Artículo de método

Modelo murino de co-colonización vaginal de Candida albicans y Streptococcus agalactiae

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DOI:

10.3791/72557

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21 de agosto de 2026

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para co-colonizar vaginalmente ratones con Candida albicans y Streptococcus agalactiae. Puede utilizarse para estudiar interacciones polimicrobianas, interacciones huésped-microorganismo y las respuestas del huésped frente a estos organismos.

Resumen

Se aíslan diversos microorganismos del tracto vaginal humano, y muchos de los organismos que habitan este nicho pueden alternar entre estilos de vida comensales y patógenos. Factores como la composición de la comunidad y el entorno del huésped influyen en los resultados de la enfermedad; sin embargo, los mecanismos que determinan estos resultados no se comprenden bien. En este manuscrito, describimos un modelo murino para investigar las interacciones interespecíficas y la respuesta del huésped a Candida albicans y Streptococcus agalactiae (Grupo B Streptococcus, GBS), patógenos oportunistas que colonizan el tracto genital femenino (TGF). Evidencia emergente sugiere que C. albicans la colonización es un factor de riesgo para la portación de GBS debido a su frecuente aislamiento conjunto. Durante el embarazo, la colonización por GBS puede provocar resultados adversos incluyendo corioamnionitis y muerte fetal. El EGB también puede transmitirse a un feto in utero o un recién nacido durante el parto y es una causa principal de meningitis neonatal. La colonización del tracto vaginal es un precursor crítico de la enfermedad por GBS, y este nicho ejerce numerosas presiones selectivas, algunas de las cuales pueden verse influenciadas por C. albicans colonización. Este protocolo describe un modelo de concurrente C. albicans- Colonización vaginal conjunta por GBS mediante tratamiento con antibióticos y una dosis única de 17β-estradiol para establecer C. albicans colonización, seguida de la eliminación de antibióticos e inoculación con GBS. Las cargas microbianas en la luz vaginal se cuantifican durante el transcurso del experimento mediante lavado, y las cargas en todo el tracto genital femenino se cuantifican mediante disección, homogenización y siembra de la vagina, el cuello uterino y el útero. Este método permitirá investigar los mecanismos mediante los cuales las interacciones polimicrobianas directas e indirectas influyen en los estilos de vida y la patogénesis de estos dos organismos, así como en el paisaje inmune del huésped en el tracto genital femenino.

Introducción

Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B, GBS) es un patobionte bacteriano Gram-positivo que coloniza múltiples sitios polimicrobianos, incluidos los tractos gastrointestinal y vaginal. Aunque la colonización vaginal es típicamente asintomática, durante el embarazo, el GBS puede ascender desde el tracto vaginal hacia el útero y atravesar membranas íntegras, causando infección del líquido amniótico y de la placenta. Por lo tanto, constituye un factor de riesgo principal para resultados adversos del embarazo, infección fetal y enfermedad neonatal1,2. Como una de las principales causas de infección invasiva en neonatos, es fundamental caracterizar los factores que influyen en el riesgo de transmisión e infección. La profilaxis antibiótica intraparto puede reducir la transmisión vertical y la enfermedad GBS de inicio temprano en neonatos3,4; sin embargo, se ha asociado con tasas crecientes de resistencia a antibióticos y posibles efectos a largo plazo relacionados con la administración prenatal o en la primera infancia de antibióticos5,6,7,8. Estos factores hacen necesaria la elaboración de intervenciones preventivas y terapéuticas más específicas.

Evidencia emergente ha demostrado que la composición del microbioma y las interacciones polimicrobianas influyen en la homeostasis y en la probabilidad de desarrollar enfermedades9. La predominancia de GBS en el microbioma vaginal humano se ha asociado con una disminución en la abundancia de Lactobacillus, y se han observado interacciones específicas a nivel de especie y cepa que pueden tener diversos efectos sobre la colonización in vitro e in vivo10,11. Previamente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado un modelo murino de colonización vaginal por GBS para estudiar los correlatos del huésped y bacterianos relacionados con la aptitud de GBS12. Este procedimiento implica tratar a los ratones con una dosis única de 17β-estradiol, seguido de una inoculación intravaginal con GBS al día siguiente. Este modelo se ha utilizado para caracterizar la importancia de las proteínas de superficie de GBS, las redes de señalización reguladoras y la secreción de toxinas en el mantenimiento de la colonización y en la invasión de los tejidos del tracto genital femenino. Además, hemos encontrado que GBS exhibe interacciones complejas con otras bacterias en el tracto vaginal, incluyendo Akkermansia muciniphila y Enterococcus faecalis13,14,15, lo que demuestra cómo el estilo de vida y la persistencia de GBS se ven influenciados por la presencia de microorganismos vecinos.

