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Artículo de investigación
Este protocolo tiene como objetivo evaluar la eficacia antitumoral de la ruscogenina en células de carcinoma nasofaríngeo. Describe metodologías exhaustivas —incluyendo ensayos de viabilidad, migración, apoptosis y ferroptosis— para elucidar sistemáticamente cómo este compuesto induce una muerte celular dual al dirigirse contra y desregular KDM1A.
El carcinoma nasofaríngeo (NPC) es una malignidad altamente agresiva. El compuesto natural ruscogenina (Rus) muestra potencial contra el cáncer. Este estudio aclara el mecanismo de acción específico en el carcinoma nasofaríngeo (NPC) mediante la investigación de sus efectos sobre las células de NPC y la vía molecular subyacente. La línea celular humana de carcinoma nasofaríngeo (NPC), C666-1, fue tratada con diversas concentraciones de Rus. Se realizaron una serie de ensayos in vitro para evaluar la viabilidad celular, proliferación, migración, invasión, apoptosis y ferroptosis. Se investigó el papel de la lisina específica demetilasa 1A (KDM1A) mediante inmunotransferencia (Western blot) y acoplamiento molecular, y su función mediadora se validó mediante experimentos de rescate por sobreexpresión. La ruscogenina redujo de manera dependiente de la dosis las capacidades proliferativas, clonogénicas, migratorias e invasivas de las células C666-1. Mecánicamente, el tratamiento con Rus indujo tanto apoptosis, evidenciada por la activación de la caspasa efectora-3 y un desplazamiento hacia una señalización proapoptótica mediante el equilibrio Bax/Bcl-2, como ferroptosis, marcada por una peroxidación lipídica elevada y hierro intracelular. Estos efectos antitumorales se correlacionaron fuertemente con la regulación negativa de KDM1A. Crucialmente, la sobreexpresión forzada de KDM1A atenuó significativamente la apoptosis y ferroptosis inducidas por Rus, y revirtió la supresión de los fenotipos malignos, confirmando el papel mediador esencial de KDM1A. La ruscogenina inhibe la progresión maligna del carcinoma nasofaríngeo mediante la regulación negativa de KDM1A, promoviendo así la apoptosis y la ferroptosis. Estos hallazgos identifican al eje Rus-KDM1A como un objetivo terapéutico prometedor para el tratamiento del NPC.
El carcinoma nasofaríngeo (NPC) es un tipo de cáncer causado por la cooperación de factores genéticos y ambientales1. Aunque la radioterapia ha logrado avances notables en el tratamiento, la supervivencia general de los pacientes con NPC sigue siendo insatisfactoria. Esto probablemente se deba a que las células de NPC pueden proliferar rápidamente y tienen una alta tendencia a metastatizarse a ganglios linfáticos regionales y órganos distantes2. Por lo tanto, es esencial explorar los mecanismos moleculares que promueven la progresión del NPC. Recientemente, la ferroptosis, una nueva modalidad de muerte celular, regulada por Fe2⁺ y peróxidos lipídicos de manera dependiente del hierro, se ha encontrado que está críticamente involucrada en el NPC3. La evidencia actual ha demostrado que la ferroptosis desempeña un papel importante en el NPC, y su inducción puede potenciar la radioterapia contra el cáncer4,5.
Debido a su toxicidad mínima y a los efectos secundarios reducidos, las fórmulas herbales chinas se han utilizado ampliamente para tratar el cáncer durante miles de años6,7. Como un tipo de medicamento con múltiples componentes, múltiples dianas y efecto sinérgico, las recetas de medicina tradicional china (MTC) se han empleado como terapia complementaria eficaz en la prevención y el tratamiento del cáncer, incluido el carcinoma nasofaríngeo (NPC)8,9,10. La raíz de Ophiopogon (RO), la raíz de la planta herbácea perenne Ophiopogon japonicus, se ha reportado que alivia eficazmente el NPC como terapia adyuvante11,12. La ruscogenina (Rus), el componente principal de la RO, se ha descrito con potentes efectos anticancerígenos13. En modelos murinos de cáncer colorrectal, la Rus puede mejorar las lesiones de las uniones estrechas e inhibir la migración tumoral14. Importante, la Rus también puede disminuir la viabilidad de las células de cáncer de páncreas mediante la inducción de ferroptosis. Sin embargo, el efecto de la Rus sobre el NPC aún no está claro.
