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Preparación de muestras de médula ósea fijadas en formol e incluidas en parafina para transcriptómica espacial mediante descalcificación basada en EDTA

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DOI:

10.3791/72474

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28 de agosto de 2026

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

En este artículo

Resumen

Un procedimiento estandarizado para la preparación de muestras de hueso fijadas en formalina y embebidas en parafina para la transcriptómica espacial incluye un paso de descalcificación con EDTA de 10 días para preservar la integridad del ARN. Puntos clave de control de calidad ayudan a determinar si las muestras cumplen con los requisitos para el análisis espacial de expresión génica en etapas posteriores.

Resumen

La médula ósea (MO) es una estructura compleja y dinámica en la que las relaciones espaciales influyen en el comportamiento celular, la señalización y la función. Debido a esto, comprender completamente la dinámica de las interacciones celulares requiere técnicas espaciales complementarias que preserven y mapeen la arquitectura de las poblaciones celulares in situ. A pesar de los avances significativos en las tecnologías de célula individual que han contribuido a entender la heterogeneidad transcripcional de tejidos de MO sanos y enfermos, la organización espacial de diferentes tipos celulares, los programas reguladores específicos del nicho y sus interacciones aún necesitan más estudios. Los avances recientes en la transcriptómica espacial han permitido el análisis imparcial de la expresión génica con contexto espacial en diferentes tejidos, lo que convierte a estas tecnologías en complementarias de los métodos de célula individual que carecen de resolución espacial. Aunque la transcriptómica espacial se ha utilizado ampliamente en tejidos blandos, su uso en tejidos mineralizados como la MO sigue siendo limitado debido a los desafíos asociados con el procesamiento del tejido óseo. El protocolo presentado aquí se ha utilizado para preparar muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) de tejidos de ratón y humanos sanos y enfermos. Incluye un paso de descalcificación basado en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 10 días para preservar la integridad del ARN y facilitar el uso de la transcriptómica espacial en muestras de huesos largos. Este protocolo describe la preparación de muestras de MO para análisis transcriptómico espacial, incluyendo el procesamiento del tejido, su preservación y seccionado, así como pasos esenciales de evaluación de calidad, como la evaluación de la integridad de los cortes, la morfología del tejido y la calidad del ARN. El flujo de trabajo también permite la identificación de tipos celulares y la integración con datos transcriptómicos de célula individual para caracterizar la composición celular, definir interacciones entre células y visualizar la distribución espacial de células heterogéneas transcripcionalmente en estados sanos y patológicos. En general, este flujo de trabajo prepara tejidos sanos y malignos completamente mineralizados para análisis transcriptómico espacial, preservando al mismo tiempo la arquitectura de la médula ósea.

Introducción

La médula ósea (MO) es un órgano altamente complejo y compartimentalizado que sirve como sitio principal de hematopoyesis y maduración de células inmunitarias1,2. Este tejido heterogéneo comprende una amplia variedad de linajes celulares hematopoyéticos, mesenquimales, endoteliales e inmunitarios que coexisten en un nicho tridimensional altamente especializado y organizado3,4. Dentro de este nicho, cada población celular ocupa territorios anatómicos distintos, y el contexto espacial desempeña un papel fundamental en la regulación del comportamiento, la señalización y la función celulares4,5. La proximidad física a estructuras específicas, como el hueso trabecular o las redes vasculares, rige procesos fisiológicos esenciales, incluyendo el mantenimiento de la quiescencia de las células madre hematopoyéticas (CMH) y la remodelación ósea6,7. En consecuencia, este microambiente dinámico y las interacciones estrictamente reguladas entre sus componentes celulares y estromales configuran las redes reguladoras que mantienen la homeostasis y afectan la progresión de las enfermedades hematológicas malignas8,9,10,11,12,13.

Los avances en la secuenciación de ARN a nivel de célula individual (scRNA-seq) han revolucionado nuestra comprensión de la diversidad celular en la médula ósea (MO), permitiendo el descubrimiento de subtipos celulares previamente no reconocidos y sus interacciones predichas dentro del nicho3,10,11,12,14,15,16. Sin embargo, la transcriptómica de célula individual, aunque proporciona información de alta resolución sobre los componentes individuales del nicho hematopoyético, tiene limitaciones inherentes debidas al proceso de digestión del tejido, que disocia las células de su entorno nativo y potencialmente altera su estado original17, así como por la falta de contexto espacial que define la organización del tejido óseo4,18. Esta pérdida de contexto posicional hace imposible trazar con certeza dónde residen poblaciones específicas con perfiles transcripcionales distintos o cómo interactúan con las células vecinas19. Además, el tejido óseo denso a menudo solo se disocia parcialmente, lo que resulta en la subrepresentación de poblaciones celulares clave, como osteocitos y adipocitos, en los conjuntos de datos de scRNA-seq y en una representación sesgada de la heterogeneidad tisular20,21. La transcriptómica espacial permite el estudio de la expresión génica in situ, dentro de secciones de tejido con conservación espacial, recuperando así información contextual y abordando las limitaciones de las tecnologías de célula individual8,19,22,23,24,25,26. Esta tecnología representa un avance esencial en el campo, ya que permite la ubicación espacial precisa y la organización estructural de las diferentes poblaciones celulares que componen la MO, lo cual es indispensable para comprender sus interacciones y roles funcionales dentro de su microentorno nativo8,26. Además, en el contexto de enfermedades, la transcriptómica espacial permite a investigadores y clínicos cerrar la brecha entre la patología tradicional y la genómica de alto rendimiento, al facilitar la superposición de datos moleculares sobre imágenes morfológicas1,8. Las tecnologías de transcriptómica espacial pueden clasificarse en dos grupos principales: métodos basados en secuenciación y métodos basados en imágenes17,24. Las plataformas basadas en secuenciación, como Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) y la de código abierto Open-ST, capturan el ARNm en matrices o microesferas marcadas espacialmente antes de la secuenciación de próxima generación. Los métodos basados en imágenes, incluyendo la hibridación fluorescente multiplexada robusta a errores in situ (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX y Xenium, visualizan directamente los transcritos in situ mediante hibridación multiplexada o química de sondas tipo lazo (padlock probe)27,28. Alternativamente, las plataformas pueden categorizarse como dirigidas o no dirigidas, dependiendo de si requieren detección basada en sondas17,24.

Los métodos de transcriptómica espacial se han aplicado ampliamente a tejidos blandos, como el cerebro, el corazón y el hígado, donde la obtención de secciones histológicas íntegras es sencilla29,30,31. En contraste, la implementación de la transcriptómica espacial en el hueso es considerablemente más difícil debido a su naturaleza mineralizada, lo que requiere un proceso de descalcificación32,33, es decir, la eliminación controlada de fosfato de calcio, con el fin de ablandar el tejido lo suficiente para permitir su seccionado y análisis histológicos o moleculares posteriores8,20,23,34. Los métodos tradicionales de descalcificación comúnmente utilizados en la práctica clínica suelen basarse en soluciones ácidas agresivas, como ácido clorhídrico, nítrico, fórmico o fosfórico, que degradan severamente la integridad del ARN y alteran la morfología celular35,36. Esta degradación molecular reduce la relación señal-ruido en los ensayos espaciales, lo que a menudo resulta en tasas de detección génica inaceptablemente bajas en comparación con los tejidos blandos8,10. Esta limitación subraya la necesidad de protocolos estandarizados de descalcificación que preserven de forma confiable la integridad del ARNm en muestras mineralizadas para análisis espaciales basados en secuenciación8,20.