Aunque este modelo existente se ha adaptado para estudiar interacciones interbacterianas, se requirieron modificaciones adicionales para estudiar otros microorganismos. Los hongos son un componente poco estudiado del microbioma vaginal, y con el modelo presentado aquí, buscamos desarrollar una herramienta para estudiar la colonización fúngica junto con las interacciones hongo-bacterias in vivo. El hongo más comúnmente aislado del tracto vaginal humano es Candida albicans, que coloniza a más del 70 % de las personas16. C. albicans es polimórfico y puede experimentar morfogénesis para alternar entre formas levaduriformes y filamentosas. La filamentación se asocia con un repertorio distinto de expresión génica17,18. Algunos de estos genes específicos de hifas han sido recientemente descritos como factores que confieren una ventaja adaptativa en el contexto de la colonización polimicrobiana19,20,21.

Varios estudios han reportado el aislamiento conjunto de C. albicans y GBS en hisopados vaginales humanos, y nuestro grupo de investigación ha descubierto recientemente que los individuos colonizados con C. albicans presentan tasas significativamente más altas de portación de GBS22. Hemos desarrollado un in vivo sistema para estudiar las interacciones tripartitas entre hongos comensales, bacterias y el huésped. Los estudios con hongos en ratones convencionales típicamente requieren tratamiento con antibióticos para superar la resistencia a la colonización mediada por bacterias y establecer una colonización persistente23. Para lograr esto sin interrumpir la capacidad de GBS de colonizar, tratamos a los ratones con un cóctel de antibióticos e inoculamos C. albicans, y después de que se establece la colonización, eliminamos la exposición al antibiótico para permitir que GBS colonice posteriormente. Esto ha sido optimizado de manera que ambos C. albicans y GBS colonizan el tracto vaginal con cargas y cronogramas similares, lo que permite que ocurran interacciones directas dentro del tracto vaginal. Este protocolo describe un método para pretratar ratones con antibióticos, administrar 17β-estradiol, establecer la colonización con hongos y bacterias, y recolectar muestras de lavado y tejido para su posterior análisis.

Protocolo

El trabajo con animales presentado en este manuscrito fue aprobado por y llevado a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC) de la Universidad de Colorado Anschutz bajo el protocolo n.º 00316. En la cronología que se muestra a continuación, el día 0 se refiere al día de la inoculación con S. agalactiae.

1. Administre antibióticos antes de la inoculación.

  1. Prepare una solución concentrada de 50 mg/mL de ampicilina, neomicina y gentamicina disueltas en agua de bebida para ratones. Use un filtro de 0,22 µm para esterilizar la solución de antibióticos.
  2. Añada la solución de antibióticos al agua de bebida para ratones en una dilución 1:100, agregando 1 mL de la solución por cada 99 g de agua.
  3. Después de 7 días, reemplace el agua repitiendo los pasos 1.1 y 1.2.
  4. Mantenga los antibióticos durante al menos 7–10 días antes de comenzar el experimento, pero no exceda un total de 14 días de tratamiento con antibióticos.

2. Sincronizar los ciclos de estro en ratones (día -3).

  1. Añada 0,5 mg por ratón de 17β-estradiol, más un exceso pequeño para compensar la adherencia de la suspensión a las paredes del tubo, a un tubo cónico estéril de 50 mL. Tape firmemente el tubo cónico y vortex brevemente para deshacer grumos.
    ADVERTENCIA: Dado que el 17β-estradiol puede penetrar en el cuerpo por contacto dérmico o mucoso, manipule este reactivo con cuidado y use equipo de protección personal adecuado.
  2. Use un filtro de 0,45 µm para esterilizar 100 µL de aceite de sésamo por cada 0,5 mg de 17β-estradiol directamente en el tubo cónico que contiene el 17β-estradiol. La concentración es de 5 mg/mL. Tape firmemente y mezcle bien mediante vortex para obtener una suspensión homogénea.
  3. Prepare jeringas estériles de 1 mL (una por ratón) tirando del émbolo hasta la marca de 0,15 mL y colóquelas de forma que el émbolo quede hacia abajo y la punta con bloqueo Luer hacia arriba.
  4. Aspire la suspensión de 17β-estradiol en una jeringa estéril nueva de 10 mL con una aguja estéril de 18G y 1,5” y úsela para llenar las jeringas de 1 mL preparadas con 100 µL de la suspensión.
  5. Coloque una aguja estéril de 26G y 0,5” en cada jeringa de 1 mL.
  6. Prepare una suspensión de 100 µL de aceite de sésamo que contenga 0,5 mg de 17β-estradiol y administre una dosis a cada ratón mediante inyección intraperitoneal un día antes de la inoculación con C. albicans.

