Artículo de método

Un método basado en impedancia en tiempo real y sin marcadores para el cribado antiviral de alto rendimiento

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DOI:

10.3791/72539

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3 de septiembre de 2026

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1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

En este artículo

Resumen

El enfoque de análisis celular en tiempo real (RTCA) basado en impedancia permite la cuantificación en tiempo real y sin marcado de los efectos citopáticos inducidos por virus, proporcionando un método rápido para evaluar compuestos antivirales y anticuerpos monoclonales mediante un flujo de trabajo de ensayo integrado y dirigido por software.

Resumen

Las tecnologías basadas en impedancia proporcionan un medio robusto y objetivo para cuantificar los efectos citopáticos (CPE) en monocapas de cultivo celular, superando las limitaciones de los ensayos tradicionales de punto final o subjetivos desde el punto de vista visual. Los virus citolíticos suelen inducir cambios morfológicos pronunciados y muerte celular en cultivos infectados, lo que convierte a las mediciones de impedancia, que reflejan cambios en la adhesión, morfología y viabilidad celular, en un indicador sensible y dinámico de la infección viral y su progresión. Como resultado, las lecturas basadas en impedancia ofrecen un enfoque potente y eficiente para evaluar los efectos protectores de las intervenciones antivirales. Este estudio presenta una plataforma de cribado en tiempo real y sin marcado que aprovecha sistemas avanzados de medición de impedancia para monitorear continuamente los CPE inducidos por virus. Este enfoque permite una evaluación rápida y cuantitativa de la eficacia antiviral tanto de fármacos de molécula pequeña como de anticuerpos monoclonales, sin necesidad de pasos adicionales de marcado o tinción. El protocolo detalla todo el flujo de trabajo del ensayo, desde la siembra celular y la infección viral hasta la adquisición y el análisis de datos. Además, el software integrado en el sistema, diseñado específicamente para aplicaciones en virología, simplifica el procesamiento e interpretación de los datos, facilitando la determinación de la potencia neutralizante de anticuerpos monoclonales y la actividad de compuestos antivirales.

Introducción

Cuando se enfrenta la amenaza de un brote viral, las vacunas y los tratamientos antivirales representan las estrategias principales para limitar la transmisión viral y tratar a los pacientes infectados1. Las vacunas previenen la infección al preparar al sistema inmunológico para reconocer patógenos y proporcionan protección proactiva y a largo plazo. Los tratamientos antivirales tienen diversos usos dependiendo de la modalidad y diseño del fármaco. De manera similar a las vacunas, los anticuerpos monoclonales pueden ofrecer protección proactiva y sostenida (desde semanas hasta muchos meses) y también pueden utilizarse como herramienta para el control tras la exposición. Tanto los anticuerpos monoclonales como los tratamientos antivirales de molécula pequeña se emplean para tratar infecciones establecidas mediante el ataque directo o la inhibición de componentes virales, reduciendo así la gravedad de la enfermedad y actuando como una intervención reactiva y a corto plazo.

El enfoque convencional para evaluar funcionalmente la actividad antiviral en sistemas biológicos es la prueba de neutralización por reducción de virus (VRNT), que cuantifica la reducción en la formación de placas en pruebas de neutralización por reducción de placas (PRNT), focos mediante inmunotinción en la prueba de neutralización por reducción de focos (FRNT, por sus siglas en inglés), o efectos citopáticos (CPE) mediante ensayos basados en la viabilidad celular. La PRNT se considera el método fenotípico de referencia para determinar la actividad inhibitoria de agentes antivirales frente a una amplia gama de infecciones virales.2Sin embargo, el PRNT es un procedimiento que lleva mucho tiempo y es intensivo en mano de obra, y la interpretación de los resultados puede ser subjetiva, especialmente cuando ocurre sobrecrecimiento o fusión de placas durante una incubación prolongada. La objetividad de la lectura de los ensayos puede mejorarse mediante el FRNT, que se basa en la detección de antígenos específicos del virus o en la expresión de un gen reportero. No obstante, este enfoque puede verse limitado por la disponibilidad y el rendimiento de anticuerpos de alta calidad o enzimas de detección. Existen varios reactivos y protocolos de ensayo bien establecidos y ampliamente utilizados para la evaluación de viabilidad celular, que miden ciertos aspectos del efecto citopático (CPE). La reducción enzimática de la sal mono-tetrazolio MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio) por las deshidrogenasas mitocondriales en células vivas produce una señal colorimétrica cuantificable debida al producto coloreado formazán. El reactivo para ensayos de viabilidad celular (que lisa las células y libera el ATP intracelular que impulsa una reacción catalizada por luciferasa, convirtiendo el sustrato luciferina en oxiluciferina) es un ensayo luminiscente homogéneo. Estos ensayos de viabilidad celular pueden emplearse para cuantificar la disminución del CPE durante el cribado de agentes antivirales.3Sin embargo, estos métodos también requieren múltiples pasos de lavado y tinción y, al igual que los ensayos PRNT y FRNT, son ensayos de punto final. Como resultado, pueden pasarse por alto agentes antivirales parcialmente eficaces que ejercen efectos retardados sobre la infección viral si el ensayo antiviral se termina en un momento subóptimo. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un ensayo automatizado, de throughput medio a alto, que permita la monitorización en tiempo real de las respuestas celulares a infecciones virales.

