Este estudio demostró que la ecografía pulmonar (LUS) y el miR-486-3p sérico estaban elevados en neonatos con síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS). La evaluación combinada de ambos mejoró la predicción de la gravedad de la enfermedad y del pronóstico, y se encontró que el miR-486-3p regula la función celular en el modelo de ARDS al dirigirse a la ligando 4 tipo Delta-Como de Notch canónico.
Artículo de investigación
Valor pronóstico de la puntuación de ecografía pulmonar y del miR-486-3p sérico en el síndrome de distrés respiratorio agudo neonatal
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Este estudio tuvo como objetivo evaluar el valor pronóstico del puntaje de ultrasonido pulmonar (LUS) y del miR-486-3p sérico en el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) neonatal y explorar el mecanismo subyacente. Se incluyeron en el estudio un total de 112 recién nacidos con ARDS y 100 lactantes sanos nacidos en el mismo período, asignados a los grupos de estudio y control sano, respectivamente. A cada recién nacido se le realizó un ultrasonido pulmonar dentro de las 6 h posteriores al ingreso a la unidad de cuidados intensivos y se evaluó su puntaje LUS. Se utilizó PCR cuantitativa en tiempo real para cuantificar la expresión génica, mientras que se realizaron análisis de la curva de característica operativa del receptor (ROC) y de correlación de Pearson para evaluar el desempeño pronóstico y las correlaciones. Además, se estableció un modelo in vitro de ARDS utilizando células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMECs) para investigar el mecanismo subyacente del miR-486-3p. Se realizó un ensayo de luciferasa dual para verificar la relación diana entre el miR-486-3p y el ligando 4 de tipo Delta-Notch (DLL4). Los resultados revelaron que el LUS y el miR-486-3p sérico estaban significativamente sobreexpresados en recién nacidos con ARDS. El análisis de la curva ROC mostró que tanto el miR-486-3p como el LUS podían predecir el pronóstico neonatal del ARDS (AUC = 0,883 y 0,873, sensibilidad: 96,4% y 89,3%, especificidad: 77,4% y 73,8%, respectivamente), y la combinación de miR-486-3p con LUS tuvo un mejor efecto predictivo (AUC = 0,929, sensibilidad: 92,9%, especificidad: 84,5%). Mecánicamente, el miR-486-3p se dirigió a DLL4 para regular las funciones biológicas de las células del modelo de ARDS. En conjunto, la evaluación combinada del LUS y del miR-486-3p sérico podría servir como un enfoque prometedor para evaluar la gravedad de la enfermedad y predecir el pronóstico en recién nacidos con ARDS. Aún se requiere una validación multicéntrica adicional para confirmar su aplicabilidad general.
Introducción
El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) neonatal es un trastorno respiratorio crítico potencialmente mortal, caracterizado principalmente por la alteración de la función del surfactante alveolar, lo que representa un gran riesgo para la supervivencia neonatal1,2. A pesar del desarrollo de diversas modalidades de tratamiento, el pronóstico general en neonatos afectados sigue siendo insatisfactorio3. Por ello, la identificación temprana de la gravedad de la enfermedad y la evaluación pronóstica precisa son esenciales para optimizar las intervenciones clínicas y mejorar los resultados en los pacientes. Una vez que se desarrolla el SDRA, la función pulmonar neonatal se ve gravemente comprometida, acompañada de alteraciones en la ventilación y el intercambio de gases4. La ecografía pulmonar puede considerarse el método de imagen principal para el monitoreo de la ventilación en el SDRA5. Se ha convertido en la herramienta de imagen preferida a la cabecera del paciente para monitorear lesiones pulmonares en el SDRA, y el puntaje de ecografía pulmonar (LUS) se ha aplicado ampliamente para diagnosticar enfermedades respiratorias agudas neonatales y evaluar la gravedad y el pronóstico de la enfermedad en entornos de cuidados intensivos6. Sin embargo, las pruebas de imagen o de laboratorio aisladas presentan defectos inherentes y no pueden satisfacer completamente las necesidades de evaluación clínica7. Por lo tanto, explorar nuevos biomarcadores para establecer un sistema de evaluación combinado tiene una gran importancia clínica.
El microARN (miARN) representa una clase novedosa de factores reguladores génicos que desempeñan un papel fundamental en la patogénesis del SDRA8. Por ejemplo, el miR-141-3p regulado a la baja está estrechamente asociado con la gravedad de la enfermedad en la fibrosis pulmonar y la lesión pulmonar9. El miR-124-3p es un factor protector para el SDRA al dirigirse contra p6510. Estudios previos de secuenciación de alto rendimiento han confirmado que el miR-486-3p está significativamente sobreexpresado en pacientes con SDRA11. Investigaciones recientes han destacado el eje hsa_circ_0006892/miR-486-3p como un posible mecanismo molecular implicado en el desarrollo del SDRA12. Estos hallazgos sugieren que el miR-486-3p está estrechamente relacionado con el SDRA. Sin embargo, el valor pronóstico y predictivo del miR-486-3p respecto a la gravedad y el resultado del SDRA neonatal aún debe esclarecerse completamente.