3. Inocular ratones con C. albicans (día -2).

  1. Un día antes de la inoculación (el mismo día de la administración de 17β-estradiol), cultive una cultura sobrenocturna de 5 mL de C. albicans en caldo Yeast Peptone Dextrose, en un incubador a 30 °C con agitación de 250 rpm.
  2. El día de la inoculación, transfiera una alícuota de la cultura sobrenocturna a un tubo estéril de microcentrífuga y centrifugue a ≤10,000 × g durante 7–8 s o hasta que se forme un botón.
  3. Retire el sobrenadante y resuspenda el botón en solución salina tamponada con fosfatos estéril (PBS).
  4. Utilice un hemocitómetro para calcular la concentración de la suspensión.
  5. Transfiera una alícuota de la suspensión a un nuevo tubo estéril de microcentrífuga, vuelva a centrifugar para formar un botón y resuspenda en PBS estéril fresco hasta alcanzar una concentración final de 109 células de C. albicans/mL, en un volumen final de al menos 10 µL por ratón. Por ejemplo, si la concentración es de 2 × 108 células/mL y hay 10 ratones, centrifugue 500 µL y resuspenda en 100 µL.
  6. Inocule cada ratón por vía intravaginal con 10 µL de C. albicans suspendido en PBS a una concentración de 109 células/mL (107 células/animal).
    1. Retenga a cada ratón sujetando la piel del pescuezo entre el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante, luego gire la muñeca de forma que la espalda del ratón quede apoyada en la palma de la mano. Utilice los dedos anular y meñique para inmovilizar la cola.
    2. Aspire 10 µL de la suspensión de C. albicans en una punta estéril de pipeta. Introduzca la punta aproximadamente 5–10 mm dentro de la luz vaginal, ajustando la profundidad según la anatomía del ratón.
    3. Libere la inoculación de C. albicans en la vagina y retire la punta de la pipeta.
    4. Tras soltar el pescuezo, sostenga al ratón por la cola para elevar las patas traseras. Haga que camine sobre sus dos patas delanteras durante aproximadamente 1 min o hasta que la inoculación de C. albicans ya no sea visible.

4. Reemplazar el agua potable (día -1).

  1. Un día después de la inoculación con C. albicans, que coincide con el día anterior a la inoculación con S. agalactiae, traslade los ratones a jaulas limpias.
  2. Asegúrese de que los ratones reciban agua fresca sin antibióticos.

5. Cuantificación de la carga de C. albicans en el lumen vaginal (día -1).

  1. El día -1, prepare un tubo estéril para microcentrífuga y 100 µL de PBS estéril por ratón.
  2. Restrinja a cada ratón según se describe en el paso 3.6.1.
  3. Aspire 50 µL de PBS en una punta estéril para pipeta. Introduzca la punta aproximadamente 1–5 mm en la luz vaginal y aspire y expulse todo el volumen de PBS de arriba abajo 3–5 veces. Deposite el PBS en un tubo estéril para microcentrífuga.
  4. Repita el paso 5.3 para obtener un volumen total de 100 µL de líquido de lavado.
  5. Vortexee el tubo para microcentrífuga y luego realice diluciones seriadas de 10 veces hasta una dilución de 1:10.000 en PBS estéril.
  6. Plaque 10 µL de las suspensiones diluidas y 25 µL del líquido de lavado sin diluir en placas de agar cromogénico selectivo para Candida.
  7. Incube las placas a 30 °C durante 48 h. Las colonias de C. albicans aparecerán lisas y de color turquesa o verde.

6. Inocular ratones con S. agalactiae (día 0).

  1. Un día antes de la inoculación (el mismo día del reemplazo del agua de bebida), cultivar un cultivo nocturno de 3 mL de S. agalactiae en caldo Todd Hewitt (THB) de forma estática a 37 °incubadora C
  2. El día de la inoculación, diluya la cultivo nocturna 1:10 en 4 mL de THB e incube de forma estática a 37 °incubadora C hasta que alcance la fase logarítmica media (densidad óptica a 600 nm [OD600] de 0,4–0,5 en aproximadamente 1,5–2 h.
  3. Transferir el cultivo en fase logarítmica media a un tubo cónico estéril de 15 mL y centrifugar a 3.000 × g durante 5 min o hasta que se forme un pellet.
  4. Elimine el sobrenadante por aspiración, luego suspenda el precipitado en 300 µL de PBS estéril.
  5. Utilice el pellet resuspendido para preparar al menos 100 µL de S. agalactiae suspensión por ratón, más 500 adicionales µL, en PBS estéril a OD600 0,4 (aproximadamente 108 unidades formadoras de colonias [UFC]/mL; ≥1,5 mL en total para 10 ratones
    NOTA: Algunos S. agalactiae las cepas pueden diferir en su DO600-a-CFU/mL. Determine cuál OD600 corresponde a 108 UFC/mL con anticipación.
  6. Transferir la suspensión a un nuevo tubo cónico estéril de 15 mL y centrifugar a 3.000 × g durante 5 min o hasta que se forme un pellet.
  7. Aspire el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 1/10th del volumen inicial de PBS estéril (si se centrifugó 1,5 mL de la suspensión, re suspensionar en 150) µL). Esta suspensión estará a 109 UFC/mL y servir como el inóculo bacteriano.
  8. Diluir y sembrar en placa seriamente 50 µL del inóculo en Agar Todd Hewitt, luego incubar las placas a 37 °C durante 24 h para determinar la concentración exacta del inóculo.
  9. Inocular intravaginalmente cada ratón con 10 µL de S. agalactiae suspendido en PBS a 109 UFC/mL (107 UFC/ratón) utilizando la misma técnica que en los pasos 3.6.1–3.6.4.

7. Cuantificación de las cargas de C. albicans y S. agalactiae en la luz vaginal (inicio el día +1).

  1. A partir de un día después de la inoculación con S. agalactiae, recolecte 100 µL de líquido de lavado vaginal y dilúyalo seriamente utilizando la misma técnica que en los pasos 5.1–5.5.
  2. Plaque en duplicado 10 µL de las suspensiones diluidas y 25 µL del líquido de lavado sin diluir en placas de agar cromogénico selectivo para Candida y selectivo para StrepB.
  3. Incube las placas de Candida a 30 °C durante 48 h. Las colonias de C. albicans aparecerán lisas y de color turquesa o verde.
  4. Incube las placas de StrepB a 37 °C durante 24 h. Las colonias de S. agalactiae aparecerán lisas y de color rosa o malva.
  5. Repita los pasos 7.1–7.4 diariamente, o a un intervalo de tiempo apropiado, para monitorear la carga microbiana en la luz vaginal.

8. Cuantificación de las cargas de C. albicans y S. agalactiae en los tejidos del tracto genital femenino (punto final experimental).

  1. Prepare tres tubos roscados de 2 mL con aproximadamente 0,4–0,5 g de perlas de circonia de 1 mm y 500 µL de PBS estéril por ratón para recolectar los tejidos (vagina, cuello uterino y útero). También prepare un tubo estéril de microcentrifugado y 100 µL de PBS estéril por ratón para recolectar el lavado. Registre el peso de cada tubo roscado para usarlo como referencia al calcular los pesos de los tejidos.
  2. Sacrifique al ratón utilizando un método aprobado institucionalmente, como asfixia con CO2 y dislocación cervical. Use etanol al 70 % para esterilizar las tijeras y las pinzas.
  3. Elevé el extremo trasero del ratón por la cola y recolecte el lavado vaginal utilizando la técnica descrita en los pasos 5.3–5.4.
  4. Rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70 % y use las tijeras esterilizadas para abrir la cavidad abdominal. Utilice pinzas para retirar la piel hacia atrás y desplazar el tracto gastrointestinal con el fin de exponer los tejidos del tracto genital.
  5. Use las tijeras esterilizadas para retirar la vejiga, así como la grasa visceral y las membranas que obstruyen el útero. Separe los cuernos uterinos de los ovarios cortando entre el cuerpo uterino y cada ovario.
  6. Usando pinzas esterilizadas, sujete el tracto vaginal en el punto inferior al cuello uterino. Levante hasta que todo el tracto vaginal sea visible y use tijeras esterilizadas para realizar un corte transversal lo más cercano posible a la vulva, evitando cualquier tejido de la piel. Retire todo el tracto genital y colóquelo en una placa de Petri estéril de 10 cm.
  7. Use una cuchilla estéril para realizar dos cortes transversales inferior y superior al cuello uterino, separando así la vagina, el cuello uterino y el útero. Mince cada uno de los tejidos realizando 2–5 cortes adicionales sagitales y transversales en cada uno. Coloque cada tejido en su respectivo tubo roscado preparado.
  8. Pese cada tubo roscado y calcule el peso de cada tejido restando el valor obtenido en el paso 8.1. Tape firmemente cada tubo, realice la agitación con perlas a 3.450 rpm durante 1 min, coloque los tubos en hielo durante 1 min y luego realice nuevamente la agitación con perlas a 3.450 rpm durante 1 min.
  9. Diluya y plaque en serie cada homogenizado de tejido y muestra de lavado utilizando el método descrito en los pasos 5.5–5.6. Incube las placas según se describe en los pasos 7.3–7.4.

