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Artículo de método

Sistema óptico para la evaluación de la mecánica auricular y ventricular en corazones de ratón perfundidos mediante la técnica de Langendorff

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DOI:

10.3791/72264

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14 de agosto de 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para la extracción y canulación del corazón de ratón, así como la preparación y configuración del sistema de perfusión retrógrada Langendorff. El montaje experimental se acopla a un sistema óptico de alta resolución diseñado para evaluar las respuestas mecánicas de las aurículas y los ventrículos, manteniendo sus dinámicas naturales.

Resumen

El corazón de ratón sirve como un modelo ampliamente utilizado en la investigación cardiovascular, facilitado por avances en tecnologías de ingeniería. Sin embargo, la evaluación de la contractilidad auricular y ventricular sigue siendo un desafío debido al pequeño tamaño del corazón de ratón. Este estudio presenta una metodología novedosa para evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca en un corazón aislado e intacto. El uso de un corazón de ratón perfundido mediante el método de Langendorff, en combinación con un sistema óptico de alta resolución, permite la evaluación de la contractilidad auricular y ventricular. El montaje experimental aborda los desafíos asociados con el pequeño tamaño del corazón y las altas tasas de contracción, al tiempo que obtiene señales de alta resolución. La sincronización entre la frecuencia del estímulo y la frecuencia de contracción cardíaca en el rango de 420 a 660 latidos por minuto (lpm) fue coherente con los resultados obtenidos mediante el método auxotónico. Además, las mediciones del acortamiento ventricular y de las señales dinámicas auriculares permiten determinar la contracción auriculoventricular. Este método es adecuado para evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca en un corazón aislado e intacto, sin influencias farmacológicas ni sistémicas. Estos resultados demuestran que el sistema óptico permite medir las respuestas de acortamiento ventricular y auricular.

Introducción

Hay mucho por descubrir en la fisiología cardíaca; procesos clave, como la generación del ritmo cardíaco y el acoplamiento excitación-contracción, son principios fundamentales que se investigan continuamente1. Aunque los efectos del ruido biológico sobre la contractilidad cardíaca2 y la actividad marcapasos aún se comprenden de forma limitada1, nuevos métodos de imagen óptica han permitido presentar nuevos paradigmas3,4.

Dos metodologías experimentales que utilizan el sistema Langendorff han realizado contribuciones invaluables para medir la función cardíaca. Primero, el método de contracción isovolumétrica, en el que se obtiene una señal mediante un pequeño balón insertado en el ventrículo izquierdo5,6,7. Segundo, el método de registro auxotónico, en el que se obtiene una señal al coser un extremo de un hilo al ápice del corazón y el otro extremo a un dispositivo mecánico de registro para medir las contracciones auxotónicas a lo largo del eje del corazón2,8. Sin embargo, evaluar la contractilidad auricular y ventricular en el corazón de ratón es difícil debido a su tamaño diminuto. Además, el preparado requiere cierto grado de delicadeza, ya que el corazón es susceptible a lesiones9,10,11,12,13.

El sistema óptico para evaluar la dinámica mecánica de corazones de ratón posee varias características y ventajas novedosas. Primero, este método es adecuado para evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca en un corazón intacto y aislado, en ausencia de influencias farmacológicas o sistémicas. El protocolo también podría emplearse eficazmente en experimentos que analicen lesiones por isquemia-reperfusión al investigar tratamientos farmacológicos, de regeneración celular o basados en terapia de oxígeno.

En este artículo, presentamos un protocolo para registrar parámetros biofísicos de la función contráctil del corazón de ratón utilizando un sistema óptico de alta resolución. Este método permite evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca en un corazón intacto y aislado. Además, permite la evaluación de la contractilidad auricular y ventricular. La preparación del corazón de ratón Langendorff presenta una mejora que incluye una ligera modificación para minimizar la pérdida de temperatura del perfusato y los artefactos de movimiento sin inhibir las contracciones musculares.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones federales para el experimento y cuidado de animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal del CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., México). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J, con un peso de 28–34 g y una edad de 8–14 semanas. Todos los materiales y equipos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Los Archivos Suplementarios 1–11 proporcionan diagramas de apoyo, guías de software, programas de análisis, datos de estimulación y archivos de aplicación para el protocolo.