Actualmente, la radiografía de tórax, el análisis de gases en sangre y la detección de un solo biomarcador son los métodos convencionales para evaluar el SDRA neonatal. La imagenología torácica implica exposición a radiación y no puede proporcionar un monitoreo repetido en tiempo real. El análisis de gases en sangre refleja únicamente la función respiratoria aguda y carece de valor predictivo para el pronóstico a largo plazo. La detección individual de microARN proporciona resultados cuantitativos objetivos, pero no puede reflejar los cambios morfológicos en tiempo real del tejido pulmonar. En comparación con estos enfoques convencionales, la combinación de la ecografía pulmonar (LUS) y el miR-486-3p sérico integra las ventajas de la imagenología a la cabecera del paciente y la detección molecular.
Este estudio se centró en neonatos que cumplían los criterios de SDRA en lugar de la EDR clásica por déficit de surfactante. Por lo tanto, este estudio busca evaluar si la EUS basal y el miR-486-3p sérico predicen la mortalidad a corto plazo en el SDRA neonatal. Esta investigación tiene como objetivo proporcionar datos valiosos para mejorar la evaluación clínica del estado de la enfermedad y las evaluaciones pronósticas a corto plazo en el SDRA neonatal.
Protocolo
Este estudio recibió aprobación ética del Comité de Ética Médica del Primer Hospital Popular de Yongkang, en estricta adhesión a la Declaración de Helsinki.
Sujetos
Este estudio de cohorte observacional unicéntrico con un componente experimental in vitro se llevó a cabo entre enero de 2022 y diciembre de 2023. Se incluyó un total de 112 neonatos consecutivos diagnosticados con SDRA en el Primer Hospital Popular de Yongkang. A efectos comparativos, se reclutaron lactantes sanos nacidos durante el mismo periodo, sin antecedentes de asfixia ni sufrimiento intrauterino, como sujetos de control.
Criterios de inclusión:
Todos los participantes cumplían los criterios diagnósticos para el síndrome de dificultad respiratoria aguda neonatal según lo establecido en las guías de Montreux (edición 2017). El diagnóstico se confirmó mediante evaluaciones clínicas y de imagen: los exámenes de rayos X revelaron opacidades difusas en ambos pulmones, compatibles con edema pulmonar, y la ecocardiografía no mostró evidencia de hipertensión auricular izquierda, excluyendo así el edema pulmonar de origen cardiógeno. Otros criterios adicionales incluyeron aparición aguda de síntomas y la necesidad de ventilación mecánica durante más de 3 días, sin infecciones extrapulmonares graves. Se obtuvo el consentimiento informado de manera debida por parte de las familias de los neonatos.
Criterios de exclusión:
Se excluyeron neonatos con deficiencia primaria de surfactante alveolar, enfermedad cardíaca congénita, trastornos metabólicos u otras afecciones subyacentes importantes. Además, se excluyeron lactantes con malformaciones pulmonares o de la pared torácica u otras anomalías congénitas mayores. Se excluyó la enfermedad de la membrana hialina neonatal.
Datos clínicos
Se documentó la edad gestacional, el sexo, el peso al nacer al momento del ingreso y las características maternas de todos los participantes. Cada neonato se sometió a una ecografía pulmonar dentro de las 6 horas posteriores al ingreso en la unidad de cuidados intensivos y fue evaluado mediante la LUS. La LUS se puntuó en una escala con un máximo de 36 puntos, en la que una puntuación más alta indicaba mayor gravedad de los síntomas pulmonares. Se recogieron muestras de sangre inmediatamente al ingreso como parte de la evaluación clínica inicial y antes de cualquier intervención terapéutica importante (por ejemplo, administración adicional de surfactante, aumento del modo de ventilación o inicio de agentes vasoactivos). Las muestras de sangre de neonatos sanos se obtuvieron en el momento de su inclusión. Para el aislamiento de suero, se colocó sangre total en tubos separadores de suero y se mantuvieron en reposo a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la formación completa del coágulo. Las muestras se centrifugaron luego a 1500 x g durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante claro de suero se aspiró cuidadosamente, se fraccionó en viales criogénicos estériles y se almacenó inmediatamente en un congelador de ultra baja temperatura a -80 °C para experimentos posteriores. Solo se utilizaron muestras de suero claras y no hemolizadas en los experimentos subsiguientes. Los tubos de recolección de sangre utilizados y el residuo sanguíneo se desechaban como residuo biológico médico de acuerdo con las normativas institucionales.
Agrupación
Todos los recién nacidos se clasificaron en dos grupos distintos: el grupo leve (grados I-II) y el grupo grave (grados III-IV), según los hallazgos iniciales de la radiografía de tórax y la gravedad de la afección evaluada a las 24 h del ingreso. La interpretación de las radiografías de tórax reveló el grado I, caracterizado por una disminución bilateral de la transparencia pulmonar, con partículas pequeñas y sombras reticulares en el parénquima pulmonar. El grado II indicaba que las lesiones se extendían hacia las zonas media y periférica de los pulmones, con evidencia del signo de broncograma aéreo. En el grado III, existía una reducción significativa de la transparencia en ambos pulmones, lo que provocaba márgenes del corazón y del diafragma poco definidos. El grado IV se caracterizaba por signos pronunciados de broncograma aéreo, que culminaban en una opacificación casi completa, similar a una apariencia de pulmón blanco.
