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Artículo de investigación

Liuwei Dihuang Wan inhibe la osteoclastogénesis y la pérdida ósea inducida por ovariotectomía al suprimir la señalización de NF-κB

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DOI:

10.3791/72270

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28 de julio de 2026

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1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio demostró que Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) suprime la diferenciación de osteoclastos y la pérdida ósea inducida por ovariotectomía al inhibir la vía de señalización NF-κB, como se revela a través del análisis LC-MS/MS, la farmacología de redes y la validación in vivo e in vitro.

Resumen

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW), una fórmula clásica de medicina tradicional china, se utiliza ampliamente para tratar diversas enfermedades asociadas a la deficiencia renal y ha demostrado una eficacia clínica satisfactoria en la osteoporosis posmenopáusica (PMOP). Sin embargo, sus mecanismos farmacológicos siguen siendo inciertos. Para abordar esto, primero analizamos los componentes químicos de LWDHW usando LC-MS/MS, que identificaron 1.615 componentes. La farmacología de redes predijo entonces que la inflamación y la vía de señalización NF-κB son posibles mecanismos terapéuticos subyacentes a los efectos de LWDHW sobre el PMOP. Posteriormente, 27 ratones hembras C57BL/6J fueron asignadas aleatoriamente a los grupos Sham, Model y LWDHW. Los ratones de estos dos últimos grupos se sometieron a ovariotomía bilateral (OVX), y los del grupo LWDHW recibieron LWDHW oral a 9,75 g/kg/día durante 8 semanas. Se recogieron muestras de sérum y fémur para el ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA), tomografía microcomputarizada (μCT), examen histológico e inmunohistoquímica (IHC). Los macrófagos primarios derivados de la médula ósea (BMM) fueron tratados con LWDHW y luego sometidos a tinción TRAP y qRT-PCR. En ratones OVX, LWDHW alivió significativamente la pérdida ósea y el deterioro de la microarquitectura ósea, acompañados de niveles reducidos de β-CTX en el suero y disminución de los números de osteoclastos en los tejidos femorales. La tinción con IHC reveló una expresión notablemente menor de TNF-α, IL-1β y p-P65 en tejidos femorales de ratones tratados con LWDHW en comparación con el grupo modelo. In vitro, la tinción TRAP demostró que LWDHW inhibía la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL/M-CSF y regulaba a la baja la expresión de Ctsk, MMP9 y Nfatc1. El análisis Western blot mostró además que los niveles de proteínas de P65, p-P65, IκBα y p-IκBα disminuyeron significativamente en las BMM tras el tratamiento con LWDHW. En conjunto, LWDHW alivia la osteoporosis posmenopáusica, posiblemente suprimiendo la osteoclastogénesis mediada por señalización de NF-κB.

Introducción

La osteoporosis posmenopáusica (PMOP) es una enfermedad metabólica ósea prevalente caracterizada por la pérdida de masa ósea y el deterioro de la microarquitecturaósea 1. Con el envejecimiento creciente de la población, la incidencia creciente de PMOP se ha convertido en un problema global de salud pública que amenaza seriamente la salud de las mujeresposmenopáusicas 2. En China, la prevalencia global de PMOP es de hasta el 32,1%3. Las personas afectadas son más susceptibles a complicaciones graves como dolor crónico de espalda, deformidades en la columna y fracturas porfragilidad 4,5. Actualmente, los medicamentos aprobados por la FDA para la osteoporosis incluyen bisfosfonatos6, hormona paratiroidea67y denosumab8, que se utilizan ampliamente en la práctica clínica. Sin embargo, su aplicación a largo plazo suele estar limitada por diversos efectosadversos 9. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar agentes terapéuticos más seguros y eficaces para el PMOP. Entre las posibles alternativas, las medicinas herbales chinas han recibido cada vez más atención debido a su eficacia reconocida y su perfil de seguridadfavorable.