Resultados

Para caracterizar el GBS y C. albicans colonización vaginal, se inoculó intravaginalmente a ratones con C. albicans cepas SC5314 o un control de vehículo PBS, seguido de inoculación con la cepa GBS COH1. Esta cepa representa aislados del serotipo capsular hipervirulento III, tipo de secuencia 17, que se asocian con mayor frecuencia a enfermedad invasiva neonatal y meningitis1. Se excluyeron del análisis los ratones que no fueron colonizados con GBS un día después de la inoculación. A lo largo de un período experimental de cuatro días, los ratones colonizados únicamente con GBS eliminan progresivamente el GBS de la luz vaginal. La mayoría de los ratones co-colonizados con C. albicans mantener altas cargas de GBS (Figura 1A, B). C. albicans también coloniza la luz vaginal del ratón durante aproximadamente cuatro días antes de ser eliminado (Figura 1C). Trabajos previos que han utilizado este modelo han demostrado que las cargas de GBS en los tejidos del tracto genital femenino, incluyendo la vagina, el cuello uterino y el útero, también son más altas en ratones co-colonizados en comparación con animales mono-colonizados22.

Gráficos de colonización por GBS; comparación estadística, curva de supervivencia, análisis de datos en escala logarítmica de UFC/mL.
Figura 1. Cuantificación de la colonización por el grupo B de Streptococcus. Se colonizaron ratones CD-1 con C. albicans (SC5314) o se trataron con solución salina tamponada con fosfato como control, seguido de inoculación vaginal con GBS (COH1). (A) Carga de GBS en el líquido de lavado vaginal, se muestran las medianas. (B) Porcentaje de ratones colonizados a lo largo del tiempo evaluado mediante la detección de GBS en el líquido de lavado vaginal. (C) Carga de C. albicans en el líquido de lavado vaginal, se muestran las medianas. Tres experimentos independientes. n = 26-27 ratones por grupo. * p < 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001 mediante múltiples pruebas t con la prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak (A) o la prueba de log-rank (B). Abreviaturas: GBS = grupo B de Streptococcus, Ca = Candida albicans, UFC = unidades formadoras de colonias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La colonización vaginal por GBS representa un riesgo crítico para la salud materno-fetal y neonatal. Los modelos in vivo son imprescindibles para comprender los determinantes de la colonización y para desarrollar terapias preventivas. En este manuscrito, describimos un modelo murino para colonizar vaginalmente ratones de forma conjunta con GBS y C. albicans, evaluar las cargas microbianas en la luz vaginal y el tracto genital femenino (FGT), y recolectar tejidos relevantes para análisis posteriores. Este modelo ha sido desarrollado para estudiar las interacciones hongo-bacteria y huésped-microbio en el contexto de la colonización vaginal polimicrobiana. Nuestro grupo de investigación ha utilizado este modelo para elucidar los mecanismos que contribuyen a que C. albicans favorezca la colonización vaginal y la infección ascendente por GBS22.

Los modelos animales se han utilizado con éxito para comprender las interacciones entre el hospedador y los microorganismos; sin embargo, incorporar comunidades polimicrobianas en estos modelos puede presentar varios desafíos únicos. Los objetivos principales en el desarrollo de este modelo fueron establecer la colonización fúngica, permitir tiempo para que C. albicans forme hifas e inocular con GBS para monitorear la dinámica de colonización antes de que el hospedador eliminara a cualquiera de los microorganismos. Como un hongo polimórfico, C. albicans puede responder a diversas señales ambientales relacionadas con el hospedador iniciando la morfogénesis de hifas17. La filamentación in vivo fue prioritaria en este modelo debido a la creciente evidencia de que las interacciones específicas de las hifas con GBS impulsan la simbiosis en el tracto genital femenino. Utilizando una cepa de C. albicans que expresa NRG1 bajo el control del promotor represible TetO, nuestro grupo de investigación ha demostrado previamente que GBS muestra una mayor coagregación y una mayor adherencia epitelial con C. albicans bloqueado en forma de hifa en comparación con el bloqueado en forma de levadura22. La coagregación con C. albicans y la asociación con células epiteliales vaginales humanas son determinantes importantes del ajuste biológico de GBS en este entorno del hospedador. También se ha demostrado que bacterias adicionales como Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y diversas especies de Streptococcus modulan la expresión génica asociada a la morfogénesis en C. albicans, así como que interactúan preferentemente con las hifas24. En el futuro, se podrán abordar las implicaciones de la filamentación in vivo utilizando este modelo para colonizar ratones con cepas de C. albicans bloqueadas en forma de hifa o de levadura.