1. Preparación de soluciones madre

  1. Preparar dos soluciones stock con antelación y almacenarlas en un refrigerador a 4 °C: (1) Stock I, 1 L (en agua desionizada; en g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) y (2) Stock II, 0,1 L (en agua desionizada; en g/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    NOTA: Las soluciones pueden usarse hasta 30 días después de su preparación. Almacénelas a 4 °C.

2. Conexión y limpieza del sistema Langendorff

  1. Conecte el depósito (1), el baño térmico del depósito (2), la bomba de perfusión (3), el serpentín (4), el recirculador del serpentín (5), el sistema de monitoreo (6) y el sistema de drenaje (8), como se muestra en Figura 1A.
    NOTA: La conexión entre el sistema de monitoreo y el sistema de drenaje se muestra con mayor detalle en Archivo Suplementario 1.
  2. Llene el sistema Langendorff con 1 L de agua desionizada a 50 °C, luego encienda las bombas de perfusión y drenaje (Archivo Suplementario 1, sistema de drenaje). Después de aproximadamente 20–30 min, retire el líquido del sistema y continúe con el siguiente paso.
    NOTA: Verifique que no haya fugas ni caídas de presión en el sistema. Si esto ocurre, no continúe con el experimento.
  3. Llene el sistema con 1 L de ácido acético al 1% (disuelto en agua desionizada), luego apague las bombas de perfusión y drenaje y espere 60 min; después, encienda las bombas para eliminar el líquido.
  4. Repita el paso 2.2 dos veces.
  5. Llene el sistema con etanol al 70% (disuelto en agua desionizada) para evitar la adhesión de los componentes de la solución.
    NOTA: El sistema de perfusión Langendorff debe limpiarse cada diez experimentos o mensualmente. El protocolo de limpieza previo al experimento se explica en sección 4. Mientras que el protocolo de limpieza posterior al experimento se detalla en sección 8.

3. Preparación de la solución de Tyrode durante el experimento

  1. Preparar 1 L de solución en mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucosa, 10 HEPES, ajustado a pH 7,35 ± 0,05 con NaOH.
    1. Mezclar 100 mL de Solución Stock I con 700 mL de agua desionizada bajo agitación constante, luego elevar la temperatura de la solución a 37 °C; mantener la oxigenación de la solución conectando el tanque de O2 a la piedra de aire como se muestra en Figura 1A (1).
    2. Agregar 3,6 mL de Solución Stock II y 96,4 mL de agua desionizada para obtener 1,8 mM CaCl2(2H2O), luego agregar NaOH para ajustar el pH a 7,35 ± 0,05.
    3. Completar con agua desionizada hasta obtener 1 L de solución de Tyrode.
      NOTA: Se recomienda almacenar 100 mL de la solución en el refrigerador a 4 °C; este volumen será necesario más adelante en el paso 6.

4. Preparación del sistema Langendorff

NOTA: Si el sistema Langendorff no está lleno de etanol el día del experimento, no se recomienda continuar con el procedimiento; en su lugar, repetir sección 2.

  1. Encienda las bombas de perfusión y drenaje. Ajuste el caudal de la bomba de perfusión a 3 mL/min y el de la bomba de drenaje a 10 mL/min. Drene el sistema.
  2. Llene el sistema con 1 L de agua desionizada a 37 °C, luego deseche el agua.
  3. Llene el sistema con la solución de Tyrode preparada en paso 3 y mantener la solución a temperatura fisiológica y con oxigenación constante.
  4. Encienda las bañeras térmicas del depósito y el recirculador serpentino. Establezca la temperatura del depósito (Figura 1A (2)) en 38 °C para mantener la solución en condiciones fisiológicas. Ajuste la temperatura del serpentín (Figura 1A (5)) en 40 °C. Esto compensa la pérdida de temperatura en la solución del sistema Langendorff.
    NOTA: Si la temperatura de la solución de Tyrode en la salida del sistema no es fisiológica (37 ± 0.5 °C), ajuste la temperatura del recirculador serpenteado. No se recomienda pasar al paso 6 hasta que la temperatura se haya estabilizado en el valor adecuado.
  5. Encienda el monitor de presión (Archivo Suplementario 1, sistema de monitorización) y calibrar en el rango de 0–200 mmHg. La aplicación de monitorización y estimulación está disponible para ayudar a calibrar el sistema (Archivo Suplementario 3 y Archivo Suplementario 11).
    NOTA: Es esencial verificar que no haya pérdida de presión ni burbujas en el sistema. Si el sistema contiene burbujas, bloquee temporalmente la salida inferior del serpentín y abra la válvula superior; esto hará que la columna se llene, permitiendo que las burbujas se liberen al exterior. No se recomienda continuar con el experimento hasta que se haya verificado esta condición.