Los sistemas de análisis celular en tiempo real (RTCA) permiten la monitorización continua del desarrollo de los efectos citopáticos (CPE) y de las respuestas antivirales en modelos celulares permisivos, mediante una lectura basada en impedancia, sin etiquetas y no invasiva. Los CPE inducidos por virus incluyen no solo la muerte celular, sino también alteraciones en la morfología y la adhesión celular, todos los cuales pueden detectarse con sensibilidad mediante cambios en la impedancia eléctrica4,5. Estas mediciones de impedancia se obtienen utilizando sensores de microelectrodos de oro integrados en una placa especializada de cultivo celular de 96 pocillos, lo que permite la evaluación cuantitativa de las respuestas celulares dinámicas sin necesidad de etiquetas ni expresión de genes reporteros. La tecnología RTCA ha sido ampliamente utilizada para la detección de CPE en diversos modelos celulares infectados con virus de múltiples familias, así como para la evaluación de la actividad neutralizante de anticuerpos6–10.

Aquí, los pasos críticos de este método basado en impedancia en tiempo real y sin marcadores in vitro los ensayos antivirales fueron definidos. Este enfoque se basó en estudios previos que incluyeron la selección de compuestos antivirales en células HEK293A infectadas con adenovirus 5 y la evaluación de anticuerpos neutralizantes mediante un virus de la estomatitis vesicular recombinante con capacidad de replicación que expresa la glucoproteína de Lassa (rVSV-LASV(Lin IV)) en células Vero CCL-8111. Todos estos experimentos se realizaron en un sistema RTCA MP, que permite ejecutar hasta 6× placas de 96 pocillos simultáneamente. El objetivo de este trabajo fue establecer una base para la selección antiviral basada en impedancia. El método puede ampliarse fácilmente a una amplia gama de modelos virus-célula una vez que se hayan definido las condiciones óptimas del ensayo utilizando el protocolo descrito aquí.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo y pase de células permisivas

NOTA: En este protocolo, se utilizan células Vero CCL-81 para la neutralización de anticuerpos, mientras que se utilizan células HEK293A para la selección de compuestos antivirales. Para reducir la variación entre experimentos, se recomienda encarecidamente elaborar un banco de células permisivas en el mismo pase para el ensayo.

  1. Precaliente el medio de crecimiento celular —Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina— en un baño de agua a 37°C antes de usarlo.
  2. Descongele un vial de células permisivas criopreservadas en un baño de agua a 37°C hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo; no sumerja la tapa en el baño de agua. 
  3. Coloque el vial que contiene las células revividas en la cabina de seguridad biológica (CSB) después de limpiar el exterior con etanol al 70%.
  4. Transfiera suavemente las células a un tubo cónico nuevo de 50 mL y agregue gota a gota 9 mL de medio de crecimiento tibio a las células. Mezcle suavemente.
  5. Centrifugue la suspensión celular a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente (TA).
  6. Transfiera las células resuspendidas en 5 mL de medio de crecimiento precalentado a un matraz T-25 nuevo.
  7. Cultive las células hasta alcanzar una confluencia del 80%–90% en un incubador a 37°C con 5% de CO2 antes del siguiente subcultivo celular. 
  8. Pase las células.
    1. Aspire el medio y lave suavemente la monocapa celular dos veces con 3 mL de solución salina tamponada con fosfatos (PBS) libre de calcio y magnesio 1× para eliminar el medio de crecimiento residual.
    2. Agregue 2 mL de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz para cubrir las células.
    3. Después de 2–5 min de incubación a 37°C, neutralice la tripsina agregando un volumen 5 veces mayor de medio de crecimiento precalentado.
    4. Resuspenda las células pipeteando suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo contra la pared del matraz.
    5. Siembre las células a la densidad de siembra deseada o a la proporción de división indicada con medio fresco. 
      NOTA: La densidad de siembra celular deseada se determina empíricamente según la velocidad de crecimiento celular, la frecuencia de pase y la confluencia objetivo en el momento del pase. Por ejemplo, sembrar células Vero CCL-81 con una densidad mínima de 0,4 × 104 células/cm2 permite pasear las células cada 3 días antes de que alcancen el 90% de confluencia.

2. Búsqueda de agentes antivirales

NOTA: Figura 1 ilustra el flujo de trabajo del ensayo de cribado antiviral basado en la impedancia. En resumen, las células permisivas se siembran en microplacas de 96 pocillos integradas con microelectrodos, y el desempeño celular se monitorea durante aproximadamente 24 h antes del ensayo. Para las pruebas de neutralización con anticuerpos, los virus a una multiplicidad de infección (MOI) fija se mezclan con los anticuerpos y se preincuban durante 1 h antes de añadirlos a las células. En contraste, para el cribado de compuestos antivirales, los virus a un MOI fijo y los compuestos se añaden simultáneamente a las células. El efecto citopático (CPE) inducido por el virus se monitorea continuamente mediante lecturas basadas en la impedancia, y el análisis de datos puede realizarse durante el ensayo o después de su finalización.

