Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Flujo de trabajo optimizado de visualización de superficies de levadura para la evolución dirigida de proteasas

329 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/72559

⸱

4 de agosto de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para la evolución dirigida de proteasas virales en Saccharomyces cerevisiae utilizando un sistema de selección basado en la visualización de superficies. Describe el diseño de bibliotecas de inserciones de ADN y casetes de sustrato, electroporación optimizada para una alta eficiencia en la transformación, selección basada en la clasificación celular activada por fluorescencia para la escisión de proteasas y secuenciación de variantes enriquecidas.

Resumen

La evolución dirigida imita el proceso evolutivo natural en un entorno de laboratorio rápido y controlado para evolucionar proteínas con funciones o rasgos deseables. El cribado de un gran conjunto de genes mutantes codificadores de proteínas permite la selección funcional de variantes deseadas para aplicaciones en biotecnología, medicina y biología sintética. Utilizando este protocolo, realizamos evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae para diseñar variantes de proteasas con alta especificidad para una secuencia de sustrato no nativa. Mostramos estas variantes de proteasa en la superficie celular de la levadura para facilitar la selección de variantes deseadas mediante la selección celular activada por fluorescencia (FACS) a lo largo de múltiples rondas de enriquecimiento. Cuatro elementos clave del casete de sustrato se coexpresan con la biblioteca de proteasas: una proteína de fusión compuesta por (i) la subunidad del receptor de adhesión de levadura Aga2, (ii) secuencias de selección y (iii) de contraselección, (iv) secuencias de etiquetas de epítopos y una secuencia opcional de señal de recuperación del retículo endoplásmico (RE). Las células de levadura en las que solo se corta la secuencia del sustrato de selección se aíslan usando FACS multicolor mediante anticuerpos antiepítopos fluorescentes (marcados con isotiocianato con ficoeritrina/fluoresceína). Aquí proporcionamos detalles del protocolo optimizado paso a paso para llevar a cabo una campaña de evolución de proteasas, incluyendo el diseño de biblioteca de inserciones de ADN y diseño de casetes de sustrato, electroporación de células de levadura con alta eficiencia de transformación (hasta 109 transformantes por microgramo de ADN), selección, enriquecimiento y secuenciación basados en FACS de variantes evolucionadas. Demostramos nuestro protocolo de evolución dirigida evolucionando la proteasa de inclusión nuclear A (TEVp) del virus del grabado del tabaco desde la cisión de su secuencia natural del sustrato, ENLYFQ↓S, hasta la cisión de una nueva secuencia, ENLYFE↓S.

Introducción

Las proteasas cisteínas de la familia Potyviridae, específicamente las proteasas de inclusión nuclear A (NIa), representan una fuente en gran medida inexplorada de endopeptidasas específicas de secuencia. Con más de 3.800 miembros de la familia característica, las proteasas NIa clivan una secuencia de sustrato distinta de siete aminoácidos. La familia potyviral ofrece un conjunto diverso de proteasas para la ingeniería de sistemas programables de control proteico, la construcción de circuitos genéticos ortogonales basados en proteasas y el desarrollo de herramientas biotecnológicas específicas parasecuencias 1,2. A pesar de esta diversidad natural, solo dos proteasas NIa, TEVp y la proteasa del virus moteado de venas de tabaco (TVMVp), han sido completamente caracterizadas e ingenierizadas para un uso amplio en laboratorioy biotecnológico 3,4. Este conjunto limitado de proteasas limita el espacio de diseño para circuitos multicomponentes que requieren actividades ortogonales deproteasas 5, lo que motiva los esfuerzos para expandir y caracterizar aún más las proteasas NIa mediante evolucióndirigida 6,7.

La visualización superficial de levaduras se ha convertido en una de las plataformas más potentes para la evolución dirigida, permitiendo un cribado de alta capacidad en bibliotecas de proteínas mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)6,7. Por ejemplo, el sistema de cribado de secuestro del retículo endoplásmico de levaduras (YESS) acopla la actividad de la proteasa a la exhibición superficial a través de la vía secretora de S. cerevisiae 6,7. El sistema YESS se ha aplicado para diseñar novedosas especificidades proteasa y sustrato y ha demostrado utilidad para campañas de evolución dirigida de múltiples rondas. En este sistema, las variantes de la proteasa se coexpresan con una proteína de fusión que contiene un casete de sustrato de escisión con marcadores de epítopo, y el ancla superficial Aga1p se expresa en la cepa de levadura EBY100. El marcaje diferencial con anticuerpos fluorescentes distingue a los casetes de sustrato no escididos de los que se muestran en la superficie celular. Este mecanismo de visualización dependiente de la actividad es directamente compatible con la selección iterativa basada en FACS para bibliotecas de 10,7 o másvariantes 6,7.

