Recogida voluntaria de muestras heces compatibles en ratones mediante un sistema de jaula personalizado

Resumen

Este protocolo describe un sistema de jaulas personalizado para la recogida voluntaria, favorable al bienestar, simultánea e individual de muestras fecales de ratones alojados en grupo.

Resumen

La medición fiable de metabolitos de corticosterona fecal requiere muestras fecales que puedan asignarse a animales individuales y recogerse dentro de un periodo de tiempo definido. Esto es un reto en ratones alojados en grupo, donde las muestras agrupadas en jaulas no permiten asignaciones individuales, y la separación temporal puede interferir con el bienestar animal y los resultados del estudio. El objetivo de este protocolo es presentar un sistema de jaula sencillo y económico que permita la recogida voluntaria, simultánea e individual de muestras fecales de ratones alojados en grupo. El sistema consiste en una jaula doméstica de policarbonato con techo de alambre conectada a tres cajas de recogida individuales. Tras la habituación y el entrenamiento, los ratones entran voluntariamente en las cajas para acceder a una pequeña recompensa alimenticia. Las puertas pueden cerrarse sin necesidad de perseguir, manipular o transferir forzadamente. Los pellets fecales se recogen de cada caja por separado, permitiendo asignar muestras a animales individuales mientras se mantiene una vivienda social fuera del periodo de muestreo. Este protocolo permite muestreo longitudinal no invasivo y es adecuado para estudios que miden metabolitos de corticosterona fecal u otros biomarcadores fecales. El diseño es fácil de construir con material estándar de jaula y vidrio acrílico, puede desmontarse para su limpieza y permite probar varias jaulas en paralelo. Al reducir las alteraciones relacionadas con la manipulación y mejorar la estandarización de la ventana de muestreo, el método proporciona un refinamiento práctico para el monitoreo endocrino en ratones alojados en grupo.

Introducción

Un gran desafío para evaluar las concentraciones plasmáticas de corticosterona es que el propio procedimiento de muestreo puede inducir un aumento agudo de la corticosterona, lo que confunde la medición y puede afectar potencialmente la interpretación de los resultados^{del estudio 1,2,3}. La medición de metabolitos de corticosterona fecal (FCM) proporciona una alternativa no invasiva, ya que las concentraciones de FCM reflejan los niveles circulantes de glucocorticoides varias horas antes del muestreo, dependiendo de la especie, la cepa, el sexo y el tiempo de paso intestinal ^4,5. Sin embargo, el análisis fiable de la MCF en ratones alojados en grupo sigue siendo un reto. Las muestras fecales agrupadas recogidas de la jaula de origen no pueden asignarse a animales individuales y pueden mostrar una alta variabilidad debido a diferencias interindividuales en la secreción de glucocorticoides e incertidumbre en la ventana exacta de muestreo. Separar animales durante períodos prolongados puede interferir con los objetivos del estudio, mientras que la separación a corto plazo para la recogida individual de muestras requiere mucho trabajo, limita el rendimiento y puede inducir estrés².

Para permitir la recogida individual de muestras heces de ratones alojados en grupo con un manejo mínimo, se desarrolló una jaula de recolección fecal hecha a medida (Figura 1A-E). El diseño fue adaptado de una jaula de recolección fecal previamente descrita para ratones^{espinosos 6} y modificado para su uso con ratones de laboratorio. El sistema consiste en una jaula estándar de policarbonato tipo III conectada a tres cajas de recogida individuales, a las que los animales pueden acceder voluntariamente y cerrar mediante puertas correderas. Este sistema permite recoger muestras fecales de ratones individuales sin manipulación directa durante el periodo de muestreo y facilita el muestreo simultáneo de varios animales. Por tanto, la jaula proporciona un enfoque práctico para el muestreo de MCF no invasivo y atribuible individualmente en ratones alojados en grupo.

El siguiente protocolo describe un sistema de muestreo fecal que permite la recogida e identificación de muestras fecales de ratones individuales manteniendo un entorno de alojamiento grupal, utilizando jaulas heces hechas a medida para la toma de muestras sin contacto.