Los neonatos diagnosticados con SDRA recibieron un régimen integral de manejo tras su ingreso a la unidad de cuidados intensivos neonatales. Este régimen incluyó ventilación mecánica, sedación, administración de surfactante pulmonar, terapias antiinflamatorias, soporte nutricional, asistencia para la expectoración y medidas de reposición de líquidos. El diagnóstico neonatal de SDRA sirvió como punto de partida del estudio. Los puntos finales se definieron como la recuperación exitosa del paciente y su alta, o el fallecimiento del paciente debido a un tratamiento ineficaz. Según los resultados clínicos, los participantes se clasificaron en dos grupos: el grupo de supervivencia y el grupo de fallecidos.
Cultivo celular y tratamiento
Las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMECs) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 °C en un incubador humedecido que contenía 5% de CO₂. Para establecer un modelo celular de SDRA, las células se trataron con lipopolisacárido (LPS) a una concentración de 1 mg/L13,14. La correcta creación del modelo se confirmó observando una ligera retracción celular bajo un microscopio invertido tras el tratamiento con LPS. Tras finalizar los experimentos, el medio de cultivo usado, las células muertas y los materiales de cultivo desechables se descartaron como residuos biológicamente peligrosos.
Transfección celular y agrupación
Las HPMEC se sembraron en placas de cultivo y se incubaron hasta alcanzar una confluencia del 70 % antes de la transfección. Los complejos de transfección se prepararon según las instrucciones del fabricante. Las células se dividieron en grupos: control en blanco, mimético de miR-486-3p, control negativo del mimético, inhibidor de miR-486-3p, control negativo del inhibidor, mimético de miR-486-3p + plásmido de sobreexpresión de DLL4 (OE-DLL4) y mimético de miR-486-3p + plásmido de sobreexpresión vacío (OE-NC). Los complejos de transfección se añadieron a los pozos correspondientes y se incubaron durante 4–6 h. El medio se reemplazó por medio completo fresco, y el cultivo se continuó durante 24–48 h para los experimentos posteriores. La transfección exitosa se indicó mediante una confluencia celular estable sin muerte celular excesiva.
PCR cuantitativa en tiempo real
Se extrajo ARN total de muestras de suero y células cultivadas utilizando un reactivo de extracción de ARN. La concentración y pureza del ARN se midieron mediante un espectrofotómetro, y las muestras con una relación A260/A280 de 1,8 a 2,1 se consideraron adecuadas para análisis posteriores. Se sintetizó ADN complementario (cADN) utilizando un kit de transcripción inversa. Posteriormente, se realizó una PCR cuantitativa utilizando un sistema de PCR en tiempo real con las siguientes condiciones de amplificación: una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s. Para la detección de microARN, se calculó la expresión relativa de miR-486-3p mediante el método 2-ΔΔCt, utilizando U6 snARN como referencia interna. Para la cuantificación de ARNm, la expresión de DLL4 se normalizó respecto al ARNm de GAPDH mediante el mismo algoritmo 2-ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: miR-486-3p sentido: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' y miR-486-3p antisentido: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 sentido: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' y U6 antisentido: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 sentido: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' y DLL4 antisentido: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH sentido: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' y GAPDH antisentido: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
Ensayo de proliferación celular CCK-8
Las células transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 103 células por pocillo y se incubaron durante 24, 48 y 72 h. Luego se aspiró el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS 1×. Posteriormente, se añadieron 100 µL de PBS 1× fresco y 10 µL de solución CCK-8 a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37 °C durante 2 h. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas, y la proliferación celular se evaluó en función de los valores de absorbancia. El correcto desempeño del ensayo se indicó mediante cambios dependientes del tiempo en la absorbancia entre los grupos experimentales.
Ensayo de apoptosis por citometría de flujo
Las células fueron digeridas con tripsina al 0,25 %, y la suspensión celular resultante se recolectó y centrifugó a 1500 × g durante 5 min a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y los pellet celulares se lavaron tres veces con PBS 1× preenfriado. Luego, las células se resuspendieron en 500 µL de tampón de enlace 1×, seguido por la adición de 5 µL de anexina V-FITC y 5 µL de yoduro de propidio (PI). Tras una mezcla suave, las muestras se incubaron durante 40 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La apoptosis celular se midió mediante citometría de flujo, y los datos se analizaron con el software adecuado para el análisis de citometría de flujo. El correcto desempeño del ensayo se indicó mediante una baja tasa de apoptosis en el grupo control normal y un aumento notable de la apoptosis en el grupo modelo de SDRA.
Ensayo de represor de luciferasa
Los genes diana potenciales de miR-486-3p se identificaron utilizando la base de datos en línea TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/). Tras identificar los sitios de unión predichos, se construyeron plásmidos reporteros de luciferasa tipo silvestre (DLL4-WT) y mutantes (DLL4-MUT) que contenían las secuencias de unión correspondientes. Los vectores DLL4-WT y DLL4-MUT se co-transfectaron en HPMEC junto con análogos o inhibidores de miR-486-3p, respectivamente. Posteriormente, se midió la actividad relativa de luciferasa utilizando un kit de ensayo de reportero de doble luciferasa. Las señales de bioluminiscencia se detectaron con un luminómetro según las instrucciones del fabricante. Una validación exitosa del blanco se indicó mediante una reducción significativa en la actividad de luciferasa en el grupo DLL4-WT tras la sobreexpresión de miR-486-3p.
Se proporcionó información detallada sobre todos los reactivos, materiales de consumo y equipos de laboratorio utilizados en este estudio en la Tabla de Materiales adjunta.
