Cuarenta ratas adultas machos Sprague–Dawley (SD) libres de patógenos específicos (SPF), que pesan entre 240 y 280 g, fueron adquiridos a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [Licencia nº: SCXK (Jing) 2021-0011]. Todas las ratas se alojaban en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina China de Pekín bajo condiciones controladas, con una temperatura ambiente de 23°C ± 1°C, humedad relativa del 50% ± 5%, y un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con libre acceso a comida y agua. Las ratas se aclimataron durante 5 días, durante los cuales se realizó simultáneamente entrenamiento de aclimatación en cinta de correr. Los animales se someten a la aclimatación en cinta una vez al día a una velocidad de 10 m/min durante 15 minutos por sesión sin estimulación eléctrica para reducir el estrés de manipulación.
Según nuestro estudio anterior, la tasa de éxito de la inducción de PSS mediante el método de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) es aproximadamente del 60%. Utilizando una tabla de números aleatorios, 9 ratas se seleccionaron aleatoriamente de antemano como el grupo operado por simulación; las 31 ratas restantes se usaron para el establecimiento de modelos. Tras un modelado exitoso, estas ratas se dividieron aleatoriamente en el grupo modelo y el grupo MSSA. En total, se incluyeron nueve ratas en cada grupo. Este experimento se llevó a cabo conforme a los principios 3R del bienestar de animales de laboratorio y fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Pekín (BUCM 20250915-008).
Establecimiento de modelos
El modelo MCAO se estableció en ratas utilizando una técnica modificada de filamento intraluminal. Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano al 3% para inducción, y la anestesia se mantuvo con un 1,5% de isoflurano administrado en oxígeno a un caudal constante de 1 L/min durante todo el procedimiento quirúrgico. Se realizó una incisión cervical en la línea media, seguida de una disección roma para exponer la arteria carótida común derecha (ACC), la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ICA). Se introdujo una sutura de monofilamento de nailon (diámetro, 0,36 ± 0,02 mm) en la ACI a través de la ECA y avanzó aproximadamente 18–20 mm hasta el origen de la arteria cerebral media (MCA) para lograr la oclusión arterial. Los vasos estaban ligados y la incisión cerrada. Después, las ratas fueron colocadas en una almohadilla térmica hasta la recuperación de la anestesia. Las ratas del grupo operado simulado fueron sometidas a una exposición quirúrgica idéntica a la CCA, ICA y ECA sin la inserción del filamento intraluminal.
Tras la cirugía, todas las ratas MCAO recibieron atención postoperatoria estandarizada. Los animales se mantuvieron en una almohadilla térmica a 37°C durante las primeras 12 horas para evitar la hipotermia. Se limpiaron incisiones quirúrgicas diariamente durante tres días consecutivos, se administró ampicilina (100 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal para la profilaxis de infecciones y se administró alimentos ablandados para mantener una nutrición adecuada. La actividad general, la ingesta de alimentos, el estado de la herida y la función motora de las extremidades se monitorizaron diariamente desde los días postoperatorios 1 hasta 10.
Los déficits neurológicos fueron evaluados por investigadores cegados a la asignación de grupos utilizando la puntuación de déficit neurológico Zea Longa, y el tono muscular se evaluó mediante la Escala de Ashworth Modificada (MAS). Las evaluaciones se realizaron 1 día antes de la cirugía (día −1), el día de la cirugía antes de la MCAO (día 0) y en los días postoperatorios 1, 3, 5, 7 y 10. Se consideró que las ratas con puntuaciones de Zea Longa y MAS ≥1 en el tercer día postoperatorio habían establecido un modelo PSS exitoso.
Tratamiento MSSA
Las intervenciones comenzaron en el tercer día postoperatorio. El lugar de estimulación de la acupuntura del cuero cabelludo fue la línea ipsilesional de la EM 6 (línea oblicua parietotemporal anterior). De acuerdo con la Norma Nacional para la Manipulación Estandarizada de la Acupuntura del Cuero Cabelludo (GB/T 21709.2-2021), la línea MS 6 se extiende desde GV 21 (Qianding) hasta GB 6 (Xuanli).