Protocolo

Se consultó al comité responsable de ética animal de la Universidad Médica de Viena antes de realizar el estudio y se informó que no se requería ninguna licencia formal de experimentación con animales; por lo tanto, no hay número de aprobación ni de protocolo disponible. El estudio incluyó únicamente prácticas establecidas de cría y cría, junto con la recogida de muestras fecales no invasivas. No se realizaron procedimientos invasivos. De acuerdo con la Directiva 2010/63/UE, se evaluó que la carga esperada para los animales estaba por debajo del umbral de dolor, sufrimiento, angustia o daño duradero equivalente o superior al causado por la introducción de una aguja, conforme a las buenas prácticas veterinarias. Todos los animales fueron alojados y cuidados según los estándares institucionales de bienestar animal.

1. Construcción de las jaulas (véase la lista de materiales)

1. Corta las piezas 1-4 de metacrilato/vidrio acrílico de 5 mm según las plantillas mostradas en la Figura 2A-C.
   NOTA: Las plantillas con dimensiones exactas pueden imprimirse en formato DIN A3 (Figura Suplementaria 1 y Figura Suplementaria 2).
2. Corta la parte inferior de la jaula de policarbonato tipo II (PTII) como se indica en la Figura 2D. Esta parte servirá más adelante como la tapa superior de las cajas de recogida de heces.
3. Perfora los agujeros y ranuras en la antigua parte inferior de la jaula PTII, como se indica en la Figura 2D.
   NOTA: Las dimensiones exactas se proporcionan en la Figura Suplementaria 3.
4. Perfora agujeros en el lado frontal y el lado corto de la jaula PTIII como se indica en la Figura 2E.
   NOTA: Las dimensiones exactas se proporcionan en la Figura Suplementaria 4.
5. Utiliza la parte 2 como plantilla para marcar los agujeros correspondientes en el lado corto de la jaula PTIII y en el lado largo de la jaula PTII.
6. Perfora los agujeros marcados y fija la jaula PTIII, la jaula PTII y la parte 2 usando los tornillos roscados, como se muestra en la Figura 2F.
7. Inserta la parte 1 como la parte inferior de la jaula PTII. Coloca las partes 4a y 4b de modo que sujeten la parte 1 en su lugar y divide la jaula de muestreo en cajas de recogida separadas. Usa la pistola de pegamento caliente para fijarlos en su sitio.
8. Deslízate las protuberancias inferiores de las partes 4a y 4b en las ranuras de la parte 1. Estas protuberancias forman las patas de las cajas de recogida.
9. Deslicen las protuberancias superiores de las partes 4a y 4b a través de la cubierta superior, la antigua parte inferior de la jaula PTII, para sujetarla en su lugar.
10. Pasa los palillos o varillas de madera por los orificios de las protuberancias, usando una varilla en la parte superior y dos en la parte inferior, para estabilizar y fijar la construcción.
    NOTA: Los materiales de madera solo deben usarse en el vivario si son desechables, ya que no se pueden limpiar. Si no es así, se deben usar varillas de composición alternativa.
11. Cierra los huecos restantes o pequeñas inexactitudes usando una pistola de pegamento caliente. Utiliza las piezas 3a, 3b y 3c (Figura 2B) como puertas correderas entre la jaula de la casa y las cajas de recogida.
    NOTA: Asegúrese de que no queden bordes afilados, residuos de pegamento ni material sobresaliente accesibles para los animales. Los componentes de vidrio acrílico/plexiglás utilizados en este prototipo no son adecuados para la esterilización con autoclave a vapor. Por lo tanto, si el sistema se utiliza en instalaciones SPF que requieren material esterilizado relacionado con jaulas, debe emplearse un procedimiento de desinfección no autoclave aprobado institucionalmente, o los componentes acrílicos deben sustituirse por material autoclavable manteniendo las mismas dimensiones.

2. Preparación y alojamiento de animales

1. Obtén el número requerido de ratones de la(s) cepa(s) adecuada(s) para el estudio.
   NOTA: Los datos representativos se obtuvieron de 30 ratones C57BL/6J de ocho semanas, compuestos por 20 hembras y 10 machos. Los ratones estaban libres de patógenos específicos según los estándares FELASA y fueron obtenidos de Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemania.
2. Animales domésticos en condiciones convencionales en jaulas adaptadas de policarbonato tipo III con un máximo de tres ratones adultos por jaula.
   NOTA: Los machos separados fueron alojados en jaulas estándar de policarbonato tipo II para este estudio.
3. Mantén la sala de animales a 22 ± 2 °C y 55 ± 10% de humedad relativa bajo un ciclo de 12 horas luz/oscuridad con las luces encendidas a las 6:00 a.m.
4. Proporciona una dieta de mantenimiento estándar y agua ad libitum.
5. Añade ropa de cama de madera de álamo, papel higiénico de papel, una casa de plástico transparente roja y papel de cocina como material de anidación en cada jaula.
6. Identifica a los ratones principalmente por las marcas naturales de la cola. Aplicar temporalmente marcas de corral a animales con marcas similares en la cola durante el pesaje, si es necesario.

