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Detección por citometría de flujo de proteínas intracelulares en células de eritroleucemia humana K562 mediante el uso de anticuerpos primarios no conjugados

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DOI:

10.3791/72500

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8 de septiembre de 2026

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1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la detección por citometría de flujo de proteínas intracelulares en células de eritroleucemia humana K562 mediante anticuerpos primarios policlonales no conjugados. La especificidad del anticuerpo se demuestra mediante la inhibición dependiente de la dosis de la tinción a través de la competencia con péptidos.

Resumen

La citometría de flujo es una técnica potente para el análisis cuantitativo de la expresión proteica con resolución a nivel de célula individual. Este protocolo describe un procedimiento para detectar proteínas intracelulares en células de eritroleucemia humana K562 mediante el uso de anticuerpos primarios policlonales no conjugados y anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromos. Las células se fijan, permeabilizan y bloquean secuencialmente antes de la tinción con anticuerpos. Al variar el orden de la incubación con anticuerpos respecto a la fijación y permeabilización, el protocolo permite evaluar proteínas con localización superficial o intracelular mediante procedimientos de tinción independientes. Se demuestra la tinción nuclear del factor de empalme 3a, subunidad 1 (SF3A1), utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-SF3A1 purificado por afinidad, y se evalúa la especificidad del anticuerpo mediante la inhibición dependiente de la dosis de la tinción con el péptido antigénico correspondiente. Además, se utilizan condiciones de tinción para evaluar la reactividad de un anticuerpo dirigido contra el dominio intracelular del receptor de eritropoyetina. Este procedimiento estandarizado amplía el uso de anticuerpos primarios no conjugados en citometría de flujo y proporciona un enfoque práctico para evaluar la expresión y localización proteica, así como la especificidad de los anticuerpos en células de eritroleucemia humana K562.

Introducción

La citometría de flujo es una herramienta analítica potente y ampliamente utilizada que permite la evaluación cuantitativa de la expresión proteica a resolución de célula individual, facilitando así el estudio de poblaciones celulares heterogéneas y raras1,2,3. Aunque los enfoques convencionales de citometría de flujo emplean principalmente anticuerpos dirigidos contra antígenos de superficie celular, muchas proteínas funcionalmente importantes, como factores de transcripción, reguladores del procesamiento de ARN y receptores que experimentan internalización inducida por ligandos, se localizan dentro de compartimentos intracelulares. En consecuencia, estas proteínas citoplasmáticas y nucleares no son accesibles mediante protocolos estándar de tinción de superficie. La incorporación de métodos de tinción intracelular, que implican la fijación y permeabilización de las membranas celulares, ha ampliado considerablemente la utilidad de la citometría de flujo al permitir la evaluación cuantitativa de proteínas intracelulares, citocinas e intermediarios de señalización, manteniendo al mismo tiempo las capacidades de alto rendimiento y multiparamétricas del análisis convencional por citometría de flujo4,5,6,7.

Una limitación clave en la detección de proteínas asociadas a la superficie y proteínas intracelulares mediante citometría de flujo es la disponibilidad de anticuerpos adecuados y, en muchos casos, el conocimiento incompleto de las secuencias de epítopes o inmunógenos8,9. Dado que las estrategias de inmunofenotipificación se basan principalmente en marcadores de superficie celular, la mayoría de los anticuerpos disponibles comercialmente y validados para citometría de flujo son monoclonales, reconocen un único epítope extracelular y vienen previamente conjugados a fluoróforos. En contraste, los anticuerpos policlonales son capaces de reconocer múltiples epítopes dentro de una proteína diana y se utilizan comúnmente en inmunotransferencia (western blot), inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Sin embargo, estos anticuerpos suelen no estar conjugados y, por lo tanto, no son directamente compatibles con los protocolos estándar de citometría de flujo. El uso de anticuerpos primarios no conjugados en combinación con anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos ofrece una alternativa flexible que amplía el rango de dianas detectables y puede permitir la amplificación de la señal, lo cual resulta ventajoso para proteínas de baja abundancia.

Para abordar estas limitaciones, optimizamos un protocolo para la tinción de proteínas en células de eritroleucemia humana K56210. La tinción intracelular requiere fijación para preservar la estructura y el estado celular, así como permeabilización para permitir que los anticuerpos accedan a los compartimentos intracelulares. En este protocolo, las células se fijan con paraformaldehído (PFA), un fijador de reticulación comúnmente utilizado que mantiene la morfología celular y puede aumentar la permeabilidad de la membrana celular bajo condiciones específicas11,12,13,14. La permeabilización con etanol (EtOH) permite la entrada de anticuerpos a los compartimentos intracelulares, incluyendo el acceso a dianas nucleares5,13,15. Tras la permeabilización, se realiza la tinción con anticuerpos primarios policlonales no conjugados y anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo. Mediante este procedimiento, el tratamiento con PFA solo se utiliza para la detección de inmunorreactividad no superficial, mientras que se emplea un paso adicional de permeabilización con EtOH para la detección de dianas nucleares. La evaluación de la especificidad de la tinción nuclear mediante competencia con péptidos mostró una inhibición dependiente de la dosis del enlace del anticuerpo por el péptido homólogo, pero no por un control no específico. En general, el uso de anticuerpos primarios policlonales no conjugados amplía la aplicabilidad de la citometría de flujo más allá del análisis convencional de marcadores superficiales con anticuerpos conjugados a fluorocromos y proporciona un enfoque flexible para evaluar la expresión de proteínas intracelulares con resolución a nivel de célula individual.

Protocolo

Las células K562 se obtuvieron comercialmente y fueron autenticadas periódicamente y analizadas para micoplasma por el Núcleo de Genética de la Universidad de Arizona. En este estudio no participaron seres humanos ni animales vertebrados.