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estandarizado para preparar muestras de médula ósea (MO) fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) para la transcriptómica espacial, previamente aplicado por Muiños-Lopez et al.8. El flujo de trabajo incluye un paso de descalcificación de 10 días utilizando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a un pH controlado. A diferencia de los ácidos agresivos, el EDTA actúa como un agente quelante suave que preserva la estructura microscópica y mantiene la calidad de los ácidos nucleicos, lo que respalda su uso en aplicaciones moleculares8,20,33,36,37. Como prueba de concepto, el protocolo se implementó en muestras de tejido óseo de modelos murinos sanos y con mieloma múltiple (MM), así como en muestras de MO humanas procedentes de individuos sanos y enfermos, y las muestras se secuenciaron posteriormente en la plataforma Visium de Expresión Génica Espacial38. El flujo de trabajo incluye procedimientos estandarizados para la obtención de tejido a partir de muestras óseas humanas y murinas, fijación, descalcificación, deshidratación, inclusión en parafina y corte, seguidos de una exhaustiva tubería de control de calidad que abarca la evaluación de la integridad de los cortes, tinción con hematoxilina y eosina (H&E), evaluación de la calidad del ARN (DV200) e inmunofluorescencia (IF) opcional para la verificación del tipo celular. Estos pasos preparatorios aseguran que solo los cortes de alta calidad pasen a los flujos de trabajo posteriores de transcriptómica espacial, incluyendo el preprocesamiento de los cortes de tejido, la construcción de bibliotecas, la secuenciación y el control y análisis posterior de la calidad de los datos.

Este procedimiento estandarizado facilita la preparación y evaluación de la calidad de muestras de médula ósea humana y murina para análisis transcriptómico espacial. Tiene como objetivo apoyar investigaciones sobre programas reguladores específicos de nichos en trastornos hematológicos y esqueléticos.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Navarra (Comité de Ética para la Experimentación Animal; protocolos CEEA082-20 y CEEA039-20). El cuidado, manejo y eutanasia de los animales se llevaron a cabo cumpliendo con la legislación española para minimizar el dolor y el sufrimiento.

El estudio con seres humanos fue aprobado por la Comisión de Ética de Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Navarra (Comisión de Ética de Investigación, CEI; proyectos 2022.100mod1 y 2023.172) y por la Comisión de Ética de Investigación del Servicio Navarro de Salud (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1). Todos los procedimientos que involucraron a participantes humanos se llevaron a cabo de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki. Los datos personales se manejaron de forma confidencial, cumpliendo con la Ley Orgánica española 3/2018 de Protección de Datos Personales y Garantía de los Derechos Digitales y con la Ley española 14/2007 sobre Investigación Biomédica.

NOTA: Se proporciona una lista detallada de los reactivos y equipos utilizados en este estudio en la Tabla de Materiales. El flujo experimental completo para la implementación de la transcriptómica espacial en tejidos óseos se ilustra esquemáticamente en Figura 1 y se organiza en tres fases operativas: adquisición de muestras, control de calidad (QC) y perfilado transcriptómico espacial. La adquisición de muestras incluye la recolección de fragmentos óseos humanos o murinos, seguida de fijación, descalcificación con EDTA, deshidratación, inclusión en parafina, corte y preparación de portaobjetos. La fase de control de calidad evalúa la integridad histológica y la preservación del ARN. Las secciones óseas validadas pasan entonces por permeabilización del tejido directamente en el portaobjeto, preparación de la biblioteca, secuenciación y análisis de datos.

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Figura 1: Flujo de trabajo para la recolección de muestras y preparación basada en EDTA de tejidos óseos murinos y humanos. Se recolectan fémures de ratón y muestras óseas humanas, se fijan, descalcifican con EDTA, deshidratan, incluyen en parafina y seccionan. La calidad de las muestras se evalúa mediante tinción con H&E e integridad del ARN (evaluación DV200), seguido de preprocesamiento espacial de tejidos para transcriptómica, preparación de bibliotecas, secuenciación y control de calidad de los datos. Abreviaturas: BM = médula ósea; DV200 = porcentaje de fragmentos de ARN más largos de 200 nucleótidos; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; H&E = hematoxilina y eosina; QC = control de calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Adquisición y procesamiento de muestras de tejido óseo