Métodos estadísticos
Los análisis estadísticos y las visualizaciones de datos se realizaron utilizando SPSS versión 26.0 y GraphPad Prism versión 9.0. Los datos de medición se presentaron como media ± desviación estándar, y las comparaciones entre las medias de dos muestras independientes se evaluaron mediante una prueba t independiente. Para comparaciones entre tres o más grupos, se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y un ANOVA de medidas repetidas, seguidos por la prueba post hoc de Tukey para identificar diferencias entre grupos. Los datos categóricos se expresaron como conteos (porcentajes), y las comparaciones entre grupos se analizaron empleando la prueba de chi-cuadrado. Se aplicó la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney para datos no paramétricos. Además, se construyó la curva ROC para evaluar el valor predictivo de los niveles de expresión sérica de miR-486-3p y de la ecografía pulmonar (LUS) en la determinación de la mortalidad en pacientes pediátricos con SDRA. Se utilizó el análisis de correlación de Pearson para examinar las correlaciones. Todos los grupos experimentales tuvieron tres réplicas biológicas independientes y réplicas técnicas. La unidad estadística se definió como un experimento independiente, donde cada réplica biológica representaba un lote separado de cultivo celular derivado de diferentes pasajes, y las réplicas técnicas se utilizaron para reducir la variación intra-experimental. Primero se promediaron los datos de las réplicas técnicas, y luego se realizó el análisis estadístico basado en los valores medios de las réplicas biológicas. La significancia estadística se estableció en p < 0,05.
Resultados
Datos basales comparables entre grupos
Las características generales de los lactantes incluidos en el estudio se presentan en la Tabla 1. No hubo diferencias significativas en las características demográficas basales entre los dos grupos: edad gestacional (36,07 ± 2,71 frente a 35,72 ± 2,64 semanas, p = 0,347), proporción de sexo masculino (59,0 % frente a 66,1 %, p = 0,290), peso al nacer (3,39 ± 0,57 frente a 3,33 ± 0,55 kg, p = 0,437), edad materna (29,18 ± 4,00 frente a 29,66 ± 4,05 años, p = 0,387) y método de parto (vaginal: 54,0 % frente a 58,0 %; cesárea: 46,0 % frente a 42,0 %, p = 0,554), lo que indica que estos grupos eran comparables. Según la evaluación mediante radiografía de tórax, en el grupo con SDRA, 72 casos (64,3 %) se clasificaron como leves (grado I-II), mientras que 40 casos (35,7 %) se clasificaron como graves (grado III-IV).
La gravedad del SDRA se correlaciona con el pronóstico del paciente
El análisis comparativo de los resultados de supervivencia entre el grupo de niños con SDRA que sobrevivieron y aquellos que fallecieron se presenta en la Tabla 2. De los 112 neonatos diagnosticados con SDRA, 84 casos (75 %) sobrevivieron, mientras que 28 casos (25 %) resultaron en mortalidad. Cabe destacar que no hubo diferencias estadísticamente significativas en la edad del lactante, el sexo, el peso al nacer, la edad materna, el modo de parto, las características del líquido amniótico, la etiología ni en otras variables entre los dos grupos (p > 0,05). Sin embargo, se observó una diferencia significativa en la gravedad del SDRA (p < 0,01), lo que destaca un factor pronóstico crítico.
El miR-486-3p y el LUS están elevados en el SDRA. El análisis mediante RT-qPCR reveló que los niveles séricos de miR-486-3p estaban significativamente elevados en neonatos con SDRA en comparación con controles sanos. Además, dentro del grupo con SDRA, el grupo grave presentó niveles notablemente más altos que el grupo leve (P < 0,001) (Figura 1A). Asimismo, el LUS fue mayor en el grupo con SDRA grave que en el grupo con SDRA leve (p < 0,001) (Figura 1B). Al dividir a los pacientes con SDRA según el resultado clínico, el grupo de fallecidos mostró niveles marcadamente más altos de LUS y miR-486-3p que el grupo de sobrevivientes (Figura 1C,D). Se encontró una fuerte correlación positiva entre el LUS y el miR-486-3p sérico en los pacientes no sobrevivientes (r = 0,832, p < 0,001) (Figura 1E).
La detección combinada mejora la predicción pronóstica
Basándonos en el protocolo de análisis ROC, evaluamos el rendimiento pronóstico de indicadores individuales y combinados. Los valores de AUC de LUS y miR-486-3p para predecir la mortalidad a corto plazo fueron 0.873 (IC del 95 %: 0,809-0,936) y 0,883 (IC del 95 %: 0,822-0,944), respectivamente. Los valores de sensibilidad fueron del 89,3 % y del 96,4 %, mientras que los valores de especificidad fueron del 73,8 % y del 77,4 %, respectivamente. Los valores óptimos de corte para LUS y miR-486-3p fueron 15,500 y 1,465, respectivamente. Además, el AUC para el modelo predictivo combinado fue de 0,929 (IC del 95 %: 0,883-0,975), mostrando una sensibilidad del 92,9 % y una especificidad del 84,5 % con el valor óptimo de corte de 1,659 (Figura 1F).
