Artículo de método

Reconstitución funcional de supercomplejos respiratorios mitocondriales

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DOI:

10.3791/72243

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21 de agosto de 2026

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1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo sencillo para reconstituir supercomplejos respiratorios mitocondriales funcionales en proteoliposomas bien definidos, con el fin de realizar una caracterización estructural y funcional correlacionada.

Resumen

Las mitocondrias son centros esenciales del metabolismo bioenergético y la principal fuente de ATP. La membrana interna mitocondrial aloja el sistema de fosforilación oxidativa, que incluye los complejos de la cadena de transporte de electrones (CI, CII, CIII2, y CIV) y la ATP sintasa (CV). En mamíferos, CI, CIII2, y CIV forman estructuras de orden superior denominadas supercomplejos (SC) como SC I+III2+IV, SC I+III2, y SC III2+IV. Aunque los factores fisiológicos que favorecen la formación de complejos superiores (SC) aún no están claros, se ha propuesto que la formación de SC podría aumentar las tasas de transferencia de electrones entre complejos, reducir la producción de especies reactivas de oxígeno o prevenir la agregación inespecífica de proteínas en la membrana interna mitocondrial densamente empaquetada. Los estudios estructurales y funcionales de los SC respiratorios han dependido en gran medida de complejos extraídos con detergentes. Si bien estos estudios han mejorado nuestra comprensión de la cadena de transporte de electrones, la ausencia de una bicapa membranal sellada limita su capacidad para investigar los beneficios funcionales del ensamblaje de supercomplejos. Sin embargo, avances recientes han demostrado que las proteínas de membrana pueden caracterizarse estructuralmente en entornos de membrana reconstituidos y similares al estado nativo, ofreciendo un contexto más fisiológico para estas investigaciones. Aquí presentamos un protocolo sencillo, rápido y reproducible para la reconstitución de complejos superiores respiratorios en liposomas. Este método permite evaluar los efectos de diferentes composiciones lipídicas, concentraciones proteicas y potencial de membrana sobre la función de los SC respiratorios, proporcionando una herramienta valiosa para futuros estudios mecanicistas.

Introducción

Las mitocondrias son centrales en la respiración eucariota. La membrana interna mitocondrial (MIM) alberga el sistema de fosforilación oxidativa, que comprende los complejos de la cadena de transporte de electrones (CI–CIV) y la ATP sintasa (CV)1. CI y CII transfieren electrones desde sustratos reducidos a la ubiquinona (CoQ), generando ubiquinol (CoQH2), que transfiere electrones a través de CIII2 y mediante el citocromo c a CIV, donde el oxígeno se reduce a agua. El bombeo de protones por CI, CIII2 y CIV establece la fuerza protón-motriz (FPM), que es utilizada por CV para sintetizar ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico (P)1.

Además de funcionar de forma independiente, el CI, el CIII2 y el CIV pueden ensamblarse en estructuras de supercomplejos (SC) de orden superior con estequiometrías definidas, como el SC I+III2+IV (también conocido como el respirasoma), el SC I+III2 y el SC III2+IV2,3,4,5. Las ventajas funcionales de estos ensamblajes aún no están claras6. Las hipótesis sobre su función abarcan desde roles en el ensamblaje y el canalización de sustratos hasta ser un subproducto de la alta densidad proteica en la membrana interna mitocondrial (IMM)3,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Estudios recientes sugieren que las propiedades de la membrana, incluyendo la tensión inducida por el desajuste hidrofóbico en la membrana, las interacciones proteína-proteína y las interacciones proteína-lípido, contribuyen a la formación y estabilidad de los SC16.

Los estudios estructurales y funcionales de proteínas de membrana tradicionalmente han dependido de complejos solubilizados con detergentes, lo que altera los entornos nativos de la membrana y limita la investigación de procesos dependientes del potencial de membrana y de gradientes iónicos. En contraste, avances recientes demuestran que las proteínas de membrana pueden caracterizarse estructuralmente en membranas reconstituidas17,18,19 o en membranas nativas20,21,22,23, mejorando significativamente nuestra capacidad para examinar los mecanismos funcionales de las proteínas de membrana que dependen del potencial de membrana y de gradientes iónicos.

Este protocolo describe un método sencillo y reproducible para reconstituir supercomplejos respiratorios mitocondriales (SC) en proteoliposomas definidos. El sistema resultante proporciona una plataforma potente para investigar cuestiones fundamentales relacionadas con la formación, estabilidad y función de los SC respiratorios en un entorno de membrana controlado y similar al nativo. Al incorporar CoQ10 y citocromo c durante la reconstitución, demostramos que los SC reconstituidos en proteoliposomas permiten el consumo de oxígeno impulsado por NADH, lo que indica que los complejos conservan su competencia funcional dentro de la bicapa lipídica. Además, mostramos que los SC pueden visualizarse fácilmente en proteoliposomas mediante microscopía electrónica criogénica (crio-EM), permitiendo así una correlación directa entre la organización estructural y la actividad bioquímica.

Aunque el método es robusto y fácilmente reproducible, la reconstitución exitosa depende de la cuidadosa optimización de la composición lipídica, la concentración de detergente, la relación proteína-lípido y el sellado eficiente de la membrana para preservar la estabilidad y actividad del supercomplejo.

El objetivo general de este método es permitir un análisis estructural y funcional integrado de los SC respiratorios bajo condiciones definidas de membrana. Este enfoque aborda limitaciones clave de los sistemas basados en detergentes al restablecer los SC en una bicapa lipídica sellada que puede soportar la formación de un potencial de membrana e interacciones proteína-lípido fisiológicamente relevantes. Además, el sistema permite un control preciso sobre la composición lipídica, los cofactores y el contenido proteico, lo que lo hace especialmente adecuado para pruebas sistemáticas de cómo las propiedades de la membrana influyen en la estabilidad y actividad del SC. En comparación con preparaciones solubilizadas con detergentes o enfoques in situ, este método ofrece la ventaja distintiva de combinar ensayos funcionales, como el consumo de oxígeno impulsado por NADH, con análisis estructural basado en criomicroscopía electrónica (crio-EM), permitiendo así correlaciones entre estructura y función difíciles de lograr con otros sistemas.

