Sistema óptico para la evaluación de la mecánica auricular y ventricular en corazones de ratón perfundidos mediante la técnica de Langendorff

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para la extracción y canulación del corazón de ratón, así como la preparación y configuración del sistema de perfusión retrógrada Langendorff. El montaje experimental se acopla a un sistema óptico de alta resolución diseñado para evaluar las respuestas mecánicas de las aurículas y los ventrículos, manteniendo sus dinámicas naturales.

Resumen

El corazón de ratón sirve como un modelo ampliamente utilizado en la investigación cardiovascular, facilitado por avances en tecnologías de ingeniería. Sin embargo, la evaluación de la contractilidad auricular y ventricular sigue siendo un desafío debido al pequeño tamaño del corazón de ratón. Este estudio presenta una metodología novedosa para evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca en un corazón aislado e intacto. El uso de un corazón de ratón perfundido mediante el método de Langendorff, en combinación con un sistema óptico de alta resolución, permite la evaluación de la contractilidad auricular y ventricular. El montaje experimental aborda los desafíos asociados con el pequeño tamaño del corazón y las altas tasas de contracción, al tiempo que obtiene señales de alta resolución. La sincronización entre la frecuencia del estímulo y la frecuencia de contracción cardíaca en el rango de 420 a 660 latidos por minuto (lpm) fue coherente con los resultados obtenidos mediante el método auxotónico. Además, las mediciones del acortamiento ventricular y de las señales dinámicas auriculares permiten determinar la contracción auriculoventricular. Este método es adecuado para evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca en un corazón aislado e intacto, sin influencias farmacológicas ni sistémicas. Estos resultados demuestran que el sistema óptico permite medir las respuestas de acortamiento ventricular y auricular.

Introducción

Hay mucho por descubrir en la fisiología cardíaca; procesos clave, como la generación del ritmo cardíaco y el acoplamiento excitación-contracción, son principios fundamentales que se investigan continuamente¹. Aunque los efectos del ruido biológico sobre la contractilidad cardíaca² y la actividad marcapasos aún se comprenden de forma limitada¹, nuevos métodos de imagen óptica han permitido presentar nuevos paradigmas^3,4.

Dos metodologías experimentales que utilizan el sistema Langendorff han realizado contribuciones invaluables para medir la función cardíaca. Primero, el método de contracción isovolumétrica, en el que se obtiene una señal mediante un pequeño balón insertado en el ventrículo izquierdo^5,6,7. Segundo, el método de registro auxotónico, en el que se obtiene una señal al coser un extremo de un hilo al ápice del corazón y el otro extremo a un dispositivo mecánico de registro para medir las contracciones auxotónicas a lo largo del eje del corazón^2,8. Sin embargo, evaluar la contractilidad auricular y ventricular en el corazón de ratón es difícil debido a su tamaño diminuto. Además, el preparado requiere cierto grado de delicadeza, ya que el corazón es susceptible a lesiones^{9,10,11,12,13}.

El sistema óptico para evaluar la dinámica mecánica de corazones de ratón posee varias características y ventajas novedosas. Primero, este método es adecuado para evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca en un corazón intacto y aislado, en ausencia de influencias farmacológicas o sistémicas. El protocolo también podría emplearse eficazmente en experimentos que analicen lesiones por isquemia-reperfusión al investigar tratamientos farmacológicos, de regeneración celular o basados en terapia de oxígeno.

En este artículo, presentamos un protocolo para registrar parámetros biofísicos de la función contráctil del corazón de ratón utilizando un sistema óptico de alta resolución. Este método permite evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca en un corazón intacto y aislado. Además, permite la evaluación de la contractilidad auricular y ventricular. La preparación del corazón de ratón Langendorff presenta una mejora que incluye una ligera modificación para minimizar la pérdida de temperatura del perfusato y los artefactos de movimiento sin inhibir las contracciones musculares.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones federales para la experimentación y el cuidado de animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., México). En este estudio, se utilizaron ratones macho C57BL/6J, con un peso de 28–34 g y una edad de 8–14 semanas. Todos los materiales y equipos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Los Archivos Suplementarios 1–11 proporcionan diagramas de apoyo, guías de software, programas de análisis, datos de estimulación y archivos de aplicación para el protocolo.

1. Preparación de soluciones madre

1. Preparar dos soluciones stock con antelación y almacenarlas en un refrigerador a 4 °C: (1) Stock I, 1 L (en agua desionizada; en g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl₂(6H₂O), 0,4 NaH₂PO₄) y (2) Stock II, 0,1 L (en agua desionizada; en g/L: 73,5 CaCl₂(2H₂O)).
   NOTA: Las soluciones pueden utilizarse hasta 30 días después de su preparación. Almacénelas a 4 °C.

2. Conexión y limpieza del sistema Langendorff

1. Conecte el depósito (1), el baño térmico del depósito (2), la bomba de perfusión (3), el serpentín (4), el recirculador del serpentín (5), el sistema de monitoreo (6) y el sistema de drenaje (8), como se muestra en Figura 1A.
   NOTA: La conexión entre el sistema de monitoreo y el sistema de drenaje se muestra con mayor detalle en el Archivo Suplementario 1.
2. Llene el sistema Langendorff con 1 L de agua desionizada a 50 °C, luego encienda las bombas de perfusión y drenaje (Archivo Suplementario 1, sistema de drenaje). Después de aproximadamente 20–30 min, retire el líquido del sistema y continúe con el siguiente paso.
   NOTA: Verifique que no haya fugas ni caídas de presión en el sistema. Si esto ocurre, no continúe con el experimento.
3. Llene el sistema con 1 L de ácido acético al 1% (disuelto en agua desionizada), luego apague las bombas de perfusión y drenaje y espere 60 min; a continuación, encienda las bombas para eliminar el líquido.
4. Repita el paso 2.2 dos veces.
5. Llene el sistema con etanol al 70% (disuelto en agua desionizada) para evitar la adhesión de los componentes de la solución.
   NOTA: El sistema de perfusión Langendorff debe limpiarse cada diez experimentos o mensualmente. El protocolo de limpieza previo al experimento se explica en la sección 4. Mientras que el protocolo de limpieza posterior al experimento se detalla en la sección 8.