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) es una fórmula clásica de la medicina tradicional china (MTC), documentada por primera vez en el antiguo texto Clave para la Terapéutica de las Enfermedades Infantiles durante la dinastía Song. Durante miles de años, LWDHW se ha utilizado ampliamente en la práctica clínica para tratar diversas enfermedades atribuidas a la deficiencia renal 11,12,13,14. Según la teoría de la MTC de "gobierna los huesos renales", la pérdida de masa ósea y el deterioro óseo en pacientes con PMOP se deben principalmente a una nutrición insuficiente de la esenciarenal 15. En consecuencia, LWDHW se aplica comúnmente en el manejo clínico de la PMOP y ha demostrado una eficacia terapéutica clara16,17. Sin embargo, aunque estudios en animales y clínicos han revelado que LWDHW ejerce múltiples efectos farmacológicos, incluyendoantioxidativos 18,antiinflamatorios 19 y antifibróticos14, su mecanismo subyacente contra la PMOP sigue siendo en gran medida desconocido.

La homeostasis ósea se basa en el equilibrio entre la reabsorción ósea por osteoclastos y la formación ósea porosteoblastos 20. Este equilibrio se ve alterado porque la diferenciación y actividad osteoclasta se intensifican en condiciones inflamatorias, lo que conduce a una reabsorción óseaacelerada 21. En este proceso, la vía NF-κB actúa como regulador central. Factores inflamatorios como TNF-α e IL-1β pueden inducir la fosforilación y degradación de IκBα, desencadenando la translocación nuclear de p65 fosforilado (p-P65)22. En consecuencia, se activan genes específicos del osteoclasto aguas abajo, incluyendo Ctsk, Mmp9 y Nfatc1, para promover la osteoclastogénesis23,24.

La farmacología de redes es un campo interdisciplinar que integra informática, farmacología y bioinformática25. Presenta ventajas claras al explorar de forma exhaustiva los mecanismos farmacológicos que subyacen a los efectos terapéuticos de las hierbaschinas 26. En el presente estudio, se empleó la farmacología de redes para predecir los posibles procesos biológicos y las vías de señalización implicadas en los efectos antiosteoporóticos de LWDHW. Simultáneamente, los componentes químicos de LWDHW se analizaron utilizando LC-MS/MS. Además, se realizaron validaciones in vivo utilizando un modelo murino OVX y experimentos in vitro con macrófagos primarios derivados de la médula ósea (BMM) para investigar más a fondo el mecanismo farmacológico de LWDHW frente a PMOP. El flujo de trabajo se presenta en la Figura 1.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica China de Zhejiang (IACUC-202402-07).

Preparación y análisis LC-MS/MS de LWDHW

La fórmula de LWDHW consta de seis hierbas chinas: Rehmannia glutinosa (Gaertn.), Cornus officinalis (Sieb.), Paeonia suffruticosa (Andr.), Dioscoreae opposite (Thunb.), Poria cocos (Schw.) y Alisma orientale (Sam.). La información detallada sobre estas hierbas se encuentra en la Tabla 1. Todas las hierbas crudas eran suministradas por el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang (Hangzhou, China) y hervidas en agua purificada con una proporción hierba-agua de 0,1 kg/L. El extracto acuoso resultante fue filtrado y concentrado hasta obtener una solución funcional de 0,5 g/mL para posteriores análisis de LC-MS/MS y experimentos en animales. Además, la solución de trabajo se procesaba en polvo liofilizado para experimentos celulares.

En el análisis LC-MS/MS, las condiciones de cromatografía líquida fueron las siguientes: fase móvil A (acuosa) y fase móvil B (orgánica) consistieron en 0,1% de ácido fórmico en agua y acetonitrilo, respectivamente, para el modo iónico positivo, o 5 mM de formiquio de amonio en agua y acetonitrilo, respectivamente, para el modo iónico negativo. El tiempo de funcionamiento total era de 8 min, con un caudal de 0,3 mL/min, una temperatura de columna de 40 °C y un volumen de inyección de 2 μL. Para espectrometría de masas, los datos se adquirieron en modo MS-ddMS2 completo, con tensiones de pulverización ajustadas a +3,50 kV (positivo) y –2,50 kV (negativo).

Ingredientes bioactivos y objetivos para la predicción de LWDHW

Los nombres individuales de seis hierbas constituyentes se introdujeron en la base de datos del Sistema de Farmacología del Sistema de Medicina Tradicional China (TCMSP) para obtener la lista completa de ingredientes de LWDHW. Posteriormente, se examinaron los ingredientes bioactivos utilizando los parámetros farmacocinéticos de biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y semejanza del fármaco (DL) ≥ 0,18, 27,28,29,30. Las proteínas correspondientes de los ingredientes bioactivos fueron identificadas y enviadas a UniProt para recuperar sus nombres génicos estandarizados, que se definieron como los objetivos génicos finales de LWDHW.

Objetivos superpuestos entre LWDHW y PMOP

Los objetivos génicos asociados con PMOP se recuperaron buscando la palabra clave "osteoporosis postmenopáusica" tanto en las bases de datos GeneCards como en las de DisGeNET el 2 de octubre de 2024. Los objetivos se filtraron usando umbrales de puntuación de >0,1 en DisGeNET y >10 en GeneCards, y se eliminaron entradas duplicadas para obtener un conjunto no redundante de genes relacionados con PMOP. Posteriormente, los objetivos derivados de hierbas de LWDHW y los objetivos asociados al PMOP se importaron a la herramienta online de Venny para generar un diagrama de Venn que representara los objetivos superpuestos entre LWDHW y PMOP.

Ontología génica (GO) y análisis de enriquecimiento de vías de señalización

Los objetivos superpuestos entre LWDHW y PMOP fueron objeto de análisis de enriquecimiento GO utilizando la base de datos DAVID. Los términos GO recuperados se clasificaron en tres categorías, incluyendo componente celular, función molecular y proceso biológico (BP). Tras filtrar FDR < 0,01, los 30 términos principales de BP se listaron en un diagrama de burbujas en orden descendente de enriquecimiento de pliegues.

A continuación, los objetivos superpuestos se introdujeron en las bases de datos de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) y Metascape para el análisis de enriquecimiento de vías de señalización. Las rutas enriquecidas de las bases de datos KEGG y Metascape se clasificaron por el número de objetivos correspondientes en orden descendente, y las 25 rutas principales de cada base de datos se mostraron como gráficos de barras.

Construcción de la red

Las redes "Fórmula-Hierbas-Ingredientes-Objetivos-Enfermedad" y "Vías Objetivos" se construyeron en Cytoscape para visualizar las interrelaciones entre los componentes. Se generó una red de interacción proteína-proteína (PPI) introduciendo los objetivos superpuestos en la base de datos STRING. Los objetivos del núcleo dentro de la red se identificaron mediante cribado basado en características topológicas, incluyendo centralidad de grado (DC), centralidad de intermedio (BC) y centralidad de proximidad (CC).

Agrupación animal, modelo de osteoporosis inducida por OVX e intervención farmacológica

Un total de 27 ratones C57BL/6J (de 2 meses, con un peso de 22 ± 2 g) fueron proporcionados por el Centro de Experimentación con Animales de la Universidad Médica China de Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang). Todos los animales fueron alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF) con un ciclo de 12 horas luz/oscuridad, temperatura ambiente mantenida en 25 °C y humedad entre el 40% y el 60%, con libre acceso a alimento y agua. Tras una semana de alimentación adaptativa, los ratones fueron asignados aleatoriamente a tres grupos (n = 9 por grupo) usando una tabla de números aleatorios: Sham, Model y LWDHW. Los ratones de los grupos Model y LWDHW se sometieron a una ovariotomía bilateral (OVX) para establecer el modelo PMOP, mientras que el grupo Sham se sometió a un procedimiento simulado que implicó la resección de un volumen equivalente de tejido adiposo periovárico. A partir de dos días después de la cirugía, los ratones del grupo LWDHW recibieron diariamente una dosis oral de solución de trabajo LWDHW a una dosis de 9,75 g/kg/día (convertida de la dosis equivalente humana basada en la superficie corporal), mientras que los grupos Model y Sham recibieron un volumen igual de solución salina. Se recogieron muestras biológicas, incluyendo suero y tejidos femorales, 8 semanas después de la administración para su posterior análisis. No se produjeron muertes o mortalidades inesperadas en ninguno de los grupos durante el periodo experimental.