Un requisito fundamental para la evolución dirigida es la capacidad de introducir bibliotecas variantes a una escala suficiente para lograr una cobertura adecuada del espacio de secuencias objetivo. Para bibliotecas de mutagénesis con saturación de sitios que abarcan múltiples posiciones de aminoácidos, se necesitan rendimientos de transformación de 108 a10 9 transformantes únicos para asegurar que la diversidad introducida en la biblioteca esté bien representada en la población ordenada. Existen varios métodos para introducir ADN exógeno en S. cerevisiae, cada uno con techos de rendimiento distintos. El método convencional de transformación química utiliza acetato de litio/ADN portador monocatenario/polietilenglicol (LiAc/ssDNA/PEG) debido a su simplicidad y accesibilidad. Sin embargo, normalmente logra eficiencias de transformación de solo 10unidades de formación de colonias (UFC) de 4–10 6 por microgramo de ADN, quedando por debajo de la variación de secuencia necesaria para campañas debibliotecas grandes 8. En cambio, el método de electroporación aplica un campo eléctrico de alto voltaje para permeabilizar transitoriamente la membrana celular y facilitar la absorción del ADN. La electroporación logra consistentemente las mayores eficiencias de transformación entre los métodos disponibles, con protocolos optimizados que reportan rendimientos de 108–109 UFC 9. Se ha observado que la eficiencia de electroporación en S. cerevisiae es críticamente sensible a la fase de crecimiento celular, la masa de ADN y la composición del tampón, proporcionando un marco que desde entonces ha sido ampliamente adaptado para la evolución dirigidaa escala de biblioteca 9.

El protocolo descrito aquí utiliza la cepa S. cerevisiae EBY100, una cepa de hospedador ampliamente adoptada para la visualización superficial de levaduras. EBY100 fue diseñado por Boder y Wittrup integrando un casete de expresión AGA1 bajo el control del promotor GAL1 inducible por galactosa en el locus cromosómico AGA1 de la cepa progenitora deficiente en proteasa BJ546510. La cepa está disponible comercialmente en el ATCC (número de catálogo MYA-4941; depositante K.D. Wittrup), portando el genotipo MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). Como resultado, tanto Aga1p como la fusión de casete de Aga2p con sustrato se expresan desde el mismo promotor inducible por galactosa, asegurando que ambas subunidades se coinducan y se ensamblen en el complejo Aga1p–Aga2p ligado a disulfuros que ancla la fusión mostrada a la pared celular.

A pesar del uso generalizado de EBY100 en aplicaciones de visualización de levaduras, no se ha optimizado sistemáticamente ningún protocolo para electroporar esta cepa a rendimientos a escala de biblioteca. Los parámetros específicos de EBY100, como la fase óptima de crecimiento en la cosecha, la composición del medio durante la subcultura y la relación cuantitativa entre la densidad óptica inicial a 600 nm (OD600) y la eficiencia de transformación, siguen por caracterizarse y optimizarse rigurosamente. Aquí, informamos que la eficiencia de transformación en EBY100 aumenta de forma monótona con el OD600 del cultivo en la cosecha, con células en fase de log tardía que producen tasas de transformación sustancialmente mayores que las cosechadas en la fase inicial de log. Evaluamos parámetros críticos del protocolo, incluyendo valores iniciales deOD 600 en la inoculación, el uso de medio de 2 × de extracto de levadura con peptona dextrosa (YPD) para subcultivos, formulaciones de tampón de electroporación y condiciones de crecimiento posterior a la electroporación. El protocolo presentado aquí proporciona un flujo de trabajo optimizado paso a paso (Figura 1A–C, Figura 2, Figura 3A–D, Figura 4A–E) para preparar celdas EBY100 electrocompetentes y realizar electroporación de biblioteca de ADN de alta eficiencia, produciendo tasas de transformación consistentemente superiores a 10,9 CFU. Para validar este protocolo, llevamos a cabo una campaña integral de evolución dirigida para diseñar TEVp con especificidad alterada de la clivación a lo largo de cuatro rondas de selección y enriquecimiento basadas en FACS. La secuenciación de variantes enriquecidas de proteasas confirmó una diversificación sustancial en residuos objetivo dentro del bolsillo de unión al sustrato de la proteasa, demostrando que el protocolo proporciona una cobertura suficiente de biblioteca del espacio de secuencias para apoyar campañas evolutivas productivas. Este protocolo será de amplia utilidad para investigadores que utilicen EBY100 para evolución dirigida basada en la visualización de superficies de levaduras y cribado de alto rendimiento compatible con FACS de proteasas,anticuerpos 9, quinasas11 y receptores12, entre otras proteínas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los experimentos que involucraron S. cerevisiae recombinante se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas y procedimientos del Comité Institucional de Bioseguridad y Seguridad Química de la Universidad de Texas en Dallas. Las cepas de levadura recombinante se manejaron bajo contención de Nivel de Bioseguridad 1 (BSL-1) de acuerdo con las prácticas microbiológicas institucionales establecidas. Se realizaron electroporaciones, cultivos y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de acuerdo con los procedimientos institucionales aprobados de bioseguridad. Los cultivos de levadura y los consumibles contaminados fueron descontaminados y eliminados como residuos biopeligrosos conforme a las directrices institucionales.