  1. Día 0: Medir el fondo de la placa y sembrar células permisivas
    1. Para comenzar un experimento, abra el software del instrumento (RTCA Pro) y seleccione la cuna deseada para el ensayo. A continuación, elija el Virología módulo antes de iniciar el experimento.
    2. Introduzca cualquier nota relevante en el Notas de la experiencia pestaña (por ejemplo, Nombre del experimento, Número de serie del dispositivo, Tipo de dispositivo, u otros detalles pertinentes). Estos campos son opcionales y pueden dejarse en blanco si no son aplicables.
    3. Diríjase a la Distribución y defina los pocillos utilizados en el experimento. Si ciertos pocillos no se van a utilizar, seleccione los pocillos no utilizados, haga clic derecho dentro de la interfaz de diseño de la placa y seleccione Desactivar pocillo(s) del menú desplegable para excluirlos del ensayo.
    4. Medición del fondo de la microplaca de 96 pocillos con microelectrodos integrados
      1. Dispensar 50 µL de medio de ensayo a cada pocillo de la placa utilizando una pipeta multicanal en modo de pipeteo inverso para minimizar la formación de burbujas.
        NOTA: La selección del medio de ensayo debe optimizarse antes del cribado para minimizar interferencias con la sensibilidad del ensayo y garantizar una evaluación precisa de la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, los ensayos de neutralización de anticuerpos se realizaron en DMEM que contenía 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina, mientras que los ensayos de cribado de compuestos antivirales utilizaron el medio de crecimiento celular, DMEM que contenía 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.
      2. Coloque la placa en la base del instrumento ubicada dentro de un 37 °C incubadora con 5% CO₂2. Asegúrese de que la placa esté orientada correctamente, con el pocillo A1 colocado tal como se indica. A continuación, revise la pestaña Mensaje para ver si hay notificaciones de error.
        NOTA: Cada vez que se coloque la placa en el soporte, verifique que aparezca el mensaje «Placa escaneada. Conexiones correctas». Si ocurre un error, retire la placa y colóquela nuevamente en el soporte.
      3. Diríjase a la Programación pestaña; Paso 1 aparece por defecto, ya que es un paso obligatorio para la medición del fondo de la placa. Haga clic en el Iniciar botón para iniciar la grabación desde los pocillos. El paso concluye automáticamente después de que se ha registrado una única medición de impedancia de fondo.
        NOTA: Este paso de acondicionamiento debe realizarse antes de cada experimento. Todos los pocillos utilizados en el experimento deben contener únicamente medio de ensayo (es decir, antes de la siembra celular).
    5. Siembra permisiva de células en la placa de 96 pocillos integrada con microelectrodos
      1. Haga tripsinizar las células permisivas en el matraz T25 siguiendo los pasos descritos en la sección de pase de células permisivas.
      2. Cuenten las células resuspendidas en el medio de ensayo y realicen los siguientes cálculos:
        1. Calcule el número total de células viables en la suspensión utilizando la densidad de células viables: Número total de células viables = densidad de células viables × volumen de suspensión
        2. Ajuste la suspensión celular a una densidad final (por ejemplo, 0,30–0,35 × 106 células/mL para Vero CCL-81, equivalente a aproximadamente 15 000–18 000 células por 50 µL, o 0.12 × 106 células/mL para HEK293A, equivalente a 6.000 células por 50 µL).
          NOTA: Estas densidades de siembra se determinaron previamente como óptimas para cada modelo de virus-célula. La densidad adecuada de siembra celular es esencial, ya que el uso de demasiadas o muy pocas células podría afectar la sensibilidad del ensayo.
      3. Retire la microplaca que contiene 50 µL del medio de ensayo desde el instrumento y transfiéralo a la cabina de seguridad biológica (CSB) para la siembra celular.
      4. Dispensar 50 µL de la suspensión celular a cada pocillo de la placa utilizando una pipeta multicanal en modo de pipeteo inverso para minimizar la formación de burbujas, llevando el volumen final de cada pocillo a 100 µL.
    6. Después de añadir las células, dejar la placa en la cabina de seguridad biológica a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir una distribución uniforme de las células en el fondo de cada pocillo.
    7. Devuelva la placa al soporte del instrumento ubicado en el interior de un 37 °C incubadora con 5% de CO₂2.
      NOTA: Si se utilizan múltiples placas, etiquete cada placa claramente y asegúrese de que se devuelva al mismo soporte utilizado durante la medición de fondo.
    8. Diríjase a la Disposición pestaña y abra el Célula subpestaña. Seleccione los pozos adecuados, ingrese la célula permisiva Nombre y Númeroy haga clic en Aplicar para guardar la información. La información de las células también puede introducirse o actualizarse en cualquier momento durante el experimento.
    9. Agregue el Paso 2 en el Programar pestaña utilizando la configuración predeterminada de grabación (100 barridos y un intervalo de 15 minutos), luego haga clic en Iniciar para iniciar la monitorización continua durante la noche del acoplamiento y proliferación celulares.
      NOTA: Este paso sirve como una medida de control de calidad (CQ) celular antes de la inoculación del virus. Dado que el Índice Celular (IC) refleja la adhesión y proliferación celular, los valores de IC obtenidos durante el período de 18–24 h posteriores a la siembra se utilizan como métrica clave de CQ. Un comportamiento celular reproducible entre experimentos es esencial para lograr una reproducibilidad óptima del ensayo. Cabe destacar que tanto la amplitud como los perfiles cinéticos del IC son específicos del tipo celular. Por ejemplo, tras un cultivo nocturno, las células Vero CCL-81 sanas sembradas a 18 000 células/pocillo suelen presentar un Índice Celular de 6–8, mientras que las células HEK293A sanas sembradas a 6 000 células/pocillo generalmente presentan un Índice Celular de 0,8–1,2.
  2. Día 1: Tamizaje de agentes antivirales basado en impedancia
    NOTA: Antes de realizar el ensayo de cribado, el virus debe ser titulado adecuadamente para determinar la dilución de trabajo óptima. Este paso establece una concentración de virus que permite un desempeño robusto y reproducible del ensayo, cumpliendo al mismo tiempo con los requisitos definidos por el usuario, como la duración deseada del ensayo. Por ejemplo, en el protocolo de neutralización por anticuerpos11, se eligió una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 para el ensayo de neutralización, ya que produjo un efecto citopático completo (100 %) dentro de las 40 h posteriores a la inoculación. En el ensayo basado en impedancia, el efecto citopático completo se indica mediante la reducción del Índice de Células o Índice de Células Normalizado a cero. Durante el cribado de compuestos antivirales, se utilizó una MOI de 1, y se observó un 100 % de efecto citopático dentro de las 70 h posteriores a la inoculación. El protocolo de titulación viral siguió los procedimientos establecidos descritos en un informe previo12. Si se utilizan virus infecciosos en el ensayo, asegúrese de seguir todas las precauciones de seguridad aplicables. Consulte la sección de orientación sobre seguridad para el manejo de virus infecciosos.