Protocolo

Las membranas mitocondriales de corazón porcino se aislaron a partir de corazones adquiridos comercialmente tejido obtenido de animales sacrificados para consumo humano. No se utilizaron animales vivos específicamente para este protocolo. Se determinó que el uso de este material está exento de la aprobación ética en animales, ya que el tejido se obtuvo como subproducto de animales sacrificados para consumo humano

1. Purificación de los supercomplejos mitocondriales SC I+III2/SC I+III2+IV a partir de membranas lavadas de mitocondrias de corazón de cerdo

  1. Descongele 40 mg (4 mL) de membranas mitocondriales lavadas en alícuotas de 10 mg/mL (las membranas lavadas se prepararon según se informó previamente24,25).
  2. Diluya las membranas en 4 mL de tampón MX (30 mM HEPES, pH 7.7, 150 mM acetato de potasio, 10% glicerol, 1 mM EDTA, 0,002% (p/v) fenilmetilsulfonil fluoruro, 0,1% (p/v) CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato), 1 mM ferricianuro de potasio). Añada 8 mL de digitonina al 2% (p/v) en tampón MX (160 mg de digitonina en 8 mL; relación final 4:1, mg de digitonina:mg de proteína total de membrana). El volumen final es de 16 mL.
  3. Homogenice manualmente en un homogenizador Dounce (50 golpes), teniendo cuidado de no introducir burbujas. Incube (con agitación suave) durante 1 h a 4 °C.
  4. Centrifugue el homogenizado a 16.000 × g, 4 °C durante 30 min. Recojá el sobrenadante.
  5. Concentre el sobrenadante hasta 1 mL utilizando un concentrador por filtro centrífugo con corte de 100 kDa a 3000 × g, 4 °C. Realice la concentración en ciclos de 10 min, mezclando bien entre cada centrifugación, hasta alcanzar el volumen deseado (las muestras tienden a agregarse si no se resuspenden entre ciclos de centrifugación debido al aumento de la concentración local del detergente cerca del filtro).
  6. Divida la muestra concentrada en cuatro alícuotas de 250 µL. 
  7. Equilibre la columna de cromatografía de exclusión por tamaño (volumen de columna: 24 mL) con tampón de cromatografía de exclusión por tamaño (tampón SEC; 30 mM HEPES pH 7.8, 150 mM acetato de potasio, 1 mM EDTA, 0,005% de detergente glycocide) durante 48 mL (2 volúmenes de columna).
  8. Configure el programa de cromatografía para recolectar fracciones de 1 mL a partir de un volumen de elución de 6 mL y continúe hasta un volumen de elución de 24 mL. Inyecte una alícuota de 250 µL (del paso 1.6) en una resina de cromatografía de exclusión por tamaño de 24 mL. Utilice la columna previamente equilibrada con el tampón de cromatografía de exclusión por tamaño (del paso 1.7). Recoja las fracciones del fraccionador antes de iniciar la siguiente corrida.
  9. Repita los pasos 1.7 y 1.8 para el resto de las alícuotas concentradas del paso 1.6.
  10. Corra 10 µL de cada fracción de las corridas SEC mezcladas con 5 µL de colorante de carga para electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) en un gradiente de acrilamida del 3% al 12% y realice un ensayo de actividad en gel de CI con NADH/cloruro de nitrotetrazolio azul26  para verificar la actividad de CI en las fracciones. 
    NOTA: Los complejos respiratorios SC se eluyen del medio de filtración en gel de agarosa reticulada de 24 mL a un volumen de elución de aproximadamente 11,5 mL.
  11. Combine las fracciones que muestren la actividad máxima de CI de alto peso molecular en el ensayo de actividad de CI en gel. Concentre la muestra según se describió en el paso 1.5 anterior.
    NOTA: Los SC concentrados en un detergente glucósido, glico-diosgenina (GDN), pueden almacenarse con glicerol al 30% (v/v) a una concentración final de aproximadamente 10 mg/mL en N2 líquido. De 40 mg de complejo mitocondrial lavado se obtuvieron 3,4 mg de proteína total según un ensayo BCA.

2. Preparación de la mezcla de lípidos

NOTA: Modificado de protocolos previamente descritos27,28. El cloroformo es tóxico, volátil y un posible carcinógeno. Manipúlese únicamente en una campana extractora de gases químicos certificada y con equipo de protección personal (PPE) adecuado. El pentano es altamente inflamable. Manténgase alejado de fuentes de ignición. Manipúlese únicamente en una campana extractora de gases químicos certificada y con equipo de protección personal (PPE) adecuado. Deseche los residuos de disolventes orgánicos en recipientes aprobados para residuos de disolventes halogenados/no halogenados según las políticas institucionales de salud y seguridad en el trabajo (EH&S).

  1. En una campana extractora, prepare soluciones stock de 25 mg/mL de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina), POPE (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina) y CL (cardiolipina: 1,3-bis(sn-3’-fosfatidil)-sn-glicerol; de tejido cardíaco bovino) en cloroformo por separado. 
  2. Prepare CoQ10 al 10 mM en cloroformo. Para 25 mg de mezcla total de lípidos, añada 0,4 mL (10 mg) de POPC, 0,4 mL (10 mg) de POPE, 0,2 mL (5 mg) de CL y 50 µL de CoQ10 al 10 mM (500 nmol finales de CoQ10 (20 nmol de CoQ10/mg de lípido)) de las soluciones stock en un tubo de ensayo de vidrio de 13 mL. La proporción final en peso de POPC:POPE:CL es de 2:2:1.
  3. Seque la mezcla bajo una corriente de gas inerte (argón o nitrógeno) para eliminar el cloroformo, mientras gira suavemente el tubo para formar una capa delgada de la mezcla de lípidos a lo largo de las paredes del tubo. Seque con una corriente constante de gas inerte durante 10 min.
  4. Reconstituya la capa de lípidos seca con 1 mL de pentano y repita el paso 2.3, facilitando así la eliminación del cloroformo residual.
  5. Incube el tubo con lípidos secos en un desecador al vacío a temperatura ambiente durante la noche para eliminar completamente los solventes. 
  6. Añada 5 mL de tampón de proteoliposomas (PLB; 10 mM MOPS pH 7,4, 150 mM KCl) para rehidratar la mezcla de lípidos, selle firmemente el tubo para evitar derrames y agite suavemente en vórtex hasta que los lípidos se solubilicen completamente (los lípidos secos ya no deben ser visibles en la superficie del tubo).
  7. Retire el sello, llene el tubo con gas inerte (argón o nitrógeno), vuelva a sellar el tubo e incube a temperatura ambiente durante 1 h. Tras 1 h de incubación, prepare alícuotas de 300 µL de la mezcla de lípidos y almacénelas a −20 °C. 
    NOTA: La mezcla POPC:POPE:cardiolipina (2:2:1) se seleccionó basándose en la optimización empírica y porque la PE y la cardiolipina son componentes principales de la membrana mitocondrial interna; sin embargo, el protocolo puede adaptarse fácilmente para probar otras composiciones lipídicas.

