Este protocolo describe un modelo de herida excisional en la piel de rata que incorpora una cámara húmeda. El sistema permite la evaluación de formulaciones líquidas tópicas, suspensiones celulares, biomateriales y otros tratamientos para heridas.
Artículo de método
Modelo de herida por escisión en ratas para la investigación de agentes terapéuticos en heridas cutáneas de tamaño crítico
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Resumen
Resumen
Las heridas cutáneas representan un importante desafío mundial para la atención sanitaria, generando una morbilidad considerable y una carga económica significativa. Son esenciales modelos animales fiables y clínicamente relevantes para investigar los mecanismos de reparación tisular y evaluar estrategias terapéuticas emergentes. Sin embargo, los modelos convencionales de heridas excisionales en roedores presentan la limitación de una contracción rápida de la herida debido al panniculus carnosus, lo cual difiere notablemente de la cicatrización en humanos. Esta última ocurre predominantemente mediante la formación de tejido de granulación y la reepitelización. Este estudio describe un modelo de herida excisional en ratas diseñado para limitar la contracción de la herida, a la vez que proporciona un entorno protegido para probar intervenciones terapéuticas sensibles. Se crearon heridas excisionales dorsales de 10 mm de espesor total en ratas Sprague Dawley y se estabilizaron mediante un anillo O de caucho de nitrilo butadieno (NBR) sujeto con puntos separados. Para mantener un ambiente húmedo en la herida, se aplicó un sellado cohesivo Eakin y una lámina adhesiva transparente para formar una cámara adecuada para la administración tópica de células, biomateriales o compuestos farmacéuticos. Se utilizaron capas protectoras adicionales compuestas por un apósito de espuma, cinta adhesiva, un vendaje tubular y un sistema de fijación de doble hombro para evitar que los animales se quitaran el vendaje. La cicatrización de la herida se monitorizó durante 14 días mediante planimetría digital y evaluación histológica con tinción de hematoxilina y eosina. El procedimiento requirió aproximadamente 30 minutos por animal y produjo resultados consistentes en la cicatrización. El anillo O de NBR se utilizó como una férula para limitar la contracción de la herida. La cicatrización ocurrió principalmente mediante la formación de tejido de granulación y la reepitelización. Los apósitos permanecieron intactos hasta siete días sin evidencia de infección. El análisis histológico mostró una reparación tisular activa caracterizada por regeneración epidérmica e infiltración de células inflamatorias. Este modelo proporciona una plataforma para la evaluación preclínica de terapias para heridas y tratamientos regenerativos avanzados.
Introducción
Las heridas cutáneas, incluidas las heridas de difícil curación, afectan a más de 40 millones de pacientes en todo el mundo y representan una carga sustancial para los sistemas de salud, con costos anuales de 22 mil millones de dólares para 2024. Solo en Europa, 4 millones de pacientes sufren heridas de difícil curación cada año, ocupando hasta la mitad de las admisiones agudas disponibles1. A pesar de los avances en la técnica quirúrgica, las prácticas intraoperatorias y la disponibilidad de apósitos avanzados para heridas, algunas heridas son refractarias, y finalmente se desarrollarán complicaciones. Por lo tanto, es esencial desarrollar nuevos enfoques terapéuticos que requieran un modelo experimental en animales de heridas cutáneas para probar una amplia gama de materiales tópicos.
Entre los modelos animales experimentales de heridas cutáneas, la escisión de la piel es la técnica más aplicable para crear un modelo de cicatrización2. Dicho modelo puede ayudar a investigar la hemorragia, las reacciones inflamatorias, la formación de tejido de granulación, la reepitelialización, la angiogénesis y la remodelación del tejido3. Las heridas excisionales se crean principalmente en el dorso del animal mediante la extirpación quirúrgica de un área cutánea definida. La herida debe tener un tamaño crítico para evitar la cicatrización espontánea. Esta herida excisional de tamaño crítico permite un acceso directo para investigar la aplicación tópica de diferentes sustancias químicas, células o biomateriales y su participación en el proceso de cicatrización4,5.