1. Preparación de vectores e insertos

  1. Generación de bibliotecas de proteasas potivirales mediante mutagénesis por saturación de sitios
    1. Diseño utilizando software de diseño de secuencias que solapa oligonucleótidos directos y inversos de 30 a 50 mer, para generar una biblioteca mutante de proteasas. Sustituye el codón de tipo salvaje en el oligonucleótido correspondiente por un codón degenerado NNS, donde N representa A, T, G o C, y S representa G o C, para posiciones dirigidas a la mutagénesis.
    2. Diseña la superposición de 3′ entre cada par de oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás con una temperatura de fusión (Tm) de 55–60 °C. Diseñar el primer y último oligonucleótidos para que contengan una superposición de 50 nts con el vector de visualización superficial de la levadura más allá de los sitios de restricción.
    3. Asegúrese de que al menos un extremo del inserto se solape exactamente con uno de los extremos del vector linealizado para facilitar la recombinaciónhomóloga 13. Evitar los huecos entre oligonucleótidosadyacentes 14.
    4. Resuspende los oligos a 100 μM con H2Odesionizado. En un tubo estéril de 1,5 mL, combinar 0,5 μL de cada oligo para obtener un volumen final de 200 μL (concentración final de 250 nM por cada oligo).
    5. Establece una reacción de PCR con los componentes listados en la Tabla 1 para ensamblar la biblioteca de proteasas, usando las condiciones de termociclo de la Tabla 2.
    6. Establecer una segunda reacción PCR usando los oligos más externos hacia adelante y hacia atrás (Tabla 3) usando el primer producto PCR ensamblado como plantilla. Amplifica el producto como se muestra en la Tabla 4.
    7. Ejecuta el segundo producto de PCR sobre un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio (0,5 μg/mL) a 240 V durante 30 minutos. Elimina la banda correspondiente a la longitud esperada del ADN.
      NOTA: PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno y debe manipularse con el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Evita el contacto con la piel e inhalación. Eliminar geles, buffers y consumibles que contienen bromuro de etidio como residuos químicos peligrosos conforme a las directrices de seguridad institucionales.
    8. Purifica usando un kit de extracción en gel. Elute en 50 μL de H2Odesionizado.
    9. Mide la concentración de ADN usando un espectrofotómetro. Almacena el ADN a −20 °C.
      NOTA: Cada reacción de 50 μL de lasegunda PCR produciría aproximadamente entre 0,5 y 1,0 μg de ADN total. Dado que cada electroporación requiere 12 μg de la biblioteca de proteasas (es decir, insertar), las reacciones se escalan en consecuencia.
  2. Conjunto de casete de sustrato
    1. Prepara placas de LB-agar y medios líquidos de LB-cloranfenicol. Consulta las recetas en la Tabla 5.
    2. Diseñar un conjunto de oligonucleótidos de 30 merériles superpuestos en dirección adelante y reversa para el ensamblaje de casetes de sustrato. Diseña los extremos 5′ de cada oligonucleótido inverso y el oligonucleótido frontal del siguiente fragmento para que coincidan con 4 nucleótidos.
    3. Resuspende oligos liofilizados a 100 μM usando H2Odesionizado.
    4. Mezcla los reactivos como en la Tabla 6.
    5. Utiliza el programa de ciclos de la Tabla 7 para recocer y fosforilar la mezcla de oligo.
    6. Diluir oligos recocidos 4 veces enH2Odesionizado para alcanzar una concentración final de 1,25 μM.
    7. Combina la mezcla de oligo recocido con el vector (por ejemplo, pDD1523), siguiendo la Tabla 8.
    8. Realiza el montaje Golden Gate, siguiendo el programa de ciclismo de la Tabla 9.
      NOTA: Por ejemplo, el plásmido pDD1523 tiene un sitio de restricción tipo II (BsmBI) aguas abajo del promotor GAL1/10. El montaje exitoso permite la inducción de galactosa del casetede sustrato 7.
    9. Transforma el plásmido resultante en E. coli.
    10. Células de placa en agar LB con el antibiótico correspondiente. Incubar durante 16–18 horas a 37 °C.
    11. Elige colonias aisladas e inocúlalas en 5 mL de medio LB. Incubar durante la noche (16–18 h) a 37 °C con agitación (220 rpm).
    12. Extrae plásmidos de cultivos nocturnos usando un kit de minipreparación para plásmidos.
    13. Mide la concentración de plásmidos usando un espectrofotómetro y luego envía la secuenciación.
  3. Linealización del vector de visualización de levaduras
    1. Linealiza el plásmido de visualización de levadura, por ejemplo, digiera pDD1524 con enzimas de restricción SphI y PstI para preparar el vector de visualización de levaduras que contiene el casete sustrato para electroporación. Mezcla los reactivos listados en la Tabla 10 e incuba a 37 °C durante 1 hora.
    2. Aplica el producto de digestión por restricción sobre un gel de agarosa al 1% a 240 V durante 30 minutos. Extirpa la banda correspondiente a la longitud esperada de ADN y purifica usando un kit de extracción en gel.
      NOTA: Cada 50 μL de digestión de restricción produciría aproximadamente entre 0,5 y 1,0 μg de ADN total. Dado que cada electroporación requiere 4 μg de vector linealizado, se escalan las reacciones digestivas en consecuencia.

2. Electroporación

Nota: Seguir los procedimientos de seguridad institucionales para el manejo de materiales y reactivos biológicos, usar el EPI adecuado y eliminar los residuos biológicos y químicos conforme a las directrices institucionales.

