Este estudio presenta un flujo de trabajo integrado de visualización que combina la recolección y el procesamiento estandarizados del líquido de lavado broncoalveolar, un panel de citometría de flujo de siete marcadores, un ensayo multiplex de citoquinas de 13 analitos y una tubería unificada de análisis.
Artículo de investigación
Visualización integrada del reclutamiento de neutrófilos y el perfil de citocinas inflamatorias en el líquido de lavado broncoalveolar
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Resumen
Resumen
El líquido de lavado broncoalveolar (BALF) es la matriz de muestreo más directamente accesible para estudiar la inflamación de las vías respiratorias inferiores, sin embargo, los análisis convencionales dependen de la citometría de flujo con un solo marcador combinada con ensayos inmunoenzimáticos por ligandos (ELISA) analito por analito, un enfoque que limita la densidad de información y oculta la asociación entre células y factores. Este estudio presenta un flujo de trabajo integrado de visualización que combina la recolección y el preprocesamiento estandarizados con un panel de citometría de flujo de siete marcadores para neutrófilos y monocitos, un ensayo multiplex de citocinas de 13 analitos y una tubería unificada de análisis basada en la aproximación uniforme de variedades y proyección (UMAP), metaagrupamiento FlowSOM, agrupamiento jerárquico, redes de correlación de Spearman y análisis de componentes principales (PCA).
El flujo de trabajo se aplicó a una cohorte prospectiva de un solo centro compuesta por 112 adultos sometidos a broncoscopia, incluyendo 64 pacientes con infección pulmonar confirmada microbiológicamente y 48 controles sin infección. Los resultados citológicos y de citometría de flujo revelaron un marcado desplazamiento desde un perfil alveolar dominado por macrófagos a uno dominado por neutrófilos durante la infección, con un aumento del porcentaje de neutrófilos de una mediana del 3,2 % al 68,4 % y un incremento de aproximadamente 50 veces en la concentración absoluta de neutrófilos. El perfilado multiplex identificó una respuesta coordinada de citoquinas en tres módulos, en la que los módulos de quimioquinas, proinflamatorios y reguladores estaban todos sobreexpresados, siendo CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α y G-CSF los marcadores individuales con mayor capacidad de discriminación dentro de la cohorte del estudio (área bajo la curva [AUC] de 0,89 a 0,94). La visualización integrativa mediante PCA, una matriz de correlación y un gráfico de red reveló un eje neutrófilo-quimioquina estrechamente acoplado a nivel de participante, con el recuento de neutrófilos en el LBA emergiendo como el núcleo central de la red.
El procedimiento utiliza únicamente material obtenido rutinariamente de lavados broncoalveolares indicados clínicamente, no requiere un volumen adicional de muestra y proporciona un marco rico en información para resolver la inflamación de las vías respiratorias en infecciones respiratorias, lo que podría ser factible en laboratorios de atención terciaria equipados con citometría de flujo multiparamétrica y plataformas de matrices de microesferas multiplexadas, ampliándose hacia estudios longitudinales, a nivel de célula individual y de evaluación terapéutica. La adopción clínica más amplia de analitos individuales como biomarcadores requerirá una validación prospectiva en cohortes independientes multicéntricas.
Introducción
Las muertes infecciosas por infecciones del tracto respiratorio inferior siguen siendo una causa importante de mortalidad mundial, aunque se han logrado avances en las estrategias de vacunación y modalidades de tratamiento; sin embargo, esto sigue siendo especialmente cierto entre las poblaciones pediátrica y anciana1. Los neutrófilos son las células principales que se observan en las primeras etapas de una respuesta inmunitaria innata en el sistema respiratorio afectado, un proceso vital para eliminar el patógeno invasor; no obstante, una inflamación neutrófila descontrolada provoca la ruptura de la barrera alvéolo-capilar, daño oxidativo en los tejidos y el desarrollo del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA)2,3. Los neutrófilos en el espacio pulmonar también presentan cinéticas de reclutamiento, patrones de retención y comportamientos efectoras distintos a los de otros tejidos, y estas diferencias influyen en si la infección se resuelve o progresa hacia una neumonía grave4.
El líquido de lavado broncoalveolar (BALF) es una fuente importante de información sobre el microentorno alveolar y ofrece la representación más cercana a la inmunidad clínica en este sitio5. La quimiocina CXCL8 desempeña un papel esencial en el reclutamiento de neutrófilos hacia los pulmones a través de sus receptores, CXCR1 y CXCR2, junto con otras quimiocinas, incluyendo CXCL1, CXCL2 y CXCL56. Las citoquinas IL-1β, IL-6 y TNF-α potencian aún más este proceso, mientras que la IL-10 actúa como una citoquina contrarreguladora. Se ha demostrado que sus niveles en el BALF se correlacionan con la gravedad de las infecciones pulmonares y con el desarrollo de complicaciones pulmonares debidas a neumonías bacterianas, virales y atípicas7, y los perfiles multiplex de biomarcadores en BALF están siendo adoptados para lograr un diagnóstico más temprano y la discriminación de patógenos en infecciones del tracto respiratorio inferior8.
Las pruebas rutinarias de LBA generalmente no logran abarcar completamente la biología subyacente a la prueba. Los recuentos celulares pueden estimarse mediante la diferenciación manual de células en muestras de citocentrifugado, mientras que los mediadores solubles se miden utilizando ensayos inmunoenzimáticos individuales (ELISA) y se presentan en forma de gráfico de barras. Las quimiocinas, citocinas y cada tipo celular se evalúan por separado, sin establecer ninguna correlación entre un gradiente de concentración particular de quimiocina y las poblaciones celulares que afecta en la muestra. La combinación de módulos de citocinas, las relaciones dosis-respuesta entre quimiocinas y neutrófilos, y las subpoblaciones de pacientes con sus propias firmas inflamatorias suelen pasarse por alto en ausencia de un análisis multivariado9.
Los avances en computación hacen que este enfoque holístico sea progresivamente más realista. Combinar la citometría de flujo multiparamétrica y la citometría de flujo espectral con métodos de reducción de dimensionalidad, como el embebido estocástico de vecinos distribuido en t (t-SNE) o la proyección uniforme de variedades (UMAP), permite mapear fenotipos inmunitarios de alta dimensionalidad en un espacio bidimensional, demostrando UMAP una mejor retención de la topología global y una mayor reproducibilidad cuando se aplica a datos de citometría10. Paneles multianalíticos de citocinas, seguidos de agrupamiento jerárquico y redes de correlación, ayudan a identificar firmas asociadas a la gravedad que no son discernibles mediante enfoques de una sola citocina11. A pesar de los avances en el campo, aún no existe un flujo de trabajo que reúna estos métodos para estudiar el reclutamiento de neutrófilos y las firmas de citocinas a partir de las mismas muestras de LBA en infecciones respiratorias. Este estudio describe un flujo de trabajo integrado de visualización para investigar el reclutamiento de neutrófilos mediante citología y citometría de flujo multiparamétrica, seguido de análisis de firmas de citocinas mediante inmunoensayo múltiple, con agrupamiento jerárquico, matrices de correlación y análisis de componentes principales. El flujo de trabajo genera una visualización integrada que abarca lecturas inmunitarias celulares y solubles de las vías respiratorias en un solo gráfico, utilizando muestras de LBA obtenidas rutinariamente durante broncoscopia indicada clínicamente en infecciones del tracto respiratorio inferior.
Protocolo
Población de estudio y ética
Este fue un estudio observacional prospectivo monocéntrico realizado en un hospital docente terciario entre enero de 2026 y abril de 2026. El protocolo fue aprobado bajo el número de aprobación 2026HL-038, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de cualquier procedimiento del estudio.
Se reclutaron consecutivamente adultos de 18 a 75 años que se sometieron a broncoscopia flexible diagnóstica con lavado broncoalveolar (LBA) como parte de la atención clínica habitual, y se asignaron a un grupo de infección o a un grupo control sin infección según sus diagnósticos clínicos y microbiológicos finales. En Figura 1 se muestra un resumen del flujo de trabajo de visualización integrada, desde el reclutamiento de pacientes hasta las salidas visuales integradas.