3. Preparación de la solución de Tyrode durante el experimento

1. Preparar 1 L de solución en mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl₂(6H₂O), 0,33 NaH₂PO₄, 1,8 CaCl₂(2H₂O), 10 D-glucosa, 10 HEPES, ajustado a pH 7,35 ± 0,05 con NaOH.
   1. Mezclar 100 mL del Stock I con 700 mL de agua desionizada bajo agitación constante, luego elevar la temperatura de la solución a 37 °C; mantener la oxigenación de la solución conectando el tanque de O₂ a la piedra difusora de aire como se muestra en Figura 1A (1).
   2. Añadir 3,6 mL del Stock II y 96,4 mL de agua desionizada para obtener 1,8 mM CaCl₂(2H₂O), luego añadir NaOH para ajustar el pH a 7,35 ± 0,05.
   3. Completar con agua desionizada hasta obtener 1 L de solución de Tyrode.
      NOTA: Se recomienda almacenar 100 mL de la solución en el refrigerador a 4 °C; este volumen será necesario más adelante en el paso 6.

4. Preparación del sistema Langendorff

NOTA: Si el sistema Langendorff no se ha llenado con etanol el día del experimento, no se recomienda continuar con el procedimiento; en su lugar, repita sección 2.

1. Encienda las bombas de perfusión y drenaje. Ajuste el caudal de la bomba de perfusión a 3 mL/min y el de la bomba de drenaje a 10 mL/min. Drene el sistema.
2. Llene el sistema con 1 L de agua desionizada a 37 °C, luego drene el agua.
3. Llene el sistema con la solución de Tyrode preparada en paso 3 y mantener la solución a temperatura fisiológica y con oxigenación constante.
4. Encienda los baños térmicos del depósito y el recirculador serpentino. Establezca la temperatura del depósito (Figura 1A (2)) en 38 °C para mantener la solución en condiciones fisiológicas. Ajuste la temperatura del serpentín (Figura 1A (5)) en 40 °CEsto compensa la pérdida de temperatura en la solución del sistema Langendorff.
   NOTA: Si la temperatura de la solución de Tyrode en la salida del sistema no es fisiológica (37 ± 0.5 °C), ajuste la temperatura del recirculador serpenteante. No se recomienda pasar al paso 6 hasta que la temperatura se haya estabilizado en el valor adecuado.
5. Encienda el monitor de presión (Archivo Suplementario 1, sistema de monitorización) y calibrar en el rango de 0–200 mmHg. La aplicación de monitorización y estimulación está disponible para ayudar a calibrar el sistema (Archivo Suplementario 3 y Archivo Suplementario 11).
   NOTA: Es esencial verificar que no haya pérdida de presión ni burbujas en el sistema. Si el sistema contiene burbujas, bloquee temporalmente la salida inferior del serpentín y abra la válvula superior; esto provocará que la columna se llene, permitiendo que las burbujas se liberen al exterior. No se recomienda continuar con el experimento hasta que se haya verificado esta condición.

5. Sistema óptico¹⁴

1. Monte la cámara CMOS (Figura 1A, 10), la lente ajustable de la cámara (LC) y el sistema de iluminación.
   NOTA: El sistema de iluminación consta de dos LED (Figura 1A, 9), dos lentes de iluminación plano-convexas (LI), un control de iluminación (Figura 1A, 11), una tarjeta de adquisición (Archivo Suplementario 1, sistema de monitoreo) y piezas de soporte diseñadas en 3D (Archivo Suplementario 1).
2. Coloque un objeto de referencia con un volumen de aproximadamente 1.000 mm³ a una distancia de 100–200 mm del objetivo de la cámara (centro de la Figura 1A).
   NOTA: El objeto debe colocarse en la posición del corazón en el sistema Langendorff. Esta posición puede observarse en la Figura 1B, específicamente en el centro de la imagen donde inciden los haces de luz.
3. Inicie el software de adquisición de la cámara, luego configure la cámara con una submuestreo de 4x (4 píxeles = 1 subpíxel). Establezca una región de interés (ROI) de 200 x 200 subpíxeles (Archivo Suplementario 2).
   NOTA: Con esta configuración, es posible alcanzar una resolución temporal de 750 cuadros por segundo (fps).
4. Encienda el sistema de iluminación (Archivo Suplementario 1), ajuste los haces de luz para enfocarlos en el objeto de referencia y logre una iluminación homogénea (Figura 1B).
5. Ajuste la intensidad de la luz sobre el objeto de referencia para evitar la sobreexposición de la imagen.
   NOTA: La imagen debe parecerse a la Figura 2A (o a la Figura 1C, PC del controlador). Las reflexiones sobre la superficie del objeto (corazón) deben reducirse lo más posible sin perder la definición de su contorno. Esto puede lograrse ajustando la potencia del control de iluminación o reduciendo el tiempo de exposición en la configuración de la cámara.
6. Enfoque el objetivo de la cámara para obtener una imagen nítida del objeto de referencia (Figura 1C, PC del controlador). Asegúrese de que el objeto de referencia ocupe el 80 % del campo de visión (Figura 2A) para obtener una escala de conversión de aproximadamente 61 µm por subpíxel.
   NOTA: El sistema óptico activa automáticamente el sistema de iluminación cuando la cámara se configura en modo de adquisición (Figura 1A y Archivo Suplementario 2). Se recomienda mantener la cámara en modo de espera para que el sistema de iluminación permanezca apagado, activándose únicamente durante los periodos de recopilación de datos experimentales, con el fin de evitar el sobrecalentamiento.

