Paradigma de reconocimiento social en ratones para distinguir relaciones a corto y largo plazo

Resumen

Aquí, describimos un procedimiento detallado para medir el reconocimiento social entre relaciones nuevas, a corto plazo y a largo plazo mediante un paradigma experimental conductual de Cuatro Vasos. Describimos los beneficios y usos potenciales de este paradigma, junto con información importante para interpretar con precisión los resultados. 

Resumen

La memoria social es la capacidad de recordar y reconocer con-específicos. Es un aspecto fundamental del comportamiento de los mamíferos, con ventajas comprobadas para la supervivencia en mamíferos altamente sociales como los ratones y los seres humanos. Los roedores, particularmente los ratones, son un modelo animal establecido ampliamente utilizado para estudiar la memoria social y sus mecanismos subyacentes. La mayoría de los existentes memoria social los paradigmas evalúan principalmente el reconocimiento social a corto plazo, en el que la duración de la relación y el nivel de familiaridad entre el sujeto y un agente es de entre 5 y 15 minutos. Por lo tanto, los paradigmas existentes y estudios previos no capturan recuerdos sociales de relaciones a largo plazo y se centran en la dicotomía entre novedad y familiaridad a corto plazo, dejando un gran brecha en nuestra comprensión mecanicista de los recuerdos sociales. Para llenar esta brecha, diseñamos un ensayo sencillo que capta las respuestas del ratón a diferentes niveles de familiaridad, colocando el recuerdo complejo de la memoria social en un contexto observable y cuantificable. En el paradigma de los cuatro vasos, un ratón sujeto explora libremente un arena conteniendo cuatro vasos perforados colocados en cada esquina. Estos vasos contienen tres agente ratones con diferentes niveles de familiaridad (estímulos sociales): un individuo familiar a largo plazo (compañero de jaula; convivencia de 1 mes), un individuo familiar a corto plazo (exposición previa de 10 minutos), un congénere novedoso y una taza vacía como control. Los ratones macho CD-1 muestran preferencia por investigar al ratón novedoso y al familiar a largo plazo en comparación con el estudio de ratones familiarizados a corto plazo en este paradigma. Esta tarea demuestra reconocimiento del nivel de familiaridad y minimiza comportamientos agresivos mientras aún controlando por historial de exposición. Este nuevo ensayo proporciona una plataforma para comparar directamente los mecanismos neuronales de lo social memoria a largo plazo, a corto plazo y novedosa individuos. El paradigma de los cuatro vasos sirve como un novedoso medición para reconocimiento de familiaridad a largo plazo que complementará los ensayos de reconocimiento a corto plazo existentes. 

Introducción

La memoria social es una característica fundamental del comportamiento social de los mamíferos y está particularmente bien desarrollada en especies altamente sociales como los ratones y los seres humanos. En roedores, el reconocimiento de otros subyace a las dinámicas conductuales críticas para la supervivencia dentro de grupos familiares y de congéneres, incluyendo la cohesión grupal, las jerarquías de dominancia, los comportamientos reproductivos y el cuidado parental^1,2. Además de su papel evolutivamente ventajoso en la supervivencia animal, la alteración de la memoria social en humanos es una característica común en múltiples trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, incluyendo el trastorno del espectro autista, la esquizofrenia y la enfermedad de Alzheimer^3,4,5,6. Dado que el reconocimiento social es fundamental para el funcionamiento diario de las especies sociales y tiene una clara importancia clínica, desarrollar ensayos conductuales que capturen con precisión su naturaleza multidimensional y sus bases neuronales es esencial. Aunque los paradigmas existentes miden algunos aspectos del reconocimiento social en ratones, la mayoría de los ensayos están diseñados para evaluar preferencias por novedad comparando relaciones nuevas frente a relaciones a corto plazo formadas en minutos u horas, en lugar de cuantificar el reconocimiento de relaciones sociales a largo plazo.   

Los enfoques existentes, como el paradigma de tres cámaras o los paradigmas de habituación-deshabituación, evalúan la preferencia por la novedad tras una exposición previa breve, a menudo limitada a 5–15 minutos.^7,8,9,10,11. Estos métodos han proporcionado una comprensión sustancial de los mecanismos neuronales de estos social a corto plazo memorias en ratones^12,13. Sin embargo, los recuerdos sociales naturalistas y la función social deben incorporar los mecanismos distintos que intervienen en las relaciones a largo plazo, construido mediante cohabitación, a largo plazo jerarquías sociales o parejas de apareamiento Aunque algunos estudios utilizan el paradigma de las tres cámaras con camadas¹⁴ o ratones familiares cohabitados con el sujeto durante hasta 72 h^15,16, el uso principal del paradigma aún se centra en la simple dicotomía entre novedoso y familiar. Esto limita las comparaciones entre múltiples ratones familiares diferentes. Con los paradigmas establecidos de reconocimiento social sesgados hacia estudio relaciones a corto plazo, identificamos una clara brecha en nuestro conocimiento sobre los mecanismos neuronales que subyacen al reconocimiento social de relaciones a largo plazo.   

Para abordar esta limitación, desarrollamos el paradigma de las cuatro tazas: un ensayo sencillo y flexible diseñado para diferenciar reconocimiento de múltiples niveles de familiaridad social dentro de una sola sesión de prueba. En este paradigma, un ratón sujeto explora cuatro esquinas de una arena abierta, cada conteniendo a perforado copa sosteniendo a conspecífico o un vaso vacío de control. Los vasos contienen un congénere con el que se tiene una convivencia prolongada (compañero de jaula), un familiar a corto plazo conspecífico con exposición previa limitada (10 min), un novedoso ratón, y un vacío control. El tiempo de investigación sirve como un índice cuantitativo del reconocimiento social y de la preferencia social. Esta configuración permite comparaciones simultáneas entre diferentes niveles de familiaridad, al tiempo que minimiza la interacción física directa y los posibles encuentros agresivos. 

Protocolo

Todos los procedimientos que involucren animales deben realizarse de acuerdo con las directrices institucionales y ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida (IACUC).  

1. Preparación y alojamiento de los animales  

1. Utilice adultos del mismo sexo ratones alojados en grupo para todos los experimentos.  Manipule los ratones durante al menos 2 días para habituarlos al manejo y reducir la ansiedad antes de las pruebas experimentales.
2. Mantenga a los ratones en jaulas de laboratorio estándar bajo un ciclo luz-oscuridad invertido con acceso ad libitum a alimento y agua 
   NOTA: Se utilizaron ratones adultos CD-1 y C57BL/6 (de 3 a 4 meses de edad) para los experimentos representativos. Los ratones se mantuvieron en grupos de 3 a 4 animales por jaula. Los conjuntos de datos representativos incluyeron 10 ratones macho CD-1, 12 ratones hembra CD-1 y 31 ratones macho C57BL/6. El comportamiento debe evaluarse durante la fase activa del animal (fase oscura). Los ratones incluidos en este estudio fueron evaluados entre las 9:00 y las 18:00 horas y se mantuvieron en un ciclo luz-oscuridad invertido (fase oscura de 8:00 a 20:00 horas).
3. Defina un agente familiar a largo plazo como un compañero de jaula de la misma cepa y del mismo sexo que ha convivido con el ratón objeto en la misma jaula durante un mínimo de 3 a 4 semanas antes de la prueba. 
4. Seleccionar congéneres familiares y novedosos a corto plazo agentes de la misma cepa y sexo que el ratón objeto del estudio. 
5. Asegúrese de que los ratones novedosos no hayan tenido exposición física u olfativa previa al ratón objeto. 
6. Seleccione un agente novedoso y un agente familiar de corta duración de jaulas hogar diferentes para evitar señales olfativas similares en estos dos agentes.
   NOTA: Registre edades aproximadas de todos los animales utilizados y minimice la reutilización del mismo agente novedoso y de corta duración varias veces al día. Si los agentes van a reutilizarse, proporcione >2 h de descanso en la jaula de origen entre ensayos para evitar agentes estresados.