Figura 1: Vista general del flujo de trabajo integrado de visualización para el perfilado basado en LBA de la reclutación de neutrófilos y las respuestas de citoquinas inflamatorias. Las cinco etapas resumen, de izquierda a derecha, el reclutamiento prospectivo de los grupos de infección y control mediante broncoscopia y LBA, el preprocesamiento del LBA en un sedimento celular y una fracción de sobrenadante, mediciones celulares (citología con Wright-Giemsa y citometría de flujo multiparamétrica) y solubles (inmunoensayo con microesferas de 13 plex) en paralelo, la canalización unificada de visualización (UMAP con metaagrupamiento FlowSOM, mapa de calor jerárquico, análisis de componentes principales y red de correlación de Spearman) y la salida visual integrada. Abreviaturas: LBA = lavado broncoalveolar; LBA-L = líquido de lavado broncoalveolar; UMAP = proyección y aproximación uniforme de variedades. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los criterios de inclusión para el grupo de infección fueron los siguientes: (1) pacientes diagnosticados con neumonía adquirida en la comunidad (CAP), neumonía adquirida en el hospital (HAP) o neumonía asociada al ventilador (VAP), según las guías de la Sociedad de Enfermedades Infecciosas de América (IDSA) y la Sociedad Torácica Americana (ATS); (2) detección de uno o más patógenos mediante cultivo de LBA con ≥104 unidades formadoras de colonias (CFU)/mL, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) respiratoria múltiple, secuenciación metagenómica de nueva generación del LBA, o pruebas específicas de antígeno/anticuerpo a partir de muestras respiratorias/séricas pareadas.
Los criterios para el grupo de control fueron los siguientes: (1) razones no infecciosas para la broncoscopia, que consistieron en la evaluación de un nódulo pulmonar indeterminado, resultados de radiología anormales que no sugirieran infección o el examen por tos crónica; (2) ausencia de infección pulmonar aguda demostrada por resultados negativos en pruebas microbiológicas y falta de cualquier signo de inflamación o infección sistémica al momento de la broncoscopia; y (3) no haber utilizado antibióticos en los 30 días previos a la participación. Los controles se reclutaron entre pacientes que se sometieron a broncoscopia por otras afecciones pulmonares clínicamente indicadas, y no entre voluntarios sanos, reflejando así la población de la cual habitualmente se obtiene el lavado broncoalveolar clínicamente indicado en el centro del estudio.
Los criterios de exclusión incluyeron: (1) neoplasia maligna y/o quimioterapia citotóxica en los últimos seis meses; (2) seropositividad para VIH; (3) trasplante de órganos sólidos o trasplante de células madre hematopoyéticas; (4) terapia inmunosupresora sostenida que implique una dosis diaria equivalente de prednisona > 0,3 mg/kg durante más de 3 semanas; (5) mujeres embarazadas o en período de lactancia; (6) antecedentes de diatesis hemorrágica o cualquier contraindicación para broncoscopia flexible; (7) enfermedad respiratoria crónica grave preexistente (enfermedad pulmonar obstructiva crónica [EPOC] estadio III/IV según la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica [GOLD], fibrosis pulmonar idiopática, asma persistente grave o bronquiectasias clínicamente significativas); (8) tuberculosis activa; (9) participación en otro estudio de intervención en los últimos 30 días. Se realizó lavado broncoalveolar durante la primera broncoscopia, dentro de las 72 h del ingreso por infecciones, y dentro de las 48 h de la intubación en pacientes con ventilación mecánica que presentaran infecciones.
Los cálculos del tamaño de la muestra se centraron en el resultado celular primario: el número de neutrófilos en el LBA entre los grupos. Con respecto al tamaño del efecto esperado de 0,6 DE entre vías respiratorias infectadas y no infectadas, y considerando un margen de abandono del 15 %, se necesitaba un tamaño mínimo de muestra de 45 sujetos por grupo para un α bilateral = 0,05 con un poder estadístico del 80 %. De 156 candidatos elegibles, 27 no cumplieron con los requisitos de elegibilidad (18 no cumplieron con los criterios de inclusión, principalmente debido a la imposibilidad de identificar un agente patógeno responsable de su enfermedad dentro del período establecido o a la falta de acuerdo con el procedimiento en sí; 9 incumplieron los criterios de exclusión, principalmente debido a una neoplasia activa o antecedentes de administración de quimioterapia, uso crónico de corticosteroides, enfermedad pulmonar crónica preexistente grave o diatesis hemorrágica). Los 129 participantes restantes se sometieron a broncoscopia. Posteriormente, 17 sujetos fueron retirados del estudio (7 debido a un rendimiento inadecuado de LBA < 40 %; 4 debido a la retirada del consentimiento durante la hospitalización; y 6 debido a la reclasificación de los sujetos tras la evaluación microbiológica final: 4 candidatos del grupo control diagnosticados con infección oculta según los resultados del cultivo; y 2 candidatos del grupo infeccioso que no presentaron evidencia de infección tras el análisis del cultivo). El grupo final de sujetos del estudio comprendió 112 participantes: 64 con infección y 48 sin infección.
Recolección y preprocesamiento del LBA
Se realizó broncoscopia por operadores calificados siguiendo el protocolo institucional estándar, conforme a las recomendaciones técnicas publicadas para el lavado broncoalveolar12. Se utilizó lidocaína de forma tópica, y los pacientes recibieron sedación intravenosa moderada mientras se administraba oxígeno suplementario para mantener la saturación de oxígeno (SpO₂) >92%. Se insertó el broncoscopio flexible y se posicionó en el segmento broncopulmonar con anomalías radiológicas. En los casos en que las anomalías radiológicas eran difusas o no localizables, se seleccionaron los segmentos del lóbulo medio derecho o del lóbulo lingular izquierdo. Después de cada instilación, se realizó succión manual suave con presión negativa < 100 mmHg. Se administraron un total de tres a cinco instilaciones de solución salina estéril a 37 °C, de 20–40 mL cada una, para un volumen total de 100–150 mL. La proporción de recuperación se estimó como el volumen recuperado en relación con el volumen instilado, y solo se consideraron para el análisis las muestras con una recuperación ≥40%.
Las muestras recogidas de los lavados segundo y posteriores se agruparon para reducir la contaminación bronquial y obtener una muestra enriquecida en alvéolos. El concentrado de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) se mantuvo sobre hielo y se procesó dentro de las 2 h posteriores a su recolección, teniendo en cuenta hallazgos recientes sobre cambios en la composición celular y en los recuentos diferenciales tras el almacenamiento prolongado y el calentamiento de muestras humanas de BALF13. Después de la filtración mediante una malla de nailon estéril con un tamaño de poro de 70 micrones para eliminar el moco, realizada únicamente mediante paso mecánico sin añadir agentes mucolíticos o anticonglomerantes como el ditiotreitol, ya que pruebas piloto mostraron que esto era suficiente para eliminar los coágulos de moco sin pérdida medible de la integridad de los epítopos superficiales en pasos posteriores, el fluido se sometió a centrifugación a 400 × g durante 10 min a 4 °C. Se decantó el sobrenadante y se dividió en alícuotas en viales criogénicos de baja unión a proteínas para el análisis de citoquinas, y las células se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,5 % de albúmina sérica bovina y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), reservando parte de ellas para citología y citometría de flujo. Las muestras de citoquinas se congelaron en nitrógeno líquido, se mantuvieron a –80 °C y no se sometieron a más de un ciclo de congelación-descongelación antes de su uso.
Citología de neutrófilos y cuantificación mediante citometría de flujo
En cuanto a la citopatología, se aplicaron 100 µL de la suspensión celular del LBA sobre una portaobjetos utilizando un citocentrífugo (véase la Tabla de materiales) a 300 ×g durante 5 min, se dejó secar al aire y se tiñó con Wright-Giemsa. Un tecnólogo de hematología realizó los recuentos diferenciales sin conocimiento del historial médico del paciente, contando un mínimo de 400 células por portaobjetos y calculando los porcentajes de macrófagos, linfocitos, neutrófilos y eosinófilos. Los porcentajes de neutrófilos en el LBA se consideraron la medida principal del resultado en citopatología, dado el evidencia actual que sugiere su utilidad para distinguir enfermedades pulmonares infecciosas de las no infecciosas en pacientes con infiltrados pulmonares14.