1. Preparar los reactivos

  1. Cultive las células en condiciones estériles. Utilice la línea celular de leucemia mieloide humana K562 para este protocolo.
    1. Descongele y mantenga las células K562 en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina a 37°C en 5% de CO₂16. Para la propagación, siembre las células a una densidad de aproximadamente 1 × 105 células/mL, recójalas cuando los cultivos alcancen entre el 75% y el 95% de la densidad celular máxima recomendada, y no cultive más allá de 20 pasajes. Para la tinción, recoga las células cuando alcancen entre el 50% y el 75% de la densidad celular máxima recomendada.
  2. Prepare una solución estéril de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10× dentro de una cabina de seguridad biológica clase II.
    1. Agregue 80 g de cloruro de sodio (NaCl), 2 g de cloruro de potasio (KCl), 2,4 g de fosfato monobásico de potasio (KH₂PO₄) y 14,4 g de fosfato dibásico de sodio (Na₂HPO₄) a 800 mL de agua autoclavada en un cilindro graduado de 1 L.
    2. Agregue una barra de agitación y agite la solución en una placa magnética hasta que todo el polvo se haya disuelto.
    3. Utilice un electrodo de pH para ajustar el pH a 7,2–7,4. Ajuste el volumen final a 1 L con agua autoclavada. Esterilice la solución por filtración mediante un filtro de botella equipado con una membrana de nailon de 0,2 µm de poro.
  3. Diluya el PBS 10× a PBS 1× agregando 100 mL de PBS 10× estéril a 900 mL de agua autoclavada dentro de una cabina de seguridad biológica clase II.
  4. Prepare el colorante fijable de viabilidad según las instrucciones del fabricante. Para este protocolo, agregue 50 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) a un tubo de colorante liofilizado y vortexee hasta que el colorante se disuelva completamente.
    1. Guarde el colorante reconstituido a −20°C, protegido de la luz, durante hasta 1 año. Almacene el colorante en alícuotas pequeñas para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
  5. Prepare el tampón para clasificación de células por citometría de flujo (FACS) combinando 10% de PBS 10×, 86% de agua y 4% de suero bovino fetal (FBS). Por ejemplo, combine 10 mL de PBS 10×, 86 mL de agua y 4 mL de FBS para preparar 100 mL de tampón FACS.
    1. Prepare únicamente el volumen de tampón FACS necesario para aproximadamente 2 semanas.
    2. Guarde el tampón FACS a 4°C.
  6. Prepare paraformaldehído (PFA) al 1%.
    ADVERTENCIA: Manipule el PFA como un carcinógeno inflamable y reactivo. Use equipo de protección personal adecuado y prepare el PFA dentro de una campana extractora de gases químicos certificada.
    1. Mezcle 350 mL de agua y 50 mL de PBS 10×, coloque la solución en una placa de agitación calentada y caliente a 65°C. Añada gradualmente 20 g de polvo de PFA a la solución caliente para preparar PFA al 4% (peso/volumen).
    2. Agregue 1–3 gotas de hidróxido de sodio (NaOH) 5 M para facilitar la disolución del PFA. Agite la solución en una placa de agitación calentada durante aproximadamente 20 minutos. Use un medidor de pH para ajustar el pH a 7,4.
    3. Ajuste el volumen final a 500 mL con agua.
    4. Divida el PFA al 4% en alícuotas de 50 mL y almacénelo a −20°C durante hasta 1 año. Después de descongelar, guarde el PFA al 4% a 4°C durante hasta 2 meses. Deseche cualquier PFA al 4% descongelado restante después de 2 meses.
    5. Diluya el PFA al 4% a PFA al 1% utilizando PBS 1× y almacene la solución diluida a 4°C durante hasta 4 semanas17.
  7. Prepare etanol (EtOH) frío al 70% combinando 70 mL de etanol al 200% con 30 mL de agua ultrapura tipo I.
    1. Guarde el EtOH al 70% a −20°C durante hasta 1 año. Mantenga la solución extremadamente fría inmediatamente antes de añadirla a las células para la permeabilización.

2. Recoger y contar células

  1. Transferir las células de una placa de cultivo de tejidos de 10 cm a un tubo cónico de 15 mL.
  2. Centrifugar las células a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado para obtener el sedimento celular.
  3. Eliminar el medio de cultivo y lavar las células resuspendiéndolas en 5 mL de PBS 1×. Volver a centrifugar a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado, luego aspirar el sobrenadante, dejando el sedimento celular.
  4. Resuspender el sedimento celular en PBS 1×. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado mezclando 10 µL de suspensión celular con 10 µL de azul de tripano, cargando la muestra en una lámina para conteo celular y determinando la concentración celular.
    NOTA: Continuar solo si la viabilidad celular es >90% para asegurar resultados confiables.
  5. Centrifugar la suspensión celular a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado y aspirar el sobrenadante, dejando el sedimento celular. Resuspender las células a una densidad de 2 × 105 células viables/mL (mínimo 0.5 × 105 células viables/mL).
  6. Dispensar 1 mL de suspensión celular en el número necesario de tubos de muestra y control para citometría de flujo.
    1. Preparar tubos de muestra separados para cada proteína diana y flujo de trabajo de tinción. Las condiciones de tinción en superficie (Pre-PFA), Post-PFA, Pre-EtOH y Post-EtOH se realizan en tubos de muestra independientes, en lugar de tinción secuencial de las mismas células. Por ejemplo, al evaluar dos proteínas diana, preparar ocho tubos: Tubo 1 (anticuerpo primario A, Pre-PFA), Tubo 2 (anticuerpo primario B, Pre-PFA), Tubo 3 (anticuerpo primario A, Post-PFA), Tubo 4 (anticuerpo primario B, Post-PFA), Tubo 5 (anticuerpo primario A, Pre-EtOH), Tubo 6 (anticuerpo primario B, Pre-EtOH), Tubo 7 (anticuerpo primario A, Post-EtOH) y Tubo 8 (anticuerpo primario B, Post-EtOH).
      NOTA: Como se muestra en el flujo de trabajo de tinción (Figura 1), realizar la tinción con anticuerpos primarios y secundarios para las muestras Pre-PFA y Pre-EtOH el día 1. Realizar la tinción con anticuerpos primarios y secundarios para las muestras Post-PFA y Post-EtOH el día 2.
    2. Preparar tubos control sin tinción y con tinción simple para cada condición de tratamiento. Si se evalúa la viabilidad y dos proteínas diana, preparar un control sin tinción, un control solo con colorante de viabilidad y un control solo con anticuerpo secundario para cada condición de tratamiento.
      NOTA: Aunque el anticuerpo primario no esté conjugado, puede incluirse un control solo con anticuerpo primario durante la validación del ensayo o al evaluar la unión inespecífica del anticuerpo primario.
    3. Someter todos los tubos control sin tinción y con tinción simple a los mismos tratamientos que los tubos de muestra. Si las muestras se fijan con PFA al 1% y se permeabilizan con EtOH al 70%, procesar los tubos control de forma idéntica.
  7. Preparar controles de compensación con tinción simple utilizando perlas de compensación.
    NOTA: Pueden usarse perlas en lugar de células para preparar los controles de compensación.
    1. Etiquetar un tubo de control de compensación para cada fluoróforo y un tubo control sin tinción. Si se utiliza un colorante de viabilidad y dos anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos diferentes, preparar cuatro tubos: un control sin tinción, un control con colorante de viabilidad (fluoróforo 1), un control con anticuerpo secundario A (fluoróforo 2) y un control con anticuerpo secundario B (fluoróforo 3).
      NOTA: Si se utiliza un colorante de viabilidad reactivo con aminas, usar perlas de compensación reactivas con aminas para el control del colorante de viabilidad.
    2. Añadir solo un colorante o anticuerpo a cada tubo de control de compensación, de modo que cada control sea positivo para un solo fluoróforo durante la compensación en citometría de flujo.