La sobreexpresión de miR-486-3p afecta negativamente la función celular
Tras el protocolo de cultivo celular y la intervención con LPS, construimos un modelo celular in vitro de SDRA utilizando HPMEC. Los resultados de qPCR mostraron que la expresión de miR-486-3p aumentó gradualmente con el tiempo tras la estimulación con LPS (Figura 2A). Se realizó una sobreexpresión o silenciamiento de miR-486-3p para investigar sus efectos en las células del modelo de SDRA (Figura 2B). De acuerdo con los protocolos de los ensayos de CCK-8 y citometría de flujo, se detectó la proliferación y la apoptosis celular. La sobreexpresión de miR-486-3p suprimió significativamente la proliferación celular y promovió la apoptosis. Por el contrario, el silenciamiento de miR-486-3p alivió el daño celular inducido por LPS (Figura 2C,D).
El miR-486-3p reduce la expresión de DLL4
De acuerdo con el protocolo de construcción del plásmido y el ensayo de luciferasa dual, verificamos la interacción entre miR-486-3p y DLL4. La predicción bioinformática confirmó un sitio de unión conservado entre miR-486-3p y la región 3’UTR de DLL4 (Figura 3A). La actividad de luciferasa del grupo tipo silvestre de DLL4 se redujo significativamente tras la sobreexpresión de miR-486-3p, mientras que no se observó un cambio evidente en el grupo mutante (Figura 3B), lo que demuestra que DLL4 es un gen diana directo de miR-486-3p. En modelos celulares, la expresión de DLL4 disminuyó de manera dependiente del tiempo tras el tratamiento con LPS (Figura 3C). La manipulación de la expresión de miR-486-3p también reguló negativamente los niveles de DLL4 (Figura 3D).
En muestras clínicas, la expresión de DLL4 fue menor en neonatos con SDRA que en controles sanos, y disminuyó aún más en el grupo de fallecidos (Figura 3E–F). Se observó una correlación negativa entre miR-486-3p y DLL4 en pacientes no supervivientes (r = -0.795, P < 0.001) (Figura 3G). Todas las pruebas de qPCR para DLL4 se realizaron con tres réplicas técnicas, y los resultados fueron estables.
DLL4 revierte la lesión celular mediada por miR-486-3p
Tras seguir el protocolo de co-transfección utilizando el mimético de miR-486-3p y el plásmido de sobreexpresión de DLL4, realizamos experimentos de rescate. La qPCR confirmó que la expresión de DLL4 se restableció eficazmente tras la transfección con OE-DLL4 (Figura 4A). Las pruebas funcionales mostraron que la sobreexpresión de DLL4 revirtió parcialmente el efecto inhibitorio de miR-486-3p sobre la proliferación celular y su efecto proapoptótico (Figura 4B,C). Estos resultados indicaron que miR-486-3p modula parcialmente la actividad celular mediante el blanco molecular DLL4.
Disponibilidad de datos:
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se proporcionan como Archivo Suplementario 1.
Figura 1: Comparación de LUS y niveles séricos de miR-486-3p entre grupos. (A) Niveles séricos de miR-486-3p en recién nacidos sanos y en recién nacidos con SDRA. (B) Valores de LUS en recién nacidos sanos y en recién nacidos con SDRA. (C) Niveles séricos de miR-486-3p en el grupo de supervivencia y en el grupo de fallecidos. (D) Valores de LUS en el grupo de supervivencia y en el grupo de fallecidos. (E) Análisis de correlación entre miR-486-3p sérico y LUS en recién nacidos con SDRA no supervivientes. (F) Curvas ROC de LUS individual, miR-486-3p individual y detección combinada para predecir el pronóstico del SDRA neonatal. Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± desviación estándar; las barras de error representan la desviación estándar. *** = p <0,001, comparado con el grupo sano; ### = p <0,001, comparado con el grupo de SDRA leve. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 2: Efecto de miR-486-3p en células del modelo de SDRA. (A) Cambios dependientes del tiempo en la expresión de miR-486-3p en HPMECs tras el tratamiento con LPS. (B) Expresión relativa de miR-486-3p tras la sobreexpresión y la interrupción génica. (C) Actividad de proliferación celular detectada mediante el ensayo CCK-8 tras modificar la expresión de miR-486-3p. (D) Tasa de apoptosis celular detectada por citometría de flujo tras modificar la expresión de miR-486-3p. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar; las barras de error representan la desviación estándar. Marcadores estadísticos: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: Verificación de la relación de diana entre miR-486-3p y DLL4. (A) Diagrama esquemático del sitio de unión predicho entre miR-486-3p y la región 3’UTR de DLL4. (B) El ensayo del gen reportero de luciferasa dual confirmó la relación de diana entre miR-486-3p y DLL4. (C) Cambios dinámicos en la expresión de DLL4 en HPMEC tras el tratamiento con LPS. (D) Expresión de DLL4 tras la sobreexpresión o silenciamiento de miR-486-3p. (E) Niveles séricos de DLL4 en neonatos sanos y en neonatos con SDRA. (F) Niveles de DLL4 en el grupo de supervivencia y en el grupo de fallecidos entre los neonatos con SDRA. (G) Análisis de correlación entre miR-486-3p sérico y DLL4 en neonatos con SDRA no supervivientes. Todos los datos cuantitativos se muestran como media ± desviación estándar; las barras de error representan la desviación estándar. Marcadores estadísticos: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001 frente al grupo sano, ### = p <0,001 frente al grupo con SDRA leve. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 4: Efecto del miR-486-3p dirigido contra DLL4 en células del modelo de SDRA. (A) Detección de la expresión de DLL4 tras la co-transfección del análogo de miR-486-3p y del plásmido de sobreexpresión de DLL4. (B) Cambios en la actividad de proliferación celular tras la recuperación de DLL4. (C) Cambios en la tasa de apoptosis celular tras la recuperación de DLL4. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar; las barras de error representan la desviación estándar. Marcadores estadísticos: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
| Variable | Sano (n=100) | SDRA neonatal (n=112) | Valor de p |
| Edad gestacional (semanas) | 36,07 ± 2,71 | 35,72 ± 2,64 | 0,347 |
| Sexo (masculino, %) | 59 (59,0 %) | 74 (66,1 %) | 0,29 |
| Peso al nacer (kg) | 3,39 ± 0,57 | 3,33 ± 0,55 | 0,437 |
| Edad materna (años) | 29,18 ± 4,00 | 29,66 ± 4,05 | 0,387 |
| Método de parto | 0,439 | ||
| Vaginal | 54 (54,0 %) | 65 (58,0 %) | |
| Cesárea | 46 (46,0 %) | 47 (42,0 %) | |
| Grados de SDRA | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64,3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35,7 %) |
Tabla 1: Características basales de los lactantes incluidos. Esta tabla resume la información demográfica basal de neonatos sanos y de neonatos con SDRA. Los datos se presentan como media ± desviación estándar para variables continuas, y número (porcentaje) para variables categóricas. Los valores de P indican diferencias estadísticas entre grupos. Abreviaturas: ARDS = síndrome de dificultad respiratoria aguda.