El protocolo de cuantificación mediante citometría de flujo se basó en una validación reciente del protocolo de diferenciación de leucocitos en líquido de lavado broncoalveolar (BALF) con cuatro colores15 e incluyó marcadores adicionales para identificar neutrófilos. Específicamente, aproximadamente 5 × 105 células aisladas del BALF se bloquearon con un reactivo bloqueador de receptores Fc humanos (ver Tabla de Materiales) durante 10 min a 4 °C, y luego se marcaron durante 20 min a 4 °C con anticuerpos contra CD45 (clon HI30), CD66b (clon G10F5), CD15 (clon HI98), CD16 (clon 3G8), CD11b (clon ICRF44), CD14 (clon M5E2) y HLA-DR (clon L243), además de un colorante vital fijable (ver Tabla de Materiales). Para la lisis de eritrocitos, se utilizó una solución comercial de lisis de eritrocitos (ver Tabla de Materiales) durante 10 min a temperatura ambiente. Tras la lisis de eritrocitos, las células se lavaron dos veces con PBS suplementado con 2% de suero bovino fetal y se resuspendieron en tampón de citometría, luego se analizaron con un citómetro de flujo multicolor (ver Tabla de Materiales). La compensación se realizó utilizando perlas de compensación monocromáticas (ver Tabla de Materiales), y se incluyeron tubos de control con fluorescencia menos uno y tubos sin tinción para cada panel.
Al menos 1 × 105 CD45⁺ se adquirieron los eventos para cada muestra. Primero se seleccionaron los eventos únicos en el gráfico FSC-A/FSC-H, seguidos de las células viables (colorante de viabilidad)⁻CD45⁺ leucocitos, tras lo cual se excluyó CD14⁺HLA-DR⁺ monocitos-macrófagos se realizó para seleccionar CD66b de alta dispersión lateral⁺ granulocitos. Los neutrófilos se definieron entonces dentro de la población de granulocitos como CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ eventos. Este CD66b primario⁺ la puerta del granulocito se trazó ampliamente alrededor de todos los eventos con alta dispersión lateral, en lugar de restringirla al CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ límite, de modo que los neutrófilos activados CD16-débiles, CD11b-altos y otras formas de granulocitos menos maduras permanecieron dentro del recuento total automatizado de neutrófilos; el criterio más estricto de CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ la definición se aplicó únicamente para caracterizar el subconjunto de neutrófilos maduros reportado por separado en los análisis de agrupamiento posteriores. El recuento de neutrófilos en el LBA (células/µL) se estimó en función del porcentaje de neutrófilos y del recuento total de células nucleadas determinado mediante un analizador hematológico automatizado (véase Tabla de materiales). Las matrices de compensación, la estrategia de selección de eventos y los informes individuales de control de calidad de las muestras fueron archivados, y los analistas permanecieron ciegos respecto a la asignación de los participantes a los grupos durante toda la adquisición y el análisis.
Perfilado multiplex de citocinas inflamatorias
Los sobrenadantes de LBA se descongelaron una vez sobre hielo húmedo, seguido de una breve vortexación y clarificación mediante centrifugación a 10.000 × g durante 5 min a 4 °C inmediatamente antes del ensayo. La medición de 13 analitos en tres categorías funcionales se realizó mediante una plataforma de inmunoensayo multiplex basada en microesferas, utilizando un panel personalizado de microesferas magnéticas (ver Tabla de materiales). El grupo proinflamatorio incluyó la IL-1β, IL-6, IL-17A y TNF-α; el grupo de quimioquinas incluyó CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 y CCL3/MIP-1α; y el grupo regulador compuesto por IL-10, IFN-γ, IL-1RA y G-CSF. La selección de analitos se basó en aquellos que con mayor frecuencia se han reportado como informativos en análisis multiplex de citocinas en LBA o suero en estudios de neumonía/infección respiratoria grave7,11. El factor de dilución (1:2 en tampón de ensayo) se determinó a partir de un experimento piloto realizado con un subconjunto representativo de muestras infectadas y controles para asegurar que >El 90 % de las mediciones cayó dentro de la curva estándar.
Las curvas estándar se determinaron utilizando diluciones seriadas de siete puntos de los estándares recombinantes del fabricante, preparadas por duplicado en cada placa, incluyendo un pozo en blanco para restar el fondo. El ajuste de la curva se realizó mediante regresión logística de cinco parámetros (5PL) utilizando el software propietario de adquisición y análisis del instrumento (ver Tabla de Materiales). El límite inferior de cuantificación (LLOQ) se calculó como la cantidad más baja del estándar que produjo una recuperación por retroajuste entre el 80 % y el 120 % y un coeficiente de variación intramuestra (CV) ≤ 20 %. Los valores que estuvieron por debajo del LLOQ se sustituyeron por LLOQ/√2. Se prepararon dos muestras agrupadas de control de calidad de líquido de lavado broncoalveolar (BALF), cada una procedente de un paciente infectado representativo y de un sujeto no afectado, se aliquotaron y se añadieron a cada placa para seguir el rendimiento a largo plazo. Los estándares de aseguramiento de calidad se basaron en recomendaciones de buenas prácticas derivadas de un programa de competencia de ensayos multiplex basados en microesferas, multicéntrico y de 12 años16, que incluyen requisitos de CV intramuestra ≤ 10 % en pozos por duplicado, CV interplaca ≤ 20 % para el control de calidad y un recuento mínimo de microesferas de ≥ 50 por analito por pozo. Las placas que no cumplieron con los criterios anteriores se volvieron a analizar. El análisis se realizó en un único lote dentro de las cuatro semanas siguientes, utilizando un solo lote del kit, con una intercalación aleatoria de las muestras de infección y de control.
Secuencia de análisis de visualización
Los archivos del estándar de citometría de flujo (FCS) se analizaron primero mediante software comercial de citometría de flujo (ver Tabla de materiales) para compensar y seleccionar eventos únicos vivos CD45⁺, y luego se exportaron para un análisis imparcial en R v4.4. Para cada muestra, se redujo el muestreo a 10 000 eventos CD45⁺, se concatenaron y las intensidades de señal se transformaron utilizando la función arcsinh con un coefactor de 150. La reducción de dimensionalidad y las proyecciones UMAP se realizaron utilizando el paquete uwot con 15 vecinos más cercanos y una distancia mínima de 0,1, junto con incrustaciones t-SNE paralelas usando el paquete Rtsne con una perplejidad de 3010. Los grupos fenotípicos se identificaron mediante FlowSOM con 100 nodos de mapas autoorganizados y se dividieron posteriormente en 12–15 grupos mediante metaagrupamiento, utilizando un enfoque basado en optimización que recientemente ha sido validado para datos de citometría de alta dimensión17. Cada grupo se anotó según la expresión mediana de marcadores de linaje y activación y se revisó frente a las compuertas manuales.
Para el análisis de datos multiplex de citocinas, los valores brutos se transformaron primero mediante log₁₀ y luego se estandarizaron entre analitos mediante puntuaciones z antes de realizar análisis adicionales. Tanto los analitos como los pacientes fueron sometidos a agrupamiento jerárquico utilizando la distancia euclidiana y el enlace Ward.D2; los resultados se mostraron en un mapa de calor con agrupamiento por filas y columnas. Este enfoque se utilizó para detectar módulos de citocinas coexpresadas y clasificar subconjuntos de pacientes en cohortes inflamatorias multiplex9. Se generaron matrices de correlación para todos los biomarcadores celulares y solubles utilizando correlaciones de rangos de Spearman por pares. Los mapas de calor de las matrices de correlación se representaron junto con una red en la que los nodos corresponden a biomarcadores y los enlaces indican correlaciones que resistieron la corrección por comparaciones múltiples mediante el método de Benjamini–Hochberg (BH). El ancho de los enlaces se escaló según la magnitud del coeficiente de correlación |ρ|, y solo se incluyeron enlaces si |ρ| ≥ 0,30 y p < 0,05 tras la corrección. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) sobre la matriz estandarizada que contenía células y citocinas utilizando la función prcomp() con escalado de varianza unitaria. Los participantes se proyectaron sobre los dos primeros componentes principales, superponiendo los grupos de infección y control. Un submuestreo y estandarización consistentes de todos los análisis garantizaron la comparabilidad entre las lecturas de biomarcadores celulares y solubles en todas las visualizaciones.