5. Sistema óptico14

  1. Monte la cámara CMOS (Figura 1A, 10), el objetivo ajustable (LC) y el sistema de iluminación.
    NOTA: El sistema de iluminación consta de dos LED (Figura 1A, 9), dos lentes de iluminación planoconvexas (LI), un control de iluminación (Figura 1A, 11), una tarjeta de adquisición (Archivo Suplementario 1, sistema de monitoreo) y piezas de soporte diseñadas en 3D (Archivo Suplementario 1).
  2. Coloque un objeto de referencia con un volumen de aproximadamente 1.000 mm3 a una distancia de 100–200 mm del objetivo de la cámara (centro de la Figura 1A).
    NOTA: El objeto debe colocarse en la posición del corazón en el sistema Langendorff. Esta posición puede observarse en la Figura 1B, específicamente en el centro de la imagen donde inciden los haces de luz.
  3. Inicie el software de adquisición de la cámara y configure la cámara con una submuestreo de 4x (4 píxeles = 1 subpíxel). Establezca una región de interés (ROI) de 200 x 200 subpíxeles (Archivo Suplementario 2).
    NOTA: Con esta configuración, es posible alcanzar una resolución temporal de 750 cuadros por segundo (fps).
  4. Encienda el sistema de iluminación (Archivo Suplementario 1), ajuste los haces de luz para enfocarlos en el objeto de referencia y logre una iluminación homogénea (Figura 1B).
  5. Ajuste la intensidad de la luz sobre el objeto de referencia para evitar la sobreexposición de la imagen.
    NOTA: La imagen debe parecerse a la Figura 2A (o a la Figura 1C, PC del controlador). Las reflexiones sobre la superficie del objeto (corazón) deben reducirse lo más posible sin perder la definición de su contorno. Esto puede lograrse ajustando la potencia del control de iluminación o reduciendo el tiempo de exposición en la configuración de la cámara.
  6. Enfoque el objetivo de la cámara para obtener una imagen nítida del objeto de referencia (Figura 1C, PC del controlador). Asegúrese de que el objeto de referencia ocupe el 80 % del campo de visión (Figura 2A) para obtener una escala de conversión de aproximadamente 61 µm por subpíxel.
    NOTA: El sistema óptico activa automáticamente el sistema de iluminación cuando la cámara se configura en modo de adquisición (Figura 1A y Archivo Suplementario 2). Se recomienda mantener la cámara en modo de espera para que el sistema de iluminación permanezca apagado, activándose únicamente durante los periodos de recopilación de datos experimentales, con el fin de evitar el sobrecalentamiento.