| Variable | Supervivencia (n=84) | Fallecimiento (n=28) | Valor p |
| Edad gestacional (semanas) | 35,95 ± 2,58 | 35,04 ± 2,76 | 0,112 |
| Sexo (masculino, %) | 53 (63,1 %) | 21 (75,0 %) | 0,253 |
| Peso al nacer (kg) | 3,37 ± 0,58 | 3,23 ± 0,42 | 0,248 |
| Edad materna (años) | 29,49 ± 3,82 | 30,18 ± 4,74 | 0,438 |
| Método de parto | 0,444 | ||
| Vaginal | 47 (56,0 %) | 18 (64,3 %) | |
| Cesárea | 37 (44,0 %) | 10 (35,7 %) | |
| Líquido amniótico anormal | 6 (9,5 %) | 4 (14,3 %) | 0,485 |
| Grados de SDRA | 0,001** | ||
| I-II | 61 (72,6 %) | 11 (39,3 %) | |
| III-IV | 23 (27,4 %) | 17 (60,7 %) | |
| Etiología | 0,827 | ||
| Atragantamiento | 33 (39,3 %) | 12 (42,9 %) | |
| Neumonía | 17 (20,2 %) | 6 (21,4 %) | |
| Sepsis | 12 (14,3 %) | 2 (7,1 %) | |
| Síndrome de aspiración de meconio | 22 (26,2 %) | 8 (28,6 %) |
Tabla 2: Comparación de los datos clínicos entre el grupo de supervivencia y el grupo de fallecidos en neonatos con SDRA. Esta tabla compara los indicadores clínicos entre neonatos con SDRA que sobrevivieron y los que no sobrevivieron. Los datos continuos se presentan como media ± desviación estándar, y los datos categóricos se expresan como número (porcentaje). Los valores de p indican la significancia estadística entre los dos grupos. ** = p<0,01. Abreviaturas: SDRA = síndrome de dificultad respiratoria aguda.
Archivo suplementario 1: Conjuntos de datos clínicos y experimentales brutos que respaldan los hallazgos de este estudio, incluidas las mediciones a nivel individual del puntaje de ultrasonido pulmonar (LUS), la expresión sérica de miR-486-3p, la expresión de DLL4 y los resultados de los ensayos celulares.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
El SDRA neonatal es una causa principal de insuficiencia respiratoria y mortalidad temprana entre neonatos gravemente enfermos15. La evaluación temprana y precisa de la gravedad de la enfermedad y del pronóstico es un requisito previo para la intervención individualizada y la reducción de la mortalidad. Una creciente cantidad de evidencia confirma que los microARN participan en la progresión patológica del SDRA y actúan como biomarcadores circulantes prometedores16. Investigaciones indican que el miR-155 está notablemente elevado en pacientes sépticos que padecen lesión pulmonar aguda/SDRA17. Además, estudios han revelado un aumento en los niveles séricos de miR-629-5p entre niños diagnosticados con SDRA18. El miR-34a sérico está estrechamente relacionado con la gravedad y el pronóstico del SDRA neonatal19. Nuevos estudios demuestran que el miR-375 es un biomarcador diagnóstico y pronóstico para el SDRA neonatal20. De forma similar a estas moléculas descritas, el miR-486-3p sérico puede detectarse de manera estable en sangre periférica mediante PCR cuantitativa y es adecuado para cribado rápido en unidades de cuidados intensivos neonatales (UCIN). En comparación con el miR-375 y el miR-34a, que principalmente reflejan el inicio temprano de la enfermedad, la expresión del miR-486-3p se correlaciona más estrechamente con la gravedad de las lesiones pulmonares y cambia dinámicamente junto con la progresión de la lesión pulmonar. Cuando se combina con la ecografía pulmonar (LUS), alcanza una mayor precisión pronóstica respecto a la mortalidad a corto plazo. Sin embargo, el miR-486-3p presenta una especificidad relativamente baja para la enfermedad, y la evidencia clínica disponible sigue siendo limitada en comparación con la de los biomarcadores de miARN bien establecidos. En conjunto, el miR-486-3p tiene el potencial de servir como marcador para el diagnóstico auxiliar o la predicción pronóstica del SDRA neonatal.