Los modelos murinos existentes que implican la inoculación intravaginal de C. albicans se han centrado principalmente en la candidiasis vulvovaginal (VVC)25 y se han utilizado para caracterizar el estado hiperinflamatorio asociado con la infección sintomática26. Nuestro modelo, descrito en este manuscrito, representa más fielmente un estado de colonización. Trabajos previos de nuestro grupo de investigación han demostrado que, mediante este modelo, la co-colonización con C. albicans disminuye la abundancia de citocinas proinflamatorias IL-6, CXCL1, CXCL2 y TNFα en comparación con la colonización exclusiva por GBS, y que los niveles de estas proteínas en ratones co-colonizados son comparables a los de animales naïve22. Esto indica que no observamos el entorno hiperinflamatorio característico de la VVC, a pesar de la filamentación fúngica en la luz vaginal. Se ha reportado que los ratones CD-1 no endogámicos son resistentes a la VVC, posiblemente debido al control inmunitario adecuado del crecimiento fúngico27. Además, los ratones CD-1 inician una señalización inmunitaria robusta tras la inoculación intravaginal de GBS, suficiente para controlar la población bacteriana en aproximadamente una semana en ausencia de C. albicans28,29,30, aunque previamente hemos investigado la colonización vaginal por GBS en otras cepas de ratón12. El modelo descrito en este manuscrito refleja la naturaleza transitoria tanto de la colonización por C. albicans como por GBS que se observa en humanos. Además, existe una alta variabilidad entre humanos en cuanto al pH y la composición del microbioma. Este modelo presenta condiciones de pH casi neutro (~6.5)31. El microbioma vaginal de los ratones CD-1 está dominado por especies de Enterobacteriaceae y Proteus13, que se asocian con los mismos tipos de estados comunitarios microbianos vaginales que el GBS9,32.

Al tratar a los ratones con antibióticos y una dosis única de 17β-estradiol antes de la inoculación fúngica, preparamos el entorno para que sea receptivo a C. albicans, facilitando así la colonización. El tratamiento con estradiol además promueve la reproducibilidad entre experimentos al sincronizar la fase del ciclo estral y, por ende, el entorno inmunitario local en el momento de la inoculación. Sincronizamos a los ratones en la fase de proestro al momento de la inoculación con C. albicans, fase que coincide con una abundancia reducida de neutrófilos y que se ha demostrado favorece la carga fúngica en el tracto genital femenino (FGT)33,34. La eliminación de los antibióticos y su reemplazo por agua potable fresca al comienzo de la cronología experimental no solo facilita la colonización por GBS, sino que también permite que los microbios nativos repoblen el tracto vaginal. Además, limitar el tratamiento con estradiol a una única dosis inicial permite que los ratones reanuden la dinámica típica del ciclo estral, aunque se ha demostrado que la administración continua de estradiol favorece la colonización12. La composición de células inmunitarias en el FGT murino varía a lo largo del ciclo estral, y las respuestas inmunitarias mucosas son altamente sensibles a las hormonas esteroides sexuales35,36,37. Por lo tanto, evitamos la variable confundente que representa la administración repetida de estradiol para investigar específicamente los efectos de la colonización microbiana sobre el entorno del huésped.

Los datos presentados en este estudio representan la cepa C. albicans SC5314 y la cepa de GBS COH1. Seleccionamos la cepa SC5314 para establecer el modelo debido a su uso frecuente en micología, a la abundancia de herramientas genéticas disponibles en este fondo y a un cuerpo consolidado de conocimiento sobre su biología y dinámica in vitro y in vivo. Nuestro grupo de investigación también ha demostrado que la cepa C. albicans 529L puede promover las cargas de GBS en el tracto genital femenino22. La cepa GBS COH1 se utilizó como representante de la línea del tipo de secuencia III del serotipo 17, que se asocia con resistencia antimicrobiana y enfermedad invasiva neonatal1,2. Este modelo utiliza medios selectivos y diferenciales para cuantificar la abundancia de GBS y C. albicans en lavados vaginales y tejidos. Para adaptar este modelo para su uso con otras especies bacterianas y fúngicas, sería necesario optimizar las condiciones de crecimiento selectivas adecuadas.