6. Procedimientos quirúrgicos y de canulación

1. Heparinización y anestesia
   1. Preparar una mezcla anestésica que contenga tiletamina-zolazepam (40 mg/kg de peso corporal del ratón) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal del ratón), luego diluir a 200 µL con solución salina.
   2. Administrar la mezcla anestésica por vía intraperitoneal usando una aguja de 27 G. Permitir que el ratón entre en anestesia profunda.
      NOTA: Verificar la ausencia de reflejo en respuesta a un estímulo en las extremidades o en la cola (por lo general, 10 min son suficientes).
   3. Administrar 200 UI de heparina no fraccionada por vía intraperitoneal usando una aguja de calibre 27 G y esperar aproximadamente 5 min antes de continuar con el experimento.
2. Extracción y canulación
   1. Colocar al ratón en posición supina, retirar el vello y la piel del área torácica con tijeras quirúrgicas.
   2. Realizar una incisión abdominal por debajo del diafragma, asegurándose de mantener su integridad.
   3. Continuar con una incisión transversal en el diafragma y realizar rápidamente una toracotomía bilateral ascendente a través de las costillas, luego retirar la pared costal.
      NOTA: Tener cuidado de no dañar el corazón. Si el corazón se ve comprometido o dañado durante el procedimiento, se recomienda no continuar con el experimento.
   4. Sujetar suavemente las estructuras superiores del corazón usando pinzas finas, el arco aórtico y los vasos adyacentes. Levantar suavemente para hacer un corte por debajo y hacia arriba, y extraer juntos el corazón y los pulmones.
   5. Transferir rápidamente el corazón a una placa de Petri que contenga 50 mL de solución de Tyrode a 4 °C para un lavado inicial.
      NOTA: A partir del momento en que se realiza la incisión en el diafragma, el animal comenzará a experimentar dificultad respiratoria; a partir de este punto, existe una ventana de 60 s para realizar los pasos 6.2.3–6.2.6. Superar este límite de tiempo puede inducir daño isquémico.
   6. Retirar los pulmones y el tejido adiposo excesivo para exponer el arco aórtico usando un microscopio estereoscópico y tijeras finas.
      NOTA: Durante la limpieza del tejido, asegurarse de no dañar el arco aórtico. Si la aorta se corta por debajo de la arteria braquiocefálica, la canulación será difícil y podría provocar fugas de presión.
   7. Transferir el corazón a la base de canulación personalizada que contiene 50 mL de tampón de Tyrode a 4 °C e insertar el extremo aórtico en la cánula fabricada a partir de una aguja de 20 G (Archivo Suplementario 1).
      NOTA: Tener cuidado de no dañar la válvula aórtica. Si la válvula se ve comprometida, el corazón se hinchará y la circulación coronaria no se lavará adecuadamente.
   8. Amar dos nudos de canulación usando sutura de seda 4/0: el primero en la hendidura distal a la punta de la cánula y el segundo antes del tronco braquiocefálico (Archivo Suplementario 1).
   9. Aplicar lentamente solución de Tyrode usando una jeringa de 1 mL llena con tampón a temperatura ambiente. Verificar que el tejido coronario se aclare para confirmar una buena canulación.
   10. Retirar el tejido adiposo para permitir el acceso a los ventrículos y las aurículas.
       NOTA: Evitar superar los 5 min de canulación para preservar la viabilidad del corazón.
   11. Transferir el corazón al sistema Langendorff y permitir que se estabilice durante 30 min.
       NOTA: El corazón se coloca en el centro del sistema (Figura 1A,B), suspendido verticalmente. Al colgar el corazón, tomar extrema precaución para evitar la formación de burbujas de aire. Si esto ocurre, la presión aumentará por encima de 140 mmHg, el corazón comenzará a hincharse y ya no será viable.
       NOTA: El montaje Langendorff se considera completo cuando el corazón muestra una respuesta mecánicamente estable, una frecuencia de oscilación natural de aproximadamente 360 latidos por minuto (BPM) y una presión de perfusión entre 60 y 110 mmHg.