Análisis estadístico
Las variables continuas se describieron mediante la mediana (rango intercuartílico, IQR) cuando no presentaban distribución normal según la prueba de Shapiro-Wilk, y mediante la media (desviación estándar, DE) en caso contrario. Las variables categóricas se describieron mediante frecuencias y proporciones. Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando la prueba de Mann-Whitney U prueba cuando las variables continuas tenían distribuciones no normales, la de Welch t-prueba cuando las variables continuas presentaban distribución normal, y la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher cuando correspondía para variables categóricas. Las asociaciones entre variables continuas se evaluaron mediante el coeficiente de correlación de rangos de Spearman. Para tener en cuenta la tasa de descubrimientos falsos (FDR) en los análisis multiplex de citocinas y de correlación, los valores p se ajustaron utilizando el método de Benjamini–Hochberg con un umbral de q < 0.05. Bilateral p < Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05 en todos los análisis primarios. Siempre que fue posible, se mantuvieron y analizaron los casos con datos faltantes en variables individuales mediante análisis de casos completos para la variable afectada, mientras que se realizaron imputaciones múltiples utilizando ecuaciones encadenadas (m = 20) para llevar a cabo análisis de sensibilidad. Se generaron curvas de característica operativa del receptor y el área correspondiente bajo la curva (AUC) para citocinas individuales utilizando el paquete pROC dentro de la cohorte completa del estudio; no se utilizó una cohorte externa independiente para validación. Los análisis de sensibilidad preespecificados repitieron las comparaciones entre grupos primarios tras excluir a los participantes que habían recibido antibióticos en las 72 horas previas a la broncoscopia, y tras estratificar el grupo de infección según el estado de ventilación mecánica y según el subtipo de neumonía (adquirida en la comunidad, adquirida en el hospital o asociada al ventilador). Los análisis se realizaron utilizando los paquetes rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC y mice en R v4.4. Las figuras se generaron utilizando software comercial para gráficos científicos (véase Tabla de materiales).
Resultados
Población de estudio y características de la muestra
Hubo 112 sujetos en la cohorte final de análisis, con 64 sujetos en el grupo de infección y 48 sujetos en el grupo control sin infección. Las características demográficas basales fueron similares entre los grupos, mientras que los parámetros de laboratorio relacionados con la infección fueron más altos en el grupo de infección, como se muestra en la Tabla 1. Las infecciones fueron causadas principalmente por bacterias Gram-negativas, siendo los principales patógenos bacterianos Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii. Otros patógenos fueron Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, agentes atípicos, virus e infecciones mixtas.
Las tasas de recuperación del LBA cumplieron el umbral predeterminado de ≥40% para todas las muestras retenidas, con tasas ligeramente más bajas en el grupo de infección en comparación con el grupo control (mediana del 48,3% frente al 53,3%, p = 0,03), lo cual es consistente con una mayor inflamación de las vías respiratorias y congestión mucosa en las vías respiratorias infectadas. Dado que el volumen recuperado también difería entre los grupos (58 mL frente a 64 mL, p = 0,04), todas las concentraciones de citocinas informadas podrían estar sujetas a una modesta diferencia entre grupos en el factor de dilución; un análisis de sensibilidad predeterminado, restringido a muestras con tasa de recuperación ≥50% (n = 42 infección, n = 34 control), reprodujo la dirección y magnitud de cada comparación entre grupos (el mayor cambio en el tamaño del efecto fue < 8%), lo que indica que es poco probable que el sesgo por dilución explique las diferencias observadas. El tiempo entre la recolección y el procesamiento fue de 65 minutos para el grupo de infección y de 62 minutos para el grupo control, manteniéndose dentro de la ventana de 2 horas. Los criterios de control de calidad (QC) a nivel de muestra indicaron resultados de alta calidad. Los recuentos diferenciales citológicos se obtuvieron a partir de ≥400 células contadas en las 112/112 muestras (100%). Las adquisiciones de citometría de flujo cumplieron el criterio predeterminado de ≥1 × 105 eventos CD45⁺ en las 112/112 muestras (100%), con una viabilidad mediana de células viables del 89,4% (RIC 85,6–92,8%). Todas las placas de citocinas multiplex cumplieron los criterios de control de calidad tras una única repetición. Para los 13 analitos, el coeficiente de variación intraensayo (CV) fue del 4,7% (2,1–9,3%, todos <10%), el CV interplaca de las muestras de control de calidad agrupadas fue del 11,2% (6,8–18,4%, todos <20%) y el número mediano de microesferas fue de 78 eventos/analito/pocillo (53–142, todos ≥ 50).
| Variable | Infección (n = 64) | Control (n = 48) | valor p |
| Edad, años, mediana [RIC] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| Hombre, n (%) | 38 (59,4) | 26 (54,2) | 0,59 |
| IMC, kg/m2, mediana [RIC] | 23,8 [21,4–26,2] | 23,5 [21,6–25,7] | 0,66 |
| Antecedentes de tabaquismo, n (%) | 0,52 | ||
| Nunca | 28 (43,8) | 25 (52,1) | |
| Exfumador | 22 (34,4) | 16 (33,3) | |
| Actual | 14 (21,9) | 7 (14,6) | |
| Hipertensión, n (%) | 27 (42,2) | 18 (37,5) | 0,62 |
| Diabetes mellitus, n (%) | 17 (26,6) | 10 (20,8) | 0,49 |
| Enfermedad coronaria, n (%) | 11 (17,2) | 6 (12,5) | 0,51 |
| Enfermedad renal crónica, n (%) | 5 (7,8) | 3 (6,3) | 0,76 |
| Indicación de broncoscopia, n (%) | — | ||
| Neumonía adquirida en la comunidad | 35 (54,7) | — | |
| Neumonía adquirida en el hospital | 19 (29,7) | — | |
| Neumonía asociada al ventilador | 10 (15,6) | — | |
| Nódulo pulmonar indeterminado | — | 23 (47,9) | |
| Anomalía radiográfica persistente | — | 15 (31,3) | |
| Evaluación de tos crónica | — | 10 (20,8) | |
| Patógeno causal, n (%) | — | ||
| Bacterias Gram-negativas | 28 (43,8) | ||
| Bacterias Gram-positivas | 16 (25,0) | ||
| Patógenos atípicos | 7 (10,9) | ||
| Virus respiratorios | 8 (12,5) | ||
| Infección mixta | 5 (7,8) | ||
| Ventilación mecánica durante el LBA, n (%) | 14 (21,9) | 0 (0) | <0,001 |
| Exposición a antibióticos en las 72 h previas al LBA, n (%) | 41 (64,1) | 0 (0) | <0,001 |
| Volumen instilado, mL, mediana [RIC] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0,84 |
| Volumen recuperado, mL, mediana [RIC] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0,04 |
| Tasa de recuperación de LBA, %, mediana [RIC] | 48,3 [42,5–55,6] | 53,3 [46,2–60,5] | 0,03 |
| Tiempo hasta el procesamiento, min, mediana [RIC] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0,55 |
| Leucocitos en sangre, × 10⁹/L, mediana [RIC] | 11,8 [8,6–14,5] | 6,4 [5,3–7,8] | <0,001 |
| Neutrófilos en sangre, %, mediana [RIC] | 78,5 [70,2–86,4] | 60,3 [54,6–66,8] | <0,001 |
| Proteína C reactiva, mg/L, mediana [RIC] | 78,5 [42,6–128,4] | 4,2 [1,8–8,6] | <0,001 |
| Procalcitonina, ng/mL, mediana [RIC] | 0,86 [0,32–2,45] | 0,05 [0,03–0,08] | <0,001 |
Tabla 1: Características demográficas, clínicas y del procesamiento del LBA del cohorte del estudio. Se comparan las características demográficas basales, comorbilidades, indicaciones de broncoscopia, patógenos causales, parámetros del procedimiento y valores de laboratorio en sangre periférica entre los 64 participantes del grupo de infección y los 48 del grupo control sin infección. Las variables continuas se presentan como mediana [rango intercuartílico] y se comparan mediante la prueba de Mann-Whitney U prueba; las variables categóricas se presentan como n (%) y se comparan mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher, según corresponda. Abreviaturas: BAL = lavado broncoalveolar; BALF = líquido de lavado broncoalveolar; BMI = índice de masa corporal; IQR = rango intercuartílico; WBC = recuento de glóbulos blancos.
Visualización del reclutamiento de neutrófilos en el LBA
Se observó un cambio claro en la proporción, pasando de una población dominada por macrófagos a una dominada por neutrófilos, entre los sujetos infectados, como se muestra en la Figura 2. Las preparaciones del citocentrífugo se tiñeron mediante la técnica de Wright-Giemsa, y la tinción mostró una clara distinción entre los dos grupos: el grupo control presentaba más macrófagos alveolares, algunos linfocitos y pocos neutrófilos, mientras que el grupo infectado estaba dominado por neutrófilos con bacterias intracelulares frecuentes, núcleos degenerados y granulaciones tóxicas. Se realizaron recuentos diferenciales basados en al menos 400 células enumeradas para verificar las diferencias, encontrándose que la proporción de neutrófilos aumentó desde un valor mediano del 3,2 % (RIC: 1,8–5,6 %) en el grupo control hasta el 68,4 % (RIC: 49,2–82,5 %) en el grupo infectado (p < 0,001), mientras que la de los macrófagos alveolares disminuyó del 88,2 % (RIC: 82,4–92,5 %) al 22,6 % (RIC: 12,3–38,5 %) (p < 0,001). Los porcentajes de linfocitos fueron similares entre ambos grupos (7,4 % [4,8–11,3 %] frente a 6,5 % [3,4–11,2 %], p = 0,42).
Los análisis de selección de eventos y reducción de dimensionalidad confirmaron y ampliaron los fenotipos celulares observados mediante microscopía. Tras excluir restos celulares, dobletes y células muertas, los granulocitos CD45⁺CD66b⁺ representaron una mediana del 65,8 % (RIC: 46,2–79,4 %) de los leucocitos CD45⁺ en el grupo de infección frente al 4,1 % (RIC: 2,3–6,8 %) en el grupo control (p < 0,001). Dentro de la población de granulocitos, los neutrófilos maduros CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ representaron el 92,4 % (RIC: 87,5–95,8 %) de todos los granulocitos en el grupo de infección frente al 88,6 % (RIC: 82,3–93,5 %) en el grupo control, lo que indica que el reservorio de neutrófilos reclutados estaba compuesto principalmente por células maduras y completamente diferenciadas, y no por precursores tempranos. Las proyecciones UMAP y t-SNE basadas en la matriz de proteínas de superficie transformada mediante arco seno hiperbólico mostraron topologías casi idénticas, en las que los casos de infección ocupaban una isla prominente de neutrófilos maduros CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ escasamente poblada en las muestras de control, mientras que la isla de macrófagos alveolares HLA-DR⁺CD14⁺ mostraba el patrón opuesto, densamente poblada en los controles y escasamente poblada en los casos de infección. La metaagrupación mediante FlowSOM identificó 13 subpoblaciones, entre las cuales una subpoblación de neutrófilos maduros (38,4 % [22,6–56,2 %] frente a 2,8 % [1,5–4,6 %], p < 0,001) y un grupo de neutrófilos activados CD16-débil CD11b-alto (22,6 % [11,4–32,5 %] frente a 0,4 % [0,1–1,2 %], p < 0,001) mostraron las mayores expansiones entre grupos.
En cuanto al recuento absoluto de neutrófilos, hubo un aumento de aproximadamente 50 veces en los neutrófilos del LBA en el grupo de infección en comparación con el grupo control. El número total de células nucleadas por µL de LBA aumentó de 156 células/µL (RIC 88–232) en el grupo control a 384 células/µL (RIC 180–712) en el grupo de infección (p < 0,001), y los recuentos de neutrófilos aumentaron de 5 células/µL (RIC 2–13) en el grupo control a 262 células/µL (RIC 89–578) en el grupo de infección (p < 0,001). Las diferencias por pares en el porcentaje de neutrófilos y en el recuento absoluto entre los grupos siguieron siendo altamente significativas tras el ajuste de Benjamini–Hochberg (BH) (q < 0,001).
Figura 2: Visualización del reclutamiento de neutrófilos en el LBA. Campos representativos de citocentrifugado teñidos con Wright-Giemsa de un participante control y un participante infectado ilustran el cambio desde un perfil celular del LBA predominado por macrófagos a uno predominado por neutrófilos. Se muestran lado a lado una estrategia de selección por citometría de flujo en cuatro pasos (FSC singletes → leucocitos viables CD45⁺ → granulocitos CD66b⁺ tras exclusión de CD14⁺HLA-DR⁺ → neutrófilos maduros CD15⁺CD16⁺CD11b⁺), una representación UMAP de datos de citometría de flujo transformados con arco seno hiperbólico con superposición de metaclústeres FlowSOM coloreada según anotación biológica, y gráficos de caja con el porcentaje de neutrófilos en el LBA y la concentración absoluta de neutrófilos (células/µL, escala logarítmica) para permitir la comparación directa de los fenotipos celulares identificados en los grupos infectado y control. Abreviaturas: BALF = líquido de lavado broncoalveolar; FSC = dispersión directa; UMAP = aproximación uniforme de variedades y proyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Visualización de los perfiles de citocinas inflamatorias en el LBA
Un patrón de respuestas coordinadas en múltiples ejes de citoquinas distinguió al grupo de infección del grupo control, y las citoquinas se agruparon en tres módulos funcionales consistentes, como se muestra en la Figura 3. La agrupación de las concentraciones de citoquinas transformadas con log₁₀ y normalizadas mediante el método Ward.D2 produjo un dendrograma claro de dos grupos de muestras, en el que las muestras de infección y los controles ocupaban extremos opuestos del dendrograma, observándose únicamente siete participantes mal clasificados (seis controles agrupados con muestras de infección, principalmente casos de tos crónica con inflamación neutrofílica leve de las vías respiratorias, y una muestra de infección agrupada con los controles, que representaba una neumonía atípica temprana). El dendrograma de los analitos definió tres agrupaciones de citoquinas. El grupo de quimiocinas, compuesto por CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 y CCL3, mostró el mayor cambio en el valor de expresión entre los grupos de infección y control, así como la mayor correlación intramódulo. El grupo proinflamatorio, que contenía IL-1β, IL-6, IL-17A y TNF-α, mostró elevaciones en la misma dirección, aunque algo menos pronunciadas. El grupo regulador, que incluía IL-10, IL-1RA, IFN-γ y G-CSF, también se elevó en las muestras de infección, lo que indica que la respuesta no fue puramente proinflamatoria, sino que activó simultáneamente vías contrarreguladoras y antivirales.
Las medianas (RIC) de todos los analitos analizados fueron más altas en el grupo con infección en comparación con el grupo control, y el valor p ajustado fue inferior a 0,001 para los 13 analitos tras la corrección por tasa de falsos descubrimientos basada en Benjamini-Hochberg (BH-FDR). Entre los analitos, CXCL8/IL-8 presentó la concentración más alta y el cambio más pronunciado (de 68 [32–142] pg/mL en el grupo control a 2.485 [842–6.520] pg/mL en el grupo con infección, un aumento aproximado de 36 veces). Un patrón paralelo se observó para CXCL1/GRO-α, con un aumento aproximado de 21 veces (78 [36–148] frente a 1.672 [524–3.890] pg/mL). IL-1β mostró un aumento aproximado de 13 veces (5,8 [2,6–11,4] frente a 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA y G-CSF mostraron aumentos de entre 13 y 16 veces (16,4 [7,8–30,5] frente a 248 [82–612] pg/mL; 112 [48–258] frente a 1.748 [658–3.964] pg/mL; 24 [10–52] frente a 384 [125–912] pg/mL, respectivamente). Otros aumentos menores incluyeron TNF-α (~8 veces), CXCL10/IP-10 (~9 veces), CCL2/MCP-1 (~8 veces), CCL3/MIP-1α (~10 veces), IL-10 (~10 veces), IFN-γ (~6 veces) e IL-17A (~4 veces).
El análisis de características operativas del receptor dentro de la cohorte identificó a la IL-8 (AUC 0,94), la IL-1β (AUC 0,92), la IL-6 (AUC 0,91), la CXCL1 (AUC 0,91) y al G-CSF (AUC 0,89) como los analitos con la mejor discriminación individual entre los grupos de infección y control; estos valores de AUC resumen la capacidad discriminatoria dentro de la cohorte de análisis en ausencia de un conjunto externo independiente de validación. Un análisis de sensibilidad mediante imputación múltiple por ecuaciones encadenadas (m = 20) produjo estimaciones dentro del 5 % de las medianas de los casos completos para cada analito y no alteró el orden jerárquico de las magnitudes del efecto.