Las interacciones hongo-bacterianas están emergiendo como mediadores importantes de los estilos de vida microbianos38,39. Varios estudios han demostrado que estas interacciones pueden moldear considerablemente el comensalismo y el potencial de virulencia. Además, el entorno del huésped impone presiones únicas y puede influir en factores como la programación metabólica, los regulones de factores de transcripción y los perfiles de resistencia a antimicrobianos. Por lo tanto, es esencial utilizar modelos in vivo representativos para caracterizar cómo los microorganismos interactúan entre sí. El modelo murino descrito en este manuscrito puede utilizarse para estudiar cómo la colonización vaginal con bacterias y hongos de interés puede influir en la carga microbiana, la expresión génica y la respuesta del huésped.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Oficina de Recursos para Animales de Laboratorio de la Universidad de Colorado Anschutz, incluyendo al encargado de las instalaciones y al personal dedicado del vivario. Este trabajo está financiado por las subvenciones del NIH R01AI153332 y R21AI188719 otorgadas a K.S.D.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro de 0,22 µmSigma-AldrichSLGSR33SB
Filtro de 0,45 µmSigma-AldrichSLHAR33SB
Jeringa de 1 mL con bloqueo luerMcKesson16-S1C
Perlas de circonia de 1,0 mmResearch Products International9835
Jeringa de 10 mL con bloqueo luerMcKesson16-S10C
17β-estradiolSigma-AldrichE8875PRECAUCIÓN: El 17β-estradiol puede absorberse a través de la piel y las superficies mucosas. Use equipo de protección personal (EPP) adecuado y tenga precaución al manipularlo.
Aguja de 18G, 1,5"BD305196
Tubo de 2 mL con tapa roscadaFisher Scientific02-681-374
Aguja de 26G, 0,5"McKesson16-N2605
AgarAlpha BiosciencesA01-102
AmpicilinaResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
GentamicinaVWR Life Science0304
NeomicinaResearch Products InternationalN20040
Solución salina tamponada con fosfatoFisher ScientificBP2944
Aceite de sésamoSigma-AldrichS3547
Caldo Todd HewittResearch Products InternationalT47500
Caldo Yeast Peptone DextroseBD242810

