Artículo de método

Técnica de sujeción manual orientada al bienestar para la administración de sustancias y el muestreo de sangre en ratones

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DOI:

10.3791/72535

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25 de agosto de 2026

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1Department of Hematology, Oncology, and Tumor Immunology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 2Taskforce Refinement C3R, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 4Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité – Universitätsmedizin Berlin, 5Research Facilities of Experimental Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un nuevo método manual de contención para inmovilizar ratones durante inyecciones o muestreo de sangre, reduciendo así el estrés y mejorando el bienestar durante los procedimientos.

Resumen

La experimentación con animales sigue siendo esencial en la investigación biomédica, contribuyendo significativamente a la comprensión de los mecanismos de las enfermedades y a la evaluación de la eficacia y seguridad de fármacos y sustancias químicas, siendo los roedores uno de los animales de laboratorio más utilizados. Entre las intervenciones más comunes en la práctica de laboratorio se incluyen el manejo y la inmovilización durante procedimientos como inyecciones y toma de muestras de sangre, que se realizan rutinariamente en ratones conscientes sin sedación ni anestesia. Una inmovilización adecuada es necesaria para garantizar la seguridad tanto del animal como del manipulador. Sin embargo, los métodos tradicionales de inmovilización, como la fijación manual o el uso de tubos contenedores, se sabe que inducen respuestas agudas de estrés en los ratones, afectando negativamente el bienestar animal y posiblemente influyendo en los resultados experimentales. Para promover el refinamiento dentro del marco del principio de las 3R y mejorar el bienestar animal, este protocolo describe el uso de un túnel recientemente desarrollado para inyecciones y toma de muestras de sangre en ratones. El túnel proporciona un método de inmovilización menos agresivo pero igualmente seguro en comparación con las técnicas convencionales. Este método de inmovilización orientado al bienestar puede implementarse fácilmente en procedimientos estándar, como inyecciones intraperitoneales e intravenosas y toma de muestras de sangre, minimizando al mismo tiempo el estrés y mejorando las condiciones de manejo de los ratones de laboratorio.

Introducción

La experimentación con animales continúa desempeñando un papel central en la investigación biomédica, contribuyendo significativamente a la comprensión de los mecanismos de las enfermedades y a la evaluación de la eficacia y seguridad de fármacos y sustancias químicas. Los roedores representan las especies animales de laboratorio más utilizadas; en la Unión Europea, aproximadamente 3,5 millones de ratones y 0,5 millones de ratas se utilizaron con fines científicos en 20231. Un creciente reconocimiento social del sufrimiento causado por los procedimientos experimentales ha llevado a requisitos legales para mejorar el bienestar animal en los estudios de investigación, siguiendo el principio de las 3R2,3. Dado que la sustitución completa de la experimentación animal por métodos alternativos aún no es posible, optimizar los procedimientos experimentales existentes es particularmente importante para aliviar el sufrimiento animal. El manejo, incluyendo las restricciones de inmovilización durante procedimientos como inyecciones, es una de las intervenciones más comunes a las que se someten los animales de laboratorio tanto en los cuidados rutinarios como durante los experimentos.

El método tradicional de inmovilización por restricción para inyecciones intraperitoneales consiste en agarrar firmemente la piel y el pelaje del cuello con el pulgar y el índice, sujetar la cola y girar a los animales para exponer el abdomen y realizar las inyecciones. Esta posición es antinatural y puede provocar dificultad para respirar, lo que induce miedo en los animales4. Ya se han descrito diversas técnicas refinadas de restricción, como, por ejemplo, el llamado método de los tres dedos, en el cual la presión sobre la zona del cuello se reduce en comparación con las técnicas clásicas de sujeción por el cuello4. Otro método evita en gran medida la inmovilización completa: en este caso, los animales pueden aferrarse a una malla metálica mientras se restringen la cola y las extremidades posteriores, lo que permite el acceso al abdomen inferior para las inyecciones5. Sin embargo, ambos procedimientos tienen limitaciones. Con el método de los tres dedos, los animales aún deben levantarse y colocarse en una posición antinatural, lo que potencialmente puede desencadenar respuestas de estrés. La técnica alternativa, por otro lado, no ofrece suficiente protección contra mordeduras de animales estresados o defensivos y puede limitar el tiempo disponible para realizar las inyecciones. Además de las posibles lesiones por mordeduras, también existe un mayor riesgo de restricción inadecuada o lesiones accidentales por punción con aguja. La inmovilización para inyecciones intravenosas o para la extracción de sangre de la vena de la cola requiere el uso de dispositivos de restricción que inmovilicen a los animales sin necesidad de sostenerlos manualmente, dejando así las manos libres para realizar los procedimientos. Estos dispositivos de restricción suelen ser tubos hechos de acrílico transparente, con un extremo cerrado que posee ranuras o orificios para el acceso a la cola y un extremo abierto para introducir a los ratones, el cual puede fijarse con tapones ajustables. Este procedimiento requiere tomar a los animales por la cola y introducirlos en el dispositivo de restricción primero con la parte trasera, de modo que la cola pueda pasar a través de las ranuras de acceso. Se trata de un procedimiento estresante, agravado por el diámetro relativamente estrecho de los dispositivos de restricción, necesario para evitar que los ratones den vueltas durante los procedimientos, lo que podría provocar lesiones6,7.