La epigenética es el campo principal de investigación en la patogénesis del cáncer y proporciona múltiples tratamientos eficaces15. Como una de las modificaciones epigenéticas más estudiadas, la metilación de histonas participa en el desarrollo del cáncer y también constituye un objetivo importante en el diseño de fármacos16. La modulación dinámica de la metilación de histonas está mediada por metiltransferasas y desmetilasas17. KDM1A es una lisina desmetilasa de histonas que se ha encontrado críticamente implicada en la carcinogénesis debido a su participación en la modulación epigenética18. Además, se ha descubierto que KDM1A actúa como una oncoproteína con alta expresión en múltiples tipos de cáncer, como el cáncer de pulmón y el cáncer de páncreas19. Guo et al. informaron que el aumento de KDM1A podía suprimir la expresión del homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN) y potenciar la proliferación y migración de células de CPN, al tiempo que inhibía la apoptosis20. Asimismo, también se encontró que la sobreexpresión de KDM1A podía reprimir la ferroptosis en el cáncer de pulmón21. El análisis mediante la base de datos Super-PRED indicó que KDM1A es un objetivo potencial de Rus.
A pesar del potencial anti-tumoral reconocido de Rus en otros tipos de cáncer, su papel específico y sus mecanismos moleculares en el carcinoma nasofaríngeo permanecen completamente inestablecidos, lo que representa una importante brecha en la investigación. Además, aunque informes previos han vinculado por separado a KDM1A con la proliferación tumoral y la resistencia a la ferroptosis, ningún estudio hasta ahora ha explorado si el enfoque dirigido contra KDM1A puede desencadenar simultáneamente múltiples vías de muerte celular en el CNP. Por lo tanto, este estudio proporciona una sólida justificación para hipotetizar que Rus podría suprimir la progresión maligna de las células del CNP al regular directamente a la baja a KDM1A.
Este estudio tuvo como objetivo abordar esta brecha mediante la evaluación sistemática del efecto de Rus sobre la proliferación, migración e invasión de células de CPN. La principal novedad de esta investigación radica en revelar una estrategia de doble mecanismo. Se centró en la capacidad de Rus para inducir simultáneamente tanto la apoptosis clásica como la ferroptosis dependiente del hierro. Al validar el nuevo eje de señalización Rus-KDM1A, este estudio amplía significativamente el conocimiento actual al demostrar cómo un solo compuesto natural puede superar la resistencia tumoral mediante un bloqueo simultáneo de múltiples vías, ofreciendo una justificación preclínica prometedora para la terapia dirigida del CPN.
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Cultivo celular, tratamiento y transfección
La línea celular de carcinoma nasofaríngeo humano (NPC), C666-1 (RRID: CVCL_M597), y la línea celular de epitelio nasofaríngeo humano no maligno, NP69 (RRID: CVCL_F755), se adquirieron de un proveedor comercial. Ambas líneas celulares fueron autenticadas mediante perfilado de repeticiones en tándem cortas (STR) y se confirmó que estaban libres de contaminación por micoplasma antes de su uso. Para el cultivo rutinario, las células C666-1 se propagaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de penicilina-estreptomicina. Las células NP69 se cultivaron en medio libre de suero para queratinocitos, suplementado con 10 % de FBS, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico recombinante y 1 % de penicilina-estreptomicina. La ruscogenina (Rus; pureza ≥ 98 %) se adquirió de un proveedor comercial. Ambas líneas celulares se mantuvieron en un incubador humedecido a 37 °C bajo 5 % de CO₂. Para los tratamientos, las células se expusieron a ruscogenina (Rus) a concentraciones variables (10, 20, 50 µM) durante 24 h22. Para la transfección, se transfirieron en las células C666-1 plásmidos que codifican la desmetilasa 1A específica para lisina para sobreexpresión (oe-KDM1A) y un vector vacío negativo correspondiente (oe-NC), adquiridos de un proveedor comercial, cuando la confluencia celular alcanzó entre 70 y 80 %. Específicamente, 2,5 µg de ADN plasmídico y 5 µL de un reactivo de transfección basado en lípidos se diluyeron por separado en 150 µL de un medio con bajo contenido de suero, se mezclaron suavemente, se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente y luego se añadieron a cada pocillo de una placa de 6 pocillos según el protocolo del fabricante. Las células se incubaron durante 48 h a 37 °C, y posteriormente se confirmó la eficacia de la transfección.
Ensayo con el kit de conteo celular-8 (CCK-8)
La viabilidad celular tras el tratamiento con Rus se cuantificó mediante el ensayo CCK-8. Para este procedimiento, las células se sembraron primero en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche. El ensayo se inició añadiendo 10 µL de solución CCK-8, y tras 2 h de incubación, el cambio colorimétrico resultante se midió como densidad óptica (OD) a 450 nm utilizando un lector de placas.