  1. Recolección de hueso de ratón
    1. Anestesiar los animales con 5% de isoflurano y confirmar la pérdida de reflejos.
    2. Una vez completamente anestesiados, realizar la eutanasia mediante dislocación cervical siguiendo las directrices institucionales y regulatorias.
      ​NOTA: La eutanasia debe realizarse por personal capacitado, y se debe confirmar la muerte antes de proceder con la recolección de tejido.
    3. Desinfectar la piel rociando etanol al 70% sobre la superficie dorsal del ratón y, con tijeras quirúrgicas, realizar una pequeña incisión para retirar cuidadosamente la piel y exponer las extremidades posteriores.
    4. Disecar las extremidades posteriores cortando por encima de la articulación de la cadera y transferirlas a un tubo de 50 mL que contenga 10 mL de solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco fría (DPBS). Colocar el tubo en hielo.
    5. Retirar el músculo y tejido conectivo adheridos utilizando fórceps estéril y un escalpelo.
    6. Transferir los huesos a un recipiente estéril de 50 mL previamente llenado con DPBS frío y limpio, luego colocar el recipiente en hielo.
    7. Proceder inmediatamente con la fijación del tejido de muestra para preservar la integridad del tejido.
  2. Manejo de muestras óseas humanas
    1. Recibir biopsias de núcleo óseo o fragmentos óseos quirúrgicos en recipientes estériles de 100 mL.
    2. Transferir los fragmentos óseos a un recipiente limpio y estéril de 100 mL previamente llenado con DPBS frío, luego colocarlo en hielo.
    3. Proceder inmediatamente con la fijación de la muestra para preservar la integridad del tejido.
      ADVERTENCIA: Las muestras humanas deben manejarse bajo condiciones BSL 2.
  3. Fijación del tejido óseo
    1. Tomar el recipiente de 50 mL o 100 mL que contiene la muestra ósea y desechar el DPBS.
    2. Etiquetar cassettes de plástico e introducir las muestras óseas en cassettes individuales. Cerrar las tapas firmemente para evitar la pérdida de tejido durante el procesamiento posterior.
      ​NOTA: Para muestras de ratón, colocar un hueso por cassette. Para muestras óseas humanas, si es necesario, usar un escalpelo estéril para cortar el tejido en fragmentos lo suficientemente pequeños para caber en cassettes estándar, y colocar un fragmento por cassette. Si las muestras óseas humanas son demasiado duras para seccionar en esta etapa, pueden dejarse intactas y transferirse a la solución de descalcificación; una vez descalcificadas, el tejido ablandado puede cortarse en fragmentos del tamaño adecuado y colocarse en cassettes etiquetados.
    3. Agregar solución de formaldehído tamponada al 4% en una proporción de muestra a fijador de 1:20 e incubar la muestra durante 24 h a 4 °C.
      ADVERTENCIA: Manejar el fijador dentro de una campana extractora química debido a su toxicidad y vapores volátiles.
      NOTA: Evitar la sobrefijación (>48 h), que reduce la integridad del ARN en los flujos de trabajo FFPE39.
  4. Descalcificación del tejido óseo mineralizado
    1. Desechar el formaldehído y lavar la muestra ósea con agua ultrapura. Enjuagar con agua, agitar brevemente y desechar para eliminar cualquier residuo de formaldehído restante.
    2. Preparar una solución de EDTA 0,25 M en agua ultrapura y ajustar el pH a 6,95.
      NOTA: Aunque el EDTA a menudo se ajusta a pH 8,0 en protocolos tradicionales de descalcificación, este protocolo utiliza EDTA a aproximadamente pH 6,95 para favorecer una quelación eficiente mientras se preserva la morfología del tejido y la calidad del ARN8.
    3. Agregar la solución de EDTA al recipiente que contiene la muestra ósea e incubar durante 10 días a 4 °C con agitación suave.
      ​NOTA: Para muestras de ratón, aproximadamente 50 mL de solución de EDTA generalmente es suficiente. Para muestras óseas humanas, se utiliza típicamente aproximadamente 100 mL. Sin embargo, este volumen puede ajustarse según el tamaño del hueso para asegurar la inmersión completa y una descalcificación efectiva.
    4. Después de 5 días de descalcificación, desechar la solución de EDTA y reemplazarla con el mismo volumen de EDTA fresco, ya que la capacidad quelante se satura con el tiempo. Continuar la incubación en las mismas condiciones.
    5. Después de 10 días de incubación, desechar la solución de EDTA y evaluar si la descalcificación está completa.
      1. Realizar un pequeño corte con un escalpelo estéril o insertar una aguja fina y estéril en una esquina o región periférica del tejido, seleccionando siempre un área de baja relevancia analítica para evitar alterar regiones de interés. Colocar el hueso en una placa de Petri estéril para estabilizar la muestra durante el corte o la inserción de la aguja. Si el tejido se puede cortar fácilmente o la aguja penetra con mínima resistencia, la muestra está adecuadamente descalcificada.
      2. En el caso de fémures de ratón, doblar suavemente el hueso con fórceps para evaluar la flexibilidad, un indicador confiable de la eliminación completa del mineral.
        NOTA: La duración del paso de descalcificación depende del tamaño y grosor de la muestra ósea, así como del volumen de EDTA utilizado. Si el hueso permanece firme después del período inicial de incubación, continuar la descalcificación hasta que el tejido esté suficientemente blando para cortarse fácilmente. Una prolongación excesiva puede comprometer la calidad del tejido y la integridad del ARN, por lo que la extensión debe limitarse al tiempo mínimo necesario para lograr un ablandamiento adecuado20.
  5. Deshidratación
    1. Lavar agregando agua ultrapura al recipiente que contiene la muestra ósea, luego incubar durante 5 min a 4 °C con agitación.
    2. Desechar el agua y reemplazarla con una solución de etanol al 70%. Incubar durante 1 h a 4 °C.
      NOTA: Este paso puede servir como punto de interrupción. Las muestras pueden almacenarse en etanol al 70% a 4 °C antes de continuar con los siguientes pasos. La duración máxima de almacenamiento no fue validada experimentalmente en este protocolo, por lo que los usuarios deben proceder según las prácticas estándar de su laboratorio.
    3. Deshidratar secuencialmente la muestra en concentraciones crecientes de etanol (70%, 80%, 96%; 1 h cada uno a 4 °C), seguido de etanol al 100% durante la noche a 4 °C.
    4. Desechar el etanol al 100% y reemplazarlo con xileno. Incubar durante 4 h a temperatura ambiente (RT).
    5. Desechar el xileno y colocar el cassette de la muestra en un vaso que contenga parafina derretida y limpia. Incubar en parafina derretida durante la noche a 60 °C.
      NOTA: Pueden usarse tiempos de infiltración más cortos cuando están disponibles sistemas de procesamiento asistidos por vacío, ya que estos dispositivos facilitan una penetración más eficiente de la parafina40,41,42.
      ADVERTENCIA: Todos los pasos que involucran xileno y soluciones de etanol graduadas deben realizarse dentro de una campana extractora química para garantizar una ventilación adecuada y minimizar la exposición a vapores tóxicos e inflamables.
  6. Inclusión en parafina
    ​NOTA: Limpiar las superficies de la estación de inclusión con una solución de descontaminación de RNasas para prevenir la degradación del ARN.
    1. Encender la estación de inclusión y precalentar el reservorio de parafina, el baño de parafina para cassettes, el baño de parafina para moldes y la placa de calentamiento para moldes a 60 °C. Activar la placa fría para que se enfríe antes de la inclusión.
    2. Dejar que la parafina se derrita completamente, y solo entonces colocar los cassettes que contienen las muestras infiltradas con parafina en el baño de parafina para cassettes. Incubar durante 2 h para asegurar la eliminación completa del xileno antes de la inclusión.
    3. Colocar todos los moldes necesarios en el baño de parafina para moldes.
      NOTA: Para muestras humanas, usar moldes metálicos estándar para inclusión. Para muestras de ratón, usar moldes plásticos para inclusión compatibles con la plataforma Visium que incluyan una cavidad cuadrada con dimensiones adecuadas para una correcta colocación de secciones en portaobjetos Visium. Dado que los huesos completos de ratón no caben completamente dentro de la cavidad cuadrada de estos moldes, cortar los huesos inmediatamente antes de la inclusión usando un escalpelo estéril para obtener fragmentos del tamaño adecuado. Puede incluirse uno o dos fragmentos óseos por molde, dependiendo de sus dimensiones.
    4. Agregar una capa base delgada de parafina fresca dispensando parafina derretida desde la salida central de la estación de inclusión.
    5. Abrir el cassette y transferir suavemente el tejido del cassette al molde usando fórceps calientes.
    6. Colocar el molde lleno de parafina sobre la placa de calentamiento para moldes y, mientras la parafina permanece líquida, orientar el tejido en el plano de corte deseado con fórceps calientes.
    7. Colocar el molde sobre la superficie fría de la estación de inclusión para fijar brevemente la posición del fragmento óseo.
    8. Llenar completamente el molde con parafina derretida desde el dispensador, asegurándose de que el tejido esté completamente cubierto y de que no queden burbujas grandes.
    9. Colocar el cassette etiquetado encima del molde para que forme la base del bloque de parafina.
    10. Transferir el molde con el cassette adjunto a la placa fría de la estación de inclusión. Dejar que la parafina se solidifique completamente durante 10 min, hasta que el bloque esté opaco y firme.
    11. Una vez solidificado, retirar el bloque de parafina del molde y almacenarlo a 4 °C hasta el corte.
      NOTA: Este paso puede servir como punto de interrupción. El bloque de parafina puede almacenarse a 4 °C; sin embargo, siempre que sea posible, el corte de tejido y los análisis transcriptómicos espaciales posteriores deben realizarse tan pronto como sea práctico después de la inclusión para minimizar la degradación del ARN durante el almacenamiento43,44.
  7. Corte y preparación de portaobjetos
    NOTA: Limpiar el microtomo y el baño de agua con una solución de descontaminación de RNasas para prevenir la degradación del ARN.
    1. Llenar el baño de agua con agua destilada y precalentar a 42 °C. Encender el microtomo e instalar una cuchilla nueva. Etiquetar portaobjetos con un lápiz.
    2. Montar el bloque de parafina en el portamuestras, asegurando que el cassette esté orientado según el plano de corte longitudinal deseado.
      ​NOTA: Preparar una bolsa de plástico llena de hielo, y cuando el corte se vuelva difícil debido a la parafina blanda, colocar la bolsa de hielo directamente sobre el bloque mientras permanece montado en el microtomo, asegurándola con una banda elástica durante varios minutos para endurecer la parafina y mejorar la calidad del corte.
    3. Establecer el grosor del microtomo en 20 µm y realizar los cortes de desbaste.
    4. Cambiar la configuración del microtomo a 5 µm. Recoger cuatro secciones de 5 µm en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL etiquetado y libre de RNasas. Mantener el tubo en hielo seco y almacenarlo a -80 °C.
    5. Continuar el corte a 5 µm y flotar las cintas en el baño de agua. Una vez que la sección esté completamente expandida y sin arrugas, recogerla con el portaobjetos etiquetado.
      1. En cada conjunto de secciones (por ejemplo, cada 5-10 cintas, dependiendo del tamaño del tejido), recoger 4 secciones adicionales de 5 µm en un nuevo tubo de 1,5 mL etiquetado. Repetir este proceso hasta obtener un total de tres tubos de 1,5 mL que contengan secciones de 5 µm.
        NOTA: Si el tejido se agrieta, rompe o no puede obtenerse en una sección continua, la muestra no está completamente descalcificada y requiere tiempo adicional de descalcificación. Recuperar la muestra revirtiendo los pasos del protocolo hasta alcanzar la fase de descalcificación. Para ello, fundir el bloque de parafina a 60 °C durante aproximadamente 2 h y transferir la muestra a xileno (2 h). Rehidratar la muestra mediante soluciones graduadas de etanol (100%, 96%, 80%, 70%) seguidas de agua destilada. Devolver la muestra rehidratada a EDTA 0,25 M fresco (pH 6,95) y extender el período de descalcificación según sea necesario antes de continuar con la deshidratación, re-inclusión y corte. Este procedimiento de recuperación debe usarse estrictamente como última opción, ya que revertir el procesamiento FFPE puede comprometer la integridad del ARN.
    6. Colocar los portaobjetos en un horno a 37 °C durante la noche para evaporar cualquier agua residual, luego almacenarlos a 4 °C.
    7. Para mejorar la adhesión del tejido, opcionalmente hornear los portaobjetos durante 3 h a 42 °C antes de incubarlos durante la noche a 37 °C.
      NOTA: Este paso generalmente no es necesario cuando se usan los portaobjetos de vidrio listados en la Tabla de Materiales, ya que estos portaobjetos proporcionan una fuerte adhesión y el tejido generalmente permanece firmemente unido durante todo el procesamiento. Este paso puede servir como punto de interrupción. Los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C; sin embargo, siempre que sea posible, los análisis transcriptómicos espaciales posteriores deben realizarse tan pronto como sea práctico después de la inclusión para minimizar la degradación del ARN durante el almacenamiento43,44.

2. Evaluación de la calidad de la muestra

  1. Evaluación de la calidad de las secciones
    1. Examine todas las secciones una por una bajo un microscopio de luz de campo claro estándar (4×–10×). Inspeccione cada portaobjetos para asegurarse de que las secciones no estén fragmentadas y registre la calidad de cada sección.
      ​NOTA: Verifique la presencia de pliegues, arrugas, compresión o marcas de vibración, que podrían indicar problemas con la dureza del parafina, el filo del cuchillo o una descalcificación incompleta. Confirme que no falten áreas de tejido debido a desprendimiento durante el corte o la transferencia al baño de agua.
    2. Seleccione las secciones mejor conservadas para la transcriptómica espacial (las más completas, con mejor morfología).
    3. Identifique las secciones consecutivas adyacentes a las seleccionadas y resérvelas para tinción con H&E e inmunofluorescencia (IF), asegurando que la imagen teñida corresponda lo más estrechamente posible al tejido que será secuenciado.
  2. Tinción con H&E para la integridad del tejido
    1. Coloque los portaobjetos en una rejilla de tinción de vidrio e incúbelos durante 15 min a 60 °C.
    2. Transfiera la rejilla a frascos de vidrio que contengan xileno durante 15 min.
    3. Rehidrate las secciones moviendo la rejilla a través de frascos de tinción que contengan etanol al 100%, 96%, 80% y 70%, incubando 5 min en cada solución.
      ​PRECAUCIÓN: Todos los pasos que involucren xileno y soluciones de etanol en gradación deben realizarse dentro de una campana extractora química para garantizar una ventilación adecuada y minimizar la exposición a vapores tóxicos e inflamables.
    4. Lave los portaobjetos durante 5 min en un frasco de tinción lleno con agua.
    5. Sumerja la rejilla en hematoxilina durante 10 min, luego enjuague bajo agua corriente hasta que el agua de lavado quede clara.
    6. Sumerja la rejilla en agua que contenga cinco gotas de ácido clorhídrico concentrado, agitando suavemente hasta que aparezca un tono rojizo.
    7. Transfiera la rejilla a agua saturada con carbonato de litio hasta que se desarrolle una coloración azul estable, luego enjuague brevemente con agua.
    8. Teña las secciones con eosina al 1% (p/v) durante 5 min, luego enjuague nuevamente con agua.
    9. Deshidrate los portaobjetos moviendo la rejilla a través de frascos de tinción que contengan agua, etanol al 70%, 80%, 96% y 100%, incubando 5 min en cada solución.
    10. Limpie los portaobjetos con xileno durante 15 min.
    11. Seque suavemente la parte posterior de cada portaobjetos, aplique medio de montaje sobre un cubreobjetos y monte las secciones. Deje secar los portaobjetos a RT durante 24 h antes de la obtención de imágenes.
    12. Realice la obtención de imágenes del tejido utilizando un microscopio de alta resolución con aumento de 20x.
      NOTA: Realice primero la tinción con H&E en secciones adyacentes como paso de control de calidad para evaluar la idoneidad de la muestra para la transcriptómica espacial. Tras la selección, realice una segunda tinción con H&E directamente sobre la sección destinada a la transcriptómica espacial, siguiendo las pautas de preparación de tejidos del fabricante para la plataforma de expresión génica espacial indicadas en la Tabla de Materiales.
  3. Evaluación de la integridad del ARN (DV200)
    ​NOTA: Para el protocolo de expresión génica espacial, el número tradicional de integridad del ARN (RIN) no es efectivo porque los picos del ARN ribosómico 18S y 28S generalmente están ausentes en tejidos fijados. Por lo tanto, la métrica DV200, definida como el porcentaje de fragmentos de ARN mayores de 200 nucleótidos, se utiliza comúnmente como un parámetro de calidad más informativo que el RIN para muestras clínicas degradadas. Para Visium v2, 10x Genomics recomienda usar bloques de FFPE con un valor DV200 ≥ 30% para garantizar una hibridación eficiente de las sondas y un rendimiento óptimo del ensayo. La selección de bloques de tejido con los valores DV200 más altos disponibles ayuda a prevenir pérdidas en la secuenciación y maximiza la sensibilidad de los puntos.
    1. Recupere los tubos de 1,5 mL que contienen las secciones de 5 µm recolectadas durante el paso de corte de tejido y colóquelos sobre hielo para extraer ARN.
    2. Extraiga ARN total. Este procedimiento estandarizado incluye desparafinización de la muestra, digestión con proteinasa K para revertir los enlaces cruzados de formalina, eliminación del ADN genómico mediante tratamiento con DNasa I y, finalmente, elución del ARN purificado en agua libre de RNasas.
    3. Evalue la integridad del ARN utilizando un sistema basado en electroforesis capilar con un ensayo de ARN de alta sensibilidad. Un resumen del flujo de trabajo se proporciona en el Archivo Suplementario 142,45,46,47,48.
  4. Inmunofluorescencia opcional para verificación del tipo celular
    1. Coloque el portaobjetos de FFPE en una rejilla de tinción de vidrio e incúbelo durante 15 min a 60 °C.
    2. Transfiera la rejilla a frascos de vidrio que contengan xileno durante 15 min.
    3. Rehidrate la sección moviendo la rejilla a través de etanol al 100%, 96%, 80% y 70% durante 2 min cada uno, seguido de 5 min en agua y 5 min en PBS-Tween (1x PBS suplementado con 0,1% Tween-20).
      PRECAUCIÓN: Todos los pasos que involucren xileno y etanol deben realizarse dentro de una campana extractora química.
    4. Realice la recuperación de antígenos según las recomendaciones del fabricante para el anticuerpo primario, asegurando que el tampón de recuperación, el pH y las condiciones de calentamiento coincidan con la hoja técnica del anticuerpo. NOTA: En este flujo de trabajo, la recuperación de antígenos se realiza usando Tris 10 mM y EDTA 1 mM, pH 9,0, en un sistema de calentamiento tipo olla durante 30 min a 95 °C, seguido de enfriamiento durante 20 min a RT.
    5. Lave el portaobjetos dos veces durante 10 min cada vez en PBS-Tween.
    6. Dibuje una barrera hidrófoba alrededor del tejido usando un lápiz hidrófobo y bloquee la unión no específica aplicando BSA al 5% en DPBS 1x sobre las secciones de tejido durante al menos 40 min a RT en una cámara humidificada.
      NOTA: La cámara humidificada se prepara colocando una hoja de papel filtro en una caja de tinción de plástico y humedeciéndola completamente con agua destilada para mantener un ambiente húmedo estable durante la incubación con los anticuerpos.
    7. Prepare la solución de anticuerpo primario en DPBS 1x a la dilución recomendada para cada anticuerpo.
      NOTA: En este flujo de trabajo, se utilizaron anticuerpos primarios contra Emcn (V.7C7) y Cd271 (ME20.4) para identificar EC y MSC murinos, respectivamente, mientras que se usaron anticuerpos contra CD31 (JC70A) o PRRX1 (policlonal) para identificar sus contrapartes humanas, según el protocolo del fabricante.
    8. Elimine la solución de bloqueo golpeando suavemente el borde del portaobjetos sobre papel absorbente para eliminar gotas residuales, luego aplique la mezcla de anticuerpos primarios e incube el portaobjetos durante toda la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
    9. Lave el portaobjetos dos veces durante 5 min en PBS-Tween y prepare la solución de anticuerpo secundario a la dilución recomendada por el fabricante, asegurando que los fluoróforos sean espectralmente compatibles y no se superpongan.
      NOTA: En este flujo de trabajo, se utilizó un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor a una dilución de 1:200.
    10. Aplique la mezcla de anticuerpos secundarios e incube durante 30 min a RT, protegido de la luz en una cámara humidificada.
    11. Lave el portaobjetos dos veces durante 5 min en PBS-Tween.
    12. Aplique una dilución 1:10 del medio de montaje que contiene DAPI (véase la Tabla de Materiales), preparado en una solución de PBS–glicerol 1:1, e incube la muestra durante 5 min.
    13. Monte la sección con un cubreobjetos y selle los bordes con esmalte de uñas para evitar el secado.
    14. Visualice el tejido teñido utilizando una plataforma de imagen multiespectral.