3. Reconstrucción de SC mitocondriales en liposomas

  1. Descongele alícuotas de SC almacenadas en N₂ líquido  (paso 1.12) sobre hielo. Realice un intercambio de tampón para eliminar el glicerol de la muestra, resuspendiendo la muestra en tampón SEC. Concentre la muestra utilizando filtros centrífugos con un corte de 100 kDa a 3000 × g a 4 °C. Entre cada centrifugación para concentrar (~cada 5 min), continúe realizando un intercambio de tampón resuspendiendo la muestra en tampón SEC.
  2. Verifique la concentración final del SC mediante un ensayo BCA (un kit de ensayo de proteína con ácido bicinconínico).
  3. Descongele una alícuota de 300 µL de la mezcla de lípidos preparada en el paso 2.7 y extrúyala a través de un extrusor equipado con una membrana de policarbonato de 100 nm durante seis ciclos a temperatura ambiente (un ciclo consiste en pasar la mezcla de lípidos desde la jeringa izquierda a la derecha y de regreso). Tras completar los ciclos de extrusión, recoja los liposomas resultantes de 100 nm desde la jeringa opuesta al lado de inicio. Alternativamente, los liposomas pueden generarse por sonicación. 
  4. Añada 9 µL de detergente al 20% (p/v) (concentración final 0,6% p/v) a 250 µL de la mezcla de lípidos extruida en un tubo separado.
    NOTA: Se pueden probar diferentes detergentes. El colato sódico, un detergente sal biliar aniónico, funcionó mejor en estos experimentos.
  5. Mezcle mediante inversión e incube a 4 °C durante 30 min. 
  6. Añada 120 µg (o más) de SC mitocondrial y 3 µL de citocromo c al 10 mM (concentración final de 100 µM) a la mezcla. Ajuste el volumen hasta 300 µL con PLB. La relación final lípido:proteína es aproximadamente 10:1 (p:p). Como control adicional, genere liposomas vacíos en paralelo añadiendo tampón SEC (30 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM acetato de potasio, 1 mM EDTA, 0,005% de un detergente glucósido) a la mezcla de lípido-detergente en lugar de SC mitocondriales y citocromo c. 
  7. Mezcle mediante inversión e incube a 4 °C durante 30 min. 
  8. Lave una columna giratoria desaladora precargada que contenga resina G-25 con tampón PLB cuatro veces usando flujo por gravedad. Luego, lave la columna mediante centrifugación a 1.000 × g durante 2 min.
  9. Añada la muestra de proteoliposomas a la columna giratoria desaladora precargada con resina G-25 lavada y centrifugue la columna a 1.000 × g a 4 °C durante 2 min para eliminar el detergente. Recoja el eluato.
    NOTA: Los liposomas preparados por extrusión mostraron una distribución de tamaños más uniforme que los generados por sonicación. No centrifugue la columna giratoria desaladora precargada durante más tiempo del recomendado por el fabricante, para evitar la contaminación de la muestra con detergente. Los proteoliposomas se almacenaron a 4 °C y generalmente se utilizaron dentro de las 36 h para minimizar la posible pérdida de actividad y preservar la integridad del supercomplejo.

4. Ensayo de flotación de lípidos29

  1. Prepare soluciones de sacarosa al 27% y al 7% (p/v) en PLB. Prepare un gradiente escalonado añadiendo cuidadosamente 1,5 mL de sacarosa al 27% y 0,9 mL de sacarosa al 7% en un tubo de centrífuga de 3,5 mL.
  2. Añada por capas 300 µL de proteoliposomas (del paso 3.9) que contengan SC sobre el gradiente de sacarosa. Centrifugue los gradientes a 100.000 × g en un rotor de ángulo fijo durante 2 h a 4 °C.
  3. Recoja cuidadosamente (tratando de evitar mezclar) nueve fracciones de 300 µL (o 10 fracciones de 270 µL) de arriba hacia abajo. Re_suspenda el precipitado, si lo hubiera, en la última fracción y recójalo como la fracción 9 o 10. Cualquier complejo SC no reconstituido debería acumularse en la fracción 9 o 10.
    NOTA: El ensayo de flotación permite separar los proteoliposomas reconstituidos de los liposomas vacíos y de los complejos proteicos no reconstituidos. Se utiliza para optimizar la reconstitución.

5. Ensayo espectroscópico de actividad de ferricianuro de CI y ensayo de actividad de CI en gel

  1. Preparar la cantidad necesaria de tampón de reacción de ferricianuro (FRB; 20 mM Tris HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1 % p/v 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 1 mM ferricianuro de potasio).
  2. Aliquotar 990 µL de tampón de reacción en una cubeta de 1 mL. Añadir 5 µL de la muestra (de cada fracción del gradiente) a la cubeta y luego agregar 5 µL de NADH 20 mM (concentración final 100 µM) a la reacción. Sellar la cubeta con una película transparente y mezclar mediante inversión.
  3. Monitorear la velocidad de disminución de absorbancia a 340 nm a 25 °C en un espectrómetro. La disminución de absorbancia a 340 nm indica la oxidación de NADH. Repetir para todas las fracciones por triplicado. Utilizar 5 µL de PLB en lugar de la muestra para registrar el blanco.
  4. Calcular la velocidad de oxidación de NADH tras restar el blanco y graficar la actividad total de cada una de las fracciones.
    NOTA: Alternativamente, el experimento puede realizarse en una placa de 96 pocillos.
  5. Reunir las fracciones con actividad total máxima (evitando las fracciones del fondo del tubo que presentan actividad, ya que corresponden a proteína no reconstituida). Ajustar el volumen de las fracciones reunidas a 20 mL con PLB para diluir la sacarosa.
  6. Centrifugar las muestras a 150.000 × g, 4 °C durante 1 h en un rotor de ángulo fijo. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 µL de PLB.
  7. Mezclar 25 µL del precipitado resuspendido del paso anterior con 25 µL de digitonina al 2 % p/v en PLB e incubar (con agitación rotatoria) a 4 °C durante 1 h.
  8. Centrifugar para sedimentar las proteínas no extraídas a 16.000 × g durante 20 min. Recoger el sobrenadante.
  9. Añadir 10 µL de colorante de carga para BN-PAGE a 30 µL del sobrenadante y cargar en una BN-PAGE con gradiente del 3 % al 12 %. Preparar dos geles para realizar los ensayos de actividad en gel de CI y CIV26.
  10. Correr el gel a 150 V durante 30 min con tampón BN-PAGE oscuro (25 mM Tris, 0,192 g de glicina, 200 mg de azul de Coomassie). Cambiar el tampón azul oscuro por uno azul claro (25 mM Tris, pH 8,3, 0,192 g de glicina, 20 mg de azul de Coomassie) y continuar la electroforesis durante otras 2 h a 200 V.
  11. Tras finalizar la electroforesis, transferir los geles a un recipiente adecuado y realizar los ensayos de actividad en gel de CI y CIV26.
    NOTA: Para estudios estructurales y funcionales de complejos reconstituidos en liposomas, utilizar los proteoliposomas resuspendidos restantes del paso 5.6. Una vez que la reconstitución haya sido completamente optimizada, se pueden omitir los pasos 4 y 5 y utilizar directamente los proteoliposomas reconstituidos del paso 3.

6. Ensayo de apagado de fluorescencia de ACMA para medir la integridad de la membrana de los proteoliposomas reconstituidos29

  1. Prepare la cantidad necesaria de tampón de reacción ACMA (9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina) (10 mM MOPS pH 7.4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0.5 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA), 2 mM 2-mercaptoetanol). 
  2. Aliquote 930 µL del tampón de reacción en una cubeta de 1 mL. Añada 50 µL de los proteoliposomas reconstituidos a la cubeta, selle la cubeta y mezcle mediante inversión. Incube alejado de la luz durante 8 min.
  3. Establezca los parámetros del espectrómetro en: longitud de onda de excitación 410 nm, longitud de onda de emisión 490 nm. 
  4. Después de la incubación, mezcle nuevamente la cubeta mediante inversión y lea la fluorescencia con el espectrómetro a temperatura ambiente durante 8 min.
  5. Añada 4 µL de valinomicina 20 µM (concentración final de 80 nM) a la cubeta, mezcle mediante inversión y mida durante 8 min.
  6. Añada 6 µL de CCCP 1 mM (carbonyl cianuro m-clorofenil hidraza) (concentración final de 6 µM) a la cubeta, mezcle mediante inversión y mida durante 8 min.
  7. Para establecer un control de vesículas vacías, repita los pasos 6.2–6.6, pero sustituya los proteoliposomas reconstituidos por "liposomas vacíos". Los liposomas vacíos se generan siguiendo los mismos pasos que los proteoliposomas reconstituidos, pero utilizando tampón SEC en lugar de añadir SCs durante la reconstitución (paso 3.6).
  8. Repita la medición por triplicado tanto para los proteoliposomas reconstituidos como para los liposomas vacíos, y represente gráficamente su fluorescencia relativa en función del tiempo.
    NOTA: Los datos obtenidos de los proteoliposomas reconstituidos o de los liposomas vacíos se normalizan mediante (Fi − Fmin)/(Fmax−Fmin), donde Fmax es el valor inicial de fluorescencia de base del muestra y Fmin es el valor más bajo de la línea base de esa muestra tras añadir CCCP.
    ADVERTENCIA: El CCCP es un desacoplador mitocondrial tóxico y debe manipularse con guantes en una campana extractora.

7. Mediciones de respirometría del consumo de oxígeno para evaluar la función de las SC reconstruidas30.

NOTA: La tasa de consumo de oxígeno se mide utilizando un sistema de electrodo de oxígeno de tipo Clark. Los ensayos funcionales de los SC reconstituidos se realizan directamente sobre el eluato de la columna desalinizadora (paso 3.9).

  1. Configure el instrumento del sistema de electrodo de oxígeno según las instrucciones del fabricante y abra el software de control del instrumento. Añada 2 mL de agua ultrapura a la cámara de medición.
  2. Ajuste la velocidad de agitación hasta que la gráfica de concentración de oxígeno permanezca constante al aumentar la velocidad de agitación (comience en 10, aumente en incrementos de 10). Retire el agua MQ y añada agua oxigenada (agua MQ en un frasco agitado vigorosamente).
  3. Haga clic en Calibrar > Calibración en fase líquida > Agua saturada con aire y espere a que la calibración se estabilice (velocidad 0 nmol por min). Con una espátula pequeña, añada unos pocos cristales (4–6) de ditionito de sodio al vaso de reacción para establecer cero oxígeno en la cámara.
  4. Espere a que la señal alcance una meseta antes de continuar. Guarde la calibración y limpie la cámara de reacción con 5 × 1 mL de etanol al 70 %, con 5 × 1 mL de EDTA 0,1 mM, con 5 × 1 mL de agua MQ y con 5 × 1 mL de tampón de reacción para oxigrafía (ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 0,02 mM EGTA, 0,5 mg/mL BSA).
  5. Añada 2 mL de ORB, haga clic en el botón «iniciar lectura» en el software y espere a que la gráfica se estabilice. Mientras añade los proteoliposomas (muestra) en la cámara de reacción, etiquete la gráfica en el software para indicar la adición de la muestra.
    NOTA: La concentración de proteína en la muestra de proteoliposomas se estima a partir de la proteína total añadida a los liposomas. Una relación proteína: lípido de 1:12 y una concentración final de 50 µg/mL de proteína en la cámara del sistema de electrodo de oxígeno (2 mL) dieron los mejores resultados. No se midió con precisión el rendimiento de proteoliposomas.
  6. Una vez que la lectura del sistema de electrodo de oxígeno se estabilice, añada NADH a la cámara de reacción y simultáneamente etiquete la adición en el software. Continúe la lectura durante 5 min.
  7. Añada CCCP y etiquete la adición en el software, y continúe la lectura durante 5 min.
  8. Añada un inhibidor (por ejemplo, inhibidor de CI (piericidina A) o inhibidor de CIII2 (mixotiazol) o inhibidor de CIV (NaN3)) y etiquete la adición en el software, lea durante 2 min y luego detenga la lectura. 
  9. Guarde la gráfica y limpie la cámara de reacción con 5 × 1 mL de etanol al 70 %, 5 × 1 mL de EDTA 0,1 mM, 7 × 1 mL de agua MQ y 5 × 1 mL de ORB antes de realizar otra medición.
  10. Para corregir los datos por la velocidad de fondo, calcule la velocidad de fondo, es decir, la pendiente de la lectura antes de la adición de NADH, y extrapole linealmente esta velocidad a lo largo del curso temporal de la medición, calculando una [O2] de fondo esperada para cada punto temporal. Luego reste la [O2] de fondo extrapolada del valor medido de [O2] para cada punto temporal.
  11. Calcule las velocidades de consumo de oxígeno (OCRs) como la pendiente de las mediciones de concentración de [O2] corregidas por fondo tras la adición de cada reactivo.
  12. Para calcular las velocidades relativas respecto a la OCR tras la adición de NADH, divida para cada trazado individual cada OCR medida (por ejemplo, OCR tras la adición de NADH, CCCP e inhibidor, respectivamente) por la OCR medida tras la adición de NADH.     
    NOTA: PRECAUCIÓN: El ditionito de sodio es un agente reductor fuerte y puede reaccionar violentamente con oxidantes o humedad. Manipúlelo con guantes. Deseche los residuos que contengan inhibidores como residuos químicos peligrosos según las directrices institucionales.