Referencias

  1. Megli CJ et al. Virulence and pathogenicity of group B Streptococcus.: virulence factors and their roles in perinatal infection. Virulence. 2025;16(1):2451173.
  2. Manuel G et al. Group B streptococcal infections in pregnancy and early life. Clin Microbiol Rev. 2025;38(1):e00154-22.
  3. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36.
  4. Prevention of group B streptococcal early-onset disease in newborns: ACOG Committee Opinion Summary, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):489-92.
  5. Hsu CY et al. Global patterns of antibiotic resistance in group B Streptococcu.s: a systematic review and meta-analysis. Front Microbiol. 2025;16:1541524.
  6. Sabroske EM et al. Evolving antibiotic resistance in group B Streptococci. causing invasive infant disease: 1970-2021. Pediatr Res. 2023;93(6):2067-71.
  7. Azad MB et al. Impact of maternal intrapartum antibiotics, method of birth and breastfeeding on gut microbiota during the first year of life: a prospective cohort study. BJOG. 2016;123(6):983-93.
  8. Duong QA, Curtis N, Zimmermann P. The association between prenatal antibiotic exposure and adverse long-term health outcomes in children: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2025;90(1):106377.
  9. Mejia ME, Robertson CM, Patras KA. Interspecies interactions within the host: the social network of group B Streptococcus. Infect Immun. 2023;91(4):e00440-22.
  10. De Gregorio PR, Juárez Tomás MS, Leccese Terraf MC, Nader-Macías MEF. Preventive effect of Lactobacillus reuteri .CRL1324 on group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J Appl Microbiol. 2015;118(4):1034-47.
  11. Shiroda M, Aronoff DM, Gaddy JA, Manning SD. The impact of Lactobacillus. on group B streptococcal interactions with cells of the extraplacental membranes. Microb Pathog. 2020;148:104463.
  12. Patras KA, Doran KS. A murine model of group B Streptococcus .vaginal colonization. J Vis Exp. 2016;(117):e54708.
  13. Burcham LR et al. Interrelated effects of zinc deficiency and the microbiome on group B streptococcal vaginal colonization. mSphere. 2022;7(4):e00264-22.
  14. Marroquin SM, Cohen S, Neely MN, Doran KS. Akkermansia muciniphila impacts group B Streptococcus. vaginal colonization. mBio. 2026;17(6):e02868-25.
  15. Job AM, Doran KS, Spencer BL. A group B streptococcal type VII-secreted LXG toxin mediates interbacterial competition and colonization of the murine female genital tract. mBio. 2024;15(10):e02088-24.
  16. Beigi RH et al. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study. Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):926-30.
  17. Noble SM, Gianetti BA, Witchley JN. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nat Rev Microbiol. 2017;15(2):96-108.
  18. Schille TB et al. Commensalism and pathogenesis of Candida albicans .at the mucosal interface. Nat Rev Microbiol. 2025;23(8):525-40.
  19. Liang SH et al. The hyphal-specific toxin candidalysin promotes fungal gut commensalism. Nature. 2024;627(8004):620-7.
  20. Fróis-Martins R et al. Dynamic expression of candidalysin facilitates oral colonization of Candida albicans. in mice. Nat Microbiol. 2025;10(10):2472-85.
  21. Mauk KE et al. Commensal colonization of Candida albicans. in the mouse gastrointestinal tract is mediated via expression of candidalysin and adhesins. Microbiol Spectr. 2025;13(9):e00567-25.
  22. Cohen S et al. A fungal pathobiont promotes Streptococcus .vaginal persistence and pathogenesis through physical and metabolic interactions. Cell Host Microbe. 2026;34(6):1118-34.e7.
  23. Koh AY. Murine models of Candida .gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 2013;12(11):1416-22.
  24. Allison DL et al. Candida.-bacteria interactions: their impact on human disease. Microbiol Spectr. 2016;4(3):VMBF-0030-2016.
  25. Yano J, Fidel PL Jr. Protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of Candida .vaginitis. J Vis Exp. 2011;(58):e3382.
  26. Ardizzoni A, Wheeler RT, Pericolini E. It takes two to tango: how a dysregulation of the innate immunity, coupled with Candida. virulence, triggers VVC onset. Front Microbiol. 2021;12:692491.
  27. Yano J, Noverr MC, Fidel PL Jr. Vaginal heparan sulfate linked to neutrophil dysfunction in the acute inflammatory response associated with experimental vulvovaginal candidiasis. mBio. 2017;8(2):e00211-17.
  28. Patras KA et al. Group B Streptococcus. CovR regulation modulates host immune signaling pathways to promote vaginal colonization. Cell Microbiol. 2013;15(7):1154-67.
  29. Patras KA, Rösler B, Thoman ML, Doran KS. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 2015;8(6):1339-48.
  30. Spencer BL et al. Characterization of the cellular immune response to group B streptococcal vaginal colonization. J Innate Immun. 2025;17(1):566-78.
  31. Miao J, Willems HME, Peters BM. Exogenous reproductive hormones nor Candida albicans. colonization alter the near neutral mouse vaginal pH. Infect Immun. 2021;89(2):e00550-20.
  32. Rosen GH et al. Group B Streptococcus. and the vaginal microbiota. J Infect Dis. 2017;216(6):744-51.
  33. Latorre MC et al. Vaginal neutrophil infiltration is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front Immunol. 2022;13:1031941.
  34. Gómez-Oro C et al. Progesterone promotes CXCL2-dependent vaginal neutrophil killing by activating cervical resident macrophage-neutrophil crosstalk. JCI Insight. 2024;9(20):e177899.
  35. Winkler I et al. The cycling and aging mouse female reproductive tract at single-cell resolution. Cell. 2024;187(4):981-998.e25.
  36. Seavey MM, Mosmann TR. Estradiol-induced vaginal mucus inhibits antigen penetration and CD8+ T cell priming in response to intravaginal immunization. Vaccine. 2009;27(17):2342-9.
  37. Li S et al. Estrogen action in the epithelial cells of the mouse vagina regulates neutrophil infiltration and vaginal tissue integrity. Sci Rep. 2018;8(1):11247.
  38. Cohen S, Ost KS, Doran KS. Impact of interkingdom microbial interactions in the vaginal tract. PLoS Pathog. 2024;20(3):e1012018.
  39. MacAlpine J, Robbins N, Cowen LE. Bacterial-fungal interactions and their impact on microbial pathogenesis. Mol Ecol. 2023;32(10):2565-81.

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