Ensayo inmunoenzimático suero ligado a enzimas (ELISA)

Se recogió sangre total del plexo retroorbitario y centrifugada a 1000 x g durante 15 minutos a 4 °C para obtener suero. Las concentraciones séricas de osteocalcina (OCN) y telopeptídeo β-C-terminal del colágeno tipo I (β-CTX) se midieron utilizando los correspondientes kits ELISA según los protocolos del fabricante.

μCT y análisis biomecánico

Las muestras femorales se escanearon utilizando un equipo de microtomografía computarizada (μCT) de alta resolución a una resolución isotrópica de 10 μm. La microestructura tridimensional (3D) del fémur distal fue reconstruida a partir de las imágenes adquiridas utilizando el software NRecon. Posteriormente, se cuantificaron los siguientes parámetros de microarquitectura ósea, incluyendo la densidad mineral ósea (DMO, g/mm 3), la fracción de volumen ósea (VB/TV, %), grosor trabecular (Tb.Th, mm) y el número trabecular (Tb.N, 1/mm), dentro de la región de interés (ROI) del fémur distal.

Las propiedades biomecánicas de las muestras femorales (n = 3 por grupo) se evaluaron mediante una prueba de flexión en tres puntos utilizando un Sistema de Prueba de Fatiga por Torsión Axial. Se aplicaba una carga de compresión a la diáfisis media a una tasa de desplazamiento constante de 2 mm/min hasta la falla estructural. La carga máxima (N) era registrada automáticamente por el software del sistema.

Coloración de histomorfología, inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF)

Tras la fijación con paraformaldehído al 4%, la descalcificación en solución de EDTA al 14% y la deshidratación mediante una serie de etanol graduado, las muestras femorales se procesaron en secciones de parafina de 3 μm de grosor como se describiópreviamente en 31. Las secciones se tiñeron con hematoxilina azul alciano (ABH)/Orange G para evaluación morfológica. Se realizó un análisis cuantitativo de la zona del hueso trabecular en la metáfisis distal del fémur utilizando el software OsteoMetrics.

Se fijaron muestras de hígado y riñón, se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Tras la desparafinización rutinaria y la rehidratación, las secciones se teñieron con hematoxilina y eosina. El examen histológico se realizó bajo un microscopio óptico.

Los ensayos IHC y IF se realizaron en secciones embebidas con parafina según procedimientos establecidos. En breve, la extracción de antígenos se realizó incubando secciones en un tampón de citrato de 0,01 M a 60 °C durante 4 horas. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios que incluían ALP (1:300), IL-1β (1:500), TNF-α (1:500) y p-P65 (1:300). Tras la incubación con anticuerpos secundarios correspondientes durante 20 minutos, se sometieron secciones a solución de diaminobenzidina (DAB) y contratinción de hematoxilina para IHC o se coloraron con DAPI para marcaje nuclear en IF. Para la cuantificación positiva por tinción, se capturaron cuatro campos seleccionados aleatoriamente de cada una de las tres secciones de tejido por muestra. En la tinción IHC, la densidad óptica media se definió como la relación entre la densidad óptica integrada (IOD) y el área de cavidad correspondiente, determinada mediante el software Image-Pro Plus. En la tinción con FI, el área positiva de tinción se normalizó al área del campo y se expresó en porcentaje, y la cuantificación se realizó con el mismo software.

Cultivo primario de macrófagos de médula ósea (BMM) y ensayo de recuento celular

Las células de médula ósea fueron eliminadas de los fémures y tibias de ratones C57BL/6 de 2 meses con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La suspensión de celda resultante se filtró a través de un colador de 70 μm y centrifugó a 200 x g durante 5 minutos. El pellet celular fue resuspendido en un medio completo α-MEM que contenía un 10% de suero bovino fetal. Tras 24 horas de incubación a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO₂, se eliminaron las células no adherentes. Para inducir la diferenciación de los macrófagos, se cultivaron células adherentes en un medio que contenía 50 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y 40 ng/mL de RANKL durante 5–7 días hasta que se observaron BMM maduros.

Los BMM se replanchaban en 3 x 104 celdas/pozo en placas de 96 pozos. Tras 24 horas de tratamiento con concentraciones gradientes de LWDHW, se incubaron BMM con una solución de trabajo del Kit de Conteo Celular al 10% (CCK-8) a 37 °C durante 1 hora. La absorbancia de cada pozo se midió a 450 nm usando un lector de microplacas.