    1. Prepare el virus a la concentración predeterminada y realice diluciones seriadas del anticuerpo o compuesto antiviral en medio de ensayo.
    2. Para los ensayos de neutralización con anticuerpos monoclonales, mezcle 60 µL de virus a 4× la concentración final en el ensayo con 60 µL de anticuerpo a 4× la concentración final en el ensayo e incubar a 37 °C durante 1 h antes de añadirse a las células permisivas. Tras la mezcla, el virus y el anticuerpo están presentes a 2× sus concentraciones finales en el ensayo. En contraste, no se requiere preincubación del virus con el compuesto para los ensayos de cribado de compuestos antivirales.
    3. Diríjase a la Disposición pestaña y seleccione el Tratamiento subpestaña para ingresar la información de tratamiento sobre agentes antivirales en los pocillos adecuados.
    4. Seleccione los pozos para el mismo tratamiento, luego ingrese el Nombre de los agentes e ingrese el inicio Dilución o Concentración. Por ejemplo, si la concentración inicial es 10 µg/mL, introduzca 10 y seleccione µg/mL como el “Unidad”. Ingresar 3 como el Factor de dilución y especifique el Dirección de dilución (por ejemplo, de Arriba a Abajo).
      NOTA: Después de hacer clic en Aplicar, las concentraciones o diluciones de los agentes antivirales se calcularán y guardarán automáticamente según la configuración de la placa ingresada y se mostrarán en los pozos correspondientes. Los valores calculados también se guardan para su posterior análisis de datos. Ingresar información del virus (por ejemplo, Nombre y Dilución) es opcional, ya que el ensayo utiliza un MOI fijo único para todos los pozos tratados con el virus.
    5. Asignar los pocillos tratados solo con virus como controles positivos seleccionando los pocillos adecuados y eligiendo Control positivo bajo Tipo de pocillo.
    6. Asignar los pocillos no infectados como controles negativos siguiendo el paso descrito anteriormente y verificando Control negativo bajo Tipo de pocillo.
      NOTA: Asignación correcta de los pocillos con virus únicamente y sin infección como Control positivo y Control negativo, respectivamente, utilizando el Tipo de pocillo es fundamental, ya que los valores de CI de estos pocillos se utilizan en todos los cálculos relacionados con la neutralización (por ejemplo, % de Neutralización). Para los cálculos relacionados con el efecto citopático (CPE) (por ejemplo, %CPE), se requieren pocillos de control negativo designados explícitamente. En los ensayos de neutralización de anticuerpos, se recomienda encarecidamente incluir tanto anticuerpos de control positivo como negativo en la misma placa para garantizar una interpretación precisa de los datos. Sin embargo, estos anticuerpos de control deben designarse como Muestras bajo Tipo de pocillo.
    7. Cuando el ensayo esté listo para la adición del agente antiviral, presione el Abortar paso actual botón para omitir los barridos restantes en el Paso 2 y continuar con el siguiente paso.
    8. Haga clic en el Desbloquear placa botón, luego retire la placa del soporte y colóquela en la cabina de seguridad biológica.
    9. Dispensar suavemente 100 µL de la mezcla de virus–anticuerpo o de la mezcla de virus–compuesto antiviral en cada pocillo utilizando una pipeta multicanal, obteniendo un volumen final en el pocillo de 200 µL. El inóculo contiene virus y anticuerpo o compuesto antiviral a 2× sus concentraciones finales en el ensayo, que se diluyen a las concentraciones de trabajo finales al agregarse a las células.
    10. Después de devolver la placa al soporte, diríjase al Programar pestaña y agregue el paso 3. Especifique el número de Barridos y el Intervalol entre barridos. Asegúrese de que la duración total del barrido (número de barridos × intervalo) supera la duración esperada del tratamiento. Haga clic en Iniciar para reanudar la adquisición de datos y continuar el ensayo.
      NOTA: Designar un paso separado (por ejemplo, Paso 3) tras la adición del agente antiviral facilita la identificación fácil del período de monitoreo posterior al tratamiento. Programar siempre cada paso (excepto el Paso 1) para que dure más tiempo que la duración esperada del ensayo. Si se alcanza el tiempo de ejecución programado, el instrumento dejará de adquirir mediciones, lo que resultará en puntos de datos faltantes.
  3. Día 1 y posteriores: Análisis de datos
    1. Para revisar la grabación en tiempo real y/o el análisis de las respuestas celulares durante la adquisición de datos, diríjase a la Análisis de datos seleccione un punto temporal específico o un intervalo de tiempo, y luego seleccione y agregue las pocillos que se incluirán en el análisis para su visualización en el gráfico.
    2. Seleccione los parámetros de la Eje Y menú desplegable. Cuando Índice de Células Normalizado (INE) se selecciona, especifique el Tiempo de normalización, el punto temporal inmediatamente anterior al tratamiento, en la lista desplegable de tiempo. %CPE o %Neutralización también se puede mostrar seleccionando la opción correspondiente en el menú desplegable del eje Y.
      NOTA: El instrumento utiliza un parámetro sin unidades, el Índice de Células (IC), para representar la impedancia. Se recomienda el Índice de Células Normalizado (ICN) para evaluar las diferencias tras el tratamiento, minimizando al mismo tiempo el impacto de la variación inherente entre pozos.
    3. Diríjase al Parámetro sección sobre el Análisis de datos para calcular y generar diferentes tipos de gráficos, como un gráfico de barras y curvas de dosis-respuesta por regresión logística de cuatro parámetros (4PL, pendiente variable) en un punto temporal específico (por ejemplo, en el punto medio o en el punto final del ensayo). Alternativamente, la IC₅₀ derivado del área bajo la curva (AUC) del Índice de Células o del Índice de Células Normalizado tras el tratamiento, proporciona una medida de la respuesta global dosis-respuesta de los agentes antivirales durante todo el período de tratamiento.
    4. Al finalizar la prueba, haga clic en Pausa, luego presione el Desbloquear placa botón. Retire la placa del soporte y electrónicamente Liberación ello mediante el Placa menú.