Archivo suplementario 1: Resumen de los pasos del protocolo para la evaluación de la integridad del ARN y el flujo de trabajo de transcriptómica espacial Visium. Este archivo suplementario proporciona un resumen detallado de los pasos del procedimiento realizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incluye: (i) el ensayo High Sensitivity RNA ScreenTape utilizado para evaluar la integridad del ARN (DV200), descrito en el paso 2.3.3 del protocolo principal, y (ii) una visión general del flujo de trabajo de expresión génica espacial Visium CytAssist, que comprende el preprocesamiento del tejido, la preparación de la biblioteca y la secuenciación (pasos 3.1–3.3 del protocolo principal).Haga clic aquí para descargar este archivo.

3. Transcriptómica espacial

NOTA: Realice el flujo de trabajo de transcriptómica espacial utilizando la plataforma y los reactivos enumerados en la Tabla de materiales, siguiendo las guías de usuario correspondientes42,45,46. El Archivo suplementario 1 resume los principales pasos de preprocesamiento del tejido, preparación de la biblioteca y secuenciación.

  1. Control de calidad de los datos de transcriptómica espacial
    1. Demultiplexar los datos de transcriptómica espacial utilizando la canalización estándar para conjuntos de datos Visium (véase Tabla de Materiales).
    2. Mapear las lecturas al genoma de referencia de Ensembl 105 apropiado.
      NOTA: Se utilizaron GRCh38 para muestras humanas y mm10 para muestras de ratón.
    3. Generar matrices filtradas de características-barritas utilizando la misma canalización e importarlas al entorno de análisis espacial/única célula posterior (véase Tabla de Materiales).
    4. Examinar las imágenes H&E en la interfaz de visualización proporcionada por la canalización de transcriptómica espacial (véase Tabla de Materiales) y eliminar manualmente los puntos que se superponen con la región del hueso cortical o el tejido óseo, según el conjunto de datos.
    5. Normalizar los conjuntos de datos utilizando un método de transformación estabilizadora de la varianza comúnmente aplicado en flujos de trabajo de análisis de célula única (véase Tabla de Materiales).

Resultados

Para evaluar la aplicabilidad de este protocolo basado en EDTA en diferentes especies y contextos de enfermedad, se aplicó el protocolo a cuatro muestras de médula ósea: dos fémures de ratón y dos muestras óseas humanas que representan condiciones sanas y de mieloma múltiple (MM) (Tabla 1 y Figura 1).

Identificación de la muestraEspecieSexoEdadEnfermedad
YFPcγ1MouseHembra210 díasSano
mMMMouseMacho314 díasMM
hHBMHumanoMacho76 añosSano
hMMHumanoHembra50 añosMM

Tabla 1: Muestras de hueso murino y humano incluidas en el estudio. Se proporcionan la especie, el sexo, la edad y el estado de salud de cada muestra. Abreviaturas: hHBM = médula ósea humana sana; hMM = mieloma múltiple humano; mMM = mieloma múltiple murino; MM = mieloma múltiple; YFPcγ1 = ratón control sano.

Las muestras utilizadas en este estudio han sido previamente caracterizadas y reportadas en publicaciones anteriores del grupo de investigación, específicamente en los trabajos de Muiños-Lopez et al. y Cenzano et al., excepto por la muestra de ratón con MM. Para los especímenes previamente reportados, los datos y resultados de transcriptómica espacial se presentan en esos estudios8,10. Por lo tanto, el material incluido aquí se utiliza para evaluar la idoneidad técnica del protocolo para la transcriptómica espacial, más que para presentar hallazgos biológicos novedosos.

