Flujo de trabajo optimizado de visualización de superficies de levadura para la evolución dirigida de proteasas

Resumen

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para la evolución dirigida de proteasas virales en Saccharomyces cerevisiae utilizando un sistema de selección basado en la visualización de superficies. Describe el diseño de bibliotecas de inserciones de ADN y casetes de sustrato, electroporación optimizada para una alta eficiencia en la transformación, selección basada en la clasificación celular activada por fluorescencia para la escisión de proteasas y secuenciación de variantes enriquecidas.

Resumen

La evolución dirigida imita el proceso evolutivo natural en un entorno de laboratorio rápido y controlado para evolucionar proteínas con funciones o rasgos deseables. El cribado de un gran conjunto de genes mutantes codificadores de proteínas permite la selección funcional de variantes deseadas para aplicaciones en biotecnología, medicina y biología sintética. Utilizando este protocolo, realizamos evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae para diseñar variantes de proteasas con alta especificidad para una secuencia de sustrato no nativa. Mostramos estas variantes de proteasa en la superficie celular de la levadura para facilitar la selección de variantes deseadas mediante la selección celular activada por fluorescencia (FACS) a lo largo de múltiples rondas de enriquecimiento. Cuatro elementos clave del casete de sustrato se coexpresan con la biblioteca de proteasas: una proteína de fusión compuesta por (i) la subunidad del receptor de adhesión de levadura Aga2, (ii) secuencias de selección y (iii) de contraselección, (iv) secuencias de etiquetas de epítopos y una secuencia opcional de señal de recuperación del retículo endoplásmico (RE). Las células de levadura en las que solo se corta la secuencia del sustrato de selección se aíslan usando FACS multicolor mediante anticuerpos antiepítopos fluorescentes (marcados con isotiocianato con ficoeritrina/fluoresceína). Aquí proporcionamos detalles del protocolo optimizado paso a paso para llevar a cabo una campaña de evolución de proteasas, incluyendo el diseño de biblioteca de inserciones de ADN y diseño de casetes de sustrato, electroporación de células de levadura con alta eficiencia de transformación (hasta 10⁹ transformantes por microgramo de ADN), selección, enriquecimiento y secuenciación basados en FACS de variantes evolucionadas. Demostramos nuestro protocolo de evolución dirigida evolucionando la proteasa de inclusión nuclear A (TEVp) del virus del grabado del tabaco desde la cisión de su secuencia natural del sustrato, ENLYFQ↓S, hasta la cisión de una nueva secuencia, ENLYFE↓S.

Introducción

Las proteasas cisteínas de la familia Potyviridae, específicamente las proteasas de inclusión nuclear A (NIa), representan una fuente en gran medida inexplorada de endopeptidasas específicas de secuencia. Con más de 3.800 miembros de la familia característica, las proteasas NIa clivan una secuencia de sustrato distinta de siete aminoácidos. La familia potyviral ofrece un conjunto diverso de proteasas para la ingeniería de sistemas programables de control proteico, la construcción de circuitos genéticos ortogonales basados en proteasas y el desarrollo de herramientas biotecnológicas específicas para^{secuencias 1,2}. A pesar de esta diversidad natural, solo dos proteasas NIa, TEVp y la proteasa del virus moteado de venas de tabaco (TVMVp), han sido completamente caracterizadas e ingenierizadas para un uso amplio en laboratorio^{y biotecnológico 3,4}. Este conjunto limitado de proteasas limita el espacio de diseño para circuitos multicomponentes que requieren actividades ortogonales de^{proteasas 5}, lo que motiva los esfuerzos para expandir y caracterizar aún más las proteasas NIa mediante evolución^{dirigida 6,7}.

La visualización superficial de levaduras se ha convertido en una de las plataformas más potentes para la evolución dirigida, permitiendo un cribado de alta capacidad en bibliotecas de proteínas mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS^)6,7. Por ejemplo, el sistema de cribado de secuestro del retículo endoplásmico de levaduras (YESS) acopla la actividad de la proteasa a la exhibición superficial a través de la vía secretora de S. cerevisiae ^6,7. El sistema YESS se ha aplicado para diseñar novedosas especificidades proteasa y sustrato y ha demostrado utilidad para campañas de evolución dirigida de múltiples rondas. En este sistema, las variantes de la proteasa se coexpresan con una proteína de fusión que contiene un casete de sustrato de escisión con marcadores de epítopo, y el ancla superficial Aga1p se expresa en la cepa de levadura EBY100. El marcaje diferencial con anticuerpos fluorescentes distingue a los casetes de sustrato no escididos de los que se muestran en la superficie celular. Este mecanismo de visualización dependiente de la actividad es directamente compatible con la selección iterativa basada en FACS para bibliotecas de 10,⁷ o más^{variantes 6,7}.