6. Procedimientos quirúrgicos y de canulación

  1. Heparinización y anestesia
    1. Preparar una mezcla anestésica que contenga tiletamina-zolazepam (40 mg/kg de peso corporal del ratón) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal del ratón), luego diluir a 200 µL con solución salina.
    2. Administrar la mezcla anestésica por vía intraperitoneal usando una aguja de 27 G. Permitir que el ratón alcance una anestesia profunda.
      NOTA: Verificar la ausencia de reflejo en respuesta a un estímulo en las extremidades o la cola (por lo general, 10 min son suficientes).
    3. Administrar 200 UI de heparina no fraccionada por vía intraperitoneal usando una aguja de calibre 27 G y esperar aproximadamente 5 min antes de continuar con el experimento.
  2. Extracción y canulación
    1. Colocar al ratón en posición supina, retirar el vello y la piel del área torácica con tijeras quirúrgicas.
    2. Realizar una incisión abdominal por debajo del diafragma, asegurándose de mantener su integridad.
    3. Continuar con una incisión transversal en el diafragma y realizar rápidamente una toracotomía bilateral ascendente a través de las costillas, luego retirar la pared costal.
      NOTA: Tener cuidado de no dañar el corazón. Si el corazón se ve comprometido o dañado durante el procedimiento, se recomienda no continuar con el experimento.
    4. Sujetar suavemente las estructuras superiores del corazón usando pinzas finas, el arco aórtico y los vasos adyacentes. Levantar suavemente para hacer un corte por debajo y hacia arriba, y extraer juntos el corazón y los pulmones.
    5. Transferir rápidamente el corazón a una placa de Petri que contenga 50 mL de solución de Tyrode a 4 °C para un lavado inicial.
      NOTA: A partir del momento en que se realiza la incisión en el diafragma, el animal comenzará a experimentar dificultad respiratoria; a partir de este punto, existe una ventana de 60 s para realizar los pasos 6.2.3–6.2.6. Superar este límite de tiempo podría inducir daño isquémico.
    6. Retirar los pulmones y el tejido adiposo excesivo para exponer el arco aórtico usando un microscopio estereoscópico y tijeras finas.
      NOTA: Durante la limpieza del tejido, asegurarse de no dañar el arco aórtico. Si la aorta se corta por debajo de la arteria braquiocefálica, la canulación será difícil y podría provocar fugas de presión.
    7. Transferir el corazón a la base de canulación personalizada que contiene 50 mL de tampón de Tyrode a 4 °C e insertar el extremo aórtico en la cánula fabricada a partir de una aguja de 20 G (Archivo Suplementario 1).
      NOTA: Tener cuidado de no dañar la válvula aórtica. Si la válvula se ve comprometida, el corazón se hinchará y la circulación coronaria no se lavará adecuadamente.
    8. Amar dos nudos de canulación usando sutura de seda 4/0: el primero en la hendidura distal a la punta de la cánula y el segundo antes del tronco braquiocefálico (Archivo Suplementario 1).
    9. Aplicar lentamente solución de Tyrode usando una jeringa de 1 mL llena con tampón a temperatura ambiente. Verificar que el tejido coronario se aclare para confirmar una buena canulación.
    10. Retirar el tejido adiposo para permitir el acceso a los ventrículos y las aurículas.
      NOTA: Evitar superar los 5 min de canulación para preservar la viabilidad del corazón.
    11. Transferir el corazón a un sistema Langendorff y permitir que se estabilice durante 30 min.
      NOTA: El corazón se coloca en el centro del sistema (Figura 1A,B), suspendido verticalmente. Al colgar el corazón, tomar extrema precaución para evitar la formación de burbujas de aire. Si esto ocurre, la presión aumentará por encima de 140 mmHg, el corazón comenzará a hincharse y ya no será viable.
      NOTA: El montaje Langendorff se considera completo cuando el corazón muestra una respuesta mecánicamente estable, una frecuencia de oscilación natural de aproximadamente 360 latidos por minuto (BPM) y una presión de perfusión entre 60 y 110 mmHg.