Este protocolo describe el uso de un túnel de aplicación recién desarrollado para inyecciones y extracción de sangre en ratones, que permite una fijación menos agresiva pero igualmente segura. El túnel consta de un armazón exterior rígido y un forro interior extraíble de felpa, que crea un espacio suave y oscuro similar a una madriguera. En comparación con los sujetadores convencionales, el túnel fue diseñado deliberadamente con dimensiones más grandes para acomodar una inserción de Vetbed Isobed cortada a medida, proporcionando un forro interior blando y cómodo que mejora la sensación de seguridad de los animales mientras mantiene una sujeción adecuada (Figura 1A–B). Ambos extremos del túnel están abiertos, por lo que los ratones pueden entrar simplemente caminando desde el frente y salir por la parte trasera. Una vez dentro del túnel, se impide que los animales den la vuelta, mientras que la cola permanece accesible para inyecciones intravenosas o muestreo sanguíneo (Figura 1C). Para inyecciones intraperitoneales, se puede acceder a la región abdominal caudal colocando el túnel en un ángulo (Figura 1D) y sujetando la cola del animal por su base mientras se aplica una leve presión sobre la zona sacra, doblando la parte trasera del ratón hacia arriba (Figura 1C). Este método es menos estresante tanto para los ratones como para los experimentadores, ya que no requiere sujeción manual.

Un estudio previo mostró que el uso del túnel para inyecciones intraperitoneales reduce de forma duradera los niveles de estrés y mejora el bienestar de los ratones, incluso en modelos experimentales con inyecciones intraperitoneales frecuentes8. En este estudio, el túnel de aplicación también se probó con éxito para inyecciones intravenosas y toma de muestras de sangre de la vena de la cola en ratones machos y hembras.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo fueron revisados y aprobados por la autoridad local competente (Oficina Estatal de Salud y Asuntos Sociales de Berlín (LAGeSo); número de aprobación 2022-077-G) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE 2.0. Todos los materiales utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Administración intravenosa

NOTA: Este método describe un enfoque de contención manual orientado al bienestar animal para la administración intravenosa en ratones. Las inyecciones intravenosas deben realizarse únicamente por personal capacitado, cumpliendo con las directrices institucionales y los procedimientos establecidos de seguridad e higiene.

  1. Preparación de los animales
    ADVERTENCIA: Use siempre el equipo de protección personal (EPP) necesario según los requisitos de bioseguridad e higiene de la institución (por ejemplo, batas, guantes, gorros, mascarillas) al trabajar con animales.
    1. Coloque la jaula de alojamiento bajo una lámpara roja durante 10–15 min para promover la vasodilatación y mejorar la visibilidad de las venas de la cola.
  2. Preparación del área de trabajo
    1. Limpie el túnel de aplicación con etanol al 70 %. Deje que el etanol evapore completamente durante aproximadamente 5 min.
    2. Coloque un trozo enrollado de forro lavado y autoclaveado (corte un Vetbed Isobed al tamaño requerido) dentro del túnel (Figura 1B).
    3. Mediante los dedos, comprima suavemente el forro en la entrada del túnel hasta que la abertura restante tenga aproximadamente el ancho de dos dedos adyacentes. No comprima más el forro.
    4. Coloque el túnel de aplicación sobre la superficie de trabajo y coloque un trozo adicional de forro plano frente a la entrada del túnel.
    5. Prepare la jeringa de inyección equipada con una aguja de 27G que contenga la solución de inyección deseada y colóquela junto al túnel. Asegúrese de que los torundas y el aerosol desinfectante estén fácilmente disponibles.
  3. Restricción orientada al bienestar en un túnel
    1. Transfiera el ratón desde la jaula de alojamiento utilizando un tubo de manipulación.
    2. Permita que el ratón ingrese voluntariamente al túnel de aplicación colocando el tubo de manipulación directamente frente a la abertura del túnel (Figura 1C).
      NOTA: Algunos ratones prefieren primero subirse al forro colocado frente al túnel de aplicación antes de entrar voluntariamente en el túnel. Puede evitarse que los ratones caminen demasiado hacia el interior del túnel sosteniendo suavemente la base de la cola.
    3. Una vez dentro, el ratón generalmente permanece posicionado dentro del forro enrollado sin darse la vuelta.
      NOTA: Si los ratones no entran en el túnel, la abertura podría ser demasiado pequeña; comprima ligeramente el forro en la entrada del túnel. Si los ratones son demasiado pequeños y tienden a darse la vuelta, apriete más el forro enrollado o agregue una capa adicional (Figura 1B).
  4. Inyección intravenosa
    NOTA: La inyección intravenosa se realiza siguiendo procedimientos convencionales bien establecidos de inyección en la vena de la cola.
    1. Enderece suavemente la cola sujetando la punta y desinfecte el sitio de inyección previsto. Gire la cola aproximadamente 90° para posicionar las venas laterales de la cola dorsalmente.
    2. Comience la inyección en el extremo distal de la cola para permitir intentos adicionales en sitios más proximales, si es necesario.
      PASO CRÍTICO: Inserte la aguja con un ángulo de aproximadamente 15–20° respecto a la cola, manteniendo la aguja casi paralela a esta. Avance la aguja solo ligeramente más allá del bisel, ya que las venas de la cola son superficiales. La colocación correcta de la aguja se indica por una resistencia mínima durante la inyección y por el flujo visible de la solución inyectada a través de la vena. Inyecte el volumen deseado a un ritmo lento y constante (≤5 mL/kg durante 13 s). Tras retirar la aguja, aplique presión suave sobre el sitio de inyección con una torunda estéril para prevenir hemorragias.
      ADVERTENCIA: Deseche inmediatamente las agujas/jeringas usadas en contenedores resistentes a perforaciones y fugas para objetos punzocortantes. No intente recolocar la tapa de las jeringas para prevenir lesiones por punción con agujas.
  5. Liberación y refuerzo positivo
    1. Devuelva el túnel que contiene al ratón a la jaula de alojamiento y permita que el animal salga voluntariamente por el extremo opuesto del túnel (Figura 1C).
    2. Proporcione premios en la jaula de alojamiento para favorecer el refuerzo positivo y la habituación al procedimiento.
  6. Limpieza y mantenimiento
    1. Retire el forro interno del túnel de aplicación. Limpie el túnel de aplicación con etanol al 70 %.
    2. Si el forro permanece limpio, puede reutilizarse en experimentos posteriores. Si está contaminado o visiblemente sucio, lávelo y autoclávelo antes de reutilizarlo.
      NOTA: Utilice un forro por grupo experimental. Reemplace el forro entre diferentes experimentos, entre animales machos y hembras, y siempre que lo requieran las normas institucionales de higiene.

2. Administración intraperitoneal

NOTA: Este método describe un enfoque de contención manual orientado al bienestar para la administración intraperitoneal en ratones. Las inyecciones intraperitoneales deben realizarse únicamente por personal capacitado, cumpliendo con las directrices institucionales y de acuerdo con procedimientos establecidos de seguridad e higiene. Para facilitar un mejor acceso al área de inyección, se utiliza un túnel de aplicación en combinación con una plataforma inclinada (cuña), que eleva hacia arriba la parte posterior de los ratones.

  1. Preparación del área de trabajo
    1. Limpie el túnel de aplicación y la cuña con etanol al 70 %. Deje que el etanol evapore completamente durante aproximadamente 5 min.
    2. Coloque un trozo enrollado de forro lavado y autoclaveado (corte un Vetbed Isobed al tamaño requerido) dentro del túnel (Figura 1B).
    3. Usando los dedos, comprima suavemente el forro en la entrada del túnel hasta que la abertura restante tenga aproximadamente el ancho de dos dedos adyacentes. No comprima más el forro.
    4. Coloque el túnel de aplicación encima de la cuña (Figura 1D) sobre la superficie de trabajo y coloque un forro adicional plano frente a la entrada del túnel.
    5. Prepare la jeringa de inyección equipada con una aguja de 27G que contenga la solución de inyección deseada y colóquela junto al túnel.
  2. Restricción orientada al bienestar en un túnel
    ADVERTENCIA: Use siempre el equipo de protección personal (EPP) necesario según los requisitos de bioseguridad e higiene de la institución (por ejemplo, batas, guantes, gorros, mascarillas) al trabajar con animales.
    1. Transfiera el ratón desde su jaula de alojamiento utilizando un tubo de manipulación. Permita que el ratón ingrese voluntariamente al túnel de aplicación colocando el tubo de manipulación directamente frente a la abertura del túnel (Figura 1C).
      NOTA: Algunos ratones prefieren primero subirse al forro colocado frente al túnel de aplicación antes de ingresar voluntariamente al túnel. En este caso, permita que el ratón entre al túnel antes de colocar el túnel sobre la cuña.
    2. Una vez dentro, sostenga suavemente la base de la cola entre el dedo índice y el pulgar para evitar que el ratón avance demasiado dentro del túnel. Normalmente, el ratón permanece posicionado dentro del forro enrollado sin darse la vuelta.
      NOTA: Si los ratones no entran al túnel, la abertura podría ser demasiado pequeña; comprima ligeramente el forro en la entrada del túnel. Si los ratones son demasiado pequeños y tienden a darse la vuelta, apriete más el forro enrollado o agregue una capa adicional (Figura 1B).
  3. Inyección intraperitoneal
    1. Sostenga la base de la cola entre el pulgar y el dedo índice de una mano (Figura 1C). Aplique presión suave sobre la zona sacra usando el dedo medio de la misma mano y gire ligeramente la cola hacia arriba. Esto estabiliza al animal y proporciona acceso claro a la región abdominal caudal.
    2. PASO CRÍTICO: Realice la inyección sosteniendo la jeringa paralela a la superficie de trabajo e insertándola en la región abdominal caudal claramente visible.
    3. Tras la inyección, libere suavemente la presión y suelte la cola.
      ADVERTENCIA: Deseche inmediatamente las agujas/jeringas usadas en contenedores resistentes a perforaciones y fugas para objetos punzocortantes. No intente recolocar las tapas de las jeringas para prevenir lesiones por pinchazos.
  4. Liberación y refuerzo positivo
    1. Devuelva el túnel que contiene al ratón a su jaula de alojamiento y permita que el animal salga voluntariamente por el extremo opuesto del túnel (Figura 1C).
    2. Proporcione premios en la jaula de alojamiento para favorecer el refuerzo positivo y la habituación al procedimiento.
  5. Limpieza y mantenimiento
    1. Retire el forro interno del túnel de aplicación. Limpie el túnel de aplicación y la cuña con etanol al 70 %.
    2. Si el forro permanece limpio, puede reutilizarse en experimentos posteriores. Si está contaminado o visiblemente sucio, lávelo y autoclávelo antes de reutilizarlo.
      NOTA: Utilice un forro por grupo experimental. Reemplace el forro entre diferentes experimentos, entre animales macho y hembra, y siempre que lo requieran las normas institucionales de higiene.