8. Estimación del tamaño de los liposomas reconstituidos mediante dispersión dinámica de la luz

  1. Encienda el instrumento de dispersión dinámica de luz (DLS) y espere aproximadamente 30 minutos para que el láser se estabilice.
  2. Inicie el software de adquisición del instrumento y cierre cualquier archivo anterior.
  3. Filtre los proteoliposomas (0,2 μm) para eliminar cualquier partícula.
  4. Transfiera 70 µL de los proteoliposomas a una cubeta limpia, evitando huellas dactilares o manchas.
  5. Coloque la cubeta en el instrumento y cierre la tapa firmemente.
  6. Cree un archivo nuevo y seleccione Medición manual > Tamaño.
  7. Establezca la temperatura en 25 °C y mantenga el índice de atenuación en automático.
  8. Defina las propiedades del dispersante (viscosidad e índice de refracción; por ejemplo, IR = 1,330 para agua/tampón).
  9. Configure los parámetros de adquisición (duración automática, aproximadamente 3 mediciones, procesamiento de propósito general).
  10. Inicie la medición y supervise el tamaño, el índice de politispersión (PDI) y la tasa de conteo (objetivo ~100–500 kcps).
  11. Analice los resultados: verifique la distribución del tamaño (intensidad/volumen), el PDI (<0,3 aceptable) y la calidad de la autocorrelación (decaimiento suave, línea base estable); guarde los datos.

9. Preparación y análisis de rejillas para microscopía electrónica criogénica

  1. Utilice la muestra de proteoliposomas del paso 5.11 (o del paso 3.9 si se omiten los pasos 4 y 5) para preparar las rejillas de microscopía electrónica. Concentre los proteoliposomas si es necesario repitiendo el paso 5.6 y resuspendiéndolos en un volumen menor de PLB.
  2. Someta a descarga luminiscente rejillas de cobre de 300 mallas recubiertas con carbono perforado durante 90 s a 20 mA utilizando aire en un sistema de limpieza por descarga luminiscente.
  3. Configure un sistema automático de congelación por inmersión para congelar por inmersión a 95 % de humedad y a 15 °C con los siguientes parámetros: tiempo de absorción 10 s, fuerza de absorción −8, tiempo de espera 10 s y tiempo de drenaje 0.
  4. Coloque las pinzas con la rejilla sometida a descarga luminiscente en el sistema de congelación por inmersión.
  5. Añada 4,0 µL de la muestra de proteoliposomas a la rejilla sometida a descarga luminiscente en un dispositivo automático de inmersión.
  6. Incube las rejillas durante 10 s antes de absorber durante 10 s y congelar por inmersión en etano líquido. Transfiera cuidadosamente las rejillas a la caja de rejillas dentro de la cámara de N2 líquido y posteriormente al depósito de almacenamiento de N2 líquido.
  7. Cargue las rejillas congeladas y realice el análisis en un microscopio electrónico de transmisión con un cargador de muestras criogénico. Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión equipado con un detector directo de electrones.
  8. Configure el microscopio según las instrucciones del fabricante y analice las rejillas en busca de proteoliposomas reconstituidos. Guarde las imágenes.
    NOTA: PRECAUCIÓN: El etano líquido es altamente inflamable y criogénico; maneje con el equipo de protección personal adecuado y lejos de fuentes de ignición para evitar incendios y lesiones por quemaduras frías. El nitrógeno líquido es criogénico y puede causar quemaduras frías graves y desplazamiento de oxígeno. Manipúlelo con el equipo de protección personal criogénico adecuado y úselo únicamente en áreas bien ventiladas.

Resultados

Mediante este protocolo, identificamos las condiciones óptimas de reconstitución para los supercomplejos mitocondriales (SC) aislados de mitocondrias de corazón de cerdo (Figura 1A,B). El protocolo de gradiente escalonado de sacarosa separa eficazmente los proteoliposomas reconstituidos de las vesículas vacías y de las proteínas no incorporadas, lo que permite realizar pruebas rápidas y optimizar las condiciones. Los resultados representativos que se muestran en la Figura 2 presentan un gradiente con la muestra aplicada antes y después de la centrifugación. Además, optimizamos el detergente utilizado para reconstituir los supercomplejos respiratorios en liposomas. Se utilizaron por separado cuatro detergentes diferentes—un detergente de sales biliares aniónico, CHAPS, digitonina y un detergente glucósido—para la reconstitución con los SC. La actividad total de CI en las fracciones se midió mediante el ensayo de oxidoreducción de NADH-ferricianuro para cada detergente evaluado (Figura 3A–D). En las reconstituciones exitosas, se observó la actividad máxima de CI en las fracciones correspondientes a la interfase de las dos concentraciones de sacarosa (sacarosa al 27% p/v y sacarosa al 7% p/v). Cabe destacar que se detectó actividad mínima en la fracción #10 con el detergente de sales biliares aniónico y con CHAPS, mientras que la fracción #10 con digitonina y con detergente glucósido mostró actividad considerable, lo que indica que la digitonina y un detergente glucósido no reconstituyen eficazmente los supercomplejos en los liposomas. Se utilizó un detergente de sales biliares aniónico en todas las reconstituciones posteriores.