Se utilizaron análisis de sensibilidad preespecificados para evaluar la influencia de la exposición previa a antibióticos y del subtipo de neumonía en las diferencias observadas en citocinas. Cuando se repitieron las comparaciones principales entre grupos tras excluir a los 41 participantes del grupo de infección (64,1 %) que habían recibido antibióticos en las 72 horas previas al lavado broncoalveolar (BAL), los 13 analitos siguieron siendo significativamente más altos en los 23 casos de infección restantes que en los controles tras la corrección BH-FDR (ajustado p < 0,001 para los cinco principales discriminadores), con estimaciones puntuales ligeramente superiores en lugar de inferiores a las medianas del conjunto de la cohorte (por ejemplo, CXCL8/IL-8 2.860 [980–7.110] pg/mL e IL-1β 92 [34–210] pg/mL), lo que es consistente con una atenuación parcial de las citoquinas de la vía aérea debido a la exposición previa a antibióticos antes del lavado broncoalveolar. La estratificación del grupo de infección según el subtipo de neumonía mostró el mismo orden relativo de quimioquinas y citoquinas proinflamatorias en los casos de neumonía adquirida en la comunidad (n = 35), neumonía adquirida en el hospital (n = 19) y neumonía asociada al ventilador (n = 10), siendo el subgrupo de neumonía asociada al ventilador el que presentó los niveles medianos más altos de CXCL8, CXCL1, IL-6 y G-CSF; además, el estado de ventilación mecánica no alteró la dirección de ninguna comparación entre grupos.
Figura 3: Visualización de los perfiles de citocinas inflamatorias en el LBA. Mapa de calor de agrupamiento jerárquico con concentraciones transformadas a log₁₀ y normalizadas por puntuación z de los 13 analitos medidos en los 112 participantes, con barras de anotación de colores encima del mapa de calor que indican la asignación al grupo (control, infección), el subtipo de neumonía (neumonía adquirida en la comunidad, adquirida en el hospital o asociada al ventilador) y la categoría del patógeno causal (Gram-negativo, Gram-positivo, atípico, viral o infección mixta). Los diagramas de caja de las citocinas predominantemente abundantes (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF y TNF-α; escala log₁₀, pg/mL) comparan los grupos con infección y control. *** p < 0,001 tras la corrección de la tasa de falsos descubrimientos de Benjamini–Hochberg. Abreviaturas: BALF = líquido de lavado broncoalveolar; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = neumonía adquirida en la comunidad; HAP = neumonía adquirida en el hospital; VAP = neumonía asociada al ventilador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Visualización acoplada del reclutamiento de neutrófilos y los perfiles de citoquinas
La integración de los compartimentos celulares y solubles reveló una fuerte conexión biológica entre el reclutamiento de neutrófilos y el sistema de quimioquinas, como se muestra en la Figura 4. Se obtuvo una representación bidimensional mediante el análisis de componentes principales (PCA) de la matriz estandarizada de células y citocinas, donde el PC1 explicó el 51,1 % de la varianza total y el PC2 un 12,7 % adicional, alcanzando un total acumulado del 63,8 %. El PC1 separó al grupo con infección de los controles, caracterizándose por altas cargas positivas de neutrófilos en el LBA, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β y G-CSF, y altas cargas negativas de macrófagos. El PC2 diferenció entre una trayectoria rica en quimioquinas (altas cargas positivas en CXCL8 y CXCL1) y una trayectoria rica en factores reguladores (cargas positivas en IL-10, IL-1RA e IFN-γ), de modo que dentro del grupo con infección, los participantes tendieron a separarse según la gravedad, con los casos de neumonía asociada al ventilador que requerían ventilación mecánica ubicándose en el cuadrante de alta concentración de quimioquinas.
Las correlaciones de rangos de Spearman por pares entre 17 rasgos celulares y solubles revelaron una fuerte correlación positiva entre el recuento de neutrófilos en el LBA y el eje general de quimioquinas (CXCL8 ρ = 0,78; CXCL1 ρ = 0,74; CCL3 ρ = 0,69; CCL2 ρ = 0,61; CXCL10 ρ = 0,54; todos con p ajustado < 0,001). El segundo nivel de correlaciones significativas se detectó entre los recuentos de neutrófilos y el eje proinflamatorio (G-CSF ρ = 0,65; IL-1β ρ = 0,62; IL-6 ρ = 0,58; TNF-α ρ = 0,51), seguido de correlaciones positivas moderadas con el eje regulador (IL-10 ρ = 0,45; IL-1RA ρ = 0,48). El porcentaje de macrófagos mostró una correlación negativa inversa con ambos ejes, quimioquina y proinflamatorio, de intensidad similar. Las correlaciones dentro del mismo eje fueron sustancialmente más fuertes que las entre ejes (mediana |ρ| dentro del eje = 0,68 frente a mediana |ρ| entre ejes = 0,33), lo que respalda la idea de vías reguladoras upstream comunes que controlan los ejes de quimioquinas, proinflamatorio y regulador.
La red de correlación representó este acoplamiento en un gráfico en el que los neutrófilos del LBA eran el nodo central más importante, con todas las 13 conexiones a citocinas que superaron la corrección BH para pruebas múltiples. De las 136 conexiones por pares posibles entre las 17 características, 99 cumplieron el criterio conjunto de |ρ| ≥ 0,30 y p ajustado con BH < 0,05, y se conservaron. El gráfico de la red de correlación mostró una arquitectura modular clara de tres bloques que reproducía los grupos obtenidos mediante agrupamiento jerárquico: las conexiones más densas y fuertes se dieron entre el módulo de quimioquinas y el recuento y porcentaje de neutrófilos en el LBA; conexiones de peso intermedio vincularon el módulo proinflamatorio tanto con los neutrófilos como con el módulo de quimioquinas; y conexiones delgadas procedentes del módulo regulador unieron los bloques de quimioquinas y proinflamatorio. El nodo del porcentaje de macrófagos se situó opuesto al bloque neutrófilo–quimioquinas y se conectó a él mediante un abanico de aristas con pesos negativos. En conjunto, el ACP, la matriz de correlación y el gráfico de red revelaron un patrón coherente en el que la infiltración de neutrófilos en el LBA y la respuesta de quimioquinas están fuertemente asociadas a nivel individual de participante, y las vías proinflamatorias y reguladoras actúan como módulos bien definidos pero interconectados en torno a este eje neutrófilo–quimioquinas.
Figura 4: Visualización acoplada del reclutamiento de neutrófilos y los perfiles de citoquinas inflamatorias. Biplot del análisis de componentes principales de la matriz estandarizada de citoquinas y células, con participantes coloreados por grupo, mapa de calor de correlación de Spearman y gráfico de red de las 17 características celulares y solubles (nodos dimensionados por grado, aristas escaladas por |ρ| y filtradas por p ajustado con BH < 0,05 y |ρ| ≥ 0,30), destacando el centro de quimioquinas-neutrófilos. Abreviaturas: BH = Benjamini-Hochberg; PC = componente principal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:
El conjunto de datos a nivel de participantes desidentificados y el código de análisis en R utilizados en este estudio se proporcionan como Tabla Suplementaria S1 y Archivo Suplementario 1. Otros datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles bajo solicitud razonable al autor correspondiente.
Tabla suplementaria S1: conjunto de datos del LBA. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 1: Un archivo ZIP que contiene los códigos de análisis. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
La solidez de este protocolo depende de algunas decisiones tomadas antes y durante el análisis. Establecer la tasa de recuperación mínima en un 40 % y combinar la segunda y las siguientes alícuotas fue una decisión intencional, ya que la primera alícuota contiene un mayor enriquecimiento de materiales de la vía aérea bronquial, mientras que la tasa de recuperación varía sistemáticamente con la edad, el sexo, la historia de tabaquismo y el bronquio objetivo18. Bloquear los receptores Fc y titular los anticuerpos frente a clones individuales para asegurar límites de selección adecuados entre neutrófilos maduros CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ y macrófagos alveolares CD14⁺HLA-DR⁺ (las células dominantes en la muestra de LBA con mayor fondo de tinción inespecífica y autofluorescencia) es fundamental para mantener la consistencia entre los dos grupos19,20. La limitación del ciclo de congelación-descongelación y el plazo de 2 h para el análisis multiplex tampoco son aleatorios. Datos obtenidos de LBA humano mostraron una reducción significativa en el porcentaje de neutrófilos entre las 6 y las 24 h, incluso cuando se almacenaron a 4 °C, mientras que los porcentajes de macrófagos y linfocitos permanecieron constantes13. Los parámetros para los algoritmos t-SNE y UMAP, así como los parámetros para la cuadrícula de 100 nodos de FlowSOM y para 12–15 metaclusters, se determinaron de antemano antes de analizar los grupos, para evitar ajustes a posteriori, que constituyen una de las razones conocidas de la irreproducibilidad de las líneas de análisis de citometría16. Aún es posible conservar por evento celular el operador y la identificación de la placa o corrida para aplicar métodos de corrección por lotes en futuros análisis a gran escala21.