Las muestras de hueso de fémur de ratón se obtuvieron del modelo de ratón con mieloma múltiple (MM) genéticamente modificado BIC (BIcγ1), que reproduce las características clínicas e inmunológicas de los pacientes con MM, y de su correspondiente ratón control sano (YFPcγ1)8,49. Se recolectó un fémur individual de cada animal, se limpió y procesó según el protocolo estandarizado (Figura 2A). Se utilizaron específicamente fémures para estos análisis porque ofrecen abundante médula disponible, una calidad superior del nicho y facilidad para un procesamiento reproducible, lo que los hace especialmente adecuados para una plataforma de transcriptómica espacial basada en secuenciación8,10. La decalcificación exitosa del fémur del ratón control se confirmó macroscópicamente mediante un aumento notable en la flexibilidad del tejido durante la manipulación manual con pinzas (Figura 2B). Posteriormente, este fragmento óseo se incluyó eficientemente en parafina utilizando un molde especializado compatible con transcriptómica espacial, con el fin de preservar la integridad del ARN y la arquitectura tisular para análisis moleculares posteriores (Figura 2C).

También se analizaron dos muestras de MO humana con historiales de procesamiento contrastantes8,10. Se obtuvo una muestra fresca de MO humana hematológicamente sana a partir de desechos quirúrgicos durante un reemplazo articular de cadera en el Hospital Universitario de Navarra (Figura 2D–F). Para demostrar la utilidad traslacional del protocolo, esta muestra se procesó de la misma manera que las muestras murinas. De acuerdo con los resultados observados en tejido de ratón, la descalcificación exitosa de hueso humano con EDTA se confirmó macroscópicamente mediante el ablandamiento completo del tejido, evidenciado por la penetración fácil de una aguja (Figura 2E). El fragmento óseo humano descalcificado se incluyó con éxito en parafina utilizando un molde metálico estándar para su posterior procesamiento (Figura 2F). La segunda muestra humana consistió en biopsias de MO en FFPE archivadas del cresta ilíaca de un paciente con MM, provenientes del Departamento de Anatomía Patológica de la Clínica Universidad de Navarra (CUN). Cabe destacar que esta muestra archivada de MM había sido previamente descalcificada mediante un protocolo clínico estándar que utiliza ácidos fuertes36. Esta muestra proporciona un contraste cualitativo con los especímenes procesados con EDTA; sin embargo, las diferencias en el origen del tejido, el historial de fijación, almacenamiento y descalcificación implican que las diferencias observadas no pueden atribuirse únicamente al agente descalcificante.

figure-results-1
Figura 2: Muestras de hueso murino y humano durante la preparación basada en EDTA. (A) Fémures intactos de ratón control antes de la descalcificación. (B) Fémur descalcificado de ratón control mostrando mayor flexibilidad. (C) Fragmentos de hueso de ratón control embebidos en parafina. (D) Fragmentos de hueso humano sano procedentes de cirugía de cadera antes de la descalcificación. (E) El mismo fragmento después de la descalcificación con EDTA, mostrando la penetración de la aguja. (F) Hueso humano sano descalcificado con EDTA embebido en parafina. Barras de escala: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Abreviatura: EDTA = ácido etilendiaminotetraacético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para analizar la arquitectura tisular general, se realizó tinción con H&E (Figura 3). La mejor preservación morfológica observada en las secciones murinas podría reflejar diferencias en el manejo y procesamiento de las muestras más que rasgos intrínsecos específicos de la especie. Los fémures de ratón se recolectaron específicamente para transcriptómica espacial y se procesaron inmediatamente como huesos intactos, preservando así su arquitectura (Figura 3A, B). En contraste, las muestras humanas provienen bien de material residual obtenido durante cirugías de reemplazo de cadera (Figura 3C) o de biopsias óseas diagnósticas de mieloma múltiple (MM) (Figura 3D), ambas con posible variabilidad en la calidad tisular preanalítica. Como resultado, las diferencias morfológicas entre la muestra humana descalcificada con EDTA y la biopsia de MM descalcificada con ácido son sutiles, ya que ambos especímenes humanos ya presentan limitaciones estructurales basales introducidas no solo por la descalcificación, sino también por el procesamiento tisular general (Figura 3C, D). En consecuencia, evaluar exhaustivamente la calidad de la muestra para transcriptómica espacial requiere analizar múltiples parámetros distintos. Primero, debe monitorearse cuidadosamente la integridad del tejido, ya que la preservación estructural puede variar significativamente según el tipo específico de muestra y no únicamente según el ácido descalcificante utilizado. Segundo, también debe evaluarse la calidad del ARN, ya que las condiciones de descalcificación pueden afectarla20,35,36.

figure-results-2
Figura 3: Cortes teñidos con H&E utilizados para la evaluación de la calidad del tejido. Secciones consecutivas de FFPE corresponden a (A) un ratón control sano10, (B) un ratón con MM, (C) hueso humano sano8,10 y (D) una biopsia humana de MM8. Barras de escala = 500 µm. Abreviaturas: FFPE = fijado en formalina e incluido en parafina; H&E = hematoxilina y eosina; MM = mieloma múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para complementar el análisis histológico, se evaluó la calidad del ARN. Si bien la tinción con H&E arrojó diferencias ambiguas, la integridad del ARN diferenció claramente los efectos de los dos métodos de descalcificación (Tabla 2). Los valores de DV200 de las muestras murinas y de la muestra ósea humana sana superaron el umbral recomendado para los ensayos Visium FFPE, lo que indica una distribución adecuada de la longitud de los fragmentos de ARN para la hibridación de sondas y la construcción de bibliotecas. La muestra del ratón sano con YFP muestra un DV200 del 82,55 %, y la muestra ósea humana sana (hHBM) alcanza el 58 %, ambas considerablemente por encima del umbral de aceptabilidad del 30 % definido por 10x Genomics. La muestra del ratón con MM (mMM) muestra un DV200 del 31,3 %, cercano al límite inferior de aceptabilidad, lo que podría reflejar un almacenamiento prolongado del bloque de parafina a 4 °C antes del corte, entre otros factores específicos de la muestra. En contraste, la biopsia humana con MM descalcificada con ácido (hMM) exhibe un DV200 de solo el 8 %, lo que se asoció con una integridad del ARN marcadamente más baja, incluso cuando la deterioración morfológica es menos pronunciada. En resumen, es importante realizar evaluaciones tanto estructurales como moleculares para determinar la idoneidad de la muestra para el análisis espacial posterior.

Identificación de la muestraDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: Porcentaje de fragmentos totales de ARN > 200 nucleótidos.
2Esta muestra fue desmineralizada utilizando un protocolo clínico estándar que implica ácidos fuertes.

Tabla 2: Calidad del ARN de las muestras del estudio. DV200 es el porcentaje de fragmentos de ARN más largos de 200 nucleótidos; se consideró que los valores de al menos 30 % eran adecuados para la transcriptómica espacial posterior. Abreviaturas: hHBM = médula ósea humana sana; hMM = mieloma múltiple humano; mMM = mieloma múltiple murino.