3. Toma de muestras de sangre de la vena de la cola

NOTA: Este método describe un enfoque de restricción manual orientado al bienestar para la toma de muestras de sangre de la vena de la cola en ratones. Todos los procedimientos deben ser realizados por personal capacitado cumpliendo con las directrices institucionales y con los protocolos establecidos de seguridad e higiene.

  1. Preparación del área de trabajo
    1. Limpie el túnel de aplicación con etanol al 70 %. Deje que el etanol evapore completamente durante aproximadamente 5 min.
    2. Coloque un trozo enrollado de forro lavado y autoclaveado (corte un Vetbed Isobed al tamaño requerido) dentro del túnel (Figura 1B).
    3. Usando los dedos, comprima suavemente el forro en la entrada del túnel hasta que la abertura restante tenga aproximadamente el ancho de dos dedos adyacentes. No comprima más el forro.
    4. Coloque el túnel de aplicación sobre la superficie de trabajo y coloque un forro adicional plano frente a la entrada del túnel.
    5. Asegúrese de que lancetas, microtubos para recolección de sangre, hisopos y spray desinfectante estén fácilmente disponibles.
  2. Restricción orientada al bienestar en un túnel
    ADVERTENCIA: Use siempre el equipo de protección personal (EPP) necesario según los requisitos de bioseguridad e higiene de la institución (por ejemplo, batas, guantes, gorros, mascarillas) al trabajar con animales.
    1. Transfiera el ratón desde su jaula de alojamiento utilizando un tubo de manipulación. Permita que el ratón ingrese voluntariamente al túnel de aplicación colocando el tubo de manipulación directamente frente a la abertura del túnel (Figura 1C).
      NOTA: Algunos ratones prefieren primero subirse al forro colocado frente al túnel de aplicación antes de entrar voluntariamente en el túnel. Se puede evitar que los ratones caminen demasiado hacia el interior del túnel sosteniendo suavemente la base de la cola.
    2. Una vez dentro, el ratón generalmente permanece posicionado dentro del forro enrollado sin darse la vuelta.
      NOTA: Si los ratones no entran al túnel, la abertura podría ser demasiado pequeña; comprima ligeramente el forro en la entrada del túnel. Si los ratones son demasiado pequeños y tienden a darse la vuelta, apriete más el forro enrollado o agregue una capa adicional (Figura 1B).
  3. Muestreo de sangre
    1. Enderece suavemente la cola sosteniendo la punta y desinfecte el sitio de muestreo previsto. Gire la cola aproximadamente 90° para posicionar las venas laterales de la cola en posición dorsal.
    2. PASO CRÍTICO: Puncione la vena lateral utilizando una lanceta. Recoja las gotas de sangre usando un microtubo o capilar.
      ADVERTENCIA: Deseche inmediatamente las lancetas usadas en contenedores resistentes a perforaciones y herméticos para objetos punzocortantes. No intente recolocar la tapa de las lancetas para prevenir lesiones por pinchazos.
    3. Después del muestreo, aplique presión suave sobre el sitio de punción con un hisopo estéril para controlar el sangrado.
  4. Liberación y refuerzo positivo
    1. Devuelva el túnel que contiene al ratón a su jaula de alojamiento y permita que el animal salga voluntariamente por el extremo opuesto del túnel (Figura 1C).
    2. Proporcione premios en la jaula de alojamiento para favorecer el refuerzo positivo y la habituación al procedimiento.
  5. Limpieza y mantenimiento
    1. Retire el forro interno del túnel de aplicación. Limpie el túnel de aplicación con etanol al 70 %.
    2. Si el forro permanece limpio, puede reutilizarse en experimentos posteriores. Si está contaminado o visiblemente sucio, lávelo y autoclávelo antes de reutilizarlo.
      NOTA: Use un forro por grupo experimental. Reemplace el forro entre diferentes experimentos, entre animales machos y hembras, y siempre que lo requieran las normas institucionales de higiene.