7. Protocolo de estimulación y grabación de video

1. Viabilidad cardíaca
   1. Verifique que la presión coronaria esté en el rango de 60–110 mmHg con una bomba de perfusión de 3 mL/min. Si la presión de perfusión coronaria desciende por debajo de 60 mmHg, aumente ligeramente la velocidad de flujo de la bomba de perfusión (una presión baja hará que el corazón se vuelva pálido y flácido). Por el contrario, si la presión supera los 110 mmHg, disminuya ligeramente la velocidad de flujo de la bomba (una presión excesiva inducirá edema tisular y un aumento progresivo de la presión hasta que ocurra un paro cardíaco).}
      NOTA: Mantener la presión de perfusión fuera del rango óptimo mencionado anteriormente durante un período prolongado comprometerá irreversiblemente la viabilidad cardíaca.
   2. Coloque el corazón en posición frontal para obtener una vista completa de frente en la cámara. Ajuste la posición de modo que ambas aurículas sean visibles en la cámara (Figura 2A).
   3. Coloque suavemente los electrodos de platino superficialmente en la parte superior de la aurícula derecha, en el nódulo marcapasos. Utilice la imagen de la cámara como guía para colocar los electrodos en el campo de visión. Posicione el electrodo de manera que no obstruya la aurícula derecha. Mientras monitorea la vista en vivo de la cámara, avance lentamente el electrodo hasta que haga contacto con el tejido auricular, teniendo cuidado de no ejercer una compresión excesiva (lo que aplanaría la aurícula derecha en la imagen).
      NOTA: Si se realiza correctamente, la vista de la cámara se parecerá a la Figura 2A.
   4. Inicie la aplicación de monitoreo y marcapasos (Archivo Suplementario 11) y encienda la tarjeta de adquisición (Figura 1A (6)). Establezca los valores de los parámetros del estímulo: amplitud de 2 V, frecuencia de 420, 540 y 720 pulsos por minuto (PPM) con un pulso cuadrado de ciclo de trabajo de 7 ms (inseto de Figura 2A).
   5. Aplique las estimulaciones de viabilidad comenzando con la frecuencia más baja, utilizando una duración de estimulación de 20 s seguida de un período de recuperación de 20 s (tiempo de reposo) entre eventos.
      NOTA: Evalúe la viabilidad cardíaca mediante el monitoreo con la cámara. Si el órgano es funcional fisiológicamente, se observará una sincronización entre el estímulo aplicado y la respuesta cardíaca, acompañada de una adecuada coordinación entre las cámaras del corazón. Por el contrario, la falta de viabilidad se manifestará por una pérdida de coordinación entre las cámaras o por la presencia exclusiva de contracciones auriculares aisladas.
   6. Cierre la puerta de la cámara porque el experimento es sensible a la luz ambiental y a las fluctuaciones térmicas (Figura 1C).
      NOTA: La puerta de la cámara debe permanecer cerrada durante el tiempo del experimento. Monitoree la viabilidad cardíaca con la cámara y la presión de perfusión.
2. Grabación de datos
   1. Aplique el protocolo de estimulación, que consiste en trenes de pulsos cuadrados de 30 s de duración, seguidos por 30 s sin señal. Establezca los valores de los parámetros del estímulo en cada tren de estimulación: amplitud de 2 V, ciclo de trabajo de 7 ms y frecuencia en el rango de 360 a 720 PPM.
      NOTA: El protocolo de estimulación comienza a 360 PPM y aumenta en 60 PPM en cada punto de tiempo (inseto de Figura 2A).
   2. Grabe continuamente videos de la dinámica de la vista frontal del corazón en formato .avi utilizando el software de adquisición de cámara (Archivo Suplementario 2). Realice una grabación de video de 20 s para cada tren de estimulación. Grabe el segmento de 20 s comenzando 5 s después de iniciar la estimulación. Se proporciona una grabación cruda representativa en Película Suplementaria 1.
      NOTA: Un ordenador graba simultáneamente el tren de estimulación aplicado (.xls, Archivo Suplementario 9) para cada video grabado (.avi), generados por la aplicación de monitoreo y marcapasos y el software de adquisición de cámara, respectivamente (Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3).
   3. Verifique la viabilidad cardíaca comparando el primer video, grabado antes de iniciar el protocolo de estimulación, con el segundo video, grabado después de aplicar el protocolo (Figura 2B).

8. Limpieza del sistema de perfusión Langendorff tras el experimento

1. Retire el estímulo y los electrodos de platino del ECG. Retire el corazón del sistema y drene todas las soluciones residuales de Tyrode.
2. Apague el sistema óptico y cierre la válvula de O₂.
3. Lave el sistema con 1 L de agua desionizada a 37 °C, y drene el sistema.
4. Repita los pasos 2.4 y 2.5.
5. Apague todos los sistemas y equipos.

9. Procesamiento de video

1. Comience por importar cada video en un software computacional y aplicar una función de normalización de video¹⁵.
2. Seleccione una región de interés (ROI) que incluya el área del corazón. Realice una segmentación de imagen para eliminar el ruido de fondo, los electrodos y la cánula (Archivo Suplementario 4).
   NOTA: Para seleccionar correctamente el área de imagen que se eliminará, consulte el Archivo Suplementario 10.
3. Realice un análisis global de la dinámica mecánica (Archivo Suplementario 5). En la Figura Suplementaria S1, Figura Suplementaria S2 y Figura Suplementaria S3 se muestran ejemplos de variabilidad y señales de apoyo.
   1. Aplique operadores morfológicos a cada cuadro del video para detectar el perímetro del corazón, luego aplique un algoritmo de relleno de cuadro para generar una máscara¹⁵.
   2. Cuente los píxeles dentro del área segmentada en cada cuadro, luego normalice este valor respecto al número total de píxeles en la imagen para producir una señal dinámica (inset en Figura 2B y Figura Suplementaria S3).
   3. Aplique un filtro Butterworth bidireccional de quinto orden entre 3 y 100 Hz a la señal obtenida para suprimir el ruido de alta frecuencia y los artefactos por goteo de la perfusión¹⁵.
   4. Normalice las señales en todos los videos utilizando los valores máximos y mínimos registrados.
   5. Determine la frecuencia cardíaca calculando el intervalo entre dos valores de amplitud máxima (IAA (s)) para cada señal dinámica y de estímulo.
   6. Obtenga la frecuencia en latidos por minuto (BPM) con la siguiente fórmula:
      