Gráfico del protocolo de tinción con anticuerpos que muestra pasos de pre- y post-fijación, describiendo procesos secuenciales.
Figura 1. Flujo de trabajo optimizado para la detección de dianas asociadas a la superficie celular e intracelulares. Este esquema ilustra la secuencia y el cronograma de fijación, permeabilización, bloqueo, tinción con anticuerpo primario y tinción con anticuerpo secundario, tras la tinción con colorante de viabilidad fijable. Se muestran flujos de trabajo separados para las condiciones Pre-PFA, Post-PFA, Pre-EtOH y Post-EtOH. La tinción con anticuerpos primario y secundario se realiza el día 1 para los flujos de trabajo Pre-PFA y Pre-EtOH, y el día 2 para los flujos de trabajo Post-PFA y Post-EtOH. PFA, paraformaldehído; EtOH, etanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Tiña las células con un colorante fijable de viabilidad

  1. Coloque las células con un colorante vital fijable según las instrucciones del fabricante. Añada 1 µL de la solución stock del colorante vital (preparada en el paso 1.4) directamente a cada tubo de muestra y al tubo de control correspondiente monocolorado con el colorante vital que contiene 1 × 106 células en 1 mL de PBS 1×.
  2. Vortexee suavemente durante 3 s e incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 min, protegidas de la luz.
    NOTA: Proteja las células de la luz durante este paso y todos los pasos posteriores.
  3. Centrifugue la suspensión celular a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado, luego aspire el sobrenadante, dejando el botón celular.
  4. Lave las células dos veces con 1 mL de PBS 1× y resuspenda el botón celular final en 100 µL de PBS 1×.
    NOTA: Si va a teñir dianas en la superficie celular con anticuerpos primarios conjugados con fluorocromos, realice la tinción de superficie en esta etapa según las instrucciones del fabricante antes de proceder a la fijación.

4. Tratar las células con PFA al 1%

NOTA: Para muestras Pre-PFA (véase el paso 2.6.1 y la Figura 1), realice los pasos 6, 7 y 8 antes de continuar con esta sección.

  1. A las células resuspendidas en 100 µL de PBS 1×, añada 1 mL de PFA al 1% a cada tubo de muestra, incluyendo todos los tubos de control monocromáticos. Vortexee suavemente durante 3 s e incube las muestras a temperatura ambiente durante 15–20 min, protegidas de la luz.
  2. Centrifugue la suspensión celular a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado. Aspire y deseche el sobrenadante, dejando el botón celular.
  3. Lave el botón celular dos veces resuspendiéndolo en 1 mL de tampón FACS, seguido de centrifugación a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado.
  4. Resuspenda el botón celular final en 100 µL de tampón FACS.
    ​NOTA: Las células fijadas (teñidas o no teñidas) pueden almacenarse en 1 mL de tampón FACS a 4°C durante 12–48 h. Para continuar con el protocolo, centrifugue la suspensión celular a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado, aspire el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 100 µL de tampón FACS.

5. Permeabilizar las células con EtOH

NOTA: Para las muestras Pre-EtOH (ver paso 2.6.1 y figura 1), realice los pasos 6, 7 y 8 antes de continuar con esta sección.

  1. Agregue suavemente 1 mL de EtOH al 70% frío con hielo a la pared interna de cada tubo de muestra que contenga 100 µL de suspensión celular, y luego vortexee inmediatamente a aproximadamente el 50% de potencia durante 5 s. Repita este procedimiento para todos los tubos de muestra restantes y los tubos controles monocromáticos.
  2. Incube los tubos a −20°C durante al menos 2 h, protegidos de la luz.
    ​NOTA: Las células pueden almacenarse en 1 mL de EtOH al 70% a −20°C durante 12–48 h antes de continuar con el protocolo.
  3. Centrifugue la suspensión celular a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado, luego aspire el sobrenadante, dejando el botón celular.
  4. Lave las células tres veces con 1 mL de tampón FACS, centrifugando a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado entre cada lavado.
  5. Resuspenda el botón celular final en 100 µL de tampón FACS.