El ensayo de actividad en gel de CI y CIV realizado en un gel de electroforesis nativa azul de proteoliposomas POPC:POPE:CL (2:2:1) extraídos con digitonina demuestra las cantidades relativas de los supercomplejos y de los complejos individuales de la cadena de transporte de electrones (ETC) tras la reconstitución (Figura 4). Los resultados indican que la interacción entre CI y CIII2 se mantiene en gran medida en los proteoliposomas tras la re-extracción con digitonina y BN-PAGE. Aunque algo de actividad de CIV está presente en la banda del supercomplejo, también se observa una señal intensa a un peso molecular más bajo, compatible con CIV aislada, lo que indica disociación. La permeabilidad de la membrana de los liposomas reconstituidos se midió mediante el ensayo de apagado de fluorescencia de ACMA, lo que indica que los proteoliposomas no eran significativamente permeables a protones (Figura 5A,B). El tamaño de los liposomas reconstituidos se estimó mediante DLS, mostrando que la extrusión previa a la reconstitución conduce a una distribución final del tamaño de los proteoliposomas de 82,9 ± 0,8 nm de diámetro para vesículas vacías y de 110,6 ± 0,4 nm para los proteoliposomas de supercomplejos reconstituidos (RSPs) (Figura 6). El consumo de oxígeno por parte de los proteoliposomas se utilizó para evaluar la función del supercomplejo, revelando un consumo de oxígeno impulsado por NADH claramente sensible a inhibidores (Figura 7A). La representación gráfica de las OCR relativas respecto a la OCR tras la adición de NADH informa directamente sobre el grado de acoplamiento dentro de los RSPs, es decir, la OCR aumenta en un factor de ~1,5 tras la adición de CCCP en comparación con la adición de NADH solo (Figura 7B). Las rejillas de criomicroscopía electrónica analizadas permitieron la visualización de los supercomplejos en la membrana de los proteoliposomas, confirmando la reconstitución exitosa (Figura 8A–I).

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Figura 1: Aislamiento y caracterización de supercomplejos solubilizados con detergente a partir de mitocondrias de corazón de cerdo. (A) Cromatograma representativo de la purificación por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de complejos de membrana mitocondrial de cerdo extraídos con digitonina. (B)  PAGE nativo azul (BN-PAGE) de las fracciones de A visualizadas mediante tinción de actividad en gel de CI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Gradientes escalonados de sacarosa con proteoliposomas. Antes de la centrifugación (izquierda), después de la centrifugación (derecha) a 100.000 × g durante 2 h en una ultracentrífuga. La muestra de proteoliposomas cargada sobre el gradiente se separa en vesículas vacías, proteoliposomas y proteína agregada en el fondo. A continuación, este gradiente se fracciona para su posterior caracterización, como se describe. Se indica y etiqueta el tamaño aproximado de cada fracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ensayo de flotación para evaluar la eficiencia de reconstitución en diferentes detergentes. Actividad de NADH-ferricianuro de CI en las fracciones del gradiente escalonado de sacarosa tras la reconstitución con (A) detergente de sal biliar aniónico, (B) 3-[(3-colamidopropil)dimetilamoniopropanosulfonato] (CHAPS) (0,6 % (p/v)), (C) digitonina (0,6 % p/v), (D) detergente glicósido (GDN) (0,6 % (p/v)). La fracción #10 se obtiene resuspendiendo cualquier precipitado en la última fracción. La actividad en la fracción #10 indica que las proteínas no se han reconstituido. n = 3 y las barras de error muestran la DE = desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Ensayo de actividad en gel de proteoliposomas extraídos con digitonina separados en BN-PAGE del 3% al 12%. Ensayo de actividad en gel de CI (izquierda) y CIV (derecha). R = respirasoma (SC I+III2+IV), SC1,3 (SC I+III2), IGA CI = (ensayo de actividad de CI en gel); IGA = ensayo de actividad en gel, CIV = (ensayo de actividad de CIV en gel). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Ensayo de atenuación de la fluorescencia de ACMA para detectar fugas de protones en proteoliposomas reconstruidos. Mediante un colorante sensible al pH (ACMA), se comparó el pH interno de proteoliposomas reconstruidos (cian) con el de liposomas vacíos (naranja) tras la adición secuencial de valinomicina y CCCP. Se muestran trazos representativos de fluorescencia de ACMA obtenidos de diferentes preparaciones de proteoliposomas para su comparación. (A) Liposomas reconstruidos con membrana comprometida (con fugas). (B) Liposomas reconstruidos con membrana intacta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Mediciones de dispersión dinámica de la luz de liposomas vacíos y proteoliposomas de SC reconstituidos. Se muestran las distribuciones promedio del tamaño ponderado por volumen de liposomas vacíos extruidos (naranja) y proteoliposomas reconstituidos con SC (cian). Las mediciones se realizaron por triplicado técnico. Los liposomas vacíos tienen un diámetro hidrodinámico promedio de 82,9 ± 0,8 nm, mientras que los RSP tienen un diámetro hidrodinámico promedio de 110,6 ± 0,4 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Ensayos de consumo de oxígeno para evaluar el acoplamiento de SCs reconstituidos en liposomas. Se midió el consumo de oxígeno para evaluar la actividad respiratoria y el acoplamiento de los complejos de la cadena de transporte de electrones (ETC) tras su reconstitución en liposomas generados por extrusión. (A) Trazado representativo del electrodo de oxígeno corregido por fondo, que muestra los cambios en la concentración de oxígeno tras la adición secuencial de NADH para iniciar la respiración impulsada por CI, CCCP para disipar el gradiente de protones y medir la tasa máxima de consumo de oxígeno desacoplado (OCR), piericidina A para inhibir CI, antimicina A para inhibir CIII2, o NaN3 (azida) para inhibir CIV. (B) Cuantificación del OCR en las condiciones indicadas y corregida según el paso 7.10. Se muestran los puntos de datos relativos al OCR tras la adición de NADH para cada trazado, junto con la media ± DE (barras de error). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Visualización mediante microscopía electrónica criogénica de SCs reconstituidos en membranas de proteoliposomas. (A–C) Micrografías electrónicas representativas de rejillas analizadas, que muestran SCs reconstituidos asociados a membranas de proteoliposomas. Los SCs reconstituidos se indican con flechas amarillas. Barras de escala = 50 nm. (D–I) Partículas representativas de SCs vistas con mayor aumento sobre las membranas de proteoliposomas. Barras de escala = 10 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Se presenta un método sencillo y reproducible para reconstituir complejos supramoleculares (SCs) mitocondriales respiratorios en proteoliposomas definidos, lo que permite investigar de manera controlada su estructura y función. Varios pasos de este protocolo son fundamentales para lograr una reconstitución exitosa. En nuestra experiencia, los liposomas generados por extrusión presentan una distribución de tamaños más uniforme (evaluada mediante dispersión dinámica de la luz) que aquellos producidos por sonicación. La eliminación eficiente del detergente mediante una columna giratoria de desalación preempacada es esencial para favorecer el sellado de la membrana y la incorporación adecuada de los SCs en una bicapa lipídica; una eliminación incompleta puede dar lugar a proteoliposomas permeables o inestables. La optimización de la composición lipídica, las relaciones proteína/lípido y la elección del detergente es igualmente importante, ya que estos parámetros influyen fuertemente en la eficiencia de reconstitución y en la estabilidad de los SCs. El ensayo de flotación en gradiente de sacarosa es útil para la optimización inicial; sin embargo, una vez establecidas las condiciones, es preferible utilizar los proteoliposomas directamente tras la columna giratoria de desalación preempacada para realizar análisis estructurales y funcionales posteriores, evitando así la pérdida de muestra y la perturbación durante la fraccionación en gradiente. El volumen de fracción necesario para observar actividad varía entre diferentes preparaciones. Ajuste el volumen a añadir a la mezcla de reacción según cada preparación. La orientación del SC respiratorio dentro de la membrana del proteoliposoma puede influir significativamente en las mediciones respiratorias. El procedimiento de reconstitución no fue optimizado para imponer una única topología; por lo tanto, aunque se espera una población mixta de orientaciones, los ensayos de accesibilidad de ferricianuro en el complejo I (CI) indican una marcada tendencia hacia brazos periféricos del CI orientados hacia el exterior.