Un requisito fundamental para la evolución dirigida es la capacidad de introducir bibliotecas variantes a una escala suficiente para lograr una cobertura adecuada del espacio de secuencias objetivo. Para bibliotecas de mutagénesis con saturación de sitios que abarcan múltiples posiciones de aminoácidos, se necesitan rendimientos de transformación de 10⁸ a¹⁰ 9 transformantes únicos para asegurar que la diversidad introducida en la biblioteca esté bien representada en la población ordenada. Existen varios métodos para introducir ADN exógeno en S. cerevisiae, cada uno con techos de rendimiento distintos. El método convencional de transformación química utiliza acetato de litio/ADN portador monocatenario/polietilenglicol (LiAc/ssDNA/PEG) debido a su simplicidad y accesibilidad. Sin embargo, normalmente logra eficiencias de transformación de solo 10^{unidades de formación de colonias (UFC) de 4}–^{10 6} por microgramo de ADN, quedando por debajo de la variación de secuencia necesaria para campañas de^{bibliotecas grandes 8}. En cambio, el método de electroporación aplica un campo eléctrico de alto voltaje para permeabilizar transitoriamente la membrana celular y facilitar la absorción del ADN. La electroporación logra consistentemente las mayores eficiencias de transformación entre los métodos disponibles, con protocolos optimizados que reportan rendimientos de 10⁸–10^{9 UFC 9}. Se ha observado que la eficiencia de electroporación en S. cerevisiae es críticamente sensible a la fase de crecimiento celular, la masa de ADN y la composición del tampón, proporcionando un marco que desde entonces ha sido ampliamente adaptado para la evolución dirigida^{a escala de biblioteca 9}.

El protocolo descrito aquí utiliza la cepa S. cerevisiae EBY100, una cepa de hospedador ampliamente adoptada para la visualización superficial de levaduras. EBY100 fue diseñado por Boder y Wittrup integrando un casete de expresión AGA1 bajo el control del promotor GAL1 inducible por galactosa en el locus cromosómico AGA1 de la cepa progenitora deficiente en proteasa BJ5465¹⁰. La cepa está disponible comercialmente en el ATCC (número de catálogo MYA-4941; depositante K.D. Wittrup), portando el genotipo MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). Como resultado, tanto Aga1p como la fusión de casete de Aga2p con sustrato se expresan desde el mismo promotor inducible por galactosa, asegurando que ambas subunidades se coinducan y se ensamblen en el complejo Aga1p–Aga2p ligado a disulfuros que ancla la fusión mostrada a la pared celular.

A pesar del uso generalizado de EBY100 en aplicaciones de visualización de levaduras, no se ha optimizado sistemáticamente ningún protocolo para electroporar esta cepa a rendimientos a escala de biblioteca. Los parámetros específicos de EBY100, como la fase óptima de crecimiento en la cosecha, la composición del medio durante la subcultura y la relación cuantitativa entre la densidad óptica inicial a 600 nm (OD₆₀₀) y la eficiencia de transformación, siguen por caracterizarse y optimizarse rigurosamente. Aquí, informamos que la eficiencia de transformación en EBY100 aumenta de forma monótona con el OD₆₀₀ del cultivo en la cosecha, con células en fase de log tardía que producen tasas de transformación sustancialmente mayores que las cosechadas en la fase inicial de log. Evaluamos parámetros críticos del protocolo, incluyendo valores iniciales de_{OD 600} en la inoculación, el uso de medio de 2 × de extracto de levadura con peptona dextrosa (YPD) para subcultivos, formulaciones de tampón de electroporación y condiciones de crecimiento posterior a la electroporación. El protocolo presentado aquí proporciona un flujo de trabajo optimizado paso a paso (Figura 1A–C, Figura 2, Figura 3A–D, Figura 4A–E) para preparar celdas EBY100 electrocompetentes y realizar electroporación de biblioteca de ADN de alta eficiencia, produciendo tasas de transformación consistentemente superiores a 10,9 CFU. Para validar este protocolo, llevamos a cabo una campaña integral de evolución dirigida para diseñar TEVp con especificidad alterada de la clivación a lo largo de cuatro rondas de selección y enriquecimiento basadas en FACS. La secuenciación de variantes enriquecidas de proteasas confirmó una diversificación sustancial en residuos objetivo dentro del bolsillo de unión al sustrato de la proteasa, demostrando que el protocolo proporciona una cobertura suficiente de biblioteca del espacio de secuencias para apoyar campañas evolutivas productivas. Este protocolo será de amplia utilidad para investigadores que utilicen EBY100 para evolución dirigida basada en la visualización de superficies de levaduras y cribado de alto rendimiento compatible con FACS de proteasas,^{anticuerpos 9}, quinasas¹¹ y receptores¹², entre otras proteínas.

Protocolo

Todos los experimentos que involucraron S. cerevisiae recombinante se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas y procedimientos del Comité Institucional de Bioseguridad y Seguridad Química de la Universidad de Texas en Dallas. Las cepas de levadura recombinante se manejaron bajo contención de Nivel de Bioseguridad 1 (BSL-1) de acuerdo con las prácticas microbiológicas institucionales establecidas. Se realizaron electroporaciones, cultivos y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de acuerdo con los procedimientos institucionales aprobados de bioseguridad. Los cultivos de levadura y los consumibles contaminados fueron descontaminados y eliminados como residuos biopeligrosos conforme a las directrices institucionales.