6. Bloquear las células

  1. Añada 820 µL de tampón FACS y 80 µL de suero de cabra normal (NGS) a cada tubo para preparar una solución de bloqueo final que contenga 92% de tampón FACS y 8% de NGS. Vortexee suavemente durante 3 s e incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 min, en reposo y protegidas de la luz.
  2. Centrifugue la suspensión celular a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado, luego aspire el sobrenadante, dejando el botón celular.
  3. Lave las células dos veces resuspendiendo el botón en 1 mL de tampón FACS seguido de centrifugación como se describió en el Paso 6.2.
  4. Resuspenda el botón celular final en 100 µL de tampón FACS.

7. Tiña las células con un anticuerpo primario no conjugado

  1. Añada 0,5 µL del anticuerpo primario no conjugado a 100 µL de suspensión celular (dilución 1:200). Incube las muestras a temperatura ambiente durante 1 h, protegidas de la luz.
    NOTA: La dilución 1:200 es una concentración inicial recomendada y puede requerir optimización para otros anticuerpos.
    1. Si se realiza la competición con péptido, añada el péptido inmediatamente antes de agregar el anticuerpo primario. En este protocolo, los péptidos se titularon en relaciones molares péptido-anticuerpo que variaron de 50 a 0,625, calculadas en relación con la concentración del anticuerpo (4,3 nM) en la mezcla de reacción. Puede ser necesaria una optimización para pares individuales de péptido–anticuerpo.
  2. Añada 1 mL de tampón FACS y centrifugue la suspensión celular a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado. Aspire el sobrenadante, dejando el botón celular.
  3. Lave las células dos veces más con 1 mL de tampón FACS, centrifugando como se describe en el paso 7.2.
  4. Resuspenda el botón celular final en 100 µL de tampón FACS.

8. Tiña las células con un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo

  1. Añada una dilución 1:200 del anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (0,5 µL de anticuerpo en 100 µL de suspensión celular) a cada tubo de muestra y al tubo de control correspondiente.
    NOTA: En este protocolo se utilizó el anticuerpo secundario DyLight 488 de cabra anti-conejo.
  2. Incube las muestras a temperatura ambiente durante 1 h, protegidas de la luz.
  3. Añada 1 mL de tampón FACS. Centrifugue la suspensión celular a 600 × g durante 5 min a 4°C con el freno activado, luego aspire el sobrenadante, dejando el botón celular.
  4. Lave las células dos veces con 1 mL de tampón FACS repitiendo la centrifugación descrita en el Paso 8.3.
  5. Reuspenda las células en 300–500 µL de tampón FACS.
    NOTA: Las células pueden almacenarse en tampón FACS a 4°C, protegidas de la luz, durante 1–3 días antes del análisis por citometría de flujo.

9. Analice las muestras mediante citometría de flujo

  1. Realice la compensación de fluorescencia utilizando los controles monocromáticos apropiados. Adquiera las muestras en un citómetro de flujo y recopile al menos 5.000–10.000 eventos de células individuales viables para el análisis. Para este protocolo, se utilizó el software FACSDiva para la adquisición de datos.
  2. Analice los datos excluyendo primero los restos celulares mediante la dispersión directa área (FSC-A) frente a la dispersión lateral área (SSC-A), seguido por la exclusión de dobletes utilizando la altura de dispersión directa (FSC-H) frente al ancho de dispersión directa (FSC-W) y la altura de dispersión lateral (SSC-H) frente al ancho de dispersión lateral (SSC-W). Excluya las células muertas utilizando el canal del colorante de viabilidad.
  3. Analice el porcentaje de células individuales viables restantes que son positivas o negativas para las proteínas diana seleccionadas (véase Resultados Representativos). Establezca las puertas positivas utilizando los controles sin teñir y solo con el anticuerpo secundario, y aplique criterios de selección idénticos a todas las muestras comparables dentro del mismo lote de adquisición.

Resultados

El protocolo descrito aquí permite la tinción intracelular de dianas proteicas para las cuales no existen anticuerpos comerciales validados para citometría de flujo. Como ejemplo representativo, se evaluó la tinción del factor de empalme 3a subunidad 1 (SF3A1), una proteína de empalme expresada ubicuamente que se localiza en el núcleo, utilizando un anticuerpo policlonal de conejo generado frente a un péptido correspondiente a los aminoácidos 18–37 de SF3A1 (SF3A118–37; EPKQPTEEEASSKEDSAPSK)18,19.

Para evaluar el protocolo de tinción, las células se tiñeron con el anticuerpo policlonal primario anti-SF3A118–37 sin conjugación, ya sea antes o después del tratamiento con paraformaldehído (PFA) solo o con tratamiento secuencial de PFA + EtOH (Figuras 1 y 2). Como era de esperar, no se detectó ninguna población positiva para SF3A1 en las muestras teñidas antes del tratamiento con PFA (Pre-PFA) ni antes del tratamiento secuencial con PFA y EtOH (Pre-EtOH) (Figura 2A). La tinción realizada después del tratamiento con PFA solo (Post-PFA) identificó una pequeña población positiva para SF3A1 (Figura 2B). En contraste, una población positiva claramente definida para SF3A1 se observó únicamente cuando la tinción se realizó después de la permeabilización con EtOH (Post-EtOH) (Figura 2B). Estos hallazgos indican que el protocolo detecta una tinción de SF3A1 considerablemente mayor tras la permeabilización con EtOH que tras el tratamiento con PFA solo.

Gráfico de citometría de flujo; análisis de células SF3A1+ antes y después de la fijación; comparación entre EtOH/PFA; DL488, SSC-A.
Figura 2. Evaluación de la tinción de SF3A1 tras la fijación con paraformaldehído y la permeabilización con etanol. Gráficos representativos de citometría de flujo de células K562 viables, negativas para el colorante de viabilidad, que muestran la fluorescencia DyLight 488 (DL488) frente al área de dispersión lateral (SSC-A). La región enmarcada indica la población positiva para SF3A1 (SF3A1⁺). SF3A1, subunidad 1 del factor de empalme 3a; PFA, paraformaldehído; EtOH, etanol. (A) Tinción con anticuerpo anti-SF3A1 realizada antes de la fijación con PFA (Pre-PFA; izquierda) o antes de la fijación con PFA seguida de permeabilización con EtOH (Pre-EtOH; derecha). (B) Tinción con anticuerpo anti-SF3A1 realizada después de la fijación con PFA (Post-PFA; izquierda) o después de la fijación con PFA seguida de permeabilización con EtOH (Post-EtOH; derecha). (C) Comparación de la tinción de SF3A1 tras la permeabilización con EtOH durante 2 h o durante la noche. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Para determinar si la duración de la exposición al EtOH afectaba la tinción o la integridad celular, las células fueron tratadas con EtOH durante 2 h o durante la noche. El análisis citométrico de flujo no mostró diferencias apreciables en la intensidad de tinción ni en la integridad celular aparente entre las dos condiciones (Figura 2C). Estos hallazgos indican que 2 h de permeabilización con EtOH produjeron una tinción comparable a la incubación durante la noche en las condiciones evaluadas.