La orientación de los supercomplejos reconstruidos se evaluó experimentalmente, y la actividad de la ferricianuro de CI se midió en presencia y ausencia del detergente. En RSP intactos, el NADH añadido externamente solo puede acceder a las moléculas de CI cuyo brazo periférico está expuesto al medio externo, mientras que la permeabilización con detergente permite el acceso de NADH a todos los complejos. Por lo tanto, este ensayo estima la fracción de brazos periféricos de CI funcionalmente accesibles que enfrentan el medio externo, en lugar de proporcionar una determinación estructural completa de la topología del proteoliposoma. La comparación de las actividades medidas bajo estas condiciones indicó que el 83,1% ± 0,04% de los respirasomas (el SC) estaban orientados con el brazo periférico de CI orientado hacia afuera, revelando un sesgo significativo de orientación durante la reconstitución.

Varias modificaciones y estrategias de solución de problemas pueden mejorar la reproducibilidad y la estabilidad. Los ensayos de actividad en gel para CI y CIV, realizados en fracciones agrupadas extraídas con digitonina a partir de gradientes de sacarosa, muestran bandas para los SC, lo que indica que los SC no se disocian completamente durante la reconstrucción. Sin embargo, la banda de SC es más intensa en el gel de actividad de CI en comparación con el gel de actividad de CIV, lo que sugiere que CIV podría disociarse parcialmente de CI y CIII2 tras la reconstrucción (Figura 4). Ajustar la composición lipídica podría mejorar la estabilidad de los SC. La disociación parcial de CIV también podría deberse a la elección del detergente o a la eliminación rápida del detergente durante la reconstrucción, lo cual podría desestabilizar interacciones proteína-proteína más débiles dentro del supercomplejo. Una mayor optimización de las condiciones de intercambio de detergentes podría mejorar la retención de CIV. Además, minimizar el estrés mecánico, evitar pasos innecesarios de purificación y manipular cuidadosamente las muestras puede ayudar a preservar la integridad de los proteoliposomas. Para los ensayos funcionales, es fundamental asegurar el sellado completo de los proteoliposomas, ya que la permeabilidad de la membrana impide el acoplamiento al gradiente transmembranal de protones. Para la preparación de rejillas de criomicroscopía electrónica, es importante utilizar rejillas recubiertas con carbono continuo, ya que se ha demostrado que esto mejora la distribución de las partículas dentro de los orificios de la rejilla19.

A pesar de sus ventajas, este enfoque tiene limitaciones. Los proteoliposomas no reproducen completamente la complejidad composicional y dinámica de la membrana mitocondrial interna nativa, y la disociación parcial de los componentes del complejo de superestructuras (SC), particularmente el CIV, sigue siendo un desafío. Las mediciones funcionales también pueden verse influenciadas por un acoplamiento incompleto o por la heterogeneidad en la eficiencia de la reconstitución. No obstante, en comparación con los sistemas solubilizados con detergentes, este método preserva las interacciones lípido-proteína y mantiene un entorno de membrana similar al nativo, a la vez que ofrece un mayor control experimental que los enfoques in situ. Por tanto, proporciona una plataforma valiosa para la investigación sistemática de cómo la composición lipídica y las propiedades de la membrana regulan la estabilidad y la actividad del complejo de superestructuras (SC).

Comprender estas relaciones es particularmente importante porque se ha implicado que la alteración de la organización de los supercomplejos respiratorios contribuye a una amplia gama de trastornos mitocondriales y metabólicos31,32,33,34,35,36,37,38,39,40. Defectos en el ensamblaje de los complejos de la cadena de transporte de electrones (ETC), en la síntesis de cardiolipina o en la remodelación lipídica, como se observa en trastornos tales como el síndrome de Leigh41,42,43,44,45,46,47, el síndrome de Barth48,49,50,51,52,53,54 y el síndrome de Sengers48, pueden desestabilizar los supercomplejos, alterar la transferencia de electrones, reducir la producción de ATP y aumentar la generación de especies reactivas de oxígeno. Estos defectos bioenergéticos afectan de manera desproporcionada a tejidos con alta demanda de energía, como el corazón, el músculo esquelético y el cerebro, dando lugar a fenotipos que incluyen cardiomiopatía, intolerancia al ejercicio y neurodegeneración36,37,38. Por el contrario, evidencia reciente sugiere que la formación de supercomplejos puede desempeñar funciones compensatorias y protectoras bajo condiciones de estrés, al estabilizar los complejos de la ETC y limitar la producción patológica de ROS55,56. La plataforma de proteoliposomas reconstituidos descrita aquí proporciona un sistema controlado para probar directamente cómo la remodelación lipídica asociada a enfermedades, mutaciones o intervenciones farmacológicas alteran el ensamblaje y la función de los supercomplejos, permitiendo así estudios mecanicistas de la disfunción mitocondrial e informando futuras estrategias terapéuticas.