7. Protocolo de estimulación y grabación de video

  1. Viabilidad cardíaca
    1. Verifique que la presión coronaria esté en el rango de 60–110 mmHg con una bomba de perfusión de 3 mL/min. Si la presión de perfusión coronaria desciende por debajo de 60 mmHg, aumente ligeramente la velocidad de flujo de la bomba de perfusión (una presión baja hará que el corazón se vuelva pálido y flácido). Por el contrario, si la presión supera los 110 mmHg, disminuya ligeramente la velocidad de flujo de la bomba (una presión excesiva inducirá edema tisular y un aumento progresivo de la presión hasta que ocurra la parada cardíaca).
      NOTA: Mantener la presión de perfusión fuera del rango óptimo mencionado anteriormente durante un período prolongado comprometerá irreversiblemente la viabilidad cardíaca.
    2. Coloque el corazón en posición frontal para obtener una vista completa de frente en la cámara. Ajuste la posición de modo que ambas aurículas sean visibles en la cámara (Figura 2A).
    3. Coloque suavemente los electrodos de platino superficialmente en la parte superior de la aurícula derecha, en el nódulo del marcapasos. Utilice la imagen de la cámara como guía para colocar los electrodos en el campo de visión. Posicione el electrodo de forma que no obstruya la aurícula derecha. Mientras monitorea la vista en vivo de la cámara, avance lentamente el electrodo hasta que haga contacto con el tejido auricular, teniendo cuidado de no ejercer compresión excesiva (lo cual aplanaría la aurícula derecha en la imagen).
      NOTA: Si se realiza correctamente, la vista de la cámara se parecerá a la Figura 2A.
    4. Inicie la aplicación de monitoreo y marcapasos (Archivo Suplementario 11) y encienda la tarjeta de adquisición (Figura 1A (6)). Establezca los valores de los parámetros del estímulo: amplitud de 2 V, frecuencia de 420, 540 y 720 pulsos por minuto (PPM) con un pulso cuadrado de ciclo de trabajo de 7 ms (inseto de la Figura 2A).
    5. Aplique las estimulaciones de viabilidad comenzando con la frecuencia más baja, utilizando una duración de estimulación de 20 s seguida de un período de recuperación de 20 s (tiempo de reposo) entre eventos.
      NOTA: Evalúe la viabilidad cardíaca mediante el monitoreo con la cámara. Si el órgano es funcional fisiológicamente, se observará una sincronización entre el estímulo aplicado y la respuesta cardíaca, acompañada de una adecuada coordinación entre las cámaras del corazón. Por el contrario, la falta de viabilidad se manifestará por la pérdida de coordinación entre las cámaras o por la presencia exclusiva de contracciones auriculares aisladas.
    6. Cierre la puerta de la cámara porque el experimento es sensible a la luz ambiental y a las fluctuaciones térmicas (Figura 1C).
      NOTA: La puerta de la cámara debe permanecer cerrada durante el tiempo del experimento. Monitoree la viabilidad cardíaca con la cámara y la presión de perfusión.
  2. Grabación de datos
    1. Aplique el protocolo de marcapasos, que consiste en trenes de pulsos cuadrados de 30 s de duración, seguidos de 30 s sin señal. Establezca los valores de los parámetros del estímulo en cada tren de marcapasos: amplitud de 2 V, ciclo de trabajo de 7 ms y frecuencia en el rango de 360 a 720 PPM.
      NOTA: El protocolo de marcapasos comienza en 360 PPM y aumenta en 60 PPM en cada punto de tiempo (inseto de la Figura 2A).
    2. Grabe continuamente videos de la dinámica de la vista frontal del corazón en formato .avi utilizando el software de adquisición de cámara (Archivo Suplementario 2). Realice una grabación de video de 20 s para cada tren de marcapasos. Grabe el segmento de 20 s comenzando 5 s después del inicio del marcapasos. Un registro en bruto representativo se proporciona en el Película Suplementaria 1.
      NOTA: Un ordenador registra simultáneamente el tren de marcapasos aplicado (.xls, Archivo Suplementario 9) para cada video grabado (.avi), generados por la aplicación de monitoreo y marcapasos y el software de adquisición de cámara, respectivamente (Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3).
    3. Verifique la viabilidad cardíaca comparando el primer video, grabado antes de iniciar el protocolo de estimulación, con el segundo video, grabado después de aplicar el protocolo (Figura 2B).

8. Limpieza del sistema de perfusión de Langendorff tras el experimento

  1. Retire el estímulo y los electrodos de platino para ECG. Retire el corazón del sistema y drene todas las soluciones residuales de Tyrode.
  2. Apague el sistema óptico y cierre la válvula de O2.
  3. Lave el sistema con 1 L de agua desionizada a 37 °C, y luego drene el sistema.
  4. Repita los pasos 2.4 y 2.5.
  5. Apague todos los sistemas y equipos.