La LUS es un indicador maduro de imagen en el lecho que evalúa la aeración pulmonar basándose en las características ultrasonográficas del tejido pulmonar21. En particular, la LUS sirve como métrica cuantitativa efectiva para medir el grado de ventilación alveolar22. Investigaciones han corroborado su utilidad para evaluar tanto la gravedad como el pronóstico del SDRA neonatal23. En consonancia con estudios previos, nuestro estudio clínico reveló que las mediciones de LUS en neonatos con SDRA estuvieron significativamente elevadas en comparación con las de neonatos sanos. Además, entre los neonatos afectados, el subgrupo grave presentó valores de LUS marcadamente más altos que el subgrupo leve, lo que subraya una relación directa entre lecturas elevadas de LUS y la gravedad de la atelectasia, el edema pulmonar y la consolidación pulmonar24. Nuestros hallazgos indicaron además que los pacientes que finalmente fallecieron también mostraron valores de LUS notablemente más altos que los sobrevivientes. Se observó una fuerte correlación positiva entre la LUS y el miR-486-3p sérico en neonatos no sobrevivientes, lo que refuerza aún más el valor sinérgico de ambos indicadores. Cada método posee características inherentes: la LUS es libre de radiación, portátil y adecuada para monitoreo en tiempo real en el lecho, aunque su interpretación depende en gran medida de la experiencia del operador y está sujeta a sesgos subjetivos. La detección del miR-486-3p sérico proporciona resultados cuantitativos objetivos y repetibles, pero no puede reflejar cambios morfológicos en tiempo real en el tejido pulmonar. En la práctica clínica, se recomienda el uso rutinario de este enfoque combinado en unidades de cuidados intensivos neonatales. Es adecuado para la estratificación temprana del riesgo en neonatos con SDRA sospechado o confirmado, la evaluación dinámica periódica de la progresión de la enfermedad y el juicio auxiliar del pronóstico clínico a corto plazo. Sin embargo, este método no pretende sustituir los exámenes de imagen definitivos ni los estudios etiológicos; presenta especificidad limitada cuando se aplica a neonatos con enfermedades pulmonares inflamatorias concomitantes. Además, dado que nuestra investigación se realizó en un solo centro, su aplicabilidad en poblaciones de diferentes regiones aún debe verificarse.
Clínicamente, observamos que valores elevados de LUS, combinados con altos niveles séricos de miR-486-3p, se asociaron con un mal pronóstico en el SDRA neonatal, lo que sugiere que el miR-486-3p podría estar estrechamente relacionado con lesiones vasculares pulmonares graves y una capacidad deteriorada de reparación vascular en el pulmón inmaduro. Nuestros experimentos celulares in vitro complementaron esta observación clínica al demostrar que el miR-486-3p modula directamente la proliferación y la apoptosis de células endoteliales, procesos fundamentales que regulan la integridad vascular y la reparación en el pulmón neonatal. Además, investigaciones han demostrado que los miARN desempeñan funciones cruciales en diversos procesos celulares25,26. Está bien establecido que los miARN ejercen principalmente sus efectos mediante la regulación postranscripcional de genes diana, que implica predominantemente el empalme del miARN y la represión de la traducción proteica27. El gen DLL4 desempeña un papel importante en el desarrollo vascular y la angiogénesis28. Investigaciones han indicado que la familia del microARN-30 dirige a DLL4 para modular el comportamiento de las células endoteliales durante la angiogénesis29. Estos hallazgos sugieren que la modulación del DLL4 endotelial podría estar asociada con la lesión vascular pulmonar en el SDRA neonatal. En nuestra investigación, identificamos y validamos la relación de diana entre el miR-486-3p y DLL4. Análisis posteriores revelaron que la expresión elevada de miR-486-3p inhibió significativamente la proliferación de HPMEC inducidas por LPS, al tiempo que promovió la apoptosis. Importante, la expresión de DLL4 pudo revertir parcialmente los efectos mediados por el miR-486-3p. Esto sugiere que el miR-486-3p dirige a DLL4 para afectar la función de las HPMEC y regular la progresión del SDRA neonatal. Sin embargo, aún queda por verificar si afecta directamente la disfunción vascular pulmonar y contribuye al SDRA. Cabe destacar que DLL4 solo revirtió parcialmente los cambios celulares inducidos por el miR-486-3p. Como un miARN típico, el miR-486-3p modula múltiples genes diana descendentes. Estudios futuros se centrarán en identificar más genes diana para aclarar el mecanismo completo del miR-486-3p en el SDRA neonatal.