2. Configuración de la arena 

1. Coloque un limpio, arena cuadrada de campo abierto (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm; Tabla de materiales) en una sala de pruebas conductuales silenciosa.
2. Ilumine el área utilizando una lámpara alta o suspendida ajustada a aproximadamente 8–20 lux.  
3. Coloque cuatro tazas de plástico perforadas con el mismo peso en cada esquina de la arena (Figura 1A).
   1. Utilice tazas visualmente idénticas siempre que sea posible. Si se usan tazas de diferentes colores, equilibre los asignamientos y ubicaciones de las tazas entre los ensayos.
   2. Presione dos lados de cada vaso enjuagar contra las paredes de la arena para restringir el acceso, minimizando el comportamiento de ocultamiento y estandarizando los ángulos de exploración. 
   3. Utilice vasos suficientemente pesados para evitar escapes y suficientemente altos para impedir trepar.
      NOTA: En este estudio, la ubicación de los vasos representativos y del agente se pseudorandomizó entre los sujetos rotando los vasos de plástico de colores en sentido horario, mientras que el tipo de agente se desplazaba en sentido antihorario a lo largo de los ensayos.
4. Coloque la cámara suficientemente alto como para que el ensayo completo la caja está en el encuadre para evitar puntos ciegos durante la codificación del comportamiento. Mantenga el deslumbramiento mínimo e iluminación uniforme en toda la superficie del piso de la caja (Figura 1A).
5. Limpie minuciosamente el suelo del recinto y los vasos entre cada ensayo utilizando un desinfectante adecuado, seguido de agua para eliminar olores residuales. 
6. Deje que la arena se seque completamente antes de reintroducirla animales 

3. Habituation al recinto el día 0

1. Coloque al sujeto y a sus compañeros de jaula en la arena que contiene cuatro tazas perforadas vacías y permita la exploración libre durante 20 min.
   NOTA: Habitúe a los sujetos individualmente para experimentos con sujeción. Pueden requerirse sesiones adicionales de habituación. Se recomienda realizar varias jornadas de habituación si los ratones no exploran completamente toda la arena tras un día.
2. Retire todos los ratones de la arena y devuélvalos a su jaula de origen.
3. Coloque a todos los agentes sociales bajo las tazas durante 10 min para habituarlos a estar restringidos. Habitúe simultáneamente a los agentes de la misma jaula de origen, uno por taza (Figura 1B).
4. Limpie la arena y las tazas antes de introducir ratones de una nueva jaula de origen.
   NOTA: Permita que los ratones descanse al menos 15 min tras su traslado a la habitación antes de comenzar la sesión.

4. Línea base 

1. Preparar el área según la sección 2. Mantenga la misma configuración del área experimental durante todos los días del experimento. 
2. Coloque al sujeto en la arena conteniendo cuatro tazas vacías y permita exploración libre durante 10 min.
   NOTA: No detenga la grabación en ningún momento, permitiendo que registre continuamente durante todas las etapas del actual ensayo  

5. Adquisición a corto plazo 

1. Utilice una copa perforada con peso para confinar al sujeto mientras coloca el designado "familiar a corto plazo" agente. Alternativamente, exponga al sujeto al agente de corta duración en una jaula limpia.
2. Si se decide realizar la exposición en la arena, confinar a un compañero de corta duración designado agente bajo una taza perforada en la arena, dejando las otras tres tazas vacío. 
3. Liberación el sujeto y permitir exploración libre durante 10 min (Figura 1B).
   NOTA: Si se utiliza el método de exposición a un agente de corta duración en una arena, alterne la esquina utilizada para el agente familiar de corta duración entre los sujetos para evitar sesgos espaciales. 

6. Intervalo entre ensayos (ITI) 

1. Recupere el familiar a corto plazo agente y colóquelo de nuevo en su jaula de origen. Deje que el ratón sujeto permanezca solo en la arena y mover libremente durante 10 min. 
2. Recolectar novedoso y familiar a largo plazo ratones agentes para la prueba fase.  
   NOTA: Devuelva el agente familiar de corto plazo al mismo vaso utilizado durante la adquisición de corto plazo (sección 5). Se recomienda esto para evitar la novedad en la ubicación espacial si se realiza la adquisición de corto plazo en una arena.