1. Preparación de vectores e insertos

1. Generación de bibliotecas de proteasas potivirales mediante mutagénesis por saturación de sitios
   1. Diseño utilizando software de diseño de secuencias que solapa oligonucleótidos directos y inversos de 30 a 50 mer, para generar una biblioteca mutante de proteasas. Sustituye el codón de tipo salvaje en el oligonucleótido correspondiente por un codón degenerado NNS, donde N representa A, T, G o C, y S representa G o C, para posiciones dirigidas a la mutagénesis.
   2. Diseña la superposición de 3′ entre cada par de oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás con una temperatura de fusión (Tm) de 55–60 °C. Diseñar el primer y último oligonucleótidos para que contengan una superposición de 50 nts con el vector de visualización superficial de la levadura más allá de los sitios de restricción.
   3. Asegúrese de que al menos un extremo del inserto se solape exactamente con uno de los extremos del vector linealizado para facilitar la recombinación^{homóloga 13}. Evitar los huecos entre oligonucleótidos^{adyacentes 14}.
   4. Resuspende los oligos a 100 μM con H_2Odesionizado. En un tubo estéril de 1,5 mL, combinar 0,5 μL de cada oligo para obtener un volumen final de 200 μL (concentración final de 250 nM por cada oligo).
   5. Establece una reacción de PCR con los componentes listados en la Tabla 1 para ensamblar la biblioteca de proteasas, usando las condiciones de termociclo de la Tabla 2.
   6. Establecer una segunda reacción PCR usando los oligos más externos hacia adelante y hacia atrás (Tabla 3) usando el primer producto PCR ensamblado como plantilla. Amplifica el producto como se muestra en la Tabla 4.
   7. Ejecuta el segundo producto de PCR sobre un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio (0,5 μg/mL) a 240 V durante 30 minutos. Elimina la banda correspondiente a la longitud esperada del ADN.
      NOTA: PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno y debe manipularse con el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Evita el contacto con la piel e inhalación. Eliminar geles, buffers y consumibles que contienen bromuro de etidio como residuos químicos peligrosos conforme a las directrices de seguridad institucionales.
   8. Purifica usando un kit de extracción en gel. Elute en 50 μL de H_2Odesionizado.
   9. Mide la concentración de ADN usando un espectrofotómetro. Almacena el ADN a −20 °C.
      NOTA: Cada reacción de 50 μL de la^{segunda PCR} produciría aproximadamente entre 0,5 y 1,0 μg de ADN total. Dado que cada electroporación requiere 12 μg de la biblioteca de proteasas (es decir, insertar), las reacciones se escalan en consecuencia.
2. Conjunto de casete de sustrato
   1. Prepara placas de LB-agar y medios líquidos de LB-cloranfenicol. Consulta las recetas en la Tabla 5.
   2. Diseñar un conjunto de oligonucleótidos de 30 merériles superpuestos en dirección adelante y reversa para el ensamblaje de casetes de sustrato. Diseña los extremos 5′ de cada oligonucleótido inverso y el oligonucleótido frontal del siguiente fragmento para que coincidan con 4 nucleótidos.
   3. Resuspende oligos liofilizados a 100 μM usando H_2Odesionizado.
   4. Mezcla los reactivos como en la Tabla 6.
   5. Utiliza el programa de ciclos de la Tabla 7 para recocer y fosforilar la mezcla de oligo.
   6. Diluir oligos recocidos 4 veces en_H2Odesionizado para alcanzar una concentración final de 1,25 μM.
   7. Combina la mezcla de oligo recocido con el vector (por ejemplo, pDD1523), siguiendo la Tabla 8.
   8. Realiza el montaje Golden Gate, siguiendo el programa de ciclismo de la Tabla 9.
      NOTA: Por ejemplo, el plásmido pDD1523 tiene un sitio de restricción tipo II (BsmBI) aguas abajo del promotor GAL1/10. El montaje exitoso permite la inducción de galactosa del casete^{de sustrato 7}.
   9. Transforma el plásmido resultante en E. coli.
   10. Células de placa en agar LB con el antibiótico correspondiente. Incubar durante 16–18 horas a 37 °C.
   11. Elige colonias aisladas e inocúlalas en 5 mL de medio LB. Incubar durante la noche (16–18 h) a 37 °C con agitación (220 rpm).
   12. Extrae plásmidos de cultivos nocturnos usando un kit de minipreparación para plásmidos.
   13. Mide la concentración de plásmidos usando un espectrofotómetro y luego envía la secuenciación.
3. Linealización del vector de visualización de levaduras
   1. Linealiza el plásmido de visualización de levadura, por ejemplo, digiera pDD1524 con enzimas de restricción SphI y PstI para preparar el vector de visualización de levaduras que contiene el casete sustrato para electroporación. Mezcla los reactivos listados en la Tabla 10 e incuba a 37 °C durante 1 hora.
   2. Aplica el producto de digestión por restricción sobre un gