia a la insulina y desregulación relacionada con el estrés oxidativo. La intervención en el estilo de vida y otras estrategias terapéuticas tempranas pueden reducir el riesgo de progresión desde una tolerancia a la glucosa deteriorada hasta la diabetes, pero las herramientas para monitorizar dinámicamente las respuestas bioquímicas locales durante la intervención siguen siendo^{limitadas 30}. Se ha informado que la acupuntura afecta al metabolismo de la glucosa y a las vías relacionadas con el estrés oxidativo en estudios experimentales y clínicos. Sin embargo, la mayoría de los estudios mecanicistas de acupuntura se basan en mediciones finales de sangre o tejido, y relativamente pocos métodos permiten un seguimiento mínimamente invasivo de las respuestas locales asociadas a redox durante la intervención acupuntura. Ensayos clínicos previos de tratamientos para la IGT han confirmado que el riesgo de diabetes puede reducirse en gran medida mediante intervenciones en el estilo de vida, incluyendo modificaciones dietéticas, reducción de masa corporal y aumento de la actividad^{física 31}. Se ha demostrado que la acupuntura es eficaz para mejorar los índices metabólicos de glucosa y reducir el ayuno y la 2hPG. Por lo tanto, la elucidación de la relación entre acupuntura, redox e IGT puede proporcionar enfoques para revertir la IGT o intervenir en su progresión, reduciendo así la incidencia de diabetes mellitus, así como proporcionando información sobre la patología de la IGT y los mecanismos subyacentes a su desarrollo.

El presente estudio propone una plataforma de microagujas Raman activas con dispersión activa de dispersión superficial de doble surco y doble surco para combinar la intervención de acupuntura con el seguimiento SERS ratiométrico local en un modelo de rata con tolerancia a glucosa deteriorada. En este sistema, se usaron dos surcos grabados en una sola aguja de acupuntura para transportar sondas sensibles a la capacidad oxidativa y al potencial redox. Este diseño permitía que la aguja de acupuntura funcionara no solo como herramienta de intervención, sino también como portadora de detección para lecturas ópticas relativas asociadas a redox local. Los resultados mostraron que la punción en puntos de acupuntura con torsión se asoció con valores más bajos de glucosa en ayunas y 2hPG, así como con cambios en los índices SERS relacionados con la capacidad oxidativa y el potencial redox en ratas con tolerancia a la glucosa alterada. Estos hallazgos apoyan la viabilidad de utilizar microagujas activas en SERS para explorar las respuestas locales asociadas a redox durante la intervención con acupuntura. En general, los resultados sugieren que la punción en los puntos de acupuntura con torsión se asoció con valores más bajos de FPG y 2hPG, así como con cambios en los índices SERS relacionados con OC y RP en ratas IGT. Estos hallazgos apoyan la viabilidad de utilizar microagujas activas en SERS para seguir respuestas ópticas locales asociadas a redox durante la intervención con acupuntura. Sin embargo, dado que no se realizaron ensayos bioquímicos estándar de estrés oxidativo, análisis de lixiviación con sonda ni pruebas de biocompatibilidad tisular, los cambios observados en el índice SERS no deben interpretarse como pruebas bioquímicas definitivas de mejora del estrés oxidativo.

Se podrían emplear varios enfoques alternativos para investigar más a fondo la misma hipótesis. Los ensayos bioquímicos estándar de estrés oxidativo, incluyendo mediciones de especies reactivas de ogénio, malondialdehído, superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa y relaciones glutatión/disulfuro de glutatión, podrían utilizarse para validar si los cambios en los índices derivados del SERS corresponden a biomarcadores convencionales de estrés^{oxidativo 32,33}. Las sondas redox electroquímicas, los sensores redox basados en fluorescencia, los ensayos de quimioluminiscencia, la microdiálisis seguida de análisis bioquímico y la validación inmunohistoquímica o histológica basada en tejidos también pueden proporcionar información complementaria. Combinar la detección de microagujas activa por SERS con estos enfoques independientes ayudaría a determinar si los cambios ópticos observados reflejan alteraciones redox bioquímicas específicas o respuestas tisulares locales más amplias a la punción y al estado metabólico³⁴.

Las posibles aplicaciones de este método van más allá del modelo actual de tolerancia a glucosa alterada. Dado que el desequilibrio redox está implicado en enfermedades metabólicas, lesiones tisulares, inflamación y reparación de heridas, las microagujas activas por SERS pueden proporcionar una herramienta preclínica útil para monitorizar respuestas locales asociadas a redox en modelos relacionados con la diabetes, estudios de cicatrización de heridas, modelos de enfermedades inflamatorias y otros entornos de intervención mínimamente^{invasivas 35}. En la investigación en acupuntura, la plataforma puede ser útil para comparar puntos de acupuntura, sitios no acupunturas, diferentes manipulaciones de punción y distintos horarios de intervención. Sin embargo, estas aplicaciones siguen siendo exploratorias y requieren una validación técnica y biológica adicional.

Cabe señalar varias limitaciones. En primer lugar, las lecturas de OC y RP se calcularon como índices ratiométricos derivados de SERS y no se calibraron según concentraciones estándar de especies oxidativas ni valores absolutos electroquímicos de potencial redox. Por lo tanto, los resultados actuales deben interpretarse como respuestas ópticas asociadas a redox relativas bajo condiciones idénticas de adquisición, en lugar de mediciones bioquímicas absolutas. En segundo lugar, el microambiente biológico del tejido puede introducir fuentes adicionales de variación de señal, incluyendo cambios locales en el pH, adsorción de proteínas, componentes de la matriz extracelular y otros efectos de la matriz. Estos factores no se evaluaron completamente en medios que contienen suero o imitan tejidos. Tercero, la potencia real del láser suministrada a la superficie del tejido y el cambio local de temperatura durante la adquisición de Raman no se midieron directamente; Por lo tanto, no se pueden descartar por completo posibles efectos fototérmicos o fotoquímicos. En cuarto lugar, la reproducibilidad a nivel de lote de la geometría de la ranura y la carga de la sonda no se evaluó cuantitativamente mediante imágenes de SEM con múltiples agujas ni análisis de eficiencia de carga. Finalmente, no se realizaron validaciones bioquímicas independientes, análisis de lixiviación con sonda ni pruebas locales de biocompatibilidad. Estudios futuros deberían establecer curvas de calibración en matrices biológicamente relevantes, correlacionar índices SERS con ensayos estándar de estrés oxidativo y redox, cuantificar la lixiviación de sondas, evaluar la compatibilidad local de tejidos tras inserciones repetidas y validar el dispositivo en cohortes animales más grandes. Las microagujas activas por SERS pueden proporcionar una plataforma útil para combinar la intervención con acupuntura con el seguimiento relativo SERS de los índices locales asociados a redox en un modelo preclínico de rata IGT. Se requieren más calibraciones, validación bioquímica, evaluación de lixiviación de sondas y estudios de biocompatibilidad antes de poder reclamar un seguimiento cuantitativo absoluto o una aplicación traslacional.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Ácido ascórbico	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Glucosímetro	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Tiras de prueba de glucosa en sangre	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Sulfato de cobre (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Alcohol etílico (≥99,7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Sulfato ferroso (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glucosa (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Peróxido de hidrógeno (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Cloruro de hierro (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Metacrilato de metilo (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Espectrómetro micro-Raman	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-Fenilendiamina (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polimetilmetacrilato (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Microscopio electrónico de barrido	Zeiss	ULTRA Plus
Borohidruro de sodio (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Sulfito de sodio (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Agujas de acupuntura de acero inoxidable	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Software de análisis estadístico	International Business Machines Corporation	Versión 2021
Estreptozocina (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Ácido tetracloroáurico (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
Software SPSS	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	versión 26.0
ratas	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Macho Sprague-Dawley libre de patógenos específicos
pienso basal	Anuokang Biotech.	SY10001
Manteca de cerdo	MCE	HY-W127601
Sacarosa	MCE	HY-B1779
Polvo de yema de huevo	MCE	HY-B2235B
Ácido cítrico monohidrato	Sigma-Aldrich	C1909
Citrato de trisodio dihidrato	Sigma-Aldrich	S4641
Tampon citrato	beyotime	P0086
Solución salina tamponada con fosfato	beyotime	ST448-1L
Isoflurano	Bioss	D54468
Sistema de anestesia por isoflurano para animales pequeños	RWD Life Science	R500
Cámara de inducción y cono nasal	RWD Life Science	Accesorios compatibles R500
Almohadilla de calentamiento	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
Etanol al 75%	Boyu Bio.	YB60401
Cámara de eutanasia con CO2	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365