   7. Genere mapas de Poincaré a partir de los datos de IAA para ilustrar la variabilidad en períodos cortos y largos^16,17,18 (Figura Suplementaria S1 y Figura Suplementaria S2).
      NOTA: Para obtener información más detallada, consulte el Archivo Suplementario 10.
4. Realice un análisis segmental de la dinámica mecánica ventricular (Archivo Suplementario 6).
   1. Aplique binarización de imagen. Utilice operadores morfológicos para delimitar el área ventricular, ajustándola a una geometría elíptica sin comprometer la ROI¹⁵.
   2. Ajuste una elipse mínima al área ventricular en cada cuadro. Extraiga las coordenadas de un conjunto de puntos distales en un cuadro. Utilice un conjunto de 10–20 puntos en cada extremo a lo largo del eje Y (Figura 3A). En el Vídeo Suplementario 2 se proporciona un ejemplo representativo de la salida de estimación de elipse.
   3. Calcule el acortamiento ventricular como la distancia media entre los puntos extremos a lo largo del eje Y en cada video¹⁹.
   4. Aplique un filtro Butterworth bidireccional de quinto orden entre 3 y 100 Hz a la señal obtenida para suprimir el ruido de alta frecuencia y los artefactos por goteo de la perfusión¹⁵.
   5. Normalice la señal de acortamiento ventricular respecto a todos los videos obtenidos para cada ritmo, y calcule la frecuencia cardíaca y el retardo como en los pasos 9.3.5–9.3.6.
      NOTA: Se obtienen parámetros como la duración del ciclo ventricular (DVE), la duración de la relajación (DVW), el intervalo interventricular (IVV) y la amplitud ventricular (VA) (Figura 3A).
      NOTA: Para obtener información más detallada, consulte el Archivo Suplementario 10.
5. Realice un análisis segmental de la dinámica mecánica de las aurículas (Archivo Suplementario 7).
   1. Utilice dos ROI para delimitar las aurículas (Figura 3C).
   2. Analice cada aurícula individualmente.
      1. Utilice operadores morfológicos para delinear las aurículas ajustándolas sin comprometer la ROI¹⁵. Aplique un algoritmo de aumento de contraste para delimitar cada aurícula^20,21.
      2. Aplique binarización de imagen y cuantifique el número de píxeles distintos de cero por cuadro para obtener una señal dinámica auricular.
      3. Aplique un filtro Butterworth bidireccional de quinto orden entre 3 y 100 Hz a las señales obtenidas para suprimir el ruido de alta frecuencia y los artefactos por goteo de la perfusión¹⁵.
      4. Calcule el promedio de las dos señales auriculares (Figura 3D).
   3. Normalice la señal de acortamiento auricular respecto a todos los videos obtenidos para cada ritmo y calcule la frecuencia cardíaca y el retardo como en los pasos 9.3.5–9.3.6.
      NOTA: Se obtienen parámetros como la duración del ciclo auricular (DAE), el intervalo aurículo-auricular (IAT) y la amplitud auricular (AA) (Figura 3D). Para obtener información más detallada, consulte el Archivo Suplementario 10.
6. Realice un análisis electro-mecánico^13,22 (Archivo Suplementario 8).
   1. Compare los datos de estimulación con las señales auriculares y ventriculares (Figura 3D).
   2. Calcule el tiempo de propagación en el sistema de conducción cardíaca, obteniendo el retardo entre los eventos auriculares y ventriculares (AVD), tomando como referencia el estímulo aplicado.

Resultados

Los experimentos de función mecánica cardíaca se realizan utilizando el aparato de Langendorff, como se muestra en la Figura 1A (arriba). Los sistemas de monitoreo y óptico permiten la grabación de video cuando se activa el control de iluminación, como se muestra en la Figura 1A (abajo). La Figura 1C ilustra la vista externa del gabinete con control térmico, diseñado para mantener al corazón aislado de las fluctuaciones térmicas y luminosas del ambiente. Como se representa en la Figura 1B, el corazón aislado se coloca como objeto de referencia en el montaje experimental que comprende los sistemas de Langendorff, óptico y de estimulación.

Como se muestra en Figura 2A, el corazón aislado se colocó para obtener una vista frontal clara de las aurículas y los ventrículos bajo perfusión retrograda. El uso de la base de drenaje (Archivo Suplementario 1, sistema de drenaje) fue esencial para atenuar los artefactos de movimiento generados por el goteo del líquido de perfusión y para estabilizar las señales adquiridas. Los protocolos de estimulación consistieron en trenes de impulsos (2 V, 7 ms) a frecuencias que variaron entre 360 y 720 lpm, cada uno con una duración de 30 s.

El sistema óptico registra los cambios en el área del corazón (HA). Esta señal dinámica también permite obtener el intervalo de tiempo entre picos (IAA) (inseto en Figura 2B). La viabilidad del modelo se evaluó comparando la frecuencia cardíaca promedio antes (Inicio) y después (Fin) del protocolo de estimulación en una cohorte de n = 6 corazones. No hubo diferencias significativas en las frecuencias cardíacas promedio (Inicio: 385 ± 38 BPM frente a Final: 372 ± 18 BPM, estudiante de t-prueba P > 0.05), lo que indica que el procedimiento experimental no afectó la función cardíaca (Figura 2B).

La figura 2C presenta la respuesta de frecuencia del corazón a siete frecuencias de estimulación diferentes, demostrando una clara relación lineal² (R2 = 0,98 ± 0,01, modo 1:1). El valor mínimo de estimulación está limitado por las características fisiológicas del ratón (360 lpm)^22,23. El corazón perfundido mediante el método de Langendorff exhibe un perfil taquicárdico. En los recuadros de la figura 2C se muestran ejemplos de estímulos de estimulación y sus respuestas correspondientes.

Posteriormente, para evaluar la dinámica de las cámaras cardíacas, se implementan técnicas específicas de segmentación. Los parámetros del acortamiento ventricular se obtuvieron a partir de grabaciones ópticas (Figura 3A). El recuadro en la Figura 3A muestra el acortamiento ventricular normalizado. A partir de esta señal dinámica, se obtienen cuatro parámetros: amplitud del acortamiento ventricular (VA), intervalo de tiempo entre contracciones ventriculares (IVV), duración de la contracción ventricular (DVE) y duración de la relajación ventricular (DVW).

Figura 3B muestra la amplitud del acortamiento ventricular para siete valores de estimulación. Las barras azules representan este estudio. Las barras naranjas corresponden a los datos obtenidos con el método de registro auxotónico². Se realizó un análisis estadístico mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Sidak. La amplitud del acortamiento ventricular (VA) para los valores más altos de estimulación, 600 PPM y 660 PPM, aumenta significativamente (P < 0,05*, P < 0,005**), respectivamente. VA (ref. 15 vs. 360 P > 0,05, ref. 15 vs. 420 P > 0,05, ref. 15 vs. 480 P > 0,05, ref. 15 vs. 540 P > 0,05, ref. 15 vs. 600 P < 0,005, ref. 15 vs. 660 P < 0,05, ref. 15 vs. 720 P > 0,05).