Resultados

Para evaluar la influencia de la nueva técnica de inmovilización en el bienestar de los ratones, se realizaron muestreos de sangre de la vena caudal e inyecciones intravenosas según el protocolo descrito. Ratones macho y hembra de tipo salvaje C57BL/6 fueron sometidos a los procedimientos ya sea en el túnel de aplicación o en un inmovilizador convencional, y se evaluaron signos de dolor y estrés. Se utilizó la escala de gesto facial del ratón (MGS) para determinar el nivel de estrés de los ratones tras el muestreo de sangre de la vena caudal. La MGS es un sistema de puntuación ampliamente utilizado, que analiza la expresión de los músculos faciales como reacción al dolor o a procedimientos estresantes9,10. Para determinar las puntuaciones, se tomaron fotografías inmediatamente después de liberar a los ratones del inmovilizador o del túnel (se muestran imágenes representativas en Figura 2). Dos observadores con experiencia en la evaluación del comportamiento de los ratones evaluaron tres parámetros de expresión facial (mostrados en esquemas en Figura 2C): estrechamiento orbital (cierre del párpado y estrechamiento del área orbital; puede observarse una arruga alrededor del ojo), abultamiento nasal (abultamiento en el puente de la nariz y pueden aparecer arrugas verticales en los lados de la nariz) y posición de las orejas (las orejas giran hacia fuera y/o hacia atrás alejándose del rostro y pueden plegarse formando una forma «puntiaguda»; el espacio entre las orejas aumenta). La posición de los bigotes y el abultamiento de las mejillas no se evaluaron porque el color oscuro del pelaje de los ratones dificultaba una evaluación confiable. Cada parámetro se puntuó utilizando una escala de tres puntos que va de 0 a 2 (0 = ausente, 1 = moderadamente presente, 2 = claramente presente), y los tres parámetros faciales se promediaron para obtener una puntuación media MGS por animal. Para garantizar la fiabilidad, cada animal fue puntuado independientemente y de forma ciega por ambos observadores, y las dos puntuaciones MGS se promediaron posteriormente para generar una puntuación MGS final para cada animal. Tanto los ratones hembra como macho mostraron una reducción significativa en la puntuación MGS cuando el muestreo de sangre se realizó en el túnel de aplicación en comparación con el inmovilizador convencional (Figura 2A–B).

A un grupo separado de ratones se les administró una inyección intravenosa de 100 µL de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9 %, y se registraron las vocalizaciones audibles, así como los intentos de girar dentro del dispositivo de inmovilización. Los ratones emiten chillidos audibles como señal de angustia severa, especialmente cuando experimentan dolor o miedo y durante comportamientos defensivos11,12,13. Además, los ratones reaccionan naturalmente a la inmovilización física con pánico, lo que provoca una respuesta de huida para escapar del espacio confinado. Por lo tanto, los intentos de girar 180 grados dentro del dispositivo de inmovilización se consideraron signos de miedo. Tanto en ratones hembra como macho, se observó una mayor frecuencia de vocalizaciones audibles y de intentos de girar cuando las inyecciones intravenosas se realizaron dentro de un inmovilizador en comparación con el túnel de aplicación (Figura 3).

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Figura 1: Túnel de aplicación novedoso. (A) Imágenes representativas que ilustran la diferencia de tamaño entre un sujetador convencional y el túnel de aplicación novedoso. (B) El revestimiento interno del túnel consiste en un trozo cortado a medida de Vetbed enrollado, que proporciona un entorno suave, de soporte y oscuro. Si los ratones son demasiado pequeños y tienden a darse la vuelta, el revestimiento enrollado puede ajustarse para reducir el espacio disponible. (C) Diferentes pasos del manejo dentro del túnel de aplicación, incluyendo la entrada y salida, la fijación segura y cómoda, y el acceso al abdomen y a la cola. (D) Una cuña adicional para realizar inyecciones intraperitoneales dentro del túnel. La cuña aumenta el ángulo del túnel con respecto al manipulador, facilitando un acceso más fácil a la región abdominal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Escala de gesto facial en ratones tras la toma de sangre de la vena de la cola. Ratones machos o hembras fueron sometidos a la toma de sangre ya sea dentro de un túnel de aplicación o de un sujetador convencional. Se tomaron imágenes para evaluar la escala de gesto facial inmediatamente después de que los animales salieran del sujetador o del túnel, y posteriormente dos experimentadores con experiencia puntuaron de forma independiente las imágenes, a ciegas respecto a la asignación de grupo de los ratones, evaluando el estrechamiento orbital, el abultamiento del hocico y la posición de las orejas. Para cada animal se calculó una puntuación promedio basada en las dos evaluaciones. (A) Ratones hembras (túnel n = 5; sujetador n = 8). (B) Ratones machos (túnel n = 11; sujetador n = 11). Este gráfico fue adaptado de Schlutt et al., 2026, PLOS ONE. Los datos originales, publicados como un gráfico de barras bajo una licencia CC BY 4.0, han sido modificados y representados nuevamente aquí como un diagrama de caja y bigotes. (C) Ilustración esquemática de las unidades de acción facial generadas a partir de una indicación textual desarrollada por los autores mediante ChatGPT Image 2 (OpenAI; disponible en https://chatgpt.com/); la imagen final fue revisada y aprobada por los autores por su precisión científica. Los datos se presentan como diagramas de caja y bigotes (mínimo a máximo); la línea indica la media. Prueba de Mann-Whitney, valores de p < 0,05 se consideraron significativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Vocalizaciones audibles e intentos de girar tras la inyección intravenosa. Ratones machos o hembras fueron sometidos a inyección intravenosa de 100 µL de NaCl al 0,9 % ya sea dentro del túnel de aplicación o en un sujetador convencional. Se registraron durante el procedimiento los episodios de vocalización audible y los intentos de girar dentro del dispositivo de sujeción (sí/no). Todos los grupos n = 10. Los datos se presentan como gráficos de barras apiladas de contingencia. Se consideraron significativos los valores de p según la prueba exacta de Fisher < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Inyección intraperitoneal en ratas utilizando una versión más grande del túnel de aplicación. Se utilizó un túnel de aplicación con un diámetro de 15 cm para la inyección intraperitoneal en ratas. El procedimiento se realizó según el mismo protocolo descrito para ratones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Esta técnica de inmovilización fue desarrollada para la administración de sustancias y la toma de muestras de sangre, con el fin de apoyar un enfoque de buenas prácticas en el bienestar animal. Algunas comunidades científicas aún muestran reticencia a adoptar métodos refinados de manipulación e inmovilización que difieren de los procedimientos estandarizados de larga data, especialmente cuando podrían requerir tiempo y esfuerzo adicionales. Sin embargo, reducir el estrés en los animales de laboratorio no solo es deseable desde una perspectiva de bienestar animal, sino que también contribuye significativamente al éxito experimental al disminuir la variabilidad de los datos, minimizar las alteraciones fisiológicas inducidas por el estrés y reducir los intentos fallidos y la pérdida de animales. Este protocolo presenta un método de fácil implementación que mejora notablemente el bienestar animal, al tiempo que proporciona una inmovilización segura y acceso con las manos libres para procedimientos seguros de aplicación y muestreo.