  1. Preparación de buffers, placas y medios (2 días antes de la electroporación)
    1. Preparar medios de cultivo (1 × YPD; 2 × YPD; Ácidos de Casamino de dextrosa sintética, SDCAA+; y Ácidos Cásaminos de Galactosa Sintética, SGCAA+), placas (YPD y SDCAA), amortiguador de electroporación y agua estéril siguiendo las recetas de la Tabla 5. Guárdalos a 4 °C.
  2. Preparación de una placa estriada de EBY100.
    1. Extraer levadura EBY100 sobre agar de YPD desde una reserva de glicerol. Cultiva a 30 °C durante 2 días.
    2. Guarda la placa a 4 °C después del crecimiento.
      NOTA: Una placa con rayas permanece utilizable hasta un mes; Marca la fecha de la racha en la placa.
  3. Preparación del precultivo de EBY100 (1 día antes de la electroporación)
    1. Prepara 125 mL de 1 × YPD en un matraz Erlenmeyer de 500 mL.
    2. Prepare 25 mL de 1 × YPD en un tubo cónico de 50 mL. Usando una punta de micropipeta, recoge las células EBY100 de la placa cultivada durante 2 días. Luego, transfiere las células de levadura desde la punta de la pipeta al tubo cónico que contiene 1 × YPD.
      NOTA: La franja de células debe formar una mancha de aproximadamente 1–2 mm de longitud.
    3. Quita la punta de la micropipeta y haz un vórtice en el tubo cónico para asegurar una mezcla adecuada.
    4. Prepara un precultivo de 150 mL transfiriendo 25 mL de 1 × YPD que contiene las células de levadura al matraz de 500 mL que contiene 125 mL de 1 × YPD. Haz un remolino para mezclar.
    5. Usando un espectrofotómetro, mide el OD600 preparando dos microcuvetas con un recorrido de 1 cm: una con 1 mL de 1 × YPD como control en blanco y otra con 1 mL de precultivo
    6. Cultivar 150 mL de pre-cultivo durante la noche (16–20 h) a 30 °C con vibración orbital a 270 rpm.
  4. Preparación de la subcultura en el ODinicial deseado 600 (el día de la electroporación)
    1. Prepare el tampón de acondicionamiento y el medio de crecimiento, como se describe en la Tabla 5.
    2. Mide el OD600 del precultivo nocturno (el OD₆₀₀ esperado es 17–22). Para estar dentro del rango lineal del espectrofotómetro, medir una dilución 1:20 del pre-cultivo.
    3. Calcula el volumen de precultivo necesario para inocular una subcultura de 100 mL. Se recomienda una subcultura inicial OD600 de 3,0–4,0.
    4. Diluir el cultivo hasta el OD inicialdeseado de 600 en 100 mL de 2 × YPD en un matraz Erlenmeyer de 500 mL.
    5. Incubar la subcultura de 100 mL a 30 °C con agitación orbital a 270 rpm durante 4 horas.
  5. Preparación de medios durante la incubación de 4 horas
    1. Mantén a mano el amortiguador de electroporación helado y el agua estéril (desde el paso 2.1.1).
    2. Preparar el tampón de acondicionamiento (100 mL), siguiendo la receta de la Tabla 5. Utiliza 20 mL de buffer de acondicionamiento por transformación; Escala en consecuencia. Conservar a temperatura ambiente (20–23 °C).
      NOTA: PRECAUCIÓN: El tampón acondicionador contiene ditiotreitol (DTT) y acetato de litio (LiAc), que son irritantes químicos que pueden causar irritación en la piel y los ojos. Llevar el EPI adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad, y manejar estos reactivos conforme a los procedimientos de seguridad química institucional. Eliminar las soluciones no utilizadas y los amortiguadores gastados como residuos químicos conforme a las directrices institucionales.
    3. Preparar el medio de crecimiento (50 mL): Mezclar 25 mL de 2 × YPD y 25 mL de 1 M sorbitol. Usa 8 mL de medio de crecimiento por transformación. Conservar a temperatura ambiente (20–23 °C).
  6. Preparación de células de levadura electrocompetentes tras incubación de 4 horas.
    1. Divide la subcultura de 100 mL en dos tubos cónicos de 50 mL. Recoge las pilas por centrifugación a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos, luego decanta el medio. Mantén las celdas en hielo hasta que se complete el paso 2.6.4.