Los roedores y la piel humana comparten similitudes en las fases celulares y moleculares de la cicatrización de heridas, incluyendo hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación. Las ratas y los ratones son las especies más utilizadas en modelos de heridas debido a su disponibilidad, tamaño pequeño, facilidad relativa de manipulación genética y manejo sencillo. Las ratas ofrecen varias ventajas prácticas sobre los ratones, incluyendo un tamaño corporal más grande y una piel más gruesa, compuesta por más capas de queratinocitos que la de los ratones. Las heridas en ratones generalmente sanan en 7 días, mientras que en ratas el proceso de curación puede evaluarse durante aproximadamente 12–14 días6.
Un desafío importante asociado con el uso de roedores con piel suelta es la contracción de la herida3. La piel de los roedores posee una capa de panniculus carnosus, que se contrae tras una lesión para reducir el área expuesta. En contraste, las heridas humanas tienen una capacidad limitada de contracción y dependen de la formación de tejido de granulación y la reepitelialización para su reparación7. Un enfoque para superar las limitaciones de los modelos animales consiste en realizar una fijación física o entablillado de la piel que rodea el área de la herida8. Las cámaras de herida de titanio fueron algunos de los dispositivos desarrollados con éxito para prevenir la contracción de la herida9, pero presentaban desventajas como un alto nivel de estrés en los animales debido al peso de la cámara, una colocación quirúrgica compleja, riesgo de desprendimiento del dispositivo, posibilidad de infección y alto costo. El concepto del modelo de herida entablillada fue introducido por Galiano et al.10 en 2004 mediante la sutura de un anillo rígido de silicona alrededor del borde de la herida. Este enfoque reduce notablemente la contracción de la herida11, pero tiene varias desventajas y limitaciones, centradas principalmente en el riesgo de daño en los tejidos blandos, una alta tasa de desplazamiento del entablillado y una cicatrización inconsistente de la herida. Los entablillados (como los anillos rígidos de silicona) pueden ejercer presión excesiva sobre la piel circundante, provocando isquemia, irritación y necrosis, especialmente si se aplican incorrectamente. Los entablillados de silicona con frecuencia son mutilados, rotos o desprendidos debido al movimiento o aseo del animal8,11. Las suturas desiguales suelen generar una tensión irregular alrededor de la herida, lo que conduce a una cicatrización inconsistente. En el modelo presentado aquí, se coloca un anillo de caucho de nitrilo y butadieno (NBR) en el borde de la herida cutánea mediante 8-12 suturas simples interrumpidas de poliamida distribuidas uniformemente alrededor del anillo. Se espera que este enfoque minimice los riesgos mencionados anteriormente y limite suficientemente la contracción de la herida, permitiendo que esta sane mediante la formación de tejido de granulación y la reepitelialización, de manera similar al proceso de cicatrización de heridas en humanos. Este mecanismo de curación facilitaría la traducción de los hallazgos obtenidos en modelos animales a aplicaciones clínicas.
La teoría de la cicatrización húmeda de heridas fue introducida por George D. Winter en 1962 como un concepto para el diseño de productos para el cuidado de heridas12. Sobre la base de esta teoría, se han desarrollado diversas curas para heridas durante las últimas décadas, como gasas, láminas transparentes, espumas e hidrogeles13. Por otro lado, en 1974 se diseñó y desarrolló un anillo sellador moldeable de barrera de hidrocoloide para ostomía con el fin de prevenir y proteger contra fugas. Estos anillos pueden moldearse y adaptarse fácilmente al contorno de la herida, especialmente en aplicaciones de cuidado de estoma. En este modelo, se aplica un sello cohesivo en el exterior de la herida y, junto con láminas estériles transparentes, crea una cámara húmeda que imita la situación clínica de pacientes con heridas cutáneas en tratamiento, promoviendo la epitelialización de la herida y protegiendo agentes tópicos (por ejemplo, células, biomateriales, compuestos) contra fugas.