Tras confirmar que la permeabilización con EtOH produjo una tinción detectable de SF3A1 (Figura 2B) y establecer la tinción basal de SF3A1 en ausencia del péptido competidor (Figura 3A), se evaluó la especificidad del anticuerpo mediante competición con péptidos. Las células se incubaron con el péptido SF3A118–37 o con un péptido control no específico correspondiente a los aminoácidos 778–793 de SF3A1 (SF3A1778–793; GAVIHLALKERGGRKK). Los péptidos se añadieron junto con el anticuerpo primario (Protocolo, Paso 7). La incubación con un exceso del péptido específico SF3A118–37 redujo el porcentaje de células positivas para SF3A1 a un nivel comparable al del control sin tinción, mientras que el péptido no específico SF3A1778–793 no alteró de forma medible el perfil de tinción (Figura 3B,C). Experimentos de titulación con péptidos mostraron una inhibición dependiente de la dosis del acoplamiento del anticuerpo por el péptido homólogo SF3A118–37 (IC50 = 21,6 nM), mientras que no se observó inhibición con hasta un exceso molar 50 veces mayor del péptido no específico SF3A1778–793 (Figura 3D). Estos resultados demuestran que el ensayo de competición con péptidos puede utilizarse para evaluar la inhibición del acoplamiento del anticuerpo mediante citometría de flujo.

Análisis de citometría de flujo de la expresión de SF3A1 utilizando anticuerpo anti-SF3A1, péptido específico e inhibición.
Figura 3. Inhibición competitiva dependiente de la dosis del marcaje con anticuerpo anti-SF3A1 mediante un péptido cognado. Gráficos representativos de citometría de flujo de células K562 viables y negativas para el colorante de viabilidad, mostrando la fluorescencia DyLight 488 (DL488) frente al área de dispersión lateral (SSC-A). La región enmarcada indica la población positiva para SF3A1 (SF3A1⁺). SF3A1, factor de empalme 3a subunidad 1. (A) Control sin marcaje y marcaje con anticuerpo anti-SF3A1. (B) Marcaje de SF3A1 tras la adición dependiente de la dosis del péptido cognado SF3A1(18–37). (C) Marcaje de SF3A1 tras la adición dependiente de la dosis del péptido no específico SF3A1(778–793). Las concentraciones del péptido fueron 216, 43,3, 21,7, 10,8, 5,4 y 2,7 nM; las relaciones molares péptido-anticuerpo indicadas en la figura se calcularon en relación con una concentración de anticuerpo anti-SF3A1 de 4,33 nM. (D) Curva de inhibición competitiva que muestra el porcentaje de células positivas para SF3A1 en función de la concentración del péptido. El péptido cognado SF3A1(18–37) inhibió la unión del anticuerpo de manera dependiente de la dosis, mientras que el péptido SF3A1(778–793) no lo hizo. La concentración inhibitoria media (IC₅₀) para el péptido cognado fue de 21,6 nM, determinada utilizando un modelo no lineal de mejor ajuste de inhibidor frente a respuesta normalizada con pendiente variable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Finalmente, se evaluó el protocolo para la detección del receptor de eritropoyetina (EpoR), un receptor de superficie celular que también está presente intracelularmente durante la biosíntesis del receptor y tras la internalización inducida por el ligando20,21. EpoR es una proteína de 508 aminoácidos compuesta por un dominio extracelular en el extremo N-terminal, una región transmembrana única que abarca los aminoácidos 251–273 y un dominio intracelular en el extremo C-terminal. Se aplicó un anticuerpo policlonal anti-EpoR de conejo no conjugado (BS-1424R), previamente validado para inmunotransferencia, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, pero no para citometría de flujo22,23,24,25,26, utilizando el protocolo de tinción descrito anteriormente. Según el fabricante, el anticuerpo BS-1424R fue producido frente a los aminoácidos 330–365 dentro del dominio intracelular de EpoR.

Cuando las células se tiñeron antes del tratamiento con PFA (Pre-PFA), Figura 4A). En contraste, aproximadamente el 77% y el 84% de las células K562 fueron positivas tras el tratamiento únicamente con PFA (Post-PFA) y tras el tratamiento secuencial con PFA más EtOH (Post-EtOH), respectivamente (Figura 4B–D). En contraste con la tinción de SF3A1, se observó un aumento en la tinción de EpoR tras ambos protocolos, Post-PFA y Post-EtOH (comparar Figuras 2B y 4D). Estos hallazgos son coherentes con la ubicación del epítopo BS-1424R dentro del dominio intracelular del receptor de eritropoyetina (EpoR). La detección de inmunorreactividad frente a EpoR en ambas condiciones de tinción indica que el tratamiento con PFA permeabiliza suficientemente la membrana plasmática de las células K562 para permitir la unión del anticuerpo al epítopo intracelular. En este protocolo, el uso de un único anticuerpo secundario requiere la evaluación de los reservorios de EpoR en la superficie y en el interior celular mediante muestras tratadas y teñidas por separado. Esta limitación puede superarse utilizando anticuerpos primarios generados en especies huésped diferentes, lo que permite la detección multiplex mediante anticuerpos secundarios específicos de especie.