También se pueden realizar evaluaciones adicionales de calidad. Para validar aún más la integridad del tejido y confirmar la preservación de compartimentos celulares específicos tras la descalcificación con EDTA, se realizó tinción inmunofluorescente (IF) opcional en secciones adyacentes de FFPE de tejidos de ratón y humano. Se utilizaron anticuerpos contra endomucina (Emcn) y Cd271 para visualizar células endoteliales (EC) y células mesenquimales (MSC), respectivamente, en la muestra de ratón con MM (Figura 4A). Esta tinción mostró que los tejidos procesados con EDTA presentaban estructuras vasculares bien definidas con tinción continua de Emcn y redes estromales preservadas, lo que indica que los marcadores evaluados permanecieron detectables tras el procesamiento. Además, imágenes de alta resolución obtenidas mediante un sistema automatizado de imagen multiespectral proporcionaron evidencia adicional de que los antígenos evaluados permanecieron detectables para la verificación del tipo celular, aportando una capa adicional de control de calidad antes del análisis de transcriptómica espacial. Asimismo, estas observaciones también se encontraron en muestras humanas sanas de personas mayores, en las cuales la expresión de EC también se detectó mediante anticuerpos contra CD31 y la de MSC mediante anticuerpos contra PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), lo que demuestra que los marcadores de nicho evaluados permanecieron identificables tras la descalcificación con EDTA (Figura 4B). En contraste, estos hallazgos no pudieron replicarse en biopsias humanas de MM sometidas a diversos protocolos de descalcificación ácida. Como se mencionó anteriormente, la integridad del ARN en estas muestras fue baja, lo que limitó el análisis transcriptómico posterior. Debido al estado degradado de estas muestras humanas, su utilidad posterior se limitó al perfilado transcriptómico basal8 y a la evaluación inmunohistoquímica (IHC) de células plasmáticas malignas (PC) (Figura 4C).

figure-results-3
Figura 4: Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica opcionales para la verificación del tipo celular. (A) Tejido de MM de ratón que muestra núcleos marcados con DAPI (azul), MSC positivos para CD271 (verde) y EC positivos para EMCN (rojo). (B) Hueso humano sano que muestra núcleos marcados con DAPI (azul), MSC positivos para PRRX1 (verde) y EC positivos para CD31 (rojo)10. (C) Biopsia humana de MM que muestra PC malignos positivos para CD1388. Barras de escala: (A) 250 µm (vista general), 20 µm (ampliación combinada) y 50 µm (imágenes de canal único); (B) 500 µm (vista general) y 20 µm (ampliaciones combinadas y de canal único); (C) 500 µm. Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EC = célula endotelial; MM = mieloma múltiple; MSC = célula estromal mesenquimal; PC = célula plasmática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En conjunto, los resultados de la morfología del tejido y del DV200 respaldan la idoneidad de las muestras procesadas con EDTA para el análisis espacial de transcritos. Anteriormente se han reportado aplicaciones de transcriptómica espacial utilizando este protocolo de preparación8,10.

Discusión

Al integrar la descalcificación controlada basada en EDTA, el procesamiento estandarizado de FFPE y puntos de control de calidad rigurosos, este protocolo supera muchas de las limitaciones tradicionalmente asociadas con la preparación de tejido óseo para la transcriptómica espacial, particularmente aquellas relacionadas con la degradación del AR y el daño morfológico causado por métodos de descalcificación con ácidos fuertes8,10,20,33,36. El paso más crítico en el procesamiento de muestras mineralizadas para la transcriptómica espacial es la descalcificación. Una descalcificación insuficiente da como resultado un hueso que permanece demasiado rígido para seccionar, haciendo físicamente imposible obtener secciones de alta calidad para la transcriptómica espacial8,20,23,37,50. Cuando el tejido óseo sigue siendo demasiado duro, se fractura o vibra contra la hoja del microtomo, lo que provoca secciones desgarradas o con agujeros que no representan fielmente la arquitectura nativa de la médula ósea (BM). Es importante destacar que el éxito de la descalcificación no puede confirmarse completamente hasta la etapa de microtomía: incluso muestras que aparentemente están ablandadas pueden aún contener minerales residuales que solo se evidencian al intentar cortar secciones delgadas de FFPE. Por esta razón, es esencial un monitoreo cuidadoso del progreso de la descalcificación para garantizar resultados reproducibles.

El procedimiento utiliza EDTA 0,25 M a pH 6,95 durante 10 días con agitación constante y reemplazo de la solución el quinto día8,10. Durante el desarrollo del protocolo, se evaluaron el EDTA solo, el EDTA suplementado con polivinilpirrolidona y el ácido fórmico al 10 %, junto con diferentes duraciones de descalcificación y programas de reemplazo de solución; los datos comparativos no se presentan aquí. Duraciones inferiores a 10 días provocaron frecuentemente rotura del tejido durante el corte de muestras de ratón, mientras que las muestras humanas mostraron un comportamiento dependiente de la muestra. Por lo tanto, se utiliza una duración de 10 días para fémures murinos, mientras que las muestras humanas pueden requerir una descalcificación más prolongada según su densidad y contenido trabecular. Se deben utilizar puntos de control físico de calidad antes del incluido en parafina. Si durante la microtomía se evidencia una descalcificación insuficiente, utilice el procedimiento de reprocesamiento solo como un paso de salvamento de último recurso, ya que el calor adicional, la exposición a disolventes y la rehidratación podrían comprometer la calidad del ARN.

La principal limitación de este método es el tiempo prolongado de procesamiento, que contrasta marcadamente con los protocolos ácidos rápidos comúnmente utilizados en patología clínica20,36. Aunque tiempos de procesamiento más largos son generalmente aceptables en entornos de investigación, estudios recientes, como el protocolo descrito por Miao et al., que utiliza la solución de Morse (22,5 % de ácido fórmico y 10 % de citrato de sodio) para descalcificar en 24 h, destacan el creciente interés en acelerar la preparación ósea para ensayos espaciales20. Sin embargo, los métodos basados en ácidos históricamente conllevan un riesgo mucho mayor de degradación del ARN, reduciendo los valores DV200 y limitando finalmente su compatibilidad con la transcriptómica espacial1,8,35,36. Este enfoque basado en EDTA prioriza la conservación del ARN frente a la velocidad, asegurando compatibilidad con plataformas espaciales basadas en secuenciación, como Visium.

Una limitación potencial de la transcriptómica espacial en MO es la alta abundancia de transcritos de inmunoglobulinas derivados de CP, lo que puede reducir la detección de genes con baja abundancia. Al igual que con las estrategias de control y filtrado de calidad aplicadas en un estudio previo del grupo de investigación, que incluyen la eliminación de puntos de baja calidad (<200 UMI y <150 genes detectados), el filtrado de tipos celulares con baja contribución (<20% por punto) durante los análisis de desconvolución, y la selección de genes marcadores detectados en los conjuntos de datos transcriptómicos espaciales, los transcritos de inmunoglobulinas también pueden filtrarse computacionalmente durante el análisis posterior para minimizar su impacto cuando sea apropiado8. Los enfoques transcriptómicos espaciales dirigidos pueden mejorar aún más la detección de transcritos de baja abundancia en aplicaciones específicas.

Las aplicaciones potenciales de este método son extensas. La reciente integración de datos espaciales y de célula individual ha revelado nichos osteogénicos humanos especializados y gradientes de señalización complejos que irradian desde el hueso trabecular3,26. Además, la transcriptómica espacial ha demostrado que el envejecimiento remodela el microentorno de la médula ósea (BM) al alterar la organización espacial y la comunicación de las células endoteliales (EC), lo que conduce a un soporte osteogénico deficiente y al surgimiento de redes de señalización inflamatoria dentro del nicho envejecido10. El perfilado multiómico también ha identificado vecindades microambientales distintas, como regiones arterio-endostea que favorecen la mielopoyesis temprana y zonas periadipocíticas enriquecidas en células madre y progenitoras hematopoyéticas3. En el contexto del mieloma múltiple (MM), este protocolo permite integrar marcos transcriptómicos espaciales y de célula única para caracterizar la composición de la BM murina enferma y las interacciones célula-célula. Trabajos previos revelaron distribuciones espacialmente distintas de células plasmáticas malignas e identificaron programas inmunitarios e inflamatorios, como la NETosis y la señalización de IL-17, que se asociaron inversamente con regiones enriquecidas en tumor. Además, un aumento en la densidad de células plasmáticas malignas se correlacionó con un cambio desde estados de linfocitos T efectores hacia estados de agotamiento. Estos hallazgos también se validaron en muestras de BM humanas enzimadas en parafina (FFPE), demostrando su relevancia traslacional en diferentes cargas de enfermedad8. En definitiva, este protocolo de preparación proporciona la base técnica para explorar las complejas interacciones celulares dentro de la arquitectura mineralizada de la BM.