Para obtener el área auricular, se implementan técnicas particulares de segmentación (Figura 3C). Se define una ROI en cada aurícula. Figura 3D muestra la señal promedio auricular y el acortamiento ventricular. A partir de esta señal dinámica, se obtienen dos parámetros: la amplitud auricular (AA) y el intervalo de tiempo entre las contracciones auriculares (IAT). Al comparar las señales ventriculares y auriculares, se obtiene el retardo entre los eventos auriculares y ventriculares (AVD).

Figura 1. Configuración experimental del corazón aislado Langendorff y del sistema óptico montado en un gabinete. (A) Diagrama esquemático del sistema de perfusión Langendorff en retrogrado con flujo constante acoplado a un sistema óptico. El sistema Langendorff (arriba) incluye: (1) un depósito que contiene solución de Tyrode continuamente oxigenada. La temperatura del perfusado se mantiene a 37 °C mediante (2) un baño térmico y (5) un recirculador serpentino. (3) Una bomba de perfusión peristáltica asegura un flujo constante de 3 mL/min. (8) Un sistema de drenaje elimina la solución. (4) La bobina de enfriamiento sirve como intercambiador de calor y como trampa de burbujas. El monitoreo de la presión y las aplicaciones de estimulación eléctrica son controlados por (6) el sistema de monitoreo. El sistema óptico (abajo) incluye la sincronización entre (11) el control de iluminación, (10) la cámara de alta velocidad con lente telecéntrica y dos fuentes de luz (LED). El objetivo de la cámara permite enfocar manualmente en un rango de 100–200 mm. (9) Dos LED, acoplados con una lente plano-convexa (LI), iluminan homogéneamente el corazón. Los datos de estimulación se registran utilizando la aplicación de monitoreo y estimulación (Archivo Suplementario 11). (7) La PC controladora está conectada a la cámara y a la aplicación de monitoreo y estimulación para registrar simultáneamente los datos (vídeo y estimulación eléctrica). (B) Vista interior del gabinete. Se muestra la posición vertical del corazón mediante un objeto de referencia. Se muestran otros elementos del aparato Langendorff. (C) Vista exterior del gabinete. El gabinete está aislado térmicamente, y las paredes interior y exterior negras minimizan los reflejos y la luz ambiental. Se muestra la computadora que ejecuta las aplicaciones de monitoreo y adquisición de vídeo. Abreviaturas: LC = lente telecéntrica; LEDs = diodos emisores de luz; LI = lente de iluminación; PC = computadora personal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Validación del corazón de ratón montado y del sistema óptico (A) Vista frontal del corazón que muestra las aurículas, los ventrículos, los electrodos de estimulación y los electrodos de ECG. La imagen corresponde a un fotograma con estimulación a 420 lpm (Película suplementaria 1). El recuadro muestra el estímulo de marcapasos aplicado. El video se adquirió entre los 5 y los 25 s del protocolo de estimulación. (B) Prueba de viabilidad cardíaca. Se graban dos videos para obtener la frecuencia de oscilación, uno antes y otro después de aplicar el protocolo de estimulación. Se calcula la frecuencia de respuesta. t de Student t-se aplicó la prueba (P > 0,05). La diferencia entre los grupos no es significativa. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar (n = 6). El recuadro muestra el área cardíaca (AC) obtenida del paso 9.3 del protocolo y la estimulación aplicada. (C) Respuesta de la frecuencia cardíaca al estímulo aplicado. Las barras azules indican la respuesta cardíaca a siete valores de estimulación (R2 = 0,98 ± 0.01). Las barras naranjas corresponden a los datos reportados por Peña-Romo². El recuadro muestra trazas de respuesta típicas. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Sidak. La diferencia entre los grupos no es significativa (P > 0,05). Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar (n = 6). Abreviaturas: ANOVA = análisis de varianza; BPM = latidos por minuto; ECG = electrocardiograma; HA = área cardíaca; PPM = pulsos por minuto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Análisis de la respuesta mecánica auricular y ventricular. (A) Acortamiento ventricular. La imagen corresponde a un cuadro con estimulación a 420 lpm (Película Suplementaria 1). Una elipse roja permite la estimación del acortamiento ventricular (AV) (Película Suplementaria 2). El acortamiento ventricular se calcula promediando los valores máximos y mínimos a lo largo de un conjunto de 10–20 líneas sobre el eje mayor (NV; líneas naranjas). En el recuadro se muestra el acortamiento ventricular normalizado. Se pueden obtener varios parámetros: duración del acortamiento ventricular (DVE), duración de la relajación ventricular (DVW), intervalo de tiempo entre contracciones ventriculares (IVV) y amplitud del acortamiento ventricular (VA). (B) Se muestra la amplitud de la respuesta cardíaca, VA en función de la frecuencia de estimulación. Las barras azules representan este estudio. Las barras naranjas corresponden a datos obtenidos con el método de registro auxotónico². Se aplicó análisis estadístico mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Sidak. La amplitud del acortamiento ventricular (VA) aumenta significativamente para valores más altos de frecuencia de estimulación, 600 PPM y 660 PPM (P < 0,05*, P < 0,005**), respectivamente. VA (ref. 15 vs. 360 P > 0,05, ref. 15 vs. 420 P > 0,05, ref. 15 vs. 480 P > 0,05, ref. 15 vs. 540 P > 0,05, ref. 15 vs. 600 P < 0,005, ref. 15 vs. 660 P < 0,05, ref. 15 vs. 720 P > 0,05). Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar (n = 6). (C) Segmentación auricular. La imagen corresponde a un cuadro con estimulación a 420 lpm (Película Suplementaria 1). La imagen ilustra las regiones de interés aplicadas a la aurícula derecha (círculo amarillo) y a la aurícula izquierda (círculo azul). La señal mecánica auricular se obtiene promediando ambas ROI. (D) Dinámica auricular y ventricular. Se muestran el área auricular promediada (línea negra), el acortamiento ventricular (línea azul) normalizado y la estimulación (línea roja) a 420 lpm. Se pueden obtener varios parámetros: intervalo de tiempo entre contracciones auriculares (IAT), amplitud auricular promedio (AA) y retardo aurículo-ventricular (AVD). Abreviaturas: AA = amplitud auricular; ANOVA = análisis de varianza; AVD = retardo aurículo-ventricular; DVE = duración del acortamiento ventricular; DVW = duración de la relajación ventricular; IAT = intervalo aurículo-auricular; IVV = intervalo interventricular; NV = número de líneas ventriculares; PPM = pulsos por minuto; ROI = región de interés; VA = amplitud del acortamiento ventricular; VS = acortamiento ventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película suplementaria 1. Vídeo bajo estimulación de 420 PPM. Grabación de un corazón de ratón aislado capturada con una resolución espacial de 200 x 200 subpíxeles y una resolución temporal de 750 fps. Abreviaturas: fps = cuadros por segundo; PPM = pulsos por minuto.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 2. Vídeo representativo de la estimación de la elipse para el acortamiento ventricular. Demostración del algoritmo de segmentación utilizando la grabación de la Película suplementaria 1, remuestreada a 75 fps. Abreviatura: fps = cuadros por segundo.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S1. Análisis de la variabilidad de los intervalos del área cardíaca. (A) Estado basal sin estimulación, (B) 360 PPM, (C) 420 PPM y (D) 480 PPM. La variabilidad a corto y largo plazo se calculó como la dispersión relativa respecto a la media de los datos, como muestra la elipse roja. Abreviaturas: IAA = intervalo del área cardíaca; PPM = pulsos por minuto; SD1 = variabilidad a corto plazo; SD2 = variabilidad a largo plazo.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2. Análisis de la variabilidad de los intervalos del área cardíaca. (A) 540 PPM, (B) 600 PPM, (C) 660 PPM y (D) 720 PPM. La variabilidad a corto y largo plazo se calculó como la dispersión respecto a la media de los datos, indicada por la elipse roja. Abreviaturas: IAA = intervalo del área cardíaca; PPM = pulsos por minuto; SD1 = variabilidad a corto plazo; SD2 = variabilidad a largo plazo.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3. Gráfico temporal de las señales normalizadas obtenidas a partir de la dinámica contráctil. El estímulo aplicado fue de 420 PPM (rojo), y las respuestas incluyen el área cardíaca global (negro), el acortamiento ventricular (azul) y la dinámica del área auricular (amarillo). Abreviatura: PPM = pulsos por minuto.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivos suplementarios 1–11. Algoritmos y documentación técnica. Carpeta comprimida que contiene: 1) Imágenes y especificaciones de las piezas impresas en 3D. 2) Guías detalladas para el software de adquisición de imágenes con la cámara. 3) Guías detalladas para las aplicaciones de monitoreo y estimulación. 4) Programa computacional para la normalización y segmentación de videos (pasos 9.1–9.2). 5) Programa computacional para calcular la mecánica global del corazón (paso 9.3). 6) Programa computacional para el cálculo segmentado de la mecánica ventricular (paso 9.4). 7) Programa computacional para la segmentación de la mecánica de las aurículas (paso 9.5). 8) Programa computacional para calcular el retardo auriculoventricular (paso 9.6). 9) Estimulación eléctrica aplicada al Archivo suplementario 1. 10) Guía detallada sobre el funcionamiento de los programas computacionales (Archivos 4–7). 11) La aplicación de monitoreo y estimulación. Además, hay cinco funciones externas (AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare) que son necesarias para el funcionamiento de los programas computacionales.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El corazón de ratón es muy sensible a las variaciones de temperatura^2,9,10,11,22. En este experimento, el corazón perfundido se colocó verticalmente. Se incluyó una ligera modificación para minimizar la pérdida de temperatura del perfusato y los artefactos de movimiento en el método de perfusión Langendorff. Se añadió una bomba de recirculación al serpentín para minimizar la pérdida de temperatura del perfusato a 37 ± 0,5 °C, y se incorporó una base de drenaje para reducir los artefactos de movimiento. Además, se utilizó un gabinete térmicamente aislado equipado con un sistema óptico y dos fuentes de luz LED de intensidad ajustable, colocadas bilateralmente para irradiar uniformemente el tejido cardíaco, como se muestra en Figura 1.