Gráficos de dispersión de citometría de flujo y gráfico de barras que muestran los porcentajes de células EpoR+ antes y después de la fijación.
Figura 4Detección del receptor de eritropoyetina (EpoR) en células K562 tras diferentes condiciones de fijación y permeabilización. Representativos gráficos de citometría de flujo de células vivas de K562 negativas para el colorante de viabilidad, que muestran la fluorescencia de DyLight 488 (DL488) frente al área de dispersión lateral (SSC-A). La región enmarcada indica la población positiva para EpoR (EpoR⁺). La tinción de EpoR se realizó utilizando el anticuerpo policlonal BS-1424R dirigido contra los aminoácidos 330–365 dentro del dominio intracelular de EpoR. (A) Tinción de EpoR antes de la fijación con PFA (Pre-PFA). (B) Tinción de EpoR después de la fijación con PFA (Post-PFA). (C) Tinción de EpoR después de la fijación con PFA y permeabilización secuencial con EtOH (Post-EtOH). (D) Cuantificación de células positivas para EpoR en cada condición de tinción. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes (n = 3). La significancia estadística se determinó mediante la prueba t de Student t-prueba. P < 0,01 se indica con **. Las comparaciones mostradas son Pre-PFA frente a Post-PFA y Pre-PFA frente a Post-EtOH. Ab, anticuerpo; EpoR, receptor de eritropoyetina; PFA, paraformaldehído; EtOH, etanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los resultados presentados aquí destacan varios parámetros críticos para la detección de proteínas mediante citometría de flujo intracelular utilizando anticuerpos primarios no conjugados. Una consideración importante es la estrategia de permeabilización, que debe seleccionarse según la localización intracelular de la proteína diana. En el protocolo descrito aquí, la fijación con PFA seguida de permeabilización con EtOH permitió la detección de la proteína nuclear SF3A1, mientras que la inmunorreactividad de EpoR se detectó mediante ambos protocolos, Post-PFA y Post-EtOH. Al evaluar proteínas de superficie, la tinción debe realizarse antes del tratamiento con PFA, mientras que la tinción intracelular puede realizarse después del tratamiento con PFA y, cuando sea necesario, tras una permeabilización adicional con EtOH. Este protocolo permite evaluar proteínas asociadas a la superficie y proteínas intracelulares dentro de poblaciones celulares definidas inmunofenotípicamente, utilizando condiciones de tinción separadas.

Aunque el PFA se utiliza generalmente como fijador celular, el tratamiento con PFA al 1% permeabilizó suficientemente la membrana plasmática de las células K562 para permitir la unión del anticuerpo contra EpoR a un epítopo intracelular. Se ha demostrado que la permeabilización mediada por PFA también permite la entrada de anticuerpos en otras líneas celulares, incluyendo células HEK293T y HeLa; sin embargo, esto se logró utilizando una concentración más alta de PFA (4%)11. Estas diferencias sugieren efectos del PFA específicos del tipo celular; por lo tanto, puede ser necesario optimizar las condiciones de fijación para maximizar la detección del epítopo. Los reactivos alternativos para la permeabilización celular incluyen los detergentes esaponina, digitonina y Triton X-100, que actúan mediante mecanismos diferentes. Mientras que el Triton X-100 permeabiliza de forma no específica las membranas celulares, la esaponina y la digitonina permeabilizan las células mediante la unión al colesterol y otros esteroles de la membrana27. Se ha demostrado que concentraciones bajas de digitonina permeabilizan selectivamente la membrana plasmática mientras preservan la integridad de las membranas mitocondriales y nucleares28,29,30. Por lo tanto, combinaciones adecuadas de estos reactivos pueden utilizarse para distinguir la localización proteica dentro de diferentes compartimentos subcelulares, aunque una limitación de estos enfoques es la posible pérdida de antígenos intracelulares y de la integridad del epítopo13,31.

El protocolo es fácilmente adaptable y puede modificarse según los requisitos experimentales. Por ejemplo, la duración del tratamiento con EtOH puede ajustarse sin una pérdida aparente del rendimiento de tinción o de la integridad celular, lo que brinda flexibilidad para protocolos que abarcan varios días, especialmente cuando las condiciones de tinción previas y posteriores a la permeabilización se realizan en paralelo (Figura 1). El protocolo también puede aplicarse a otros tipos celulares, incluyendo células hematopoyéticas humanas primarias; sin embargo, es posible que sea necesario optimizar las condiciones de fijación, permeabilización y centrifugación, ya que estos tratamientos pueden influir en la accesibilidad del epítopo, la eficiencia de unión del anticuerpo, la integridad celular y la intensidad de la señal de fluorescencia14,32,33. Además, la optimización de los tiempos de exposición a PFA y EtOH, así como de las condiciones de centrifugación, puede ayudar a mantener la viabilidad celular y minimizar la pérdida excesiva de células. La detección de otros blancos proteicos también es posible tras la optimización de la concentración de anticuerpos y de las condiciones de incubación.

Las limitaciones potenciales incluyen una intensidad de señal débil, que puede mejorarse aumentando la concentración del anticuerpo primario o mediante la amplificación con anticuerpos secundarios. La tinción inespecífica puede reducirse optimizando las condiciones de bloqueo o mediante competencia con péptidos. El uso de anticuerpos policlonales también puede introducir variabilidad entre lotes y aumentar la posibilidad de unión fuera del blanco; por lo tanto, la especificidad del anticuerpo debe validarse cuidadosamente para cada aplicación. Además, la competencia con péptidos demuestra dependencia respecto al péptido inmunizante, pero no establece de forma independiente la especificidad del anticuerpo. En el caso del anticuerpo anti-SF3A1, estudios previos de inmunoprecipitación han confirmado la especificidad del anticuerpo19. Otros enfoques complementarios adicionales para validar la especificidad del anticuerpo incluyen el agotamiento del antígeno, la reducción de la expresión génica, la eliminación génica o el uso de modelos celulares negativos para el antígeno. Asimismo, este enfoque no es inherentemente compatible con todos los paneles multicolor, ya que el uso de múltiples anticuerpos secundarios puede introducir reactividad cruzada y limitar la multiplexación, a menos que se implementen controles adecuados. Por lo tanto, la selección cuidadosa de los anticuerpos secundarios y los fluoróforos es importante para minimizar la tinción de fondo y maximizar la resolución de la señal.