Un paso crítico del protocolo consiste en garantizar la entrada exitosa y la posición estable dentro del túnel de aplicación. Para la entrada voluntaria, se recomiendan dos enfoques posibles: bien la entrada directa desde el tubo de transferencia hacia el túnel, o bien colocar primero a los ratones desde el tubo de transferencia sobre el forro blando previamente colocado, desde donde puedan ingresar al túnel. El enfoque óptimo depende del comportamiento de los animales, por lo que ambos métodos deben evaluarse. La variante preferida es aquella en la que los ratones entran más rápidamente y con la menor reticencia. Si los ratones dudan en entrar al túnel, deben considerarse varios factores: (1) la abertura de entrada podría ser demasiado estrecha, en cuyo caso el forro puede comprimirse ligeramente para agrandar la abertura; (2) las señales olfativas del forro interno podrían influir en la aceptación, por lo tanto, los forros deben conservar preferiblemente el olor familiar de la jaula, asegurando al mismo tiempo la separación entre grupos experimentales, jaulas y sexos, y reemplazando el material sucio para evitar olores confusos; (3) se ha demostrado que los ratones se sienten más seguros sobre superficies con colores similares al de su pelaje14, por lo que podría ser beneficioso igualar el color del forro al del pelaje de los animales; y (4) colocar la abertura del túnel hacia la pared de la jaula podría facilitar la entrada, ya que los ratones aún pueden ver su jaula y compañeros. Una limitación potencial del túnel de aplicación es que depende de la entrada voluntaria del animal, lo que podría interpretarse como un breve retraso antes del tratamiento o muestreo. Sin embargo, en este estudio, los ratones ingresaron al túnel rápida y consistentemente, generalmente dentro de los 2–10 s, permitiendo realizar los procedimientos dentro de una ventana de tiempo estrecha y reproducible. Aunque este enfoque podría requerir un tiempo ligeramente mayor que la restricción convencional por la nuca, el modesto aumento en el tiempo de manipulación debe sopesarse frente a la mejora sustancial en el bienestar animal lograda al reducir el estrés asociado con la manipulación. Además, la inserción en restrictores convencionales también conlleva tiempo de manipulación, ya que los ratones frecuentemente resisten su colocación, lo que resulta en ninguna diferencia relevante. En menos del 5 % de los casos, los ratones no entraron voluntariamente al túnel. Aunque las medidas descritas anteriormente fueron generalmente suficientes para fomentar la entrada, también podría ayudarse suavemente a los animales a ingresar al túnel si fuera necesario. Incluso en estos casos, el forro interno blando ofrece una ventaja en bienestar frente a los restrictores convencionales.

Una vez dentro del túnel, los ratones pueden agarrarse firmemente al revestimiento interno. Esto es muy favorable desde una perspectiva de bienestar animal, ya que se ha demostrado que los ratones restringidos presentan niveles más bajos de estrés cuando pueden agarrarse a una superficie durante su manipulación4. Al mismo tiempo, el manipulador puede sostener firmemente la base de la cola sin que el ratón intente darse la vuelta. Es esencial que el revestimiento interno rodee ajustadamente al animal. Si los ratones son demasiado pequeños y tienden a girar dentro del túnel, se pueden realizar ajustes rápidos apretando más el revestimiento enrollado o añadiendo una capa adicional. Para experimentos que involucran animales de diferentes tamaños (por ejemplo, debido a diferencias de edad, sexo o dieta), también se pueden utilizar túneles con diámetros variables (véanse las plantillas de impresión8).