    2. Resuspende suavemente cada pellet celular con 25 mL de agua estéril helada. Centrifugar a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos, luego decantar el medio.
    3. Repite el paso 2.6.2.
    4. Resuspende suavemente cada pellet celular con 25 mL de tampón de electroporación helado. Centrifugar a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos, luego decantar el medio.
    5. Retira las células del hielo y vuelve a suspender suavemente cada pellet celular con 10 mL de buffer de acondicionamiento a temperatura ambiente (20–23 °C). Luego, se agrupa en un solo matraz Erlenmeyer de 125 mL e incuba a 30 °C con agitación orbital a 270 rpm durante 30 minutos.
    6. Vierte las celdas en un tubo de 50 mL. Centrifugar a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos. Descarta los medios.
    7. Resuspende suavemente el pellet celular con 50 mL de tampón de electroporación helado. Centrifugar a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos, luego decantar el medio.
    8. Resuspende el perdigón de celda a un volumen final de 1 mL añadiendo aproximadamente 100–200 μL de tampón de electroporación. Mantén las células en hielo hasta la electroporación.
      NOTA: Las pilas electrocompetentes pueden congelarse (es decir, colocarse en un congelador a –80 °C) y usarse posteriormente sin una pérdida significativa de eficiencia de electroporación.
  7. Electroporación, crecimiento y chapado
    1. Cubeta(s) de electroporación pre-enfriada con un espacio de 0,2 cm sobre hielo.
    2. Transfiere 380 μL del pellet resuspendido a un tubo estéril de 1,5 mL. Mezclar con 4 μg de ADN plásmido o con 4 μg de vector plásmido lineal y 12 μg de inserto. Mezcla suavemente pipeteando.
      NOTA: Para maximizar el número de células electroporadas, las concentraciones de ADN vector e insertado deberían ser idealmente de 700–800 ng/μL. Si las concentraciones son menores, usa un concentrador de vacío.
    3. Transfiere la suspensión a la(s) cubeta(s) de electroporación preenfriada(s). Mantente en hielo durante 5 minutos.
    4. Limpia los laterales de la cuveta después de 5 minutos con una toallita de laboratorio sin pelusa para eliminar la humedad residual, que puede provocar arcos eléctricos durante la electroporación. Evita cualquier burbuja o celda por encima de las placas metálicas de la cubeta, ya que también pueden provocar arcos eléctricos. Para mantener la temperatura fría de la cubeta, no toques los electrodos de la placa.
    5. Prepara 8 mL de medio de crecimiento en un tubo cónico de 50 mL.
    6. Electroporar las pilas con los siguientes ajustes: un voltaje de 2,5 kV, una capacitancia de 25 μF y una resistencia de 200 Ω9. El rango de constantes de tiempo aceptable es de 2,8–4,5 ms.
      NOTA: PRECAUCIÓN: La electroporación implica pulsos eléctricos de alto voltaje. Asegúrate de que las cubetas estén bien colocadas y sigue las instrucciones de funcionamiento del fabricante. Eliminar las cubetas de electroporación usadas como residuos biopeligrosos según las directrices institucionales.
    7. Inundar inmediatamente la cubeta, aproximadamente 200 μL de medio de crecimiento del tubo cónico y transferir las células electroporadas al tubo cónico de 50 mL. Añade otros 200–350 μL de medio de crecimiento hasta que no quede líquido visible en la cubeta.
    8. Incubar el tubo cónico de 50 mL de células electroporadas en 8 mL de medio de crecimiento a 30 °C sin agitar durante 1 hora. Invierte el tubo cada 15 minutos para mezclar.
    9. Recoge las pilas por centrifugación a 1.500 × g, 25 °C durante 3 minutos. Luego decantar los medios.
    10. Resuspender las células en medios adecuados de caída de levadura para mantener la selección de las células transformadas. Para plásmidos que contienen el marcador de selección TRP1, se resuspenden las células en 250 mL de SDCAA+ (que carece de triptófano) para recuperar selectivamente levaduras que retuvieron el plásmido.
    11. Incubar durante la noche (16–20 h) a 30 °C con agitación orbital a 270 rpm.