El protocolo descrito aquí proporciona un flujo de trabajo para la evaluación citométrica de flujo de proteínas intracelulares en células de eritroleucemia humana K562. Asimismo, permite la evaluación del desempeño de anticuerpos mediante competición con péptidos y la valoración de la inmunorreactividad asociada a receptores bajo diferentes condiciones de tinción. Este enfoque puede ser útil para investigar cambios en la expresión proteica durante la diferenciación celular o en respuesta a estímulos extracelulares, incluyendo estudios de factores de transcripción, proteínas implicadas en el procesamiento del ARN y la biología de receptores dentro de poblaciones celulares definidas inmunofenotípicamente. En un estudio independiente, este flujo de trabajo se utilizó para investigar los cambios mediados por eritropoyetina en enzimas metabólicas de lípidos intracelulares en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas que experimentan diferenciación eritroide34, lo que demuestra la adaptabilidad del protocolo a células primarias. En conjunto, este protocolo amplía la aplicación de anticuerpos primarios no conjugados en citometría de flujo y proporciona un flujo de trabajo flexible para evaluar la expresión proteica en células cultivadas.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero recibido por parte de SS del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (R01GM127464) y del Instituto Nacional del Cáncer (P30CA023074), ambos pertenecientes a los Institutos Nacionales de la Salud, del Programa de Asociación para la Investigación del Valle (VRP P1-4009 y VRP77) y del Centro de Investigación Biomédica de Arizona (ABRC: RFGA2022-010-30). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de la Salud. Los autores también agradecen el apoyo de la Dra. Mrinalini Kala, Directora de la Instalación Central de Citometría de Flujo, Colegio de Medicina–Phoenix, Universidad de Arizona.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10× Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Elaboración internaN/DAlternativa: PBS disponible comercialmente
Tubos cónicos de 15 mLVWR89039-664Alternativa: Cualquier tubo cónico estéril del tamaño adecuado
Tubos de poliestireno redondos de 5 mLCorning352052Alternativa: Cualquier tubo para citometría de flujo compatible con el citómetro disponible
Anticuerpo secundario DyLight 488 anti-conejoThermo Fisher ScientificPI35553Alternativa: Anticuerpo secundario compatible con la especie huésped del anticuerpo primario
Contador celular automatizadoThermo Fisher ScientificAMQAF2000Alternativa al hemocitómetro
Kit de perlas de compensación reactivas con aminas ArCThermo Fisher ScientificA10628Alternativa: Células; si se usan células para controles de tinción individual, procesar todos los tubos de control de forma idéntica a los tubos de muestra
Filtro de botellaThermo Fisher Scientific595-4520Membrana de nailon; 0,2 µm
Láminas para conteo celularThermo Fisher ScientificC10228Requeridas únicamente cuando se utiliza un contador celular automatizado
Dimetilsulfóxido (DMSO)Incluido en el kit del colorante de viabilidadN/DUtilizado para reconstituir el colorante de viabilidad liofilizado
Etileno, 200 grados de purezaThermo Fisher ScientificBP28184Grado biología molecular; utilizado para preparar etanol al 70% frío en hielo
Anticuerpo primario policlonal contra el receptor de eritropoyetinaBiossBS-1424R
Suero bovino fetal (FBS)Omega ScientificFB-12Alternativa: Cualquier FBS validado para la línea celular objetivo
Citómetro de flujoBD BiosciencesBD Canto II Alternativa: Cualquier citómetro de flujo adecuado
HemocitómetroHausser ScientificHS3200Alternativa: Contador celular automatizado
Placa agitadora magnética con calentamientoThermo Fisher ScientificSP88857100Utilizada para la preparación de PBS y paraformaldehído
Células de leucemia mieloide humana K562ATCCCCL-243Se pueden adquirir de cualquier otra fuente autenticada
Colorante fijable de viabilidad Live-or-Dye (405/545)Biotium32009Alternativa: Cualquier colorante de viabilidad fijable compatible. Los colorantes no fijables (por ejemplo, 7-AAD) no son adecuados
Suero normal de cabraThermo Fisher Scientific16210064Utilizado para bloqueo
Polvo de paraformaldehídoSigma-AldrichP6148Alternativa: Solución de paraformaldehído disponible comercialmente
Medidor/probe de pHAccumetAB15Utilizado para ajustar el pH del tampón
Cloruro de potasio (KCl)Thermo Fisher ScientificBP366-1
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4)Thermo Fisher ScientificBP362-1
Anticuerpo primario policlonal SF3A1 Elaboración internaN/D
Cloruro de sodio (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1
Solución de hidróxido de sodio (5 M)MilliporeSigmaS8263Alternativa: Preparar una solución 5 M a partir de perlas de hidróxido de sodio
Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4)Thermo Fisher ScientificBP332-1
Barra de agitaciónVWR74950-286Utilizada con la placa agitadora magnética
Azul de tripan, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061Utilizado para el conteo de viabilidad celular
Perlas de compensación UltraComp eBeadsThermo Fisher Scientific01-2222-42Alternativa: Células; si se usan células para controles de tinción individual, procesar todos los tubos de control de forma idéntica a los tubos de muestra