Finalmente, vale la pena señalar que la estandarización rigurosa de los pasos clave del protocolo garantiza datos confiables y repetibles. Unificamos los procedimientos de recolección de muestras, adoptamos protocolos estandarizados de cultivo celular y transfección, e incluimos réplicas independientes para minimizar el error experimental. A continuación se resumen los problemas operativos comunes y sus soluciones: para la evaluación mediante LUS, estandarice el protocolo de escaneo de 12 regiones y las reglas unificadas de puntuación, y ajuste la postura del recién nacido para obtener imágenes nítidas. Para la detección de miARN séricos, evite ciclos repetidos de congelación-descongelación, verifique la pureza del ARN (A260/A280 = 1,8–2,1) e incluya réplicas técnicas. Para los modelos celulares inducidos con LPS, utilice LPS recién preparado a 1 mg/L y condiciones de cultivo estables. Optimice la confluencia celular y la relación de reactivos durante la transfección, y cambie el medio para reducir la citotoxicidad. Asegure una lisis celular completa y una operación estandarizada para los ensayos de luciferasa dual.
En conjunto, en comparación con los métodos convencionales que incluyen imágenes de tórax, análisis de gases en sangre y pruebas de un solo biomarcador, la estrategia combinada de USP/miR-486-3p es libre de radiación, de bajo costo y fácil de realizar, con un mejor desempeño predictivo. Actúa como una herramienta pronóstica complementaria confiable para el SDRA neonatal. Clínicamente, este método puede aplicarse para la estratificación temprana del riesgo y el monitoreo dinámico del estado clínico en unidades de cuidados intensivos neonatales. También puede servir como un índice unificado de evaluación para estudios multicéntricos. Mecanísticamente, el eje miR-486-3p/DLL4 validado proporciona nuevas direcciones para explorar los mecanismos patológicos y la terapia dirigida. Sin embargo, este enfoque combinado también tiene limitaciones técnicas inherentes. Los resultados de la USP varían entre operadores, y el miR-486-3p carece de especificidad para enfermedades pulmonares inflamatorias. Este método solo permite la detección en un solo punto temporal y no puede reemplazar los exámenes de imagen definitivos ni los estudios etiológicos.
A pesar de los hallazgos prometedores, varias limitaciones merecen atención. En primer lugar, el diseño de una sola institución restringe la generalización de nuestras conclusiones. En segundo lugar, no contamos con una cohorte de validación externa para verificar la solidez del desempeño predictivo del panel de LUS/miR-486-3p. En tercer lugar, los niveles séricos de miR-486-3p se midieron únicamente en un solo punto temporal, lo que impide captar su asociación dinámica con la progresión de la enfermedad. En cuarto lugar, la ausencia de análisis complementarios de proteínas y de validación in vitro/in vivo limita la solidez de nuestras inferencias mecanicistas. Finalmente, el papel específico del miR-486-3p en la fisiopatología del SDRA neonatal aún no se ha elucidado por completo y requiere mayor investigación. En conclusión, el aumento del LUS y los niveles séricos elevados de miR-486-3p en neonatos diagnosticados con SDRA constituyen puntos de referencia significativos en la práctica clínica. La evaluación sinérgica de estos dos biomarcadores podría facilitar la predicción precisa tanto de la gravedad como del pronóstico del SDRA neonatal, demostrando así cierto valor de aplicación clínica.
Divulgaciones
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos PCR de 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Solución de Tripsina-EDTA al 0,25% | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| Tubos microcentrífugos de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Incubadora de cultivo celular con 5% de CO2 y humedad controlada | Thermo Fisher | 3111 | |
| Placas de cultivo celular de 6 pocillos | Corning | 3516 | |
| Placas de cultivo celular de 96 pocillos | Corning | 3599 | |
| Etileno absoluto | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Kit de detección de apoptosis por Anexina V-FITC | BD Biosciences | 556547 | |
| Centrífuga de banco | Eppendorf | 5810R | |
| Cabina de seguridad biológica | Thermo Fisher | 1300 Series A2 | |
| Kit de conteo celular CCK-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| Tubos desechables estériles para recolección de sangre | BD Vacutainer | 367815 | |
| Plásmido de sobreexpresión de DLL4 (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| Plásmido reportero de luciferasa DLL4-MUT | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| Plásmido reportero de luciferasa DLL4-WT | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| Medio DMEM con alta glucosa | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| Kit de ensayo de luciferasa dual | Biolab | BL101A | |
| Lector de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| Suero bovino fetal (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| Puntas de pipeta con filtro (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Tubos para citometría de flujo | BD Biosciences | 352054 | |
| Centrífuga refrigerada de alta velocidad | Eppendorf | 5424R | |
| Lipopolisacárido (LPS) de E. coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Sistema de ultrasonido pulmonar | Mindray | M9 | |
| Espetrofotómetro de microvolumen | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| Inhibidor de miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| Mimético de miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486 | |
| Conjunto de cebadores para qPCR de miR-486-3p | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| Inhibidor de control negativo (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| Mimético de control negativo (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| Plásmido de sobreexpresión de control negativo (OE-NC) | GenePharma | EX-NEG | |
| Solución de Penicilina-Estreptomicina (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| Juego de pipetas (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | Research Plus | |
| Solución de tinción con yoduro de propidio (PI) | BD Biosciences | 556463 | |
| Sistema de PCR cuantitativa en tiempo real | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| Agua libre de RNasas | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| Mezcla maestra rápida RT-PCR | Toyobo | FSQ-101 | |
| Pipetas desechables estériles | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| Mezcla maestra SYBR Green para PCR en tiempo real | Toyobo | QPK-201 | |
| Reactivo Trizol | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| Conjunto de cebadores de qPCR para U6 snRNA | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| Mezclador de vórtice | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Referencias
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