El vendaje de heridas es fundamental para proteger el lecho de la herida frente a traumatismos físicos e infecciones microbianas. El vendaje de heridas en ratas siempre ha sido un desafío debido a su baja tolerancia al mismo. Las ratas frecuentemente retiran o destruyen los vendajes mordiéndolos o desgarrándolos apenas recuperan la conciencia tras la anestesia. Esto hace muy difícil la retención de agentes tópicos como células y fármacos, y resulta imposible proteger las heridas frente a patógenos y contaminantes externos. Este es otro reto a abordar en el modelo de roedor, especialmente en estudios que requieren un entorno estéril, como las pruebas con biológicos, la terapia basada en células y los medicamentos avanzados de terapia regenerativa. En el modelo presentado aquí, se utilizó un vendaje de espuma y cinta adhesiva para cubrir la cámara húmeda. Luego, se empleó una venda tubular elástica, una venda de fijación y cinta quirúrgica microporo para aplicar un vendaje cruzado doble en los hombros, con el fin de evitar que las ratas retiraran o dañaran los vendajes.
El modelo descrito aquí combina varios elementos de diferentes protocolos y ha sido desarrollado durante varios años. El objetivo fue establecer un modelo de herida excisional en ratas utilizando una cámara húmeda que sea bien tolerada por el animal y que facilite la evaluación de materiales tópicos sensibles, especialmente en forma líquida.
Protocolo
Todos los procedimientos con animales descritos a continuación fueron aprobados por el Comité Ético de Linköping (Dnr 5163-2023), Suecia. Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Experianimales mentales
- Utilice ratas Sprague Dawley macho adultas de 8 a 14 semanas de edad.
- Antes del experimento, aclimatadas las ratas durante al menos 1 semana en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con una dieta estándar.
2. Preparación prequirúrgica
- Seduce al animal utilizando isoflurano al 1.5%–2.5% (4.5% para la inducción) mezclado con 1,0–1,5 L/min de oxígeno. Coloque al animal en posición prona sobre una almohadilla calefactora para mantenerlo caliente. Aplique un lubricante oftálmico para proteger los ojos y administre 0,05 mg/kg de peso corporal de buprenorfina diluida en solución salina por vía subcutánea en la espalda del animal para aliviar el dolor postoperatorio.
NOTA: Es importante tener una capa delgada de aislamiento desechable entre el animal y la almohadilla.
ADVERTENCIA: El isoflurano es un depresor del sistema nervioso central y un irritante respiratorio. Utilice un vaporizador calibrado con un sistema activo de captación de gases residuales para evitar la exposición al vapor. - Afeite el área dorsal con una máquina eléctrica desde la base del cuello hacia abajo aproximadamente 10 cm. Limpie cuidadosamente el área afeitada dos veces con clorhexidina y etanol al 70%, luego cubra al animal con un campo quirúrgico fenestrado que exponga únicamente el área limpia.
3. Creación de una herida excisional
- Utilice instrumentos quirúrgicos esterilizados adecuados, como tijeras y pinzas.
- Trace un círculo de 10 mm de diámetro usando una plantilla con un marcador quirúrgico permanente, aproximadamente 4 cm caudal a la base del cuello.
- Agarre el centro de la piel marcada con pinzas y extirpe el tejido cutáneo marcado con tijeras. La profundidad de la herida debe llegar hasta la fascia superficial. Esto puede identificarse liberando completamente el grosor de la piel y visualizando la fascia semitransparente que cubre el músculo.
- Aplique una arandela de NBR al borde de la herida cutánea y fíjela en su lugar mediante 8-12 puntos de sutura. El objetivo de la fijación con el anillo es prevenir la contracción de la piel. Asegúrese de que los puntos principales estén en la posición de las 12, seguidos por las 6, las 3 y luego las 9. En el caso de 8 puntos, coloque cada punto en el centro del espacio entre cada par de puntos principales (Figura 1A).