Se insertaron agujas estériles desechables de acupuntura (0,25 × 13 mm) bajo la galea aponeurótica en GV 21 a un ángulo oblicuo de aproximadamente 15° respecto a la superficie del cuero cabelludo y avanzaron hacia la GB 6 a lo largo de la línea oblicua parietotemporal anterior hasta una profundidad de aproximadamente 10 mm. Se aplicó una manipulación rápida de giro (200 revoluciones/min) de forma continua durante 1 minuto. Tras 15 minutos de retención de aguja, se repitió la misma manipulación de giro una vez, resultando en un tiempo total de retención de 30 minutos. Durante todo el periodo de retención de agujas, las ratas realizaron simultáneamente ejercicio en cinta a una velocidad constante de 10 m/min.
Las ratas de los grupos de operación simulada y modelo no recibieron acupuntura ni ejercicio en cinta de correr. Para controlar el manejo inespecífico y el estrés de sujeción, fueron manipulados y sujetos suavemente en portacargas no compresivas durante 30 minutos al día, igualando la duración total diaria de la intervención del grupo MSSA.
Evaluaciones de conducta
Puntuación Zea Longa para déficits neurológicos:
Los déficits neurológicos en ratas se evaluaron utilizando el sistema de puntuación ZeaLonga 16. Se aplicaron los siguientes criterios: una puntuación de 0 indicó que no había deterioro neurológico y que se movía sin restricciones normal; una puntuación de 1 indicaba extensión incompleta de la extremidad anterior o posterior contralateral al lado afectado; una puntuación de 2 indicaba que giraba hacia el lado contralateral durante la locomoción; una puntuación de 3 indicaba caer hacia el lado contralateral mientras caminaban; y una puntuación de 4 indicó pérdida de conciencia con ausencia de deambulación espontánea.
MAS para el tono muscular:
El tono muscular se evaluó utilizando el MAS17. Los criterios se definieron de la siguiente manera: grado 0, sin aumento del tono muscular; grado 1, ligero aumento del tono muscular, con un bloqueo transitorio o resistencia mínima al final de la flexión y extensión pasivas; grado 1+, aumento marcado del tono muscular, con un bloqueo transitorio en el rango medio del movimiento y resistencia persistente durante la segunda mitad del movimiento; grado 2, aumento pronunciado del tono muscular, con resistencia evidente en la mayor parte del rango de movimiento, aunque la extremidad seguía siendo fácilmente móvil; grado 3, aumento sustancial del tono muscular que dificultaba la flexión y extensión pasiva; y grado 4, movimiento pasivo limitado debido a la rigidez de las articulaciones. A Grade 1+ se le asignó una puntuación de 2 puntos, lo que dio una puntuación máxima MAS de 5 puntos en este estudio10.
Neuroimagen T2WI para la cuantificación del volumen del infarto cerebral
Todas las exploraciones T2WI se adquirieron utilizando un escáner de resonancia magnética PharmaScan operado con el software ParaVision 360 (versión 3.5). Se aplicó a ratas MCAO una secuencia de pulsos de adquisición turbo rápida ponderada en T2 con mejora de relajación (T2_TurboRARE, también denominada RARE/eco rápido de espín [FSE]) a ratas MCAO para cuantificar el volumen del infarto cerebral. Los parámetros de imagen se configuraron de la siguiente manera: tiempo de repetición (TR) = 3000,0 ms, tiempo de eco (TE) = 33,0 ms, campo de visión (FOV) = 35,00 × 35,00mm 2, tamaño de la matriz = 250 × 250, grosor de corte = 0,80 mm, número de cortes = 35, número de excitaciones (NEX) = 3,0 y ángulo de giro (FA) = 180,0°. Las regiones del infarto cerebral fueron delimitadas manualmente por corte en el software ITK-SNAP (versión 4.4.0) por un solo investigador cegado ante la asignación en grupo, utilizando cambios en la intensidad de la señal y características morfológicas compatibles con el infarto isquémico. El volumen del infarto cerebral se calculaba automáticamente por el software.
DTI Neuroimaging para la evaluación de la integridad microestructural de la sustancia blanca
Los datos de la resonancia magnética se obtuvieron utilizando un escáner de resonancia magnética PharmaScan de 7,0 T. La anestesia se indujo con isoflurano al 3% administrado en aire comprimido (0,4–0,6 L/min) y se mantuvo con isoflurano al 1% durante toda la adquisición del DTI. La temperatura corporal central se mantuvo mediante un baño maria controlado termostáticamente durante todo el procedimiento de imagen.