Análisis cuantitativo de expresión génica en BMMs primarios

Los BMM se sembraron en recipientes de 6 cm con una densidad de 3 x 106 celdas por plato. Tras el tratamiento con 500 y 1.000 μg/mL de LWDHW durante 24 horas, se extrajo ARN total de los BMM utilizando el Kit de Purificación Rápida de ARN según las instrucciones del fabricante. Tras cuantificación mediante espectrofotometría, 500 ng de ARN total fueron transcritos inversamente en ADNc. La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó utilizando cebadores específicos de genes (Tabla 2), y las condiciones de ciclo de PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s. Los niveles de expresión génica se analizaron utilizando el método 2ΔΔCt , con GAPDH como gen de referencia interno.

Análisis de Western blot en BMMs primarios

Tras ser emplatados en 3 x 106 células por plato en platos de 6 cm, los BMM se trataron con diversas intervenciones y luego se lisaron sobre hielo con el tampón de lisis RIPA. Se recogió y cuantificó la proteína total con un kit de análisis de proteínas BCA. Las muestras de proteína (30 μg por carril) se separaron con SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 12,5% y se transfirieron a membranas PVDF de 0,2 μm. Tras un bloqueo durante 20 minutos, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: P65 (1:1000), p-P65 (1:1000), IκBα (1:1000), p-IκBα (1:1000) y β-actina (1:1000). Al día siguiente, se incubaron membranas con anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron utilizando un Kit de Detección de Quimiluminiscencia ECL y se capturaron con un Sistema Automático de Análisis de Imágenes Quimioluminiscencias.

Tinción por TRAP de tejidos femorales y BMMs

Las secciones de tejido femoral y los BMMs recubiertos en placas de 24 pozos a 1 x 10 célulasde 5 pozos fueron teñidos utilizando un kit de tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) siguiendo el protocolo del fabricante. La superficie del hueso trabecular cubierta de osteoclasto (Oc.S/BS) en secciones tisulares y el área de formación de osteoclastos en cultivos de BMM se cuantificaron utilizando el software Image-Pro Plus.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar. En SPSS se utilizó una ANOVA unidireccional seguida de la prueba de Dunnett. *p < 0,05 y **p < 0,01 se consideraron estadísticamente significativos.

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Resultados

Componentes químicos de LWDHW analizados por LC-MS/MS

El perfil químico de la solución acuosa LWDHW se caracterizó mediante análisis LC-MS/MS. Se identificaron un total de 1615 componentes, de los cuales 968 fueron detectados en modo de ionización positiva y 647 en modo de ionización negativa (Figura 2A). Los detalles de los 10 componentes principales de cada modo de ionización se enumeran en

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Discusión

Con el envejecimiento de la población mundial, el PMOP se ha convertido en un grave problema de salud a nivel mundial, afectando a millones de mujeres cadaaño 36. Dado los efectos secundarios asociados a los actuales fármacos antiosteoporóticos, es imprescindible desarrollar estrategias terapéuticas más seguras y eficaces. LWDHW es una fórmula clásica tonificadora de riñones en la MTC y sirve como medicina alternativa para tratar diversas enfermedades