3. Orientaciones de seguridad para el manejo de virus infecciosos

  1. Use el EPP adecuado mediante el uso de doble guante, protector facial y bata de laboratorio. Esto se recomienda encarecidamente para el manejo de virus.
  2. Manipule los materiales que contengan virus y añádalos a las placas exclusivamente dentro de una cabina de seguridad biológica (BSC) en funcionamiento.
  3. Transporte los viales de virus y cualquier placa que contenga virus hacia y desde la BSC dentro de un portador hermético de bioseguridad.
  4. Antes y después de manipular materiales que contengan virus dentro de la BSC, rocíe completamente todas las superficies internas con un desinfectante y deje actuar durante 5 minutos para asegurar la inactivación viral completa. Limpie las superficies y luego desinfecte con etanol al 70 % para eliminar cualquier residuo de desinfectante.
  5. Una vez finalizado el ensayo de cribado antiviral basado en impedancia, retire todas las placas del instrumento y transpórtelas en un portador hermético de bioseguridad directamente hacia una BSC limpia.
  6. Prepare una solución fresca de lejía al 20 % y añádala a cada pocillo de las placas de ensayo. Deje que la lejía actúe durante 10 minutos antes de aspirar el contenido de todos los pocillos y desechar las placas.
  7. Descontamine todas las placas de ensayo, pipetas serológicas, puntas de pipeta, tubos y otros plásticos desechables que pudieron haber estado en contacto con el virus usando lejía, y deseche estos materiales en bolsas designadas para residuos biopeligrosos.
  8. Rocíe los plásticos no desechables, como las gradillas para tubos y las pipetas, con un desinfectante y límpielos.