Para investigar la viabilidad del montaje experimental, se realizó un conjunto de experimentos para rastrear los cambios en el área cardíaca bajo diferentes condiciones de estimulación. Se obtuvo un rango de sincronización entre la frecuencia de estimulación y la respuesta cardíaca, consistente con la región de sincronización reportada por Peña-Romo², quien utilizó el método de registro auxotónico⁸. Podemos concluir que el montaje experimental óptico es suficiente para apoyar estudios experimentales posteriores sobre el acortamiento ventricular (Figura 2).

Se investigó además si las señales de acortamiento ventricular y dinámica del área auricular permiten el análisis del acoplamiento electromecánico del corazón. Las señales ventriculares y auriculares permiten determinar la duración del retardo en la contracción auriculoventricular (AVD). A una frecuencia de estimulación de 420 PPM, se obtuvo un valor de 53 ± 14 ms (media ± DE). Este resultado concuerda con los de VanderBrink²⁴, quien informa un intervalo PR de 44 ± 6 ms medido mediante un electrocardiograma (ECG).

Este método también tiene algunas limitaciones; la inexactitud en el retardo auriculoventricular en comparación con las técnicas de ECG y en la amplitud ventricular en comparación con los resultados obtenidos mediante el método de registro auxotónico, como se muestra en Figura 3B, podría deberse a artefactos externos de movimiento.

Este método contribuye a evaluar la contractilidad y la frecuencia cardíaca sin influencias farmacológicas ni sistémicas en un corazón aislado intacto. Estos resultados demuestran que el sistema óptico permite la medición de las respuestas de acortamiento ventricular y auricular del corazón, destacando su utilidad para estudios de arritmias que comprometen la coordinación auriculoventricular o para la evaluación de efectos farmacológicos.

Este método también tiene algunas limitaciones. En primer lugar, debido a que es una aproximación bidimensional, no es posible medir la fuerza de contracción como en el método auxotónico. Este método también es beneficioso para reducir los artefactos de movimiento provenientes de gotas de solución y para controlar la temperatura de la solución. En segundo lugar, las diferencias sexuales en modelos de ratón afectan significativamente la validez, la reproducibilidad y la seguridad de la investigación biomédica. Históricamente, los investigadores prefirieron fuertemente utilizar ratones macho para evitar la variabilidad en los datos causada por los ciclos estrales femeninos, una premisa que posteriormente se ha demostrado ampliamente incorrecta^25,26. Dependiendo del tipo de estudio, este protocolo puede aplicarse a investigaciones que involucren ratones macho o hembra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 mL	BD Plastipak	302485	Procedimiento quirúrgico
Aguja 20 G	NIPRO	AH-2032	Cánula aórtica
Lente ajustable de 25 mm con aumento de 8x-100x	Generic	N/A	Lente de cámara del sistema óptico; citado genéricamente como lente de cámara ajustable
Aguja 27 G	BD PrecisionGlide	302358	Procedimiento quirúrgico
Piezas de soporte personalizadas diseñadas en 3D	CINVESTAV	N/A	Piezas de soporte personalizadas diseñadas en 3D
Sutura de seda 4-0	AMERICAN SUTURE	TGSN0901	Cánula aórtica
Fuente de alimentación de 40 A	STEREN	PRL-25	Fuente de alimentación para LED
Piedra de aire	N/A	N/A	Oxigenación de la solución de Tyrode
CaCl2 (2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Solución de Tyrode
D-Glucosa	J.T. Baker	1916-01	Solución de Tyrode
Bomba de drenaje	CINVESTAV	N/A	Bomba de drenaje personalizada; citada genéricamente como bomba de drenaje
Lente plano-convexo, F = 25,4 mm	THORLABS	LA1951-A	Lente de iluminación del sistema óptico; citado genéricamente como lente de iluminación plano-convexo
Ácido acético glacial	Sigma-Aldrich	695092	Limpieza del sistema Langendorff
Heparina	PiSA	060M91	Anticoagulante
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Solución de Tyrode
LEDs de alta potencia	Luminius	CBT-90-G-L11-C12	Fuente de luz LED
Sistema de iluminación	CINVESTAV	N/A	Sistema de iluminación personalizado; citado genéricamente como sistema de iluminación
KCl	CTR SCIENTIFIC	CTR02196	Solución de Tyrode
Software LabVIEW versión 2018	NATIONAL INSTRUMENTS	N/A	Software utilizado para ejecutar la aplicación de monitoreo y estimulación; citado genéricamente como aplicación de monitoreo y estimulación
Software MATLAB	The MathWorks	N/A	Software computacional para programas de normalización, segmentación y análisis de video; citado genéricamente como software computacional
Oxígeno médico	GRUPO INFRA	N/A	Oxigenación de la solución de Tyrode
MgCl2 (6H2O)	CTR SCIENTIFIC	CTR02104	Solución de Tyrode
Mini-bomba de flujo variable	CONTROL COMPANY	3385	Bomba de perfusión
Kit quirúrgico para ratón	Kent Scientific	INSMOUSEKIT	Procedimiento quirúrgico
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	Solución de Tyrode
NaH2PO4	DEQ	DEQF290400250	Solución de Tyrode
NaOH	CTR SCIENTIFIC	CTR03108	Ajuste de pH
NI USB-6009	NATIONAL INSTRUMENTS	779026-01	Tarjeta de adquisición
Electrodos de platino, diámetro 0,25 mm	Sigma-Aldrich	349402	Electrodos para estimulación eléctrica
Fuente de alimentación (12 V, 30 A)	Karnick	PTA-12V30A	Fuente de alimentación del recirculador
Monitor de presión	CINVESTAV	N/A	Monitor de presión personalizado; citado genéricamente como monitor de presión
Transductor de presión	LA BOUVET	B17295	Monitor de presión del sistema Langendorff
Alcohol etílico puro	Sigma-Aldrich	493511	Etileno para limpieza del sistema
Baño térmico recirculante (LXC)	PolyScience	L113A0412	Recirculador del depósito
Solución salina	PiSA	111848	Solución de cloruro de sodio al 0,9 % (NaCl)
Baño térmico serpentino	CINVESTAV	N/A	Recirculador/baño térmico serpentino personalizado
Stereo microscopio	N/A	N/A	Procedimiento quirúrgico
Iluminación del estereomicroscopio	N/A	N/A	Procedimiento quirúrgico
Software uEye Cockpit	IDS Imaging Development System GmBH	N/A	Software de adquisición de cámara; citado genéricamente como software de adquisición de cámara
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2	IDS	AB00624	Cámara CMOS de alta velocidad; citada genéricamente como cámara CMOS
Xilacina	PiSA	4001211	Anestésico
Zoletil 100	Virbac	83048907	Mezcla anestésica de tiletamina-zolacepam; citada genéricamente como mezcla anestésica