- Aplique un sellador cohesivo en el exterior de la arandela de NBR, aprovechando sus propiedades adhesivas, para formar junto con una lámina transparente estéril y adhesiva una cámara húmeda (Figura 1B). En esta etapa, la herida queda inmovilizada con la arandela de NBR, y las paredes laterales de la cámara de aplicación están formadas por el borde de la piel y el sellador cohesivo; el piso lo constituye la superficie cruda de la herida, mientras que el techo lo forma la lámina transparente.
- Cubra la herida con una capa de la lámina y, posteriormente, administre la solución de tratamiento (solución celular o solución del compuesto) a través de la lámina hasta la superficie de la herida. La cámara del tamaño descrito puede acomodar fácilmente 100 µL.
- Cubra el sitio de inyección con otra capa de la lámina para evitar fugas del tratamiento (Figura 1C).
- Cubra la lámina con un vendaje suave de silicona para protegerla (Figura 1D).
- Aplique cintas adhesivas (Figura 1E), seguidas de un vendaje tubular elástico, en una configuración de doble hombro alrededor de la rata, utilizando vendajes de fijación y cintas quirúrgicas microporo (Figura 1F–H).
- Recorte las uñas de las ratas para evitar que arranquen el vendaje.
- Administre carprofeno (5 mg/kg de peso corporal), diluido en solución salina, por vía subcutánea al animal antes de desconectarlo de la anestesia.
4. Procedimientos postoperatorios
- Mantenga al animal sobre la almohadilla térmica, cubierto con una manta, hasta que despierte de la anestesia. Coloque a los animales en jaulas separadas o en una sola jaula con un divisor para evitar que se muerdan entre sí y se quiten el vendaje.
- Administre carprofeno, 5 mg/kg de peso corporal diluido en solución salina, por vía subcutánea a la mañana siguiente para controlar el dolor posoperatorio. Los ratas deben ser monitoreados diariamente en busca de dolor posoperatorio o pérdida de peso, y se podría administrar una dosis adicional de analgesia si fuera necesario.
5. Mediciones de la herida y cambios de vendaje
- Examine cada animal diariamente durante la primera semana después de la cirugía de la herida. Se debe inspeccionar el vendaje y corregirlo si los animales tienen dificultad para moverse o muestran incomodidad.
- Cambie el vendaje el día 7 mientras el animal está bajo anestesia, como se describe en el paso 2.1.
- Retire suavemente la cubierta del vendaje de la piel. Se toman fotografías de la herida con una regla para establecer la escala. Las imágenes se analizaron utilizando el software Fiji/ImageJ para evaluar el área superficial de la herida.
- Realice mediciones u otros procedimientos según las necesidades del investigador.
- Aplique un vendaje limpio como en los pasos 3.8–3.11 y permita que el animal se recupere como se describe en el paso 4.1.
6. Recolección de heridas y eutanasia
- Aplicar anestesia según se menciona en el punto 2.1 el día 14, o según lo indicado en el plan experimental específico. Retirar el vendaje y tomar fotografías de los sitios de la herida.
- Retirar el vendaje y tomar fotografías de los sitios de la herida.
- Recoger tejido dérmico de la herida. Con un bisturí, extirpar la piel alrededor de la herida, incluyendo algo de tejido sano.
- Colocar la muestra extirpada en un tubo de 2 mL y congelarla rápidamente en nitrógeno líquido para análisis molecular posterior, o almacenarla en formaldehído tamponado al 4 % a temperatura ambiente para histología. Alternativamente, cortar la muestra en dos fragmentos para realizar ambos ensayos.
- Tras la extracción del tejido de la herida, sacrificar al animal mediante inhalación de CO2 o un método alternativo según lo aprobado éticamente.
ADVERTENCIA: El CO2 provoca dolor, malestar y acidificación rápida de las membranas mucosas antes de la inconsciencia. Utilizar un medidor de flujo regulado para desplazar el aire de la cámara.
7. Tinción histoquímica: Fijación de la herida, inclusión y corte histológico
- Fije las biopsías de tejido de la herida en solución de formaldehído al 4% durante 3 h a temperatura ambiente, luego guárdelas a 4 °C durante la noche.
ADVERTENCIA: El formaldehído es tóxico, un potente sensibilizante y un carcinógeno humano conocido. Manipule la solución en una campana extractora de gases utilizando equipo de protección personal. - Lave las biopsías dos veces con PBS durante 30 min cada vez.
- Sustituya el PBS por etanol (70%) y almacene a 4 °C.
- Mantenga las biopsías durante un máximo de 24–48 h antes del procesamiento para evitar la pérdida de antígenos, o durante 1–2 semanas para una caracterización histológica sencilla.
- Lave las biopsías exhaustivamente con agua corriente del grifo para eliminar el formaldehído residual.
- Deshidrate el tejido en baños de etanol en el siguiente orden: etanol al 70% durante 20 min; dos cambios de etanol al 95% durante 20 min cada uno; dos cambios de etanol al 100% durante 20 min cada uno.
- Mantenga las biopsías a 65 °C en el baño de parafina.
- Coloque la parafina fundida en el molde designado, colocando las biopsías en el centro, y deje que se enfríe y solidifique. Las biopsías deben orientarse perpendicularmente a la superficie del molde para permitir la visualización de todas las capas de la piel al realizar los cortes.
- Corte el bloque de tejido embebido en parafina a un grosor de 5 μm con un microtomo y colóquelo sobre un baño de agua a 39 °C que contenga agua desionizada.
- Transfiera los cortes a las laminillas y séquelos, permitiendo que el tejido se adhiera a la superficie de la laminilla. Las laminillas pueden almacenarse a 4 °C para su uso posterior o procesarse inmediatamente para tinción histoquímica.
8. Tinción con hematoxilina y eosina (HE)
- Desparafinar las láminas en placas cálidas a 60 °C durante 30 min, luego en 3 cambios de xileno (o cualquier sustituto) durante 5 min cada uno, seguido de 1 cambio de PBS durante 2 min.
ADVERTENCIA: El xileno es tóxico y altamente inflamable. Manipular la solución en una campana extractora, aplicando las medidas estándar de protección personal. - Realizar la rehidratación en etanol al 100 %, etanol al 96 % y luego en H2O dH durante 5 min cada uno.
- Aplicar la tinción con hematoxilina durante 5 min, luego lavar con agua corriente del grifo durante 5 min.
- Diferenciar con alcohol ácido al 0,3 % (ácido clorhídrico al 0,3 % en etanol al 70 %) durante unos pocos sumergimientos, luego lavar con agua corriente del grifo durante 5 min.
- Tincionar con eosina Y (0,2 %) durante 30 s, luego lavar con agua corriente del grifo durante 5 min.
- Deshidratar en etanol al 96 % durante 1 min, etanol al 100 % durante 1 min.
- Aplicar unas gotas de medio de montaje, luego colocar la cubreobjetos.
- Observar las láminas bajo un microscopio óptico y capturar fotografías digitales.
Resultados
La cirugía del modelo de herida excisional en ratas tomó aproximadamente 30 min por animal cuando se realizó de manera eficiente. Los diferentes pasos de creación del modelo, fijación del aro O y vendaje se muestran en Figura 1.
Figura 2 muestra el progreso de la cicatrización de la herida en los días 7 y 14. El radio de la herida se midió en mm, y el área de la superficie se calculó con la fórmula (área = πr2), donde r = 5 mm en el día 0. La progresión del cierre de la herida se representó como un porcentaje del área no cubierta respecto al área de la herida inducida en el día 14. Mediante el uso del software Fiji/ImageJ, se analizó una imagen digital del área de la herida, calibrando la escala a 10 mm utilizando una regla incluida en la imagen (Figura 2D). Una vez que se delineó y midió el área de la herida, esta se presentó en mm2. El área restante de la herida en el día 14 (29,4% ± 10,1%; n = 7) se presenta en la Figura 3.