Resultados

Lectura de impedancia sin marcado y en tiempo real revela el CPE inducido por virus y la protección antiviral
Como se muestra en la Figura 2A, las células huésped HEK293A se sembraron en una placa de 96 pocillos integrada con microelectrodos a una densidad de 6.000 células por pocillo13. Tras una incubación de 24 h, se añadió el adenovirus tipo 5 a una MOI de 1 en presencia o ausencia de compuestos antivirales. Las respuestas celulares a la infección viral y al tratamiento antiviral se monitorearon continuamente mediante mediciones de impedancia sin marcado y en tiempo real. En ausencia del virus, las células proliferaron continuamente durante el período de monitoreo de 80 h, alcanzando la confluencia, lo que se indica por un aumento constante de la impedancia seguido de una meseta. La infección por adenovirus permitió inicialmente el crecimiento celular durante aproximadamente 20 h, tras lo cual se observó un CPE pronunciado, que provocó una rápida disminución de la señal de impedancia hasta el nivel basal alrededor de las 65 h posteriores a la infección. El tratamiento con estavudina (50 µM) o ribavirina (20 µM) tuvo un impacto mínimo sobre el CPE inducido por el virus, con trazos de impedancia muy similares a los de las células infectadas únicamente con el virus. La ganciclovir (50 µM) mostró una actividad antiviral moderada, evidenciada por una recuperación parcial del Índice Celular Normalizado. En contraste, la cidofovir (50 µM) y la brincidofovir (1 µM) atenuaron marcadamente el CPE, produciendo perfiles de impedancia comparables a los observados en las células de control negativo no infectadas. Cabe destacar que ninguno de los compuestos afectó significativamente el Índice Celular en comparación con los controles tratados con vehículo a las concentraciones ensayadas en estudios preliminares (datos no mostrados).

En un ensayo de neutralización por anticuerpos basado en impedancia, las células Vero CCL-81 se sembraron a una densidad de 18.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos con microelectrodos integrados y se cultivaron durante 24 h antes de la infección. El día del ensayo, los anticuerpos monoclonales se preincubaron con rVSV–LASV a una MOI de 0,01 durante 1 h antes de añadirlos a las células. Se observaron perfiles de neutralización distintos entre los anticuerpos monoclonales (mAb) evaluados. Para mayor claridad, la Figura 2B muestra resultados representativos de anticuerpos que exhiben actividad neutralizante potente, parcial o nula. Los anticuerpos no neutralizantes indujeron un CPE completo, con trazos de impedancia que se superponían a los de los controles con solo virus. Los anticuerpos con actividad neutralizante intermedia redujeron parcialmente la citotoxicidad inducida por el virus, lo que dio lugar a un CPE atenuado pero detectable. En contraste, los anticuerpos completamente neutralizantes inhibieron por completo el CPE, manteniendo señales de impedancia comparables a las de los controles de células no infectadas. En conjunto, estos perfiles de impedancia permitieron diferenciar claramente entre anticuerpos monoclonales no neutralizantes, parcialmente neutralizantes y completamente neutralizantes.

Cuantificación y caracterización de la actividad antiviral
Tras demostrar la capacidad del ensayo RTCA basado en impedancia para identificar «impactos» a partir de una biblioteca de fármacos y mAb, el estudio procedió a caracterizar la eficacia de los compuestos y anticuerpos líderes. Al aumentar progresivamente la concentración del fármaco antiviral brincidofovir de 15,6 nM a 1.000 nM, se observa un incremento escalonado en la señal de impedancia; cuanto mayor es la concentración del fármaco, más se asemeja el comportamiento de las células al del control no infectado (Figura 3A). Además, el tratamiento con brincidofovir solo produjo un ligero aumento en el NCI únicamente a la concentración más alta ensayada (1100 nM). Sin embargo, a concentraciones inferiores a 1100 nM, el NCI disminuyó moderadamente, aunque este efecto no fue dependiente de la dosis. Este resultado indica que la recuperación del Índice Celular se debió exclusivamente a la actividad antiviral del fármaco, y no a un aumento directo en la proliferación o adhesión celular (Figura 3B). Al graficar el área bajo el Índice Celular Normalizado (AUC) en función de la concentración de brincidofovir, se obtiene la curva dosis-respuesta, que presenta un excelente ajuste (R2 de 0,99) y revela una IC50 de 265 nM (Figura 3C). En el ensayo de neutralización por anticuerpos, al final del ensayo (aproximadamente 50 h después del tratamiento), el software del sistema calculó automáticamente los porcentajes de neutralización a cada concentración de mAb, y posteriormente se determinaron los valores de IC50. Como se muestra en Figura 3D, en contraste con el anticuerpo control negativo rANDV-5, los otros tres mAb, r37.2D, r25.1C y r12.1F, demostraron una alta potencia antiviral, con valores de IC₅₀ de 4.315 ng/mL, 83 ng/mL y 232 ng/mL, respectivamente14,15.