Referencias

  1. Schippel N, Sharma S. Dynamics of human hematopoietic stem and progenitor cell differentiation to the erythroid lineage. Exp Hematol. 2023;123:1-17. DOI:10.1016/j.exphem.2023.05.001.
  2. Schippel N, Kala M, Sharma S. Erythropoietin-dependent acquisition of CD71hiCD105hi phenotype within CD235a- early erythroid progenitors. Stem Cells. 2025;43(12). DOI:10.1093/stmcls/sxaf061.
  3. Robinson JP. Flow cytometry: past and future. BioTechniques. 2022;72(4):159-169. DOI:10.2144/btn-2022-0005.
  4. Freer G, Rindi L. Intracellular cytokine detection by fluorescence-activated flow cytometry: basic principles and recent advances. Methods. 2013;61(1):30-38. DOI:10.1016/j.ymeth.2013.03.035.
  5. Krutzik PO, Nolan GP. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single-cell signaling events. Cytometry A. 2003;55(2):61-70. DOI:10.1002/cyto.a.10072.
  6. Manso BA, Medina KL. Standardized flow-cytometry-based protocol to simultaneously measure transcription factor levels. STAR Protoc. 2021;2(2):100485. DOI:10.1016/j.xpro.2021.100485.
  7. Hallden G, Andersson U, Hed J, Johansson SG. A new membrane permeabilization method for the detection of intracellular antigens by flow cytometry. J Immunol Methods. 1989;124(1):103-109. DOI:10.1016/0022-1759(89)90191-9.
  8. Kalina T, Lundsten K, Engel P. Relevance of antibody validation for flow cytometry. Cytometry A. 2020;97(2):126-136. DOI:10.1002/cyto.a.23895.
  9. Voskuil JL. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 2017;6:161. DOI:10.12688/f1000research.10851.1.
  10. Koeffler HP, Golde DW. Human myeloid leukemia cell lines: a review. Blood. 1980;56(3):344-350.
  11. Bernard E, et al. Assessing the limitations of paraformaldehyde fixation for accurate cell surface receptor measurement. Front Pharmacol. 2026;17:1727410. DOI:10.3389/fphar.2026.1727410.
  12. Jamur MC, Oliver C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 2010;588:63-66. DOI:10.1007/978-1-59745-324-0_9.
  13. Cheng R, et al. Influence of fixation and permeabilization on the mass density of single cells: a surface plasmon resonance imaging study. Front Chem. 2019;7:588. DOI:10.3389/fchem.2019.00588.
  14. Hobro AJ, Smith NI. An evaluation of fixation methods: spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vib Spectrosc. 2017;91:31-45. DOI:10.1016/j.vibspec.2016.10.012.
  15. Schimenti KJ, Jacobberger JW. Fixation of mammalian cells for flow cytometric evaluation of DNA content and nuclear immunofluorescence. Cytometry. 1992;13(1):48-59. DOI:10.1002/cyto.990130109.
  16. Kandarian F, Sunga GM, Arango-Saenz D, Rossetti M. A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity. J Vis Exp. 2017;(126). DOI:10.3791/56191.
  17. Bapat A, Keita N, Sharma S. Pan-myeloid differentiation of human cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. J Vis Exp. 2019;(150). DOI:10.3791/59836.
  18. Martelly W, et al. Identification of a noncanonical RNA binding domain in the U2 snRNP protein SF3A1. RNA. 2019;25(11):1509-1521. DOI:10.1261/rna.072256.119.
  19. Sharma S, et al. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes Dev. 2014;28(22):2518-2531. DOI:10.1101/gad.248625.114.
  20. Sulahian R, Cleaver O, Huang LJ. Ligand-induced EpoR internalization is mediated by JAK2 and p85 and is impaired by mutations responsible for primary familial and congenital polycythemia. Blood. 2009;113(21):5287-5297. DOI:10.1182/blood-2008-09-179572.
  21. Sinclair AM, et al. Erythropoietin receptor transcription is neither elevated nor predictive of surface expression in human tumour cells. Br J Cancer. 2008;98(6):1059-1067. DOI:10.1038/sj.bjc.6604220.
  22. Li X, et al. Oxidative stress induces the decline of brain EPO expression in aging rats. Exp Gerontol. 2016;83:89-93. DOI:10.1016/j.exger.2016.07.012.
  23. Liu T, et al. Multifaceted roles of a bioengineered nanoreactor in repressing radiation-induced lung injury. Biomaterials. 2021;277:121103. DOI:10.1016/j.biomaterials.2021.121103.
  24. Zhang Y, et al. Erythropoietin receptor is a risk factor for prognosis: a potential biomarker in lung adenocarcinoma. Pathol Res Pract. 2023;251:154891. DOI:10.1016/j.prp.2023.154891.
  25. Liu J, et al. Lithium chloride promotes endogenous synthesis of CLA in bovine mammary epithelial cells. Biol Trace Elem Res. 2024;202(2):513-526. DOI:10.1007/s12011-023-03679-z.
  26. Wu G, et al. EPO promotes the progression of rheumatoid arthritis by inducing desialylation via increasing the expression of neuraminidase 3. Ann Rheum Dis. 2024;83(5):564-575. DOI:10.1136/ard-2023-224852.
  27. Sudji IR, et al. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 2015;20(11):20146-20160. DOI:10.3390/molecules201119682.
  28. Niklas J, Melnyk A, Yuan Y, Heinzle E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 2011;416(2):218-227. DOI:10.1016/j.ab.2011.05.039.
  29. Liu J, Xiao N, DeFranco DB. Use of digitonin-permeabilized cells in studies of steroid receptor subnuclear trafficking. Methods. 1999;19(3):403-409. DOI:10.1006/meth.1999.0876.
  30. Krawczyk E, Suprynowicz FA, Sudarshan SR, Schlegel R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 2010;84(4):1696-1703. DOI:10.1128/JVI.01968-09.
  31. Goldenthal KL, et al. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. J Histochem Cytochem. 1985;33(8):813-820. DOI:10.1177/33.8.3894499.
  32. Fahlberg MD, et al. Overcoming fixation and permeabilization challenges in flow cytometry by optical barcoding and multi-pass acquisition. Cytometry A. 2024;105(11):838-848. DOI:10.1002/cyto.a.24904.
  33. Law JP, et al. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry A. 2009;75(12):1040-1050. DOI:10.1002/cyto.a.20815.
  34. Schippel N, et al. Erythropoietin mediates glycerophospholipid remodeling during human early erythropoiesis. bioRxiv. 2026. DOI:10.64898/2026.02.20.707106.

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