3. Inducción, tinción y clasificación citométrica de flujo de células de levadura

  1. Inducción de la biblioteca de proteasas y el casete de sustrato (1 día antes de la clasificación)
    1. Medir OD600 como en el paso 2.4.2 tras el crecimiento nocturno de transformantes en medios dropout.
    2. Alicuota 12 mL de transformantes de levadura y centrifugadora a 3.200 × g durante 5 minutos.
    3. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en medio de inducción SGCAA+ a un ODde 600 de 0,5. Calcular el volumen de resuspensión requerido usando la ecuación de dilución, C1V1 = C2V2.
    4. Transfiere a un matraz Erlenmeyer de 125 mL y cultiva durante la noche durante 18–24 horas a 30 °C con vibración orbital a 270 rpm.
  2. Tinción por anticuerpos fluorescentes (el día de la clasificación)
    1. Mide el OD600 de células tras la inducción. Utiliza dos cubetas: una con 1 mL de SGCAA+ y otra con 950 μL de SGCAA+ mezclada con 50 μL de celdas. Multiplica el valor medidode OD 600 por 20 para obtener el verdadero OD600 de las celdas postinducción.
    2. Normaliza cada muestra a 3 × 107 células para la tinción por anticuerpos y la clasificación FACS. Utiliza C1V1 = C2V2 para calcular el volumen de celdas que se deben transferir desde el matraz de inducción.
      NOTA: Para la mutagénesis de saturación de NNS en cuatro sitios, el tamaño teórico de la biblioteca es de 106 variantes. Para muestrear suficientemente la biblioteca, revisa al menos 10 veces el tamaño de la biblioteca, o 10celdas de 7 . Ejemplo: si se desea C1V1 = 3 × 107 celdas y C2 = postinducciónED 600 de 6 (es decir, 6 × 107 celdas/mL), entonces alicuota 500 μL de celdas inducidas (es decir, V2 = 3 × 107 celdas / 6 × 107 celdas/mL = 500 μL).
    3. Transfiere el volumen calculado de las celdas a un tubo de 1,5 mL y centrifuga a 5.000 × g durante 5 minutos.
    4. Retirar el sobrenadante y volver a suspender en 500 μL de solución fisiológica salina tamponada con fosfato (PBS) + 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA).
    5. Centrifugar a 5.000 × g durante 5 minutos y repetir el paso 3.2.4.
    6. Centrifugar a 5.000 × g durante 5 minutos y, mientras tanto, completar el paso 3.2.7.
    7. Preparar una mezcla de tinción por anticuerpos en un tubo de 1,5 mL que contenga isotiocianato de fluoresceína anti-HA (FITC) (0,5 μg/107 células), anti-FLAG ficoeritrina (PE) (0,05 μg/10 7 células) y PBS + 0,5% de BSA (100 μL/107 células). Mantén el tubo en hielo.
    8. Quita el sobrenadante y vuelve a suspender con la mezcla de tinte. Usa 300 μL de la mezcla de tinte por cada 3 × 107 celdas. No pongas el tubo en vórtice; Solo invierte o lanza un flick.
    9. Mantén las celdas en hielo en la oscuridad durante 1 hora tras la resuspensión.
  3. Lavado posterior al tinte
    1. Teñir las células en centrifugadora a 5.000 × g durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en PBS que contenga 0,5% de BSA usando 0,5 mL por cada 1 × 107 celdas (por ejemplo, 500 μL para 1 × 107 celdas o 1,5 mL para 3 × 107 celdas).
    2. Centrifugar a 5.000 × g, 5 min. Retirar el sobrenadante, volver a suspender en 750 μL de PBS + 0,5% de BSA.
    3. Transfiere otros 750 μL de PBS + 0,5% de BSA a un tubo de recogida de 10 mL.
  4. FACS
    1. Realizar el arranque y preparación necesarios del citómetro para un nuevo experimento.
    2. Crea tres puntos de diagrama. En el primer diagrama de puntos, selecciona el nombre del eje X para mostrar el canal de área de dispersión directa (FSC-A) y el nombre del eje Y para mostrar el canal de área de dispersión lateral (SSC-A).
      NOTA: Esto facilitará la selección de células vivas.
    3. Mantén el nombre del eje X para mostrar el canal FSC-A mientras se cambia el canal del eje Y para mostrar la altura de dispersión directa (FSC-H) en el segundo gráfico de puntos.
      NOTA: Esto facilitará la selección de singles.
    4. Selecciona el nombre del eje X para mostrar el canal PE y el nombre del eje Y para mostrar el canal FITC en el tercer diagrama de puntos.
    5. Ejecuta control negativo en el citómetro usando los canales de 530/30 nm (FITC) y 585/42 nm (PE). Realizar la clasificación usando una boquilla de 70 μm a 70 psi de presión de vaina. Adquirir muestras a una velocidad de 4000–5000 eventos/s.
    6. Dibuja una compuerta de polígonos alrededor de la población principal de células de levadura intactas para excluir restos y pequeñas partículas con señales bajas de FSC-A y SSC-A en el primer gráfico de puntos (FSC-A frente a SSC-A).
    7. Singlets de puerta en un gráfico FSC-H frente a FSC-A dentro de esta puerta, seleccionando la población lineal que exhibe una relación proporcional entre FSC-H y FSC-A. Excluye los eventos que se desvían de la distribución lineal y corresponden a dobletes y agregados de celdas.
      NOTA: El tercer gráfico de puntos para PE frente a FITC mostrará un grupo diagonal de puntos para el control negativo (es decir, células de levadura que expresan el casete del sustrato intacto).
    8. Toma muestras y clasifica las células de levadura según los valores deseados de PE/FITC en un o varios tubos de recogida. Analizar un número total de celdas que corresponda al menos 10 veces al tamaño teórico de la biblioteca para asegurar una representación adecuada de todas las variantes (por ejemplo, analizar ~1 × 107 celdas para una biblioteca con diversidad teórica de ~1 × 106 variantes).
    9. Posiciona la puerta de clasificación por debajo de la diagonal PE/FITC de la población de control negativo.
      NOTA: Las compuertas más estrictas mejoran el enriquecimiento de las variantes deseadas pero reducen la recuperación celular.
  5. Después de FACS
    1. Tubo de recogida de centrifugadora a 3.200 × g durante 5 minutos. Retira cuidadosamente el sobrenadante, dejando 1 mL, y vuelve a suspender en 5 mL de PBS.
      NOTA: Deje 1 mL de sobrenadante, ya que el pellet celular en la parte inferior no será visible tras la centrifugación.
    2. Centrifugar de nuevo las celdas a 3.200 × g durante 5 minutos. Quita el sobrenadante, quedando 1 mL. Resuspende con 4 mL de SDCAA+.
    3. En un matraz Erlenmeyer de 250 mL, añade 15 mL de SDCAA+. Transfiere las celdas resuspendidas del paso 3.5.2 a este matraz.
    4. Incubar durante la noche durante 18–24 horas a 30 °C con vibración orbital a 270 rpm.
    5. Repite los pasos 3.1, 3.2, 3.3 y 3.4 en cada ronda de evolución dirigida.