Ensayo de formación de colonias
Para evaluar la supervivencia clonogénica, las células C666-1 se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 14 días. Tras el período de incubación, las colonias resultantes se fijaron con metanol al 100 % durante 10 min y luego se visualizaron con violeta de cristal al 0,5 % durante 30 min. A continuación, se cuantificó el número de colonias teñidas mediante imágenes microscópicas y recuento.
Transferencia Western
Para el análisis por inmunotransferencia, primero se extrajo la proteína total de las células con tampón RIPA, y los lisados resultantes se centrifugaron (12.000 × g) para recolectar el sobrenadante. Se utilizó un ensayo BCA para cuantificar los niveles de proteína. Se cargaron cantidades iguales de proteína total (30 µg por pocillo) y se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 % (SDS-PAGE). Tras la separación, las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) a un voltaje constante de 100 V durante 90 min en hielo. Luego, las membranas se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 5 % preparada en solución salina tamponada con tris que contenía Tween 20 al 0,1 % (TBST) durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranes se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo (todos a 1:1000): Ki67, PCNA, MMP2, MMP9, Bcl-2, Bax, KDM1A, SLC7A11, GPX4, ACSL4, TFR1 y β-actin. Finalmente, tras una incubación de 2 h con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP), las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando un reactivo de detección por quimioluminiscencia mejorada (ECL), y se realizó un análisis densitométrico con software de análisis de imágenes.
Ensayo de raya para heridas
Para el ensayo de cicatrización de heridas, las células C666-1 se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 80 % en placas de 6 pocillos. Se realizó una herida uniforme en la monocapa mediante raspadura con la punta de un pipeta de 200 µL. Las células desprendidas se eliminaron mediante un lavado con PBS, tras lo cual se reemplazó el medio de cultivo por medio sin suero y se incubó durante 24 h. Se capturaron imágenes del área de la herida a las 0 h y a las 24 h utilizando un microscopio de luz para evaluar la migración celular.
Ensayo Transwell
La invasión celular se evaluó utilizando cámaras tipo transwell (con poros de 8 µm) previamente recubiertas con 50 µL de matriz de membrana basal. La capacidad invasiva de las células C666-1 se analizó mediante cámaras tipo transwell. Los insertos superiores se sembraron con células suspendidas en medio sin suero, mientras que los pozos inferiores contenían DMEM con 10 % de FBS. Tras una incubación de 24 h, las células que permanecían en el lado apical de la membrana se eliminaron cuidadosamente. Para la cuantificación, las células localizadas en la superficie basolateral se fijaron en metanol, se tiñeron con violeta cristal al 0,1 % y se contaron a partir de imágenes capturadas por microscopía de luz.
Citometría de flujo
La apoptosis se cuantificó mediante citometría de flujo. Para preparar las muestras, se recolectaron células C666-1, se lavaron con PBS frío y luego se resuspendieron en 100 µL de tampón de enlace. Las células se tiñeron simultáneamente con Annexina-V-FITC (20 µg/mL) y yoduro de propidio (PI). Esta tinción se realizó durante 15 min en hielo, protegida de la luz. Los datos se adquirieron inmediatamente en un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de células apoptóticas.
Detección de la actividad de la caspasa-3
La actividad de la caspasa-3 se midió utilizando un kit de ensayo comercial según las instrucciones del fabricante. En breve, las células C666-1 fueron lisadas, y los sobrenadantes se recolectaron tras la centrifugación a 14.000 × g. Tras una incubación de 2 h con el reactivo proporcionado, la absorbancia de cada sobrenadante se cuantificó a 405 nm.
RT-qPCR
El ARN total se purificó a partir de células C666-1 utilizando un reactivo comercial de extracción de ARN. El ARN obtenido se transcribió inversamente en ADN complementario de primera cadena utilizando un kit comercial según el protocolo del fabricante. Posteriormente, se realizó el análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa (qPCR) en un sistema de PCR en tiempo real con una mezcla maestra basada en SYBR Green. Se empleó el método comparativo de Ct (2⁻△△Ct) para determinar los niveles relativos de transcritos. Las secuencias de los cebadores utilizadas para la amplificación fueron: β-actin (Sentido: 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'; Antisentido: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3') y KDM1A (Sentido: 5'-TGACCGGATGACTTCTCAAGA-3'; Antisentido: 5'-GTTGGAGAGTAGCCTC AAATGTC-3').