La tinción HE de la herida cutánea en el día 14 se presenta en la Figura 4. Las secciones mostraron que las biopsias siguieron la curación natural de las heridas cutáneas, desde la periferia hacia el centro. La cicatrización permaneció incompleta, con el centro desprovisto de la disposición multilamelar clásica normal y con una capa epidérmica delgada. La dermis mostró una abundante infiltración de células inflamatorias, lo cual es importante para el proceso de curación fisiológica. En general, el modelo fue bien tolerado por los animales, con impedimento de la contracción cutánea y una curación incompleta pero fisiológica.
Figura 1: Creación de la herida excisional y procedimiento de vendaje. (A) Herida excisional creada en la superficie dorsal de la rata, con un anillo en forma de O cosido alrededor del margen de la herida. (B) Anillo moldeable de barrera hidrocoloide aplicado alrededor del anillo en forma de O. (C) Dos capas de apósito adhesivo transparente aplicadas sobre el anillo de barrera hidrocoloide. (D) Apósito de espuma colocado sobre el apósito adhesivo transparente. (E) Cinta adhesiva elástica aplicada para asegurar el vendaje. (F–H) Una venda tubular de retención colocada alrededor de la rata, seguida por una venda de fijación y cinta quirúrgica dispuestas en una configuración de doble hombro para asegurar el vendaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de la cicatrización de heridas. (A) Imagen representativa de la herida obtenida el día 7. (B–D) Imágenes representativas de la herida obtenidas el día 14, que muestran la herida con el anillo O colocado (B) y tras la retirada del anillo O (C,D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación del área de la herida al día 14. Porcentaje del área de la herida restante al día 14, que demuestra la reducción del tamaño de la herida. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) (n = 7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación histológica de la cicatrización de heridas al día 14. Secciones representativas teñidas con hematoxilina y eosina (HE) del tejido de la herida a 10×, 20× y 40× de aumento. El centro de la herida mostró una reepitelización incompleta, mientras que los márgenes de la herida presentaron una cicatrización epidérmica fisiológica. La dermis contenía abundantes células inflamatorias compatibles con la respuesta normal de cicatrización de heridas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Las heridas cutáneas de difícil curación son aquellas que no progresan a través de las etapas normales de cicatrización dentro del período esperado y pueden ser consecuencia de procedimientos quirúrgicos, traumatismos y reacciones alérgicas, además de ser secundarias a muchas otras afecciones de salud, como insuficiencia vascular, diabetes y obesidad14. A pesar de la disponibilidad de varias modalidades de manejo, muchos pacientes no logran cicatrizar adecuadamente. La investigación de nuevas vías terapéuticas, como terapias basadas en células, productos químicos, extractos vegetales y compuestos recién descubiertos, es fundamental para identificar estrategias novedosas de tratamiento. El modelo puede aplicarse a una amplia gama de estudios sobre la cicatrización de heridas. El establecimiento de un protocolo estandarizado para probar medicamentos, células y tratamientos biológicos podría facilitar la investigación preclínica sobre la cicatrización de heridas. El modelo de herida excisional y el protocolo descrito aquí abordan las principales limitaciones del modelo de herida cutánea en ratas en la investigación: es decir, la contracción de la piel y el vendaje de la herida.
Las férulas de titanio se utilizan comúnmente para reducir la contracción de la herida en modelos murinos de heridas excisionales; su aplicación no está exenta de limitaciones. La rigidez de la férula altera el entorno mecánico de la herida y del tejido circundante, lo cual puede afectar las respuestas celulares, la inflamación y la remodelación de la matriz. Como resultado, la cicatrización ocurre en condiciones que difieren de las presentes en la piel de roedores no tratada. Aunque limitar la contracción mejora la comparabilidad con el cierre de heridas humanas, las restricciones mecánicas impuestas por la férula también pueden introducir artefactos que influyen en el proceso de cicatrización y que deben tenerse en cuenta al interpretar los hallazgos experimentales15.
Para este propósito, se utilizaron arandelas tóricas de NBR en el modelo para limitar la contracción de la piel y se fijaron al borde original de la herida. Los anillos fueron bien tolerados por los animales y permanecieron fijos durante los 14 días del experimento. Aunque no se observó cualitativamente una contracción apreciable de la herida en ningún animal, el tatuaje del borde de la herida u otros métodos cuantitativos podrían reforzar la evaluación de la contracción de la herida en estudios futuros. Por lo tanto, el tatuaje puede considerarse un paso opcional en este protocolo.