Las inyecciones y la toma de muestras de sangre siempre deben realizarse por personal capacitado. No obstante, el túnel de aplicación resultó efectivo tanto para personal altamente experimentado como para usuarios menos experimentados. En particular, el personal inexperto informó menos intentos fallidos, reduciendo así el manejo repetido y los procedimientos prolongados. Los usuarios también indicaron sentirse más cómodos y seguros al restringir a los ratones dentro del túnel, en comparación con aprender las técnicas convencionales de fijación manual. Esto representa una ventaja considerable para laboratorios con una alta rotación de personal, ya que el método es fácil de adoptar y beneficia tanto a los animales como al experimentador. Estas observaciones están en línea con las mejoras previamente reportadas en la comodidad del manejo y la confianza del técnico asociadas con técnicas de manejo refinadas, como el manejo con túnel o con la mano en forma de copa15.

Es importante destacar que el método descrito aquí es efectivo incluso en ratones no entrenados, y todos los resultados presentados se obtuvieron utilizando animales sin habituación previa. Estudios anteriores han demostrado que la habituación y el entrenamiento médico de los animales pueden reducir las respuestas al estrés en ratones al familiarizarlos con los procedimientos previstos16,17. Por lo tanto, un protocolo de entrenamiento que incluya el uso del túnel podría reducir aún más los niveles de estrés, especialmente cuando son necesarias intervenciones frecuentes, lo cual podría generar, de otro modo, asociaciones negativas con el túnel. Dicho programa de entrenamiento se aplicó con éxito en un estudio previo, lo que nos permitió utilizar el túnel para inyecciones intraperitoneales repetidas durante varias semanas8. En particular, en estudios que requieren inyecciones repetidas, el túnel puede representar una mejora significativa. Se ha demostrado que técnicas de manipulación refinadas, que utilizan tubos de transferencia y menor restricción, mantienen efectos positivos incluso después de episodios repetidos de restricción por la nuca o inyecciones intraperitoneales, incluyendo un mayor deseo de interactuar con los manipuladores y una reducción del comportamiento similar a la ansiedad en pruebas conductuales estándar18,19. De manera similar, las inyecciones repetidas realizadas dentro del túnel no aumentaron los parámetros relacionados con el estrés en ratones8.

En efecto, se ha demostrado que las recompensas alimenticias facilitan la habituación mediante refuerzo positivo, un principio bien establecido en el entrenamiento animal. Por lo tanto, se recomienda ofrecer una pequeña golosina al final de cada sesión de manipulación como recompensa. Al probar el túnel, cantidades muy pequeñas, como un solo grano de avena, fueron suficientes y es poco probable que interfieran con la dieta normal de los animales. Si el consumo de alimento es una preocupación, por ejemplo, en estudios metabólicos, también existen golosinas con sabor compatibles con dietas especializadas (por ejemplo, dietas cetogénicas). Es importante tener en cuenta que las golosinas deben considerarse una medida adicional de refinamiento que mejore la habituación, y no un requisito previo para el uso exitoso del túnel de administración. Una vez familiarizados con el sistema, los ratones también entraron voluntariamente en el túnel de administración repetidamente sin recibir recompensa alimenticia.

El método descrito aquí presenta ciertas limitaciones respecto al acceso a regiones corporales específicas. Aunque la cola puede accederse fácilmente y de forma segura para inyecciones intravenosas y toma de muestras de sangre, y la región abdominal caudal es adecuada para inyecciones intraperitoneales, el acceso a las regiones laterales del cuerpo para aplicaciones subcutáneas es limitado. La administración oral también debe considerarse cuidadosamente. La gavaje oral convencional no es compatible con este sistema, ya que no puede lograrse la extensión necesaria del cuello. Sin embargo, métodos más refinados de administración oral, en los que los ratones consumen voluntariamente sustancias de la punta de una pipeta (por ejemplo, mezcladas con leche condensada)20, podrían ser factibles a través del lado abierto del túnel. En tales casos, debe asegurarse que la cabeza permanezca claramente visible y que el ratón no esté posicionado demasiado hacia el interior del forro o túnel, para confirmar la ingestión completa de la sustancia.

En comparación con los túneles de contención existentes, el túnel de aplicación descrito aquí ofrece ventajas claras para el bienestar animal. Aunque la contención es a menudo necesaria para procedimientos seguros de aplicación y muestreo, también se reconoce como uno de los mayores factores de estrés que experimentan los roedores durante los procedimientos experimentales7,21,22. Estudios previos ya han demostrado que sustituir el manejo tradicional por la cola y la contención por métodos refinados, como el manejo con túnel o con las manos en forma de copa, mejora significativamente el bienestar animal. Los ratones manejados con estos métodos refinados muestran menor ansiedad y mayor disposición a interactuar con los manipuladores que aquellos levantados por la cola23,24. El uso del túnel de aplicación, que los ratones entran voluntariamente, constituye una extensión coherente del manejo con túnel. La escala de gestos faciales de los ratones al salir del túnel de aplicación indica que los animales no sienten que están restringidos ni atrapados. Aunque el método de inyección intraperitoneal en el que los ratones se aferran a la rejilla de la jaula se asemeja al agarre descrito que eleva la zona pélvica5, el primero se basa en la lucha del animal por escapar. Sobre una rejilla, los ratones se aferran con sus patas y tiran hacia adelante, alejándose del agarre del manipulador, lo que provoca contención y, por tanto, malestar. Además, este tipo de contención aumenta el tono muscular abdominal, lo que posteriormente favorece la percepción de dolor por la punción con la aguja. En contraste, el túnel de aplicación representa un método de contención refinado, y los resultados indican una reducción de parámetros asociados al estrés, incluyendo puntuaciones más bajas en la escala de gestos faciales, menos vocalizaciones audibles y mantenimiento de la disposición a interactuar con los manipuladores811,12,13. Aunque las vocalizaciones ultrasónicas (USVs) son cada vez más reconocidas como señales de comunicación etológicamente relevantes, su uso como indicadores de estrés en ratones adultos sigue en estudio, ya que las USVs son altamente dependientes del contexto y también ocurren durante comportamientos fisiológicos normales25.