Durante la resonancia magnética, se aplicó primero una secuencia de localización en tres planos para posicionar el cerebro de rata dentro del imán. DTI se realizó utilizando una secuencia axial de imagen ecoplanar de eco de espín de un solo disparo con los siguientes parámetros: TR/TE = 3000/27 ms, matriz = 90 × 75, FOV = 20 × 15mm 2, grosor de corte = 0,7 mm, 30 direcciones de gradiente de difusión y valores b de 0 y 1000 s/mm 2. Para el análisis DTI, se dibujaron regiones de interés en la cápsula externa en cortes cerebrales 1,3 mm posteriores al bregma. Se reconstruyeron mapas paramétricos de anisotropía fraccionaria (FA), difusividad media (DM), difusividad axial (AD) y difusividad radial (RD) utilizando el software ParaVision 360. Los datos se expresan como la proporción del hemisferio afectado respecto al hemisferio sano contralateral.
Tinción LFB para evaluación de lesión de mielina y remielinización
Se realizó tinción con LFB para evaluar el daño estructural a axones mielinizados en la cápsula externa. La lesión de mielina, caracterizada por rarefacción y vacuolación de mielina, se cuantificó midiendo la densidad óptica integrada (IOD) de fibras mielinizadas teñidas con LFB dentro del ROI en la cápsula externa utilizando el software ImageJ (versión 6.0; umbral en escala de grises, 35–225). Según el atlas estereotáxico cerebralde rata 18, se analizaron tres secciones coronales para cada animal en bregma +1,0 mm, −1,3 mm y −1,6 mm, correspondientes a las porciones anterior, media y media-posterior de la cápsula externa. La DIO media en las tres secciones se calculó para representar a cada animal (n = 4 por grupo). Los valores de la IOD ipsilateral se normalizaron al lado contralateral y se expresaron como unporcentaje 19.
Registros electrofisiológicos para la evaluación de la excitabilidad del reflejo espinal
El reflejo H monosináptico espinal se registró mediante un sistema experimental de función biológica. Las ratas fueron ligeramente anestesiadas con α-cloralosa (50 mg/kg, intraperitoneal) para preservar la excitabilidad del reflejo espinal durante los registros electrofisiológicos. El nervio ciático izquierdo fue expuesto mediante disección contusiva y colocado sobre electrodos bipolares para estimulación eléctrica. Se aplicó una solución vitamínica aceitosa de forma intermitente al nervio expuesto para mantener la hidratación de los tejidos y la viabilidad neural. Se insertó un par de electrodos de grabación de acero inoxidable en los músculos interóseos de la pata trasera izquierda y se colocó un electrodo de tierra en la cola. El reflejo H se evocó mediante un estimulador de pulso monopolar-bipolar con una duración de pulso de 100 μs. El umbral del reflejo H y el umbral motor (MT) se determinaron mediante estimulación eléctrica incremental, aumentando la corriente en pasos de 0,05 mA hasta una intensidad máxima de 3,0 mA para evitar una lesión irreversible de los nervios periféricos.
Utilizando la misma intensidad de estimulación que provocó el reflejo H máximo (Hmáx), se administraron estímulos pulsativos de frecuencias variables (0,3, 5 y 10 Hz) para obtener amplitudes del reflejo H en diferentes frecuencias de estimulación. Se aplicó estimulación repetida de pulsos a 0,3 Hz para verificar que la amplitud de la onda M se mantenía dentro del 95% de su valor inicial; de lo contrario, el conjunto de datos se descartaba. La depresión dependiente de la frecuencia (FDD) del reflejo H se calculó como el porcentaje de la relación de amplitud H/M-onda (relación H/M) a 5 Hz y 10 Hz respecto a 0,3 Hz, siendo la relación H/M a 0,3 Hz la referenciabase 10.
Análisis de datos
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (versión 20.0). Los datos continuos se presentan como la media ± desviación estándar (DS). La normalidad de los datos se evaluó utilizando la prueba de Shapiro–Wilk. Se utilizó el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para comparar los resultados convencionales de imagen y otras variables cuantitativas entre grupos. Cuando se cumplió la homogeneidad de la varianza, se realizaron pruebas post hoc de Bonferroni; de lo contrario, se aplicó la prueba T3 de Dunnett. Los datos conductuales se analizaron utilizando ANOVA bidireccional, con el grupo experimental y el punto de tiempo postoperatorio como factores fijos. El análisis de correlación de Spearman se utilizó para evaluar las asociaciones entre variables del estudio. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.