La aplicación de vendajes protege las heridas de la contaminación y la infección, al tiempo que mantiene el tratamiento en el sitio de la lesión, lo cual es crucial para los modelos de cicatrización de heridas cutáneas. Sin embargo, no es raro que algunos animales eliminen diferentes tipos de vendajes. Las ratas frecuentemente asean y manipulan el área de la herida, lo que puede provocar el desplazamiento o la remoción completa del vendaje, a pesar del uso de películas adhesivas o métodos de fijación secundarios. La pérdida de la cobertura del vendaje puede alterar el entorno de la herida, afectar la administración del tratamiento y aumentar la variabilidad entre los animales16. En el modelo presentado aquí, el vendaje permaneció intacto hasta por 7 días, sin que los animales lo retiraran ni lo dañaran. No se observó ningún signo de infección en las heridas cutáneas de los animales experimentales. Es recomendable reemplazar los vendajes semanalmente, ya que el ajuste se vuelve más apretado conforme los animales crecen y ganan peso. Se debe tener cuidado de equilibrar una fijación segura con la movilidad del animal, asegurándose de que el vendaje no quede demasiado suelto y pueda ser retirado por los animales.
El protocolo es flexible y personalizable. Aunque recomendamos la inhalación de isoflurano por su rápida recuperación y alta seguridad, los investigadores pueden utilizar alternativamente anestesia inyectable, como ketamina/xilazina, si no se dispone de un vaporizador de isoflurano. Aunque en este estudio solo se utilizaron ratas macho, el protocolo es igualmente aplicable a ratas hembra.
Recomendamos la administración de buprenorfina como analgésico junto con carprofeno, lo cual potencia el alivio del dolor. La buprenorfina sola también puede proporcionar una analgesia postoperatoria adecuada debido a su duración relativamente prolongada de acción. Este fármaco tiene un efecto mínimo sobre la función inmune, en comparación con otros opioides, lo que representa una ventaja para la cicatrización de heridas de acuerdo con el proceso inflamatorio17. Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos, que suprimen la inflamación y reducen el dolor, deben evitarse cuando se investiga la inflamación. Aunque en este estudio se creó una herida por animal, los investigadores podrían crear heridas adicionales utilizando el mismo protocolo, de acuerdo con su aprobación ética y diseño experimental. Deben considerarse cuidadosamente las consideraciones sobre el bienestar animal y los principios de las 3R. Los investigadores deben cumplir con los principios de las 3R (sustitución, reducción y refinamiento) y respetar el bienestar animal al utilizar modelos animales. Los procedimientos quirúrgicos deben ajustarse a las directrices y seguir estrictamente el protocolo animal aprobado. En este estudio, la cicatrización de heridas se evaluó mediante mediciones del área de la herida y evaluación histológica, siendo la reepitelización un componente de la respuesta de cicatrización. La presencia de las suturas en relación con la fijación del anillo puede interferir con la cicatrización local. El número de suturas debe ser constante entre los animales. La evaluación del área de la herida debe incluir todas las áreas descubiertas, incluyendo los sitios de sutura18. Este modelo puede desarrollarse para incluir diversas condiciones subyacentes asociadas con heridas cutáneas, como isquemia, diabetes y envejecimiento. Las principales limitaciones de este estudio fueron la ausencia de un grupo control sin férula, la falta de evaluación cuantitativa de la contracción de la herida y la escasez de medidas biológicas cuantitativas más allá de la evaluación del área de la herida y la histología descriptiva. Varias dificultades técnicas y problemas durante la solución de inconvenientes fueron evidentes durante el desarrollo de este