Sin embargo, evidencias recientes sugieren que la grabación de USV podría representar un enfoque prometedor, no invasivo y reproducible para evaluar las respuestas conductuales al confinamiento26. Por lo tanto, incorporar grabaciones de USV en estudios futuros podría proporcionar una medida objetiva adicional para caracterizar mejor las respuestas al estrés y emocionales. En conjunto, estos hallazgos indican que el túnel de aplicación permite un procedimiento de contención más seguro y menos estresante para aplicaciones y muestreos rutinarios en comparación con los dispositivos de restricción convencionales. Es importante destacar que, a diferencia de los restrainers acrílicos transparentes, el revestimiento interno suave permite a los ratones aferrarse firmemente a la superficie, lo cual se considera una mejora importante en el bienestar según las recomendaciones de NC3Rs27. Se observaron notablemente menos intentos de girar dentro del túnel, mejorando tanto el bienestar como la seguridad durante el manejo. En los restrainers plásticos convencionales, los intentos de girar suelen asociarse con la micción, y el pelaje mojado resultante compromete aún más el confort. Este problema se eliminó en gran medida con el uso del túnel de aplicación.

Las aplicaciones potenciales de este método son extensas. Cabe destacar que el método de inmovilización mejorado no se limita a los ratones, sino que también puede aplicarse a ratas al utilizar un túnel con un diámetro mayor (Supplementary Figure 1). Los roedores son las especies de animales de laboratorio más utilizadas en todas las disciplinas científicas, y la inmovilización para la administración de sustancias y la toma de muestras es un procedimiento rutinario en muchos laboratorios. Sin embargo, se ha demostrado que el estrés por inmovilización no solo afecta negativamente el bienestar animal, sino que también influye significativamente en los resultados científicos, incluyendo respuestas conductuales28,29 y mecanismos fisiológicos como la función inmunitaria30. Por lo tanto, minimizar la variabilidad relacionada con el estrés es esencial tanto para la validez científica como para las consideraciones éticas en los experimentos con animales. Al reducir el estrés asociado con la inmovilización manteniendo un manejo seguro y práctico, el túnel de aplicación puede mejorar sustancialmente la calidad y la reproducibilidad experimental, al mismo tiempo que potencia el bienestar animal.

Divulgaciones

A.S., J.K.U. y L.H. son titulares de un modelo de utilidad para el túnel de inyección en Alemania (número de registro 20 2024 100 448). Todos los demás autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos al personal de la instalación de animales y a los responsables de bienestar animal del Charité, especialmente al Dr. André Dülsner, por su apoyo; a Charité 3R por el apoyo financiero para la difusión del túnel de aplicación; y a todos los miembros del Grupo de Trabajo de Refinamiento de Charité 3R por las discusiones útiles.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Lancetas de alergia, estérilesHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Hamburgo, Alemania1110106
Túnel de aplicación con cuña opcionalTúnel impreso en 3D en el laboratoriolas plantillas de impresión están disponibles en https://osf.io/vsjnb.
Tubos para recolección de sangre: Microvette 100 EDTA K3E, 100 µL SARSTEDT AG & Co. KG, Nümbrecht, Alemania20.1278.100
Tubo transparente para manipulaciónDatesand Group, Stockport, Reino UnidoGZCHTUBE-100tamaño: 50 x 3 x 100 mm
Etileno, ≥70%Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AlemaniaT913.1
Jeringa de dosificación fina de un solo uso Inject-F de 1 mL B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Alemania9166017V
AvenaSchapfen Mühle GmbH Co.KG, Ulm, AlemaniaW100197autoclavada
Lámpara infrarroja Sanitas SIL 06Beurer Europe GmbH, Ulm, Alemania61424
Forro interior suave: Vetbed Isobed SL originalVetbed Deutschland, Mudersbach, Alemania1999981cortado al tamaño requerido
Espray desinfectante Softasept ISO 70%B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Alemania19905
Agujas hipodérmicas estériles de un solo uso Sterican 27 G x ¾B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Alemania4657705Btamaño: 0,40 mm x 20 mm
Hisopos: aplicadores médicos FIWA appFink & Walter GmbH, Merchweiler, Alemania329012

Referencias

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