Existen varios modos comunes de fallo que no requieren cambios en el protocolo. La recuperación baja (<40 %) suele deberse a una posición insuficiente del cunete o a una succión excesiva; este problema se puede solucionar ajustando la posición del broncoscopio y reduciendo la succión a <100 mmHg antes de aspirar otra alícuota. La autofluorescencia excesiva de los macrófagos alveolares, el principal factor de confusión en el análisis de citometría de flujo de células pulmonares, puede reducirse incluyendo controles de células pulmonares sin teñir en cada lote y definiendo claramente la puerta de macrófagos de alta dispersión lateral, en lugar de depender únicamente de colorantes de viabilidad19. Los paneles multiplex suelen verse comprometidos por recuentos bajos de microesferas y valores atípicos elevados. Realizar una curva preliminar de dilución para un subconjunto de muestras infectadas y controles antes de fijar una dilución 1:2 asegura evitar la saturación de la señal de CXCL8, CXCL1 y G-CSF, ubicados en la parte más alta de la curva estándar para muestras de neumonía, debido a su efecto de matriz previamente descubierto en muestras de LBA22. El protocolo puede ajustarse aún más según las características específicas de la cohorte. Cuando las muestras contienen predominantemente un solo tipo de patógeno, reducir el panel básico para incluir solo quimioquinas y mediadores proinflamatorios conservaría suficiente potencia estadística. En el caso de una población mixta que contenga bacterias, virus y patógenos atípicos, aún será beneficioso medir también mediadores reguladores, ya que recientemente se ha demostrado la existencia de una firma específica del patógeno en neutrófilos y macrófagos alveolares23, y se ha mostrado que una combinación de citocinas proinflamatorias y reguladoras en el LBA refleja la gravedad de la enfermedad en la neumonía adquirida en la comunidad24.
La contribución del presente protocolo no radica en la observación individual del ingreso de neutrófilos ni en el aumento de quimioquinas y citocinas proinflamatorias en infecciones respiratorias, ya que ambos fenómenos están ampliamente documentados, sino en la combinación de un panel de citometría de flujo de siete marcadores para neutrófilos y monocitos junto con un inmunoensayo multiplex de 13 analitos, integrados en una misma tubería de visualización aplicada a la misma muestra de LBA. La implementación de un panel de siete marcadores dirigido a neutrófilos y monocitos, junto con un inmunoensayo multiplex de 13 analitos, permite capturar la complejidad fenotípica y de citocinas; sin esto, el análisis requeriría varias pruebas independientes y un volumen mucho mayor de LBA del que puede obtenerse en una muestra normal de broncoscopia. El primero se alinea bien con trabajos previos que demuestran que la citometría de flujo multicolor es tan confiable como la microscopía manual para la identificación de tipos celulares en muestras de LBA15, mientras que los criterios de aceptación del segundo reflejan las mejores prácticas de un reconocido programa multicéntrico de competencia para ensayos multiplex basados en perlas16. En particular, el mapa de calor combinado, el gráfico de redes y el ACP construidos utilizando entradas estandarizadas idénticas revelan relaciones entre tipos celulares y sus factores asociados que anteriormente solo podían inferirse mediante la suma de gráficos de barras independientes. Esto es relevante porque las quimioquinas derivadas del LBA, CXCL8, CCL2 y CCL3, actúan conjuntamente para reclutar neutrófilos y monocitos desde un lecho circulatorio compartido, y su estructura conjunta contiene información que no puede obtenerse a partir de lecturas independientes de un solo analito9,10. Dado que el LBA ya se obtiene rutinariamente con fines clínicos y no requiere volumen adicional, el protocolo puede implementarse como un complemento traslacional a los servicios existentes de broncoscopia, en lugar de como un procedimiento diagnóstico independiente.
El tiempo práctico de respuesta del flujo de trabajo completo, que comprende el transporte de la muestra, tinción, adquisición por citometría de flujo, incubación y lectura del ensayo multiplex, y la canalización computacional posterior, es del orden de 24 h bajo condiciones de laboratorio de investigación. Por lo tanto, el flujo de trabajo se posiciona como una herramienta de fenotipado profundo para la caracterización mecanicista y el monitoreo de la respuesta al tratamiento, más que como un ensayo de triaje puntual para decisiones críticas en tiempo real, como la distinción inmediata entre neumonía asociada al ventilador y síndrome de distrés respiratorio agudo estéril, para las cuales los ensayos microbiológicos y los biomarcadores de un solo marcador más rápidos siguen siendo el estándar de atención.
Existen varias limitaciones que deben mencionarse. El LBA se recoge del espacio aéreo y representa las interacciones superficiales inmediatas de este espacio, pero no contiene células ubicadas dentro de la pared alveolar y el septo, donde se localizan muchos macrófagos activados y linfocitos residentes en el tejido. Por lo tanto, no existe una relación uno a uno entre los estados inmunitarios del espacio aéreo y el parénquima, lo cual concuerda con datos publicados previamente25. La detección basada en perlas multiplex sufre de reactividad cruzada de anticuerpos, así como de efectos de matriz, que son especialmente prevalentes en el entorno del LBA que contiene mucinas y surfactante, en comparación con el suero sanguíneo; además, el proceso de dilución del líquido de revestimiento epitelial con solución salina no puede corregirse mediante ningún marcador endógeno, como la urea, de acuerdo con críticas publicadas recientemente26. El volumen de lavado recuperado fue, en promedio, 6 mL menor en el grupo con infección que en los controles, por lo que las concentraciones absolutas aquí reportadas están sujetas a una modesta diferencia entre grupos en el factor de dilución, y no se aplicó ningún marcador endógeno de dilución. La exposición previa a antibióticos en 41 de los 64 participantes del grupo con infección (64,1 %) podría atenuar las concentraciones de citocinas en la vía aérea y la recuperación de patógenos. Es importante destacar que el protocolo solo representa una instantánea en un único punto temporal durante una broncoscopia indicada clínicamente, lo que impide el análisis de la cinética del reclutamiento de neutrófilos, la secreción máxima de quimioquinas y su resolución en pacientes individuales. Los valores de AUC para analitos individuales se derivaron de la misma cohorte utilizada para la identificación de biomarcadores, en ausencia de una cohorte independiente de validación, y deben interpretarse como medidas de discriminación dentro de la cohorte, más que como un rendimiento diagnóstico validado externamente; la adopción de cualquier punto de corte basado en un solo marcador en la práctica clínica requeriría una validación prospectiva en una cohorte independiente y multicéntrica. Los análisis de sensibilidad prespecificados, restringidos a muestras con mayor recuperación, a participantes sin exposición previa a antibióticos y estratificados según el estado de ventilación mecánica y el subtipo de neumonía (adquirida en la comunidad, adquirida en el hospital o asociada al ventilador), no alteraron la dirección de las comparaciones entre grupos.
En el futuro, estas limitaciones podrían abordarse mediante la adición de secuenciación de ARN a nivel de célula individual o CITE-seq a los mismos pellets de LBA utilizados para la cuantificación de proteínas y células, técnicas que se han aplicado con éxito en grandes cohortes de neumonía bacteriana y neumonía pediátrica por Mycoplasma pneumoniae, para revelar subpoblaciones de neutrófilos y macrófagos alveolares que no son distinguibles mediante citometría de flujo tradicional27,28. La incorporación de la información obtenida mediante análisis del espacio aéreo a la proporcionada por la citometría de masas por imágenes o la transcriptómica espacial de biopsias coincidentes o incluso de material de autopsia permitiría contextualizar esta información29. Asimismo, vincular el muestreo longitudinal de LBA con la evaluación de antagonistas de CXCR1/CXCR2 y del bloqueo del receptor de IL-6, ambos con beneficios demostrados en supervivencia o soporte orgánico en neumonía grave y síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA), permitiría probar el eje neutrófilo-quimoquina destacado por este protocolo como una herramienta de ayuda para la toma de decisiones terapéuticas30,31.