modelo. El ajuste adecuado del vendaje protector es esencial para el bienestar animal y una cicatrización exitosa de la herida. Un vendaje suelto puede ser removido por el animal tras la recuperación de la anestesia, mientras que un vendaje demasiado apretado puede restringir el movimiento, afectar la circulación o interferir con la respiración. El vendaje debe permitir un espacio suficiente para un dedo (o el meñique en ratas más pequeñas) entre el vendaje y la piel. Los animales deben monitorearse diariamente, y el vendaje debe ajustarse si se observan signos de incomodidad, movilidad reducida o postura anormal. La gestión del dolor postoperatorio puede variar entre animales individuales debido a diferencias en la sensibilidad analgésica. Los animales deben evaluarse regularmente en busca de signos relacionados con el dolor, como encorvamiento, actividad reducida, disminución del apetito y pérdida de peso. Se debe proporcionar analgesia adicional cuando sea necesario, según las directrices institucionales. La fijación constante del anillo es fundamental para prevenir la contracción de la herida. Las 8–12 suturas simples interrumpidas deben espaciarse uniformemente alrededor del anillo para distribuir la tensión de manera homogénea y evitar levantamientos o deformaciones. Cada sutura debe asegurarse con un nudo quirúrgico para minimizar el aflojamiento durante la recuperación. Finalmente, recomendamos utilizar ratas de la misma cepa, edad, peso corporal y sexo dentro de un estudio determinado para minimizar la variabilidad. Además, el mismo investigador experimentado puede realizar todos los procedimientos quirúrgicos. Para evitar sesgos, recomendamos utilizar doble ciego en los análisis histológicos y moleculares.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Región Östergötland por la financiación de esta investigación. Los autores agradecen al Sr. Anders Delleskog del CBR, Universidad de Linköping, por sus sugerencias, apoyo y asistencia en el establecimiento del modelo animal. Asimismo, los autores agradecen a la Dra. Maria Ntzouni de la Instalación Central, Universidad de Linköping, por su apoyo y orientación en la inclusión, corte y tinción con hematoxilina y eosina (HE) de tejido cutáneo. Un agradecimiento especial a Sallam Abdallah en el R&Unidad #38;D para piel y células cultivadas, Universidad de Linköping, para la preparación de muestras de piel y tinción con hematoxilina y eosina.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Salfarm Scandinavia | 451790 | Conc. 0,3 mg/mL |
| Carprofeno | Zoetis Animal Health | 191380 | Rimadyl 50 mg/mL |
| Sello Eakin | Swemed | 2076152 | Grosor 3 mm |
| Estación de inclusión | Leica Biosystems | EG1150 H&C | |
| Eosina | Histolab | 1650 | Solución coloreada al 0,2% |
| Etanol absoluto | Solveco | 1015 | Grado analítico |
| Vendaje de fijación | Swemed | 2048934 | 4 cm x 4 m PA/viscosa |
| Formaldehído | Histolab | 2176 | 4% en PBS, pH 7,2-7,4 |
| Cortador de pelo | Swevet | F95000 | Longitud de corte: 0,5 mm |
| Hematoxilina | Histolab | 1800 | Harris HTX |
| Histolab-Clear | Histolab | 14250 | Sustituto del xileno |
| Isoflurano | VM Pharma | 448210 | Attane vet 1000 mg/g |
| Lekotape | Swemed | 2056774 | |
| Mepilex | Swemed | 2059125 | 7,5 x 8,5 cm |
| Película Mepore | Swemed | 2057753 | 6 x 7 cm con marco |
| Cinta quirúrgica Micropore | Swemed | 2063856 | 1,2 cm x 9,1 m |
| Micrótomo | Thermo Fisher Scientific | 387861 | Microm HM355S |
| Medio de montaje | Histolab | 00840-05 | Pertex |
| Anillo O | Ruilogod | B0B1TRQBRT | 11 mm de diámetro interno, 1 mm de ancho |
| Sutura (ethilon 4-0) | Scandivet | 21274-A | Poliamida no absorbible |
| Deshidratación de tejidos | Leica Biosystems | Leica TP1020 | |
| Tubifast de doble estiramiento | Swemed | 2069292 | 7,5 cm x 10 m PES/PA |
Referencias
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