3. Habituación y adiestramiento de los animales

NOTA: La jaula terminada consiste en una jaula doméstica, PTIII, conectada a una jaula de muestreo con tres cajas de recogida separadas, PTII. Las jaulas domésticas pueden usarse como las jaulas convencionales, con ropa de cama, enriquecimiento de jaula, tapa de alambre sin sujetadores externos y proporcionando comida y agua. El sistema puede desmontarse para lavarse y solo puede usarse durante las semanas de muestreo. Durante semanas sin muestreo, los animales pueden alojarse en jaulas estándar PTIII.

1. Coloca a los animales en el sistema de jaulas al menos dos semanas antes de la primera sesión de muestreo planificada.
2. Acostumbra a los animales a las cajas de recogida retirando las puertas correderas durante una noche, permitiendo que exploren libremente las cajas.
3. Realiza tres sesiones de entrenamiento antes de la primera sesión de muestreo. Realizar entrenamiento bajo las mismas condiciones de luz y a la misma hora del día planificada para una posterior muestreo, idealmente bajo luz roja poco después del inicio de la fase oscura.
4. Aplica una pequeña cantidad de recompensa, como crema de avellana, crema de cacahuete, pasta de malta o algún alimento similar agradable, en la pared opuesta a la entrada de cada caja de recogida.
5. El primer día de entrenamiento, deja las puertas abiertas y permite que los animales descubran y consuman la recompensa voluntariamente.
6. El segundo día de entrenamiento, espera hasta que un animal entre en una caja de recogida y empiece a lamer la recompensa. Cierra cuidadosamente la puerta corredera detrás del animal y suéltala después de 10 minutos.
7. El tercer día de entrenamiento, repite el procedimiento y amplía gradualmente el tiempo que los animales permanecen en las cajas de recogida.
   NOTA: El entrenamiento debe ser tranquilo y constante. Evita perseguir a los animales hasta las cajas, ya que esto puede aumentar el estrés y reducir la participación voluntaria en las sesiones de muestreo posteriores.