Las tasas bajas de consumo de oxígeno pueden deberse a una mala incorporación de supercomplejos, disociación parcial del CIV, detergente residual, concentración insuficiente de CoQ10 o citocromo c, NADH degradado o baja concentración de proteína en la cámara del oxígrafo. Confirme la reconstitución mediante ensayo de flotación o BN-PAGE, verifique la integridad de la membrana mediante el ensayo de apantallamiento de ACMA, prepare NADH fresco y optimice la relación proteína-lípido, la concentración de cofactores, la eliminación de detergente y la concentración de la muestra. Los proteoliposomas con fugas pueden resultar de una eliminación incompleta del detergente, concentración excesiva de detergente, manipulación brusca, ciclos repetidos de congelación-descongelación o lípidos dañados. Si se observa fuga de protones en el ensayo de ACMA, repita la eliminación del detergente utilizando una columna de desalación recién equilibrada, evite girar en exceso la columna, prepare liposomas frescos, minimice el estrés mecánico y use los proteoliposomas inmediatamente después de la reconstitución. La agregación durante los pasos de concentración puede ocurrir debido a altas concentraciones locales de proteína o detergente en la membrana del concentrador. Concentre las muestras en ciclos cortos (10 min) de centrifugación, resuspenda suavemente la muestra entre cada centrifugación, evite la sobrecarga, mantenga las muestras a 4 °C y elimine los agregados visibles mediante una clarificación de baja velocidad antes del uso posterior. Un comportamiento de flotación inconsistente puede reflejar un tamaño variable de liposomas, eliminación incompleta del detergente, agregación, estratificación incorrecta de sacarosa o alteración del gradiente durante la carga de la muestra o la recolección de fracciones. Prepare soluciones frescas de sacarosa, estratifique los gradientes lentamente sin mezclar las interfaces, utilice liposomas extruidos de forma uniforme, mantenga constantes las condiciones de centrifugación y recoja las fracciones suavemente de arriba hacia abajo. Una mala distribución de partículas en criomicroscopía electrónica (crio-EM) puede deberse a baja concentración de proteoliposomas, agregación, adsorción preferente al carbono, humectación deficiente de la rejilla, hielo grueso o exceso de secado. Optimice la concentración de proteoliposomas, elimine los agregados antes de la preparación de la rejilla, ajuste las condiciones de descarga de plasma (glow-discharge), pruebe el tiempo y la fuerza de secado, evalúe diferentes tipos de rejillas o soportes de carbono y utilice muestras recién preparadas siempre que sea posible.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Las redes se analizaron en las instalaciones del Centro BioEM de la UC Davis. Agradecemos al Dr. Fei Guo por su ayuda con el análisis. El trabajo fue financiado por el NIGMS de los NIH bajo la subvención R35GM137929 (JAL).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC)Avanti Research860320
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina (POPE)Avanti Research850757
1,3-bis(sn-3’-fosfatidil)-sn-glicerol (cardiolipina, de tejido de corazón de bovino)Avanti Research840012
2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico --- HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS)Sigma-AldrichM12545
3,3′-Diaminobencidina ---- DABBSigma-AldrichD4293
Cianuro de carbónilo m-clorofenilhidraza ---- CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
CloroformoSigma-Aldrich650948
Coenzima Q10Sigma-AldrichC9538
Citocromo c de corazón equinoSigma-AldrichC2506
DigitoninaSigma-Aldrich300410
Ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-tetraacético --- EGTASigma-AldrichE3889
Ácido etilendiaminotetraacético -- EDTASigma-AldrichE6758
GlicerolSigma-AldrichG7893
Glico-diosgeninaAnatraceGDN101detergente
Lauryl Maltosa Neopentil Glicol ---- LMNGSigma-AldrichNG310
Cloruro de magnesioSigma-AldrichM8266
MyxotiazolSigma-AldrichT5580
NADH, sal de disodioSigma-Aldrich481913
Cloruro de nitrotetrazolio azulSigma-AldrichN6876
Piericidina ASigma-Aldrich96861
Acetato de potasioSigma-AldrichP5708
Cloruro de potasioSigma-AldrichP3911
Ferricianuro de potasioSigma-Aldrich702587
Fosfato monobásico de potasio ---- KH2PO4Sigma-AldrichP0662
Azida de sodioSigma-AldrichS2002
Colato de sodio hidratadoSigma-AldrichC1254
Cloruro de sodioSigma-AldrichS9888
Ditionito de sodioSigma-Aldrich71699
SacarosaSigma-AldrichS9378
TRISSigma-AldrichT1503
ACMA (9-amino-6cloro-2-metoxiacridina)Sigma-AldrichSML4162
Equipos y kits
Filtro centrífugo Amicon®, 100 kDa MWCO 0,5 mLMilliporeUFC5100
Filtro centrífugo Amicon®, 100 kDa MWCO 15 mLMilliporeUFC9100
Ultracentrífuga Beckman Optima TLXBeckman Coulter
Gel BN-PAGEgel de electroforesis nativa azul en poliacrilamida
Ultracentrífuga Beckman Optima XEBeckman Coulter
Sistema de limpieza por descarga luminiscentesistema de limpieza por descarga luminiscente
Glacios 2 Cryo-TEM con detector Gatan K3Thermo Fisher Scientificel microscopio electrónico de transmisión
Juego de molinillo de tejidos KIMBLE DounceSigma-AldrichD9188
Plunger automático Leica GP2Leica
Microfuge 16Beckman CoulterA46474
Sistema de cromatografía NGC Discover 10Bio-Rad7880009
Oxygraph+sistema de electrodo de oxígeno
Columna desalificadora PD-10Cytiva28918007columna giratoria de exclusión por tamaño
Kit de ensayo de proteína Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225kit de ensayo de proteína con ácido bicinconínico
Sonicador Q-125Q-sonicaQ125-110
Columna Sephadex G-25 Mcolumna giratoria desalificadora preempacada con resina G-25
Lector de microplacas SpectraMax M2Molecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GLCytiva29091596medio de filtración en gel de agarosa entrecruzada
Paquete de rotor fijo TLA-100.3Beckman Coulter349490
Rotor fijo Tipo 50.2 TiBeckman Coulter337901
Agua Milli-Q (MQ)agua ultrapura
Malvern Zetasizer ZS Dispersión Dinámica de Luz (DLS)Malvern Paranytical
Sistema Hansatech Oxygraph+Hansatech Instruments
Sistema PELCO easiGlow de limpieza por descarga luminiscenteTED PELLA, INC
Sistema Vitrobot Mark IVThermo Fisher Scientificla congeladora por inmersión
Rejillas de cobre Quantifoil R 1.2/1.3 de 300 mallas con 2 nm de carbonoTED PELLA, INC668-300-Cu-100rejillas con película de carbono perforada
Extrusor mini AvantiAvanti Lipids610000

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