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Figura 1: Ilustración esquemática del flujo de trabajo para el ensayo de cribado antiviral basado en impedancia. Día 0, Paso 1: Las células permisivas se sembraron en microplacas y el crecimiento celular se monitoreó en la base del instrumento ubicada dentro de una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante aproximadamente 24 h. Día 1, Paso 2: Se preparó el virus a una MOI fija y se realizaron diluciones seriadas de los agentes antivirales. En los ensayos de neutralización con anticuerpos, el virus se preincubó con los anticuerpos a 37 °C durante 1 h antes de añadir la mezcla a las células. Paso 3: Se añadieron a las células las mezclas de virus y agente antiviral. Día 1 y posteriores, Paso 4: El CPE inducido por el virus se monitoreó continuamente mediante mediciones basadas en impedancia durante varios días. Paso 5: Los datos se analizaron en tiempo real o al finalizar el ensayo. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Monitoreo en tiempo real de la actividad antiviral mediante mediciones del índice celular basadas en impedancia. (A) Evaluación del cribado de fármacos antivirales mediante análisis de impedancia. Todos los compuestos se probaron a 50 µM, excepto la ribavirina (20 µM) y el brincidofovir (1 µM), en presencia del adenovirus tipo 5 a una MOI de 1. Los datos se presentan como media ± DE de tres pocillos replicados. La figura está adaptada de Zhang et al.13. (B) Ensayo de neutralización de anticuerpos monoclonales basado en impedancia. Se muestran perfiles representativos del índice celular para anticuerpos monoclonales que exhiben ausencia de neutralización (CPE completa, rojo), neutralización parcial (CPE parcial, naranja) o neutralización potente (sin CPE detectable, negro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Cuantificación de la actividad antiviral mediante impedancia. (A) Cambios dinámicos del Índice Celular Normalizado en tiempo real tras el tratamiento con concentraciones crecientes de brincidofovir en combinación con infección por adenovirus tipo 5 a una MOI de 1. (B) Cambios dinámicos del Índice Celular Normalizado en tiempo real tras el tratamiento con concentraciones crecientes de brincidofovir solo. (C) El área bajo las trazas de impedancia se representó en función de brincidofovir para obtener una curva dosis-respuesta. (A) y (C) se adaptaron de Zhang et al.13. (D) Curvas representativas de neutralización de rVSV–LASV Línea IV (Josiah) para los anticuerpos monoclonales r37.2D, r25.1C, r12.1F y rANDV-5 incluido como control negativo. Los anticuerpos monoclonales 37.2D, 25.1C, 12.1F y ANDV-5 se produjeron de forma recombinante basándose en estudios previos (véase la sección de Resultados). Los datos mostrados corresponden a curvas representativas de dos experimentos independientes y se reportan como media ± DE de tres pocillos por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Como todos los ensayos basados en células, el ensayo de cribado antiviral RTCA requiere una optimización para cada sistema virus-célula. Dado que este ensayo detecta el efecto citopático inducido por el virus mediante cambios en la impedancia, depende de un modelo celular permisivo que permita la replicación viral y un efecto citopático medible. Los virus que no generan un efecto citopático detectable por impedancia podrían no ser adecuados para este enfoque; en tales casos, pueden utilizarse métodos alternativos como el FRNT cuando estén disponibles anticuerpos específicos contra el virus. Otra consideración importante es que los cambios en el Índice Celular no son causados exclusivamente por la citólisis inducida por el virus. Alteraciones en la morfología celular, adhesión, proliferación y fijación también pueden influir en las señales de impedancia y potencialmente dificultar la evaluación de la actividad antiviral. Por lo tanto, los efectos de los agentes antivirales sobre el Índice Celular deben evaluarse en estudios preliminares o mediante controles adecuados con el agente solo. En el presente estudio, para maximizar el número de agentes evaluados por placa, los controles con solo agente antiviral se probaron antes del ensayo de cribado para establecer los efectos basales de cada candidato en ausencia de infección viral. El rendimiento del ensayo también se ve influenciado por factores como la densidad de siembra celular, el momento de la inoculación del virus y las condiciones del medio, los cuales pueden afectar el crecimiento celular, la replicación viral, el desarrollo del efecto citopático y la reproducibilidad del ensayo7,10,16. En consecuencia, una optimización sistemática es esencial para un cribado antiviral basado en RTCA robusto y confiable.

Después de establecer las condiciones óptimas del ensayo, la implementación exitosa de ensayos antivirales en tiempo real basados en impedancia requiere una siembra celular consistente, células sanas y condiciones estables del ensayo. Una alta variabilidad entre pozos suele deberse a una distribución desigual de las células o a pipeteo inexacto; por lo tanto, las suspensiones celulares deben mezclarse completamente antes de la siembra, y las placas deben dejarse a temperatura ambiente durante 30 minutos después de la siembra para favorecer un asentamiento celular uniforme y reducir los efectos de borde. Se recomienda un mínimo de tres réplicas por tratamiento, y se recomienda encarecidamente incluir réplicas adicionales para los controles negativo (no infectado) y positivo (solo virus), ya que estos valores sirven como puntos de referencia para los cálculos del % de EPC y % de neutralización en todas las condiciones de tratamiento. Si el EPC inducido por el virus es débil o inconsistente, verifique la calidad del stock vírico y la salud de la línea celular permisible. Para mantener la infectividad viral, evite ciclos repetidos de congelación-descongelación preparando alícuotas de virus de un solo uso para cada experimento. Finalmente, se recomienda encarecidamente utilizar un banco celular que contenga células permisibles con un número de pase constante para minimizar la variabilidad experimental y mejorar la reproducibilidad del ensayo. Si el Índice Celular medido inmediatamente antes de la infección (típicamente aproximadamente 24 h después de la siembra) se encuentra por debajo del valor de referencia establecido para la línea celular permisible, lo que indica una salud o crecimiento celular subóptimos, el experimento debe interrumpirse. En tales casos, debe descongelarse un vial nuevo de células criopreservadas y debe repetirse el ensayo de cribado antiviral.