En conclusión, este estudio describe un flujo de trabajo integrado de visualización que consiste en procedimientos estandarizados de recolección y preparación del lavado broncoalveolar (BALF), un panel de citometría de flujo de siete marcadores para cuantificar la composición de neutrófilos y monocitos, un ensayo multiplex de citocinas que mide 13 citocinas, y una plataforma común de visualización que incluye análisis de UMAP, agrupamiento jerárquico, red de correlación y análisis de componentes principales (PCA). Al aplicar este flujo de trabajo a una cohorte prospectiva de 112 adultos sometidos a broncoscopia por indicación clínica, el análisis identificó una transición notable en la composición de las células inmunitarias alveolares, desde macrófagos hasta neutrófilos en pacientes con infección, detectó un patrón de respuesta de citocinas en tres módulos y reveló un eje neutrófilo-quimiocina fuertemente acoplado que no es observable mediante mediciones de un solo marcador. El procedimiento se basa exclusivamente en material recolectado durante el diagnóstico clínico, no requiere volumen adicional de muestra y podría ser factible en laboratorios de atención terciaria equipados para citometría de flujo multiparamétrica y análisis con matrices multiplex de microesferas. Una adopción más amplia, así como el uso de analitos individuales como biomarcadores diagnósticos, requerirá una validación prospectiva en cohortes independientes multicéntricas. Por lo tanto, el estudio presenta una metodología reproducible y rica en datos para caracterizar la inflamación de las vías respiratorias en infecciones respiratorias, y proporciona una base para su desarrollo posterior en estudios longitudinales, análisis unicelulares y espaciales, y evaluación terapéutica de la inmunomodulación dirigida al eje neutrófilo-quimiocina.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos sinceramente a todos los pacientes y voluntarios que participaron en este estudio por su valiosa cooperación. Agradecemos al Comité de Ética la aprobación ética (Número de aprobación 2026HL-038) y la orientación normativa durante todo el proceso de investigación.
Agradecemos al personal médico del Departamento de Neumología, del Centro de Broncoscopia y del Laboratorio Clínico por su apoyo en la recolección de muestras clínicas, el procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y la detección microbiológica. También agradecemos el apoyo técnico brindado por el laboratorio central del hospital para experimentos de citometría de flujo de alta dimensión y perfiles multiplex de citocinas.
Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias financiadoras de los sectores público, comercial o sin fines de lucro.
Agradecemos a todos los investigadores, técnicos y personal de enfermería involucrados en este proyecto por sus esfuerzos en la selección de pacientes, manejo de muestras, operación experimental y organización de datos.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo anti-CD11b humano, Brilliant Violet 421, clon ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | Marcador de activación de neutrófilos; canal de láser violeta URL: https://www.biolegend.com |
| Anticuerpo anti-CD14 humano, APC/Cyanine7, clon M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | Marcador de exclusión de monocitos-macrófagos; canal de láser rojo URL: https://www.biolegend.com |
| Anticuerpo anti-CD15 humano, PE, clon HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | Marcador de linaje de neutrófilos; canal de láser azul URL: https://www.biolegend.com |
| Anticuerpo anti-CD16 humano, Brilliant Violet 510, clon 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | Marcador de maduración de neutrófilos y células NK; canal de láser violeta URL: https://www.biolegend.com |
| Anticuerpo anti-CD45 humano, PerCP, clon HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | Marcador pan-leucocitario; canal de láser azul URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anticuerpo anti-CD66b humano, FITC, clon G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | Marcador de granulocitos; canal de láser azul URL: https://www.biolegend.com |
| Anticuerpo anti-HLA-DR humano, PerCP/Cyanine5.5, clon L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | Marcador de células presentadoras de antígenos; canal de láser azul URL: https://www.biolegend.com |
| Analizador hematológico automatizado (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Instrumento (modelo XN-1000) | Utilizado para determinar el recuento total de células nucleadas para el cálculo absoluto de neutrófilos URL: https://www.sysmex.com |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | Utilizada en tampón de tinción para citometría de flujo (0,5 % p/v en PBS con 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| Paquete ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Proyecto Bioconductor | v2.20 (código abierto) | Utilizado para mapas de calor de agrupamiento jerárquico de datos multiplexados de citocinas URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Citocentrífuga (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | Utilizada para preparar portaobjetos de citología a partir de suspensión celular de LBA URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| Solución de lisis de eritrocitos (BD FACS Lysing Solution, concentrado 10X) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | Utilizada para la lisis de eritrocitos tras la tinción de superficie URL: https://www.bdbiosciences.com |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | Utilizado en tampón de tinción para citometría de flujo a 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Tinte fijable de viabilidad (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | Exclusión de células muertas antes del gating; canal de láser rojo URL: https://www.biolegend.com |
| Broncoscopio de video flexible | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Instrumento (modelo BF-1TQ290) | Utilizado para LBA bajo sedación moderada URL: https://www.olympus-global.com |
| Citómetro de flujo multicolor (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Instrumento (modelo CytoFLEX LX, configuración de seis láseres) | Utilizado para la adquisición del panel de citometría de flujo de siete marcadores para neutrófilos/monocitos URL: https://www.beckman.com |
| Software de análisis para citometría de flujo (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Utilizado para compensación y gating manual de archivos FCS URL: https://www.flowjo.com |
| Paquete FlowSOM (R/Bioconductor) | Proyecto Bioconductor | v2.12 (código abierto) | Utilizado para agrupamiento por mapas autoorganizados y metaagrupamiento de datos de citometría de flujo URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (software estadístico de representación gráfica) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Utilizado para generar las figuras finales URL: https://www.graphpad.com |
| Reactivo bloqueador de receptores Fc humanos (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | Bloqueo de receptores Fc antes de la tinción con anticuerpos URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| Paquete igraph (R) | CRAN | v2.0 (código abierto) | Utilizado para construir y visualizar el gráfico de red de correlación URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Viales criogénicos de baja unión proteica, 2,0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | Utilizados para alícuotas de sobrenadante de LBA para análisis de citocinas URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Plataforma de inmunoensayo multiplexado basado en microesferas Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Instrumento (modelo MAGPIX) | Utilizada para la adquisición del ensayo multiplexado de citocinas URL: https://www.luminexcorp.com |
| Solución de tinción de May-Grünwald-Giemsa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | Utilizada para el recuento diferencial de células en citospin URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| Paquete mice (R) | CRAN | v3.16 (código abierto) | Utilizado para imputación múltiple mediante ecuaciones encadenadas en análisis de sensibilidad URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| Panel multiplexado magnético de citocinas/quimiocinas (13-plex, personalizado; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | Panel personalizado que mide los 13 analitos descritos en la Sección 2.4 URL: https://www.merckmillipore.com |
| Filtro de malla de nailon, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | Utilizado para filtración mecánica de LBA para eliminar coágulos de moco URL: https://www.corning.com |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | Tampón base para resuspensión y tinción de células URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Paquete pROC (R) | CRAN | v1.18 (código abierto) | Utilizado para generar curvas ROC y valores de AUC URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (entorno de computación estadística) | Equipo central de R | v4.4 (código abierto) | Plataforma para análisis estadísticos y visualización URL: https://www.r-project.org |
| Paquete rstatix (R) | CRAN | v0.7 (código abierto) | Utilizado para comparaciones entre grupos y estadísticas de correlación URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Paquete Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (código abierto) | Utilizado para incrustaciones t-SNE URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Microesferas de compensación monocromáticas (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | Utilizadas como controles de compensación monocromática URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| Solución de cloruro sódico para inyección, 0,9 % (suero salino estéril) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | Utilizada para instilación en LBA (100–150 mL, alícuotas de 20–40 mL a 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| Paquete uwot (R) | CRAN | v0.2 (código abierto) | Utilizado para reducción de dimensionalidad UMAP URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (software de adquisición y ajuste de curvas para ensayos multiplexados) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Software específico del instrumento para ajuste de curvas estándar 5PL URL: https://www.luminexcorp.com |
Referencias
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