4. Recuperación de plásmidos y secuenciación de clones individuales

  1. Cultivar colonias individuales
    1. Haz un fondo de glicerol mezclando 500 μL del cultivo líquido tras el paso 3.5.4 y 500 μL de glicerol estéril al 50%, lo que resulta en una solución de glucerol al 25%. Vórtice para mezclar bien las células.
    2. Guárdalos en el congelador a –80 °C durante la noche. Para almacenamiento a largo plazo, transfiere al nitrógeno líquido.
    3. Raspa el material de glicerol usando una punta estéril de 1000 μL y mézclalo con 100 μL de SDCAA+. Emplata esta mezcla sobre una placa SDCAA e incubala boca abajo a 30 °C.
    4. Recoge las colonias después de 3 días y hazlas crecer durante la noche en 1,5 mL de SDCAA+ en tubos de 14 mL.
  2. Realizar minipreparación de levaduras para extraer plásmidos
    1. Pelleta el cultivo durante la noche centrifugando a 16.000 × g durante 1 minuto y vuelve a suspender 200 μL de la Solución 1 de un kit de purificación de plásmidos de levadura.
    2. Añadir 5 μL de solución enzimática lítica (5 U/μL).
    3. Incuba en una incubadora a 37 °C durante 4 horas en una batidora de extremo a extremo.
    4. Realiza un ciclo de congelación y descongelación a -80 °C durante 20 minutos y descongelando a 42 °C durante 10 minutos en baño maría.
    5. Añade 200 μL de la Solución 2 de un kit de purificación de plásmidos de levadura, mezcla invirtiendo 2–3 veces y deja reposar 5 minutos.
    6. Añade 400 μL de la Solución 3 de un kit de purificación de plásmidos de levadura y mezcle invirtiendo 2–3 veces. Centrifugar a 16.000 × g durante 5 minutos.
    7. Purificar el ADN plasmídico usando un kit de purificación con una columna de alta capacidad de unión al ADN.
      NOTA: Debido a la gran cantidad de ADN genómico de levadura cortado que proviene de las células lisadas, es necesario utilizar una columna basada en sílice con mayor capacidad de unión al ADN (35 μg) en lugar de una columna de purificación de ADN plasmídico de levadura de menor capacidad (5 μg)15.
    8. Mide la concentración de ADN usando un espectrofotómetro. Los rendimientos de ADN son de 10–30 ng/μL.
  3. Transformar plásmidos purificados en células químicamente competentes de E. coli
    1. Prepara medios SOC, siguiendo la receta de la Tabla 5, y placas de LB-cloranfenicol. Además, precalienta un baño maría a 42 °C.
    2. Calienta una placa de LB-cloranfenicol para cada plásmido a 37 °C durante 20 minutos.
    3. Saca un tubo de células químicamente competentes del congelador a –80 °C y descongela sobre hielo.
    4. Alicuota de 30 μL de células competentes para cada plásmido en un tubo de 1,5 mL sobre hielo.
    5. Pipetear 3 μL de plásmido en células competentes. Haz un toque para mezclar y déjalo reposar 5 minutos sobre hielo.
    6. Realiza el choque térmico incubando brevemente las células en el baño maria a 42 °C durante 40 segundos.
    7. Incuba en hielo durante 2 minutos.
    8. Añade 300 μL de medio SOC a las células e incuba durante 15 minutos a 37 °C a 220 rpm.
    9. Placa 50–100 μL de celdas competentes transformadas sobre placas precalentadas.
    10. Incuba las placas a 37 °C boca abajo durante 18 horas.
  4. Recogida de colonias
    1. Añade 5 mL de medio líquido de LB-cloranfenicol a tubos de cultivo de fondo redondeado de 14 mL.
    2. Elige una colonia usando una punta estéril de 1000 μL y métela en un tubo de cultivo.
    3. Colocar los tubos en un agitador (220 rpm, ángulo de 30°–45° para maximizar la aireación) a 37 °C durante 18 horas.
  5. Extracción de plásmidos a partir de cultivo líquido bacteriano
    1. Centrifuga los cultivos líquidos a 3.200 × g durante 4 minutos. Decanta el sobrenadante.
    2. Extrae plásmidos de cultivos nocturnos usando un kit de purificación de plásmidos.
    3. Mide la concentración de plásmidos purificados usando un espectrofotómetro.
  6. Enviar plásmidos para secuenciación
    NOTA: Utiliza servicios como la secuenciación de nanoporos de plásmidos completos o, alternativamente, la secuenciación Sanger con un cebador flanqueando la región mutagenizada.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La construcción eficiente de bibliotecas es fundamental para asegurar una cobertura suficiente del espacio mutacional. Para evitar la pérdida de variantes funcionales raras, el número de transformantes debe alcanzar al menos el 10× al 100× el tamaño teórico de la biblioteca. Debido a que la eficiencia de transformación en S. cerevisiae está influida por la concentración celular y es mayor en las células de faselogarítmica temprana a media 16, optimizamos ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La evolución dirigida es un método de alto rendimiento que utiliza ciclos iterativos de diversificación y selección para identificar proteínas con función bioquímica mejoradao novedosa 17. En este protocolo, detallamos un flujo de trabajo optimizado para evolucionar el reconocimiento de proteasa y sustrato utilizando un sistema de visualización de superficie celular en S. cerevisiae. El sistema de visualización superficial mapea la actividad de la proteas...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia. Los datos en bruto que apoyan este protocolo, incluyendo archivos FASTQ de secuenciación de nanopore, archivos de citometría de flujo (FCS) y datos fuente usados para generar las figuras y tablas, así como los plásmidos pDD1523 y pDD1524, han sido depositados en Zenodo y están disponibles públicamente en 10.5281/zenodo.20746804