Ensayo de sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Para medir la peroxidación lipídica, primero se prepararon sobrenadantes a partir de células C666-1 mediante precipitación (15 % TCA, 500 mM BHA) y centrifugación durante 10 min a 10 000 × g. Luego, estos sobrenadantes se hicieron reaccionar con ácido tiobarbitúrico al 0,375 % y se calentaron a 100 °C durante 10 min para generar el aducto MDA-TBA. El nivel de este aducto, indicativo de peroxidación lipídica, se determinó midiendo la absorbancia a 532 nm en un lector de microplacas23.
Detección de especies reactivas de oxígeno lipídicas (ROS)
Se detectó la peroxidación lipídica utilizando una sonda fluorescente de peroxidación lipídica. Las células C666-1 se sembraron en placas de 6 pocillos, se cultivaron durante la noche y luego se expusieron a la sonda fluorescente (2 µM). Esta sonda presenta un desplazamiento de fluorescencia del rojo al verde tras la oxidación. Se analizó la relación de fluorescencia verde/rojo mediante un microscopio confocal de barrido láser y software de análisis de imágenes. La relación de fluorescencia verde/rojo representada gráficamente estuvo claramente definida y se utilizó como indicador cuantitativo de los niveles de peroxidación lipídica24.
Detección de Fe2+
El nivel intracelular de hierro ferroso (Fe2⁺) se midió utilizando una sonda fluorescente de hierro intracelular. Las células C666-1 se incubaron con 10 µM de sonda fluorescente durante 10 min. Después de lavar con PBS para eliminar el exceso de sonda, las células se analizaron mediante microscopía de fluorescencia.
Análisis de acoplamiento molecular
El acoplamiento molecular es un método computacional fundamental que facilita el diseño de fármacos novedosos mediante la predicción de la afinidad de unión y la interacción entre un ligando y su proteína diana, evaluando sus modos de unión25. A partir de la página web de RCSB PDB (https://www.rcsb.org/), se obtuvo la estructura tridimensional de KDM1A (ID de PDB: 6NQU). Para la preparación de la estructura proteica de KDM1A, se eliminó el agua y los ligandos pequeños irrelevantes. La simulación de acoplamiento molecular se realizó mediante software de acoplamiento molecular utilizando el algoritmo genético lamarcquiano, y la visualización se llevó a cabo con software de visualización molecular26.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron utilizando al menos tres réplicas biológicas independientes, y los resultados se presentan como la media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se realizó mediante software de análisis estadístico. Las diferencias entre múltiples grupos se evaluaron mediante análisis de varianza de un solo factor (ANOVA) seguido de la prueba a posteriori de comparaciones múltiples de Tukey. Se consideró que un valor de P menor a 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa.
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La ruscogenina inhibe selectivamente la viabilidad y la proliferación de células de carcinoma nasofaríngeo
El estudio primero investigó el efecto de la ruscogenina (Rus) sobre la viabilidad de células epiteliales nasofaríngeas normales (NP69) y células de carcinoma nasofaríngeo (NPC) (C666-1). Según se determinó mediante el ensayo CCK-8, el tratamiento con Rus en concentraciones de 10, 20 y 50 µM no mostró toxicidad significativa hacia las células normales NP69. Por el contrar...
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El carcinoma nasofaríngeo (CNF) es una neoplasia grave que presenta una alta prevalencia de metástasis, lo que explica por qué se requieren con urgencia mejores intervenciones27. Aquí se demuestra que la ruscogenina (Rus), un producto natural derivado de Radix ophiopogonis, ejerce fuertes efectos antitumorales sobre las células de CNF. Asimismo, se concluye que Rus previene la progresión del CNF mediante la supresión de la desmetilasa de histonas KDM1A, lo que a su vez promueve dos tipos ...
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Los autores declaran que no existen intereses financieros en conflicto. Los autores declaran que no se utilizaron herramientas de inteligencia artificial generativa en la concepción del estudio, la recopilación de datos, el análisis de datos o la generación de figuras. Las tecnologías con asistencia de inteligencia artificial se utilizaron únicamente para ediciones lingüísticas menores y correcciones gramaticales durante la redacción de este manuscrito. Los autores asumen toda la responsabilidad por el contenido y la integridad del trabajo publicado.