Cuando el ensayo de cribado antiviral se realiza bajo condiciones bien controladas y optimizadas, como lo demuestran los datos de cribado presentados aquí, el ensayo basado en impedancia puede cuantificar con precisión la reducción en tiempo real del efecto citopático (CPE) por agentes antivirales. En contraste con los métodos tradicionales que dependen de mediciones terminales intensivas en mano de obra, la lectura continua y no invasiva de la impedancia permite el monitoreo longitudinal de todo el espectro de daño celular inducido por el virus y de los perfiles cinéticos de las respuestas antivirales. Esta capacidad de medición en tiempo real facilita la identificación de ventanas temporales óptimas para detectar no solo efectos antivirales de acción temprana, sino también efectos retardados que podrían pasar desapercibidos en ensayos convencionales de punto final.

Además, el protocolo RTCA descrito aquí proporciona un flujo de trabajo más rápido y considerablemente simplificado para la selección de antivirales en comparación con los métodos tradicionales. El ensayo requiere únicamente un paso inicial de siembra celular seguido de la adición del virus en presencia o ausencia de agentes antivirales. No se necesita manipulación adicional ni procesamiento posterior al ensayo. La configuración experimental y el análisis de datos se simplifican aún más mediante el módulo de software de virología personalizado del sistema, que permite el cálculo automatizado de parámetros comúnmente utilizados en VRNT, incluyendo %CPE, %de neutralización y la mayor dilución o menor concentración de un agente antiviral que logra un nivel de neutralización definido por el usuario. En conjunto, estas ventajas permiten la selección rápida y paralela de muchas más condiciones de ensayo (comparaciones de fármacos, diluciones extendidas, etc.) de lo que normalmente es posible utilizando métodos tradicionales.

Aunque el ensayo descrito aquí se desarrolló en un formato de placa de 96 pocillos, con las condiciones de ensayo apropiadas descritas anteriormente, puede adaptarse a un formato de placa de 384 pocillos. Para respaldar este ensayo basado en impedancia con mayor rendimiento, se puede emplear un sistema automatizado de RTCA basado en impedancia, que permite el procesamiento simultáneo de hasta cuatro placas de 384 pocillos.

Más allá del cribado antiviral, este método RTCA puede aplicarse a estudios de terapia combinada, serología e investigaciones sobre escape inmune viral. Al medir la capacidad de anticuerpos terapéuticos o sueros inmunes para prevenir el efecto citopático inducido por el virus, el ensayo proporciona una evaluación sin marcadores y en tiempo real de la actividad neutralizante y de las respuestas inmunes protectoras tras la infección o la vacunación. Además, la comparación de los perfiles de neutralización entre variantes virales puede revelar cambios en la susceptibilidad asociados con el escape inmune. Cuando se combina con secuenciación genómica, este enfoque puede facilitar la identificación de variantes resistentes a anticuerpos y apoyar el desarrollo de vacunas de nueva generación, terapias con anticuerpos y estrategias antivirales.

Divulgaciones

J.E.C. ha asesorado a Moderna y Merck, es fundador de IDBiologics y recibe regalías de UpToDate. El laboratorio de J.E.C. recibió acuerdos de investigación patrocinada no relacionados de IDBiologics durante la realización del estudio.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones U19 AI181979 y U19AI181930 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
Brincidofovir (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024desinfectante 
CidofovirSelleck S1516
Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)ATCC30-2002
E-Plate 96Agilent5232368001placa de 96 pocillos con microelectrodos integrados
Suero bovino fetalAvantor97068-085
Ganciclovir Sódico Selleck S5065
Célula HEK293AThermo Fisher Scientific  R70507
Viaflo multicanalINTEGRAVIAFLO 96
Solución de Penicilina-EstrepomicinaGibco10378016
Solución tampón de fosfato (1x)HyCloneSH30256.01
AcM recombinantesCrowe LabN/A
RibavirinaSelleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)Crowe LabN/A
Estavudina Selleck S1398
Tripsina 0,25 % con EDTA 0,53 mM  (1x)ATCC30-2101
Reservorios reactivos de 12 canalesVistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
Módulo de virologíaAgilentS2807-90089
Sistema xCELLigence RTCA MPAgilent380601040

Referencias

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