9. Procesamiento de video

  1. Comience por importar cada video en un software computacional y aplicar una función de normalización de video15.
  2. Seleccione una región de interés (ROI) que incluya el área del corazón. Realice la segmentación de la imagen para eliminar el ruido de fondo, los electrodos y la cánulaArchivo Suplementario 4).
    NOTA: Para seleccionar correctamente el área de la imagen que se eliminará, consulte Archivo Suplementario 10.
  3. Realice un análisis global de dinámica mecánicaArchivo Suplementario 5). Se muestran ejemplos de variabilidad y señales de apoyo en Figura suplementaria S1, Figura suplementaria S2, y Figura suplementaria S3.
    1. Aplicar operadores morfológicos a cada fotograma del video para detectar el perímetro del corazón, luego aplicar un algoritmo de relleno de fotograma para generar una máscara15.
    2. Cuente los píxeles dentro del área segmentada en cada cuadro, luego normalice este valor por el número total de píxeles en la imagen para producir una señal dinámica (inset en Figura 2B y Figura suplementaria S3).
    3. Aplique un filtro bidireccional de Butterworth de quinto orden entre 3 y 100 Hz a la señal obtenida para suprimir el ruido de alta frecuencia y los artefactos por goteo de perfusión.15.
    4. Normalice las señales en todos los videos utilizando los valores máximos y mínimos registrados.
    5. Determine la frecuencia cardíaca calculando el intervalo entre dos valores de amplitud máxima (IAA (s)) para cada señal dinámica y de estímulo.
    6. Obtenga la frecuencia en ppm con la siguiente fórmula:
      Ecuación para el cálculo de la frecuencia que muestra la frecuencia cardíaca como LPM igual a 60 dividido por IAA.
    7. Generar mapas de Poincaré a partir de datos de IAA para ilustrar la variabilidad en períodos cortos y largos16,17,18 (Figura suplementaria S1 y Figura suplementaria S2).
      NOTA: Para obtener información más detallada, consulte Archivo Suplementario 10.
  4. Realice un análisis segmentario de la dinámica mecánica ventricularArchivo Suplementario 6).
    1. Aplicar binarización de la imagen. Utilizar operadores morfológicos para delimitar el área ventricular, ajustándola a una geometría elíptica sin comprometer la región de interés (ROI).15.
    2. Ajustar una elipse mínima al área ventricular en cada cuadro. Extraer las coordenadas de un conjunto de puntos distales en un cuadro. Utilizar un conjunto de 10–20 puntos en cada extremo a lo largo del eje Y (Figura 3A). Se proporciona un resultado representativo de la estimación de elipses en Película suplementaria 2.
    3. Calcule el acortamiento ventricular como la distancia media entre los puntos extremos a lo largo del eje Y en cada video19.
    4. Aplique un filtro bidireccional de Butterworth de quinto orden entre 3 y 100 Hz a la señal obtenida para suprimir el ruido de alta frecuencia y los artefactos por goteo de perfusión.15.
    5. Normalice la señal de acortamiento ventricular en relación con todos los videos obtenidos para cada estimulación, y calcule la frecuencia cardíaca y el retardo como en los pasos 9.3.5–9.3.6.
      NOTA: Se obtienen parámetros, como la duración del ciclo ventricular (DVE), la duración de relajación (DVW), el intervalo interventricular (IVV) y la amplitud ventricular (VA),Figura 3A).
      NOTA: Para obtener información más detallada, consulte Archivo Suplementario 10.
  5. Realice un análisis segmentario de la dinámica mecánica de las aurículasArchivo Suplementario 7).
    1. Utilice dos ROI para delimitar las aurículas (Figura 3C).
    2. Analice cada atrio individualmente.
      1. Utilice operadores morfológicos para delimitar las aurículas mientras los ajusta sin comprometer la región de interés (ROI)15. Utilice un algoritmo de aumento de contraste para delimitar cada aurícula20,21.
      2. Aplique binarización de imagen y cuantifique el número de píxeles diferentes de cero por cuadro para obtener una señal dinámica auricular.
      3. Aplique un filtro bidireccional de Butterworth de quinto orden entre 3 y 100 Hz a las señales obtenidas para suprimir el ruido de alta frecuencia y los artefactos por goteo de perfusión.15.
      4. Calcule el promedio de dos señales atriales (Figura 3D).
    3. Normalice la señal de acortamiento auricular en relación con todos los videos obtenidos para cada estimulación y calcule la frecuencia cardíaca y el retardo como en los pasos 9.3.5–9.3.6.
      NOTA: Los parámetros, como la duración del ciclo auricular (DAE), el intervalo auricular-auricular (IAT) y la amplitud auricular (AA), se obtienen (Figura 3D). Para obtener información más detallada, consulte el Archivo Suplementario 10.
  6. Realice un análisis electro-mecánico13,22 (Archivo Suplementario 8).
    1. Compare los datos de estimulación con las señales auriculares y ventriculares (Figura 3D).
    2. Calcule el tiempo de propagación en el sistema de conducción cardíaco, obteniendo el retardo entre los eventos auriculares y ventriculares (AVD), tomando el estímulo aplicado como referencia.

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Resultados

Los experimentos de función mecánica cardíaca se realizan utilizando el aparato de Langendorff, como se muestra en la Figura 1A (arriba). Los sistemas de monitoreo y óptico permiten la grabación de video cuando se activa el control de iluminación, como se muestra en la Figura 1A (abajo). La Figura 1C ilustra la vista externa del gabinete con control térmico, diseñado para mantener al corazón aislado...