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Divulgaciones

Todos los autores declaran que no hay intereses financieros o no financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (ZCLQN25H2701).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.01 M citrate bufferSolarbioC1010Para la recuperación de antígenos de secciones femorales para tinción IHC e IF en el Paso 10 del Protocolo
0.2 μm PVDF membranes BioRad1620177Para la electrotransferencia de proteínas de SDS-PAGE a membrana en el Paso 13 del Protocolo
12.5% polyacrylamide gelsEpizyme BiotechPG113Para la separación de proteínas por SDS-PAGE en el Paso 13 del Protocolo
ALP antibody ARIGOARG57422Para detección IHC en secciones femorales en el Paso 10 del Protocolo
Automatic Chemiluminescence Image Analysis System Tanon 5200Para la visualización de bandas de Western blot en el Paso 13 del Protocolo
Axial-Torsion Fatigue Testing System Instronmodel 5569R1412Para pruebas biomecánicas de muestras femorales en el Paso 9 del Protocolo
BCA Protein Assay KitBeyotimeP0010SPara cuantificación de proteínas antes del Western blot en el Paso 13 del Protocolo
CCK-8BeyotimeC0039Para medición de viabilidad celular de BMMs en el Paso 11 del Protocolo
CytoscapeNo aplicableNo aplicableVersión 3.8.0
DAVID databaseNo aplicableNo aplicableVersión 6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
DisGeNET databaseNo aplicableNo aplicablehttps://www.disgenet.org/
ECL Chemiluminescence Detection KitVazymeE411-04Para detección quimioluminiscente de señales de Western blot en el Paso 13 del Protocolo
ELISA kit of OCNMEIMIANMM-0551M1Para medición de niveles de osteocalcina sérica en el Paso 8 del Protocolo
ELISA kit of β-CTXMEIMIANMM-44858M1Para medición de niveles séricos de β-CTX en el Paso 8 del Protocolo
GeneCards databaseNo aplicableNo aplicablehttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830APara amplificación de qRT-PCR en el Paso 12 del Protocolo
High-resolution micro-computed tomography (μCT) equipmentBrukerSkyscan 1176Para imágenes de micro-TC de alta resolución de la microestructura ósea femoral en el Paso 9 del Protocolo
IL-1β antibody BIOSSbs6319RPara detección IHC en secciones femorales en el Paso 10 del Protocolo
IκBαantibodyCST4812Para detección por Western blot en el Paso 13 del Protocolo
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database No aplicableNo aplicablehttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1Para inducir la diferenciación de BMMs en el Paso 11 del Protocolo
Metascape databaseNo aplicableNo aplicablehttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120 Thermo Fisher ScientificBRE725531Para análisis de LC-MS/MS de LWDHW en el Paso 2 del Protocolo
P65 antibodyCST8242Para detección por Western blot en el Paso 13 del Protocolo
p-IκBα antibodyCST2859Para detección por Western blot en el Paso 13 del Protocolo
p-P65 antibodyCST3033SPara detección por Western blot en el Paso 13 del Protocolo
p-P65 antibodySuzhou Ruiying RLP0187Para detección IHC en secciones femorales en el Paso 10 del Protocolo
PrimeScript RT Reagent Kit TakaraRR047APara la transcripción inversa de ARN total en BMMs para el análisis de qRT-PCR en el Paso 12 del Protocolo
QuantStudio 5 systemApplied BiosystemsA28573Para análisis de qRT-PCR de genes marcadores de osteoclastos en el Paso 12 del Protocolo
RANKLAMIZONAAMK1001-S1Para inducir la diferenciación de BMMs en el Paso 11 del Protocolo
RIPA lysis bufferEpizyme BiotechPC101Para extracción de proteínas totales de BMMs en el Paso 13 del Protocolo
RNA-Quick Purification Kit TransGen BiotechER501-01-V2Para extracción de ARN total en BMMs en el Paso 12 del Protocolo
SPSS software IBMversión 26Para análisis estadístico de datos experimentales en el Paso 15 del Protocolo
STRING database No aplicableNo aplicablehttps://string-db.org/
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase (TRAP) staining kitAMIZONAAMK1001-S1Para tinción TRAP para identificar y cuantificar osteoclastos en el Paso 14 del Protocolo
Thermo Vanquish UPLC systemThermo Fisher ScientificTSLC-002Para análisis de LC-MS/MS de LWDHW en el Paso 2 del Protocolo
TNF-αantibodySuzhou Ruiying RLM3472Para detección IHC en secciones femorales en el Paso 10 del Protocolo
Traditional Chinese Medicine System Pharmacology (TCMSP) database No aplicableNo aplicablehttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
UniProt database No aplicableNo aplicablehttps://www.uniprot.org/
UPLC ColumnWatersACQUITY HSS T3Para análisis de LC-MS/MS de LWDHW en el Paso 2 del Protocolo
Venny online tool No aplicableNo aplicablehttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
β-actin antibodyAbcamab8227Para detección por Western blot en el Paso 13 del Protocolo

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