Agradecimientos

Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Dingal por sus consejos, experiencia y debates. También agradecemos al UTD Flow Cytometry Core su infraestructura y apoyo. El M.B.L. cuenta con el apoyo de la Beca de Posgrado Eugene McDermott de la UTD. Esta investigación fue financiada por un Fondo de Startups de la UTD y premios del National Institutes of Health-NIGMS al laboratorio de P.C.D.P.D. (R35GM150967).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos
10 mM dNTP MixNEBN0447SReacciones de PCR (Tablas 1, 3)
10X PBS, pH 7.4FisherBP3994Base de tampón de tinción (Pasos 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction BufferNEBB9027SSe vende por separado; también se incluye con la polimerasa Q5
Agar, BactoBD Difco281230-500gPlacas de agar SDCAA (Tabla 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagentsBP160-500Electroforesis en gel
Anti-FLAG PE AntibodyBioLegend637309Tinción FACS; anti-FLAG conjugado con PE
Anti-HA Tag Antibody [FITC]GenScriptA01621Tinción FACS; anti-HA conjugado con FITC
Bacto Casamino AcidsBD Difco223120Medios SDCAA+, SGCAA+, SCAA (Tabla 5); 5 g/L
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0Preparación de medios LB/SOB; 20 g/L en YPD (Tabla 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction VSigma-Aldrich126575-10GM0.5% en PBS; tampón de tinción (Pasos 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SEnsamblaje Golden Gate del casete de sustrato (Tabla 8)
Calcium chloride solution (1M)Sigma-Aldrich21115-100mLBúfer de electroporación: 1 mM final (Tabla 5)
ColiRollers® Plating BeadsSigma-Aldrich71013-3Esterilizar poniéndolas en frascos de reactivo y esterilizando en autoclave a 121ºC, 15 psi, durante 15 minutos.
D-GalactoseThermo FisherA12813.30250 g; stock 20% p/v para inducción SGCAA+ (Tabla 5)
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10Búfer de electroporación (1 M) y medios de crecimiento (Tabla 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrousSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, stock 20% p/v de dextrosa (Tabla 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsSigmaY0626-250G6.7 g/L en SDCAA/SGCAA (Tabla 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)BD242820-500gYPD pre-hecho como alternativa; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GBúfer de acondicionamiento: 10 mM final; alicuotas de 250 μL, almacenar a -20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification KitOmega Bio-tekD6492-02Limpieza del producto PCR
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmega Bio-tekD2500-01Purificación en gel post-PCR y digestión de restricción (Pasos 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Purificación de plásmidos (Paso 4.2)
Glycerol (≥99%)FisherBP229-4Stock 50% v/v para reservas en glicerol (Paso 4.1.1)
Kanamycin Sulfate FisherBP906-5SDCAA+ y SGCAA+: 50 μg/mL final; reemplaza Sigma K0879-5G
KLD Enzyme MixNEBM0554SKinaza-Ligasa-DpnI; mutagénesis dirigida por sitio
KLD Reaction BufferNEBB0554AUsado con KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGCultivo líquido de E. coli
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Búfer de acondicionamiento: 0.1 M final; añadir antes del DTT (Tabla 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)RPIL24020-2000.0Placado de E. coli; reemplaza Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino AcidsSigma2240-500GMFuente alternativa de casaminoácidos
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SLinealización del vector (Tabla 10); usar versión HF
Q5 HF DNA PolymeraseNEBM0492SPolimerasa de alta fidelidad; alternativa a Q5 Hot Start
Q5 High GC EnhancerNEBB9028APara reacciones de PCR con alto contenido en GC
Q5 Hot Start DNA PolymeraseNEBM0491LEnsamblaje y amplificación de PCR (Tablas 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)NEBB6004SSuministrado con PstI-HF y SphI-HF (Tabla 10)
SalI-HFNEBR3138LEnzima de restricción adicional
SOC MediumNEBB9020SRecuperación post-transformación
Sodium Chloride (NaCl)FisherS271-1Preparación de medios LB / SOB

Referencias

  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Bioingenier aN mero 234N mero 234Valor vac oN meroproteasamutag nesisPotyviridaeSaccharomyces cerevisiaeelectroporaci ncitometr a de flujo

Este artículo ha sido publicado

Video próximamente

Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.