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Discusión

El corazón de ratón es muy sensible a las variaciones de temperatura2,9,10,11,22. En este experimento, el corazón perfundido se colocó verticalmente. Se incluyó una ligera modificación para minimizar la pérdida de temperatura del perfusato y los artefactos de movimiento en el método de perfusión Langendorff. Se añadió una bomba de recirculación al serpentín pa...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue respaldado por la Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI), con una subvención financiada con el número LN-2025-C-23.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de 1 mLBD Plastipak302485Procedimiento quirúrgico
Aguja 20 GNIPROAH-2032Cánula aórtica
Lente ajustable de 25 mm con aumento de 8x-100xGenericN/ALente de cámara del sistema óptico; citado genéricamente como lente de cámara ajustable
Aguja 27 GBD PrecisionGlide302358Procedimiento quirúrgico
Piezas de soporte personalizadas diseñadas en 3DCINVESTAVN/APiezas de soporte personalizadas diseñadas en 3D
Sutura de seda 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901Cánula aórtica
Fuente de alimentación de 40 ASTERENPRL-25Fuente de alimentación para LED
Piedra de aireN/AN/AOxigenación de la solución de Tyrode
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Solución de Tyrode
D-GlucosaJ.T. Baker1916-01Solución de Tyrode
Bomba de drenajeCINVESTAVN/ABomba de drenaje personalizada; citada genéricamente como bomba de drenaje
Lente plano-convexo, F = 25,4 mmTHORLABSLA1951-ALente de iluminación del sistema óptico; citado genéricamente como lente de iluminación plano-convexo
Ácido acético glacialSigma-Aldrich695092Limpieza del sistema Langendorff
HeparinaPiSA060M91Anticoagulante
HEPESSigma-AldrichH3375Solución de Tyrode
LEDs de alta potenciaLuminiusCBT-90-G-L11-C12Fuente de luz LED
Sistema de iluminaciónCINVESTAVN/ASistema de iluminación personalizado; citado genéricamente como sistema de iluminación
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Solución de Tyrode
Software LabVIEW versión 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/ASoftware utilizado para ejecutar la aplicación de monitoreo y estimulación; citado genéricamente como aplicación de monitoreo y estimulación
Software MATLABThe MathWorksN/ASoftware computacional para programas de normalización, segmentación y análisis de video; citado genéricamente como software computacional
Oxígeno médicoGRUPO INFRAN/AOxigenación de la solución de Tyrode
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Solución de Tyrode
Mini-bomba de flujo variableCONTROL COMPANY3385Bomba de perfusión
Kit quirúrgico para ratónKent ScientificINSMOUSEKITProcedimiento quirúrgico
NaClSigma-AldrichS5886Solución de Tyrode
NaH2PO4DEQDEQF290400250Solución de Tyrode
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108Ajuste de pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Tarjeta de adquisición
Electrodos de platino, diámetro 0,25 mmSigma-Aldrich349402Electrodos para estimulación eléctrica
Fuente de alimentación (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30AFuente de alimentación del recirculador
Monitor de presiónCINVESTAVN/AMonitor de presión personalizado; citado genéricamente como monitor de presión
Transductor de presiónLA BOUVETB17295Monitor de presión del sistema Langendorff
Alcohol etílico puroSigma-Aldrich493511Etileno para limpieza del sistema
Baño térmico recirculante (LXC)PolyScienceL113A0412Recirculador del depósito
Solución salinaPiSA111848Solución de cloruro de sodio al 0,9 % (NaCl)
Baño térmico serpentinoCINVESTAVN/ARecirculador/baño térmico serpentino personalizado
Stereo microscopioN/AN/AProcedimiento quirúrgico
Iluminación del estereomicroscopioN/AN/AProcedimiento quirúrgico
Software uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/ASoftware de adquisición de cámara; citado genéricamente como software de adquisición de cámara
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Cámara CMOS de alta velocidad; citada genéricamente como cámara CMOS
XilacinaPiSA4001211Anestésico
Zoletil 100Virbac83048907Mezcla anestésica de tiletamina-zolacepam; citada genéricamente como mezcla anestésica

Referencias

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

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