4. Recogida de muestras fecales

1. Momento de la recogida de muestras
   1. Planifica el tiempo de muestreo según la cuestión biológica y el retraso esperado entre la excreción plasmática de corticosterona y el metabolito de corticosterona fecal. En ratones, los metabolitos de corticosterona fecal suelen reflejar los niveles circulantes de glucocorticoides aproximadamente 8-10 horas antes de la muestra.
      NOTA: Si el momento preciso es crítico, realice un estudio piloto para determinar el curso temporal de la excreción de la MCF en la cepa, sexo y condiciones experimentales específicas. Este piloto puede combinarse con las sesiones de entrenamiento.
   2. Programa muestreos durante un periodo de alta producción fecal. El muestreo suele ser más eficiente al inicio de la fase oscura y activa.
   3. Realizar todas las sesiones de muestreo a la misma hora del día durante todo el estudio para reducir la variación causada por el ritmo diurno de los niveles de FCM.
      NOTA: En nuestra experiencia, los eventos que ocurren por la mañana alrededor de las 10:00 a.m. se reflejan bien cuando la muestra está programada entre las 6:00 p.m. y las 8:00 p.m., dependiendo del horario de luz de la sala de animales.
2. Procedimiento de muestreo y consejos prácticos
   1. Marca a los animales individualmente antes de tomar muestras. Utiliza marcas de oreja o marcas individuales en la cola.
      NOTA: Las marcas en los dedos y los códigos de color pueden ser difíciles de reconocer dentro de las cajas bajo luz roja.
   2. Prepara las cajas de recogida durante la fase de luz aplicando la recompensa en la pared trasera de cada caja.
      NOTA: Preparar las cajas durante el día mejora la visibilidad para el experimentador y permite a los animales oler la recompensa antes de tomar pruebas.
   3. En la hora prevista de muestreo, abre las cajas de recogida y espera hasta que los animales entren voluntariamente.
   4. Una vez que un ratón haya entrado en una caja de recogida, cierra cuidadosamente la puerta corredera detrás de él.
   5. Después de que todos los animales hayan entrado en una caja, registra la identidad y posición de cada ratón en una hoja de muestreo preparada.
   6. Si se muestrean más de 10 jaulas en una sesión, involucra a un segundo experimentador para apoyar la identificación animal, el manejo de puertas y la documentación.
   7. Mantener los animales en las cajas de recogida durante la duración prevista del muestreo, normalmente de 30 minutos a 2 horas, dependiendo de la producción fecal esperada y el diseño del estudio.
      NOTA: Excluir muestras si no se puede asignar con certeza la identidad individual, si los pellets fecales están contaminados con orina, cama o heces de otro animal, si la duración del muestreo se desvía sustancialmente de la ventana de tiempo planificada, o si la cantidad de material fecal es insuficiente para el análisis de MCF.
      NOTA: El uso de 50 mg es nuestro protocolo estándar, y esta cantidad se ha utilizado en todas las validaciones y en todos los demás artículos ^5,7,8. Normalmente, se puede conseguir fácilmente.
   8. Al final del periodo de muestreo, abre las puertas correderas y permite que los ratones regresen a la jaula de casa.
   9. Cierra las cajas de recogida inmediatamente después de que los ratones se hayan marchado para evitar la reentrada y la contaminación cruzada de muestras.
   10. Retira los pellets fecales de cada caja de recogida usando pinzas largas y transfiere a tubos de recogida etiquetados individualmente.
   11. Almacenar muestras a -20 °C hasta la preparación adicional del ensayo FCM.
       NOTA: Si las cajas están bien cerradas y los ratones no pueden volver a entrar, la recogida de pellets fecales puede posponerse hasta la siguiente fase de luz. Sin embargo, esto debe hacerse de forma consistente dentro de un estudio.
   12. Mantén a los animales en la parte de la jaula de casa (PTIII) hasta el próximo cambio de jaula. Luego se pueden desmontar y lavar en una arandela de jaula normal.

Resultados

Los metabolitos de corticosterona fecal (MCF) se cuantificaron con éxito a partir de muestras recogidas con jaulas de muestreo fecal personalizadas en un estudio longitudinal que comparó ratones criados de forma permanente e intermitente. El análisis representativo de la MCF incluyó 30 animales: grupo de cría permanente, n = 15 animales en 5 jaulas; grupo de cría intermitente, n = 10 animales en 5 jaulas, con 5 machos alojados en solitario excepto en 3 eventos de cría, donde compartían a...

Discusión

Este protocolo describe un sistema de jaulas sencillo para recoger muestras heces asignables individualmente de ratones alojados en grupo. La principal ventaja del método es que combina la atribución individual de muestras con el mantenimiento de aspectos clave de la vivienda social, especialmente el contacto visual y olfativo con compañeros de jaula. Esto es relevante porque la vivienda grupal suele ser necesaria para el bienestar animal y también puede formar parte del diseño experimen...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Broca de 5 mm	Craftomat	22380487	5mm diámetro; Cantidad 1
Brocas de 60 mm	Bosch	32064647	60 mm diámetro; Cantidad 1
Brocas de 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm diámetro; Cantidad 1
Taladradora	Makita	25730054	Taladro manual o de banco estándar; Cantidad 1
Pistola de pegamento caliente	Einhell	29051207	Para ensamblaje de jaula; Cantidad 1
Palillos de pegamento caliente	Einhell	29049664	Compatible con pistola de pegamento caliente; Cantidad 5-10
Jaula Makrolon	Animalab	31200129	Jaula estándar Tipo II; Cantidad 1
Jaula Makrolon	Animalab	31200256	Jaula estándar Tipo III; Cantidad 1
Plexiglás / vidrio acrílico	Bauhaus	29122352	Aprox. 0.25 m² total; 5 mm de grosor; Cantidad  2 hojas DIN A3
Sierra o dispositivo de fresado	Scheppach	32079641	Sierra de cinta pequeña, sierra de calar o fresadora CNC; Cantidad 1
Tornillos roscados	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Cantidad 4
Bastidores de madera	Ikea	903.429.71	Barras de madera redondas; Cantidad 3