7. Fase de reconocimiento social 

1. Coloque una taza perforada con peso adicional sobre el ratón de estudio.
2. Coloque un ratón debajo de cada uno de los tres vasos perforados con peso: un compañero de jaula de larga duración, un familiar de corta duración y un congénere novedoso. Deje una cuarta taza designada vacía como control.  
   NOTA: Etiquete las tapas de los vasos para identificar las ubicaciones de los agentes durante la evaluación del comportamiento.
3. Retire la copa perforada del ratón de estudio en el centro de la arena y permita una exploración libre durante 10 min (Figura 1A).
4. Retire todos los ratones al final del 10 min intervalo y detenga la grabación.
5. Devolver todos los ratones a sus jaulas de origen. 
6. Limpie minuciosamente la arena y los vasos antes del siguiente ensayo.  
   NOTA: Mantenga tazas de repuesto disponibles en caso de daño.

8. Puntuación del comportamiento

1. Importe todos los videos grabados a un software de análisis conductual capaz de anotación manual, como el Software Interactivo para la Observación Conductual en Investigación (BORIS).
   NOTA: La puntuación conductual no estuvo cegada respecto a la ubicación del compañero de jaula, ya que las etiquetas con el ID del agente estaban ubicadas encima de cada vaso y eran visibles en los videos, y el número de jaula podía inferirse. Los evaluadores no prestaron activamente atención a las etiquetas visibles y estuvieron cegados respecto a la identidad del agente novedoso y del agente a corto plazo. Todos los evaluadores siguieron definiciones operativas preestablecidas del comportamiento investigativo y criterios estandarizados de puntuación.
2. Defina la matriz conductual antes de comenzar la puntuación.
3. Defina un episodio de investigación como la posición del hocico del ratón sujeto dentro de 1 cm de un vaso mientras exhibe una postura investigativa sostenida. 
   NOTA: Incluya morder y roer dirigidos hacia el vaso como episodios de investigación.
4. Anote manualmente la duración total de la investigación para cada vaso durante la fase de 10 minutos del test de reconocimiento social.  Puntúe la línea base y la adquisición según se desee.
   NOTA: Puede utilizarse un seguimiento automatizado de postura con una región semicircular de interés de 1 cm alrededor de cada vaso.
5. Exporte los datos anotados para análisis estadístico posterior.

Resultados

Siguiendo el protocolo del paradigma de los cuatro vasos, los ratones machos CD-1 exhibieron un comportamiento diferencial de investigación social frente a los congéneres de convivencia prolongada (compañeros de jaula), de convivencia reciente y novedosos (Figura 2). Para cada agente, se calculó un índice de discriminación (ID) basado en los segundos dedicados a investigar a ese agente frente al vaso vacío, según la fórmula (agente − vacío)/(agente + vacío) durante la fase de reconocimiento ...

Discusión

Existen consideraciones clave para aplicar el paradigma de los cuatro vasos con el fin de medir de manera efectiva y confiable estas dinámicas sociales en otros entornos de laboratorio. La habituación el día 0 reduce la exploración del recinto y los vasos motivada por la novedad no social, la cual podría enmascarar la investigación social durante la prueba^7,8,9. También es esencial un control preciso de la duración de la familia...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Software de puntuación conductual	Software interactivo para observación conductual en investigación	Version 9.12.7	Software para anotación manual de eventos
Arena de campo abierto	Rafferty Machine and Tool	Hecho a medida	Lámina estructural de fibra de vidrio FRP, arena cuadrada (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm); paredes no transparentes, si la arena es transparente, cubrir las paredes externas con papel para minimizar distracciones para el animal
Cámara superior	Logitech	Logitech C920x HD Pro PC Webcam	Cámara capaz de grabación continua de video; montada encima del centro de la arena
Vasos perforados	Chinco Store	ONG-Chinco-0279	dimensiones de los vasos: 4,01"L x 4,01"W x 4,52"H; vasos perforados de plástico o metal, pueden ser cuadrados o cilíndricos
Prism	Graph Pad	Version 10.6.0	Software para análisis de datos; podría realizarse con otro software