No aplicable.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema 7500 Fast de PCR en Tiempo Real | Applied Biosystems | 4351106 | Análisis de RT-qPCR |
| Kit de apoptosis Annexina-V-FITC/PI | BD Biosciences | 556547 | Detección de apoptosis por citometría de flujo |
| anticuerpo anti-ACSL4 | Abcam | ab155282 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia (Western blot) |
| anticuerpo anti-Bax | Cell Signaling Technology (CST) | 5023 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia |
| anticuerpo anti-Bcl-2 | Cell Signaling Technology (CST) | 15071 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia (Western blot) |
| Anticuerpos | |||
| anticuerpo anti-GPX4 | Abcam | ab125066 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia (Western blot) |
| Anticuerpo anti-KDM1A (LSD1) | Cell Signaling Technology (CST) | 2139 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia |
| anticuerpo anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia Western |
| anticuerpo anti-MMP2 | Abcam | ab92536 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia (Western blot) |
| anticuerpo anti-MMP9 | Abcam | ab76003 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia (Western blot) |
| Anticuerpo anti-PCNA | Cell Signaling Technology (CST) | 13110 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia |
| IgG anti-conejo, conjugada con HRP | Cell Signaling Technology (CST) | 7074 | Anticuerpo secundario |
| Anticuerpo anti-SLC7A11 (xCT) | Abcam | ab175186 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia (Western blot) |
| anticuerpo anti-TFR1 | Abcam | ab84036 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia (Western blot) |
| Anti-βanticuerpo contra la actina | Cell Signaling Technology (CST) | 4970 | anticuerpo primario de control de carga |
| Kits de ensayo | |||
| Autodock 4.2 | Instituto de Investigación Scripps | N/A | Simulación de acoplamiento molecular |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Beyotime Biotechnology | P0012 | Cuantificación de proteínas |
| Sonda BODIPY 581/591 C11 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | D3861 | Detección de ROS lipídicos (2 μM) |
| línea celular C666-1 | iCell Bioscience Inc. | iCell-h378 | Línea celular de carcinoma nasofaríngeo humano |
| Kit de ensayo de actividad de caspasa-3 | Beyotime Biotechnology | C1115 | Evaluación de la apoptosis |
| kit de ensayo CCK-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | Medición de la viabilidad celular |
| Productos químicos & Reactivos | |||
| Citómetro de flujo CytoFLEX | Beckman Coulter | CytoFLEX | Análisis de apoptosis |
| Reactivo de detección ECL | MilliporeSigma | WBKLS0500 | Visualización de inmunotransferencia (Immobilon) |
| Equipamiento | |||
| Suero bovino fetal (SBF) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10099141 | Suplemento para cultivo celular |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | N/A | Análisis estadístico y elaboración de gráficos |
| software ImageJ | NIH | N/A | Análisis de densitometría de imagen |
| Medio libre de suero para queratinocitos | iCell Bioscience Inc. | iCell-019 | Para el cultivo celular de NP69 |
| Microscopio confocal de barrido láser | Carl Zeiss | LSM 880 | Imagen de fluorescencia con BODIPY C11 |
| Microscopio de luz / de fluorescencia | Olympus | IX73 | Rasgado de herida, Transwell & Imagenología de Fe2+ |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche Diagnostics | 4887352001 | PCR cuantitativa en tiempo real |
| reactivo Lipofectamine 2000 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 11668019 | Reactivo para transfección celular |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matriz de membrana basal para ensayo de invasión |
| Lector de microplacas | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Medición de absorbancia (405, 450, 532 nm) |
| línea celular NP69 | iCell Bioscience Inc. | iCell-h431 | Línea celular epitelial nasofaríngea humana normal |
| oe-KDM1A & plásmidos oe-NC | Shanghai GenePharma Co., Ltd. | Síntesis personalizada | Plásmidos para la sobreexpresión de KDM1A |
| sonda Phen Green SK (PGSK) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | P14312 | Detección de Fe2+ intracelular (10 μM) |
| Pymol 3.0 | Schrödinger | N/A | Visualización del acoplamiento molecular |
| Kit de transcripción inversa | Roche Diagnostics | 4379012001 | Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit |
| Tampón de lisis RIPA | Solarbio (Pekín, China) | R0010 | Extracción de proteínas totales |
| Medio RPMI 1640 | iCell Bioscience Inc. | iCell-0002 | Para el cultivo celular de C666-1 |
| Ruscogenina (Rus) | MedChemExpress (MCE) | HY-N0193 | Tratamiento farmacológico, pureza ≥ 98% |
| Software | |||
| kit de ensayo TBARS | Cayman Chemical | 10009055 | Medición de la peroxidación lipídica |
| Reactivo TRizol | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)* | 15596026 | Extracción de ARN total |
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