Las plataformas de expresión génica espacial de alta definición pueden proporcionar un perfilado de todo el transcripoma con una resolución cercana a la de una sola célula38,51,52. Estos enfoques podrían ampliar el uso del protocolo de preparación para análisis de mayor resolución de las malignidades hematológicas y de la médula ósea organizadas espacialmente. Por lo tanto, el protocolo proporciona una base técnica para futuros estudios de la hematopoyesis fisiológica y maligna.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses competidores. Se ha licenciado una patente sobre el conocimiento técnico y el uso experimental de los modelos de ratón MIcγ1 de MM a MIMO Biosciences (número de solicitud PCT/EP2023/071025).

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Instituto de Salud Carlos III y cofinanciado por FEDER, una manera de hacer Europa (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) y RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020-000010/0011-1411-2020-000011; el Departamento de Salud del Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC y AIRC en el marco del Programa de Premios de Aceleración; la Fundación Internacional del Mieloma (Brian van Novis) y la Fundación Paula y Rodger Riney, concedidos a FP. IAC recibió apoyo de una beca Marie Curie (H2020-MSCA-IF-837491) de la Comisión Europea, de una beca AECC Talent (INVES258003CALV) y del Departamento de Salud del Gobierno de Navarra (GN2023/03). MC contó con una beca FPU (FPU22/03283) del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Queremos agradecer al personal del Laboratorio de Genómica Avanzada y del Centro de Experimentación Animal del CIMA de la Universidad de Navarra por su inestimable asistencia técnica e intelectual. También agradecemos a los Departamentos de Anatomía Patológica de la Clínica Universidad de Navarra (CUN) y del Hospital Universitario de Navarra por proporcionar muestras de médula ósea y por su excepcional colaboración. Un agradecimiento especial a José Ángel Martínez-Climent y a Marta Larrayoz por sus modelos de ratón para el mieloma múltiple. Agradecemos a Patxi San Martín-Uriz, Tania López y Eduardo Larequi su excelente apoyo en la optimización tecnológica, el desarrollo de protocolos y la resolución de problemas en el procesamiento de muestras de médula ósea de ratón y humano para la transcriptómica espacial. También agradecemos a Beñat Ariceta y a Asier Ullate todo su trabajo computacional en transcriptómica espacial. Finalmente, estamos profundamente agradecidos a los pacientes y donantes sanos que participaron generosamente en este estudio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de 1,5 mLEppendorf15625367
Recipiente estéril de 100 mL deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991ASistema basado en electroforesis capilar–para evaluación de la integridad del ARN
Recipiente estéril de 50 mL IberoMedREOR001
Tubo de 50 mL FALCON352070
Lápiz PAP avanzadoTed Pella 22309Z377821-1EALápiz de barrera hidrofóbica 
Anticuerpo anti-PRRX1 producido en conejoSigma-AldrichHPA051084
BSA (albúmina sérica bovina)Sigma-AldrichA9418-50G
Casetes KartellLABWARE2921
Anticuerpo monoclonal CD271 (receptor de NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, célula endotelial (concentrado) clon JC70AAligent DakoM0823
CubreobjetosFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (medio de montaje antifade VECTASHIELD con DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
Solución de desparafinizaciónQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APSolución salina tamponada con fosfato (DPBS, 1×), fórmula de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio, de Thermo Scientific Chemicals
Montante DPX para histologíaSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), solución 0,5 M, grado biología molecular, ultrapuro
Estación de inclusión Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Anticuerpo Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Genoma de referencia Ensembl (GRCh38 / mm10, versión 105)EMBL-EBIN/AGenoma de referencia utilizado para la alineación de lecturas.
EosinaMillipore SigmaHT110116
EtilenoMillipore SigmaE7023-500MLTijeras quirúrgicas
Baño de agua para histología Falc Instruments B-IFalc610.1030.00
Formalina al 4% PanReac AppliChem2524311315Formaldehído al 3,7%–4,0% p/v tamponado a pH = 7 y estabilizado con metanol (CE-IVD) para diagnóstico clínico
Portaobjetos para tinción de vidrio WHEATONZ710970-3EA
Jarras de vidrio para tinción BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
GlicerolSigma-AldrichC3H803
Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón (H+L), adsorbido cruzado, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón (H+L), altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo (H+L), altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Hematoxilina Millipore SigmaMHS16
Cinta High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Evaluación de la integridad del ARN
Escalera High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5581Evaluación de la integridad del ARN
Tampón de muestra High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5580Evaluación de la integridad del ARN
Microscopio de alta resolución Leica BiosystemsN/AEscáner Aperio CS2
Ácido clorhídrico (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Plataforma Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de rata (H+L), adsorbido cruzado, Alexa Fluo 568, InvitrogeInvitrogenA11077
Tijeras de iris - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isoflurano
Carbonato de litio Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/ASoftware utilizado para visualizar imágenes HE y curar puntos Visium; abre archivos .cloupe generados por la tubería de análisis.
Moldes metálicos para inclusiónBio-Optica07-BM24256
Portaobjetos para microscopioavantor631-0108Portaobjetos Superfrost Plus
Cuchillas para microtomoFEATHERFEAT207500006_U
Microtomo HM 340EEprediaN/AModelo HM 340E
AgujaBD301156Aguja BD Microlanc 3, 21 G, 1 IN (25 mm)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Microscopio de luz de campo claro
Parafina PanReac AppliChem256993Parafina P.F. 55–58°C plastificada + gránulos de DMSO (CE-IVD) para diagnóstico clínico
Placa de Petri CorningCLS430167-100EA
Moldes plásticos para inclusión Bio-Optica07-MP7070
Pinzas de Potts-SmithF.S.T 11012-18Pinzas
Fluorímetro Qubit 3.0Invotrogen Q33216
Tubos de ensayo QubitInvotrogen Q32856
Kit de ensayo Qubit RNA HSInvotrogen Q32855
Tubo microcentrífugo de 1,5 mL libre de ARNasasThermo Scientific AM12400
Agua libre de ARNasas MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Solución de descontaminación
Kit RNeasy FFPE (50)Qiagen73504Extracción de ARN total
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/AMétodo de normalización estabilizador de varianza implementado en Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/APaquete de R utilizado para análisis de transcriptómica unicelular y espacial.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/ASoftware utilizado para desmultiplexado, alineación y generación de matrices de características-barra de código para conjuntos de datos Visium.
Escalpelo Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/APaquete de R utilizado para visualización e integración de transcriptómica espacial.
Cuchilla de escalpelo quirúrgico n.º 23Swann-Morton210Cuchillas de escalpelo quirúrgico
Ciclador térmico Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Plataforma de imagen multispectral para visualización de IF
Kit de accesorios Visium 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Kit de sondas del transcriptoma humano Visium pequeño 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Kit de sondas del transcriptoma de ratón Visium pequeño 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Kit de portaobjetos de expresión génica espacial Visium, 4 reacciones, 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
XilenoPanreac214736Xileno, mezcla de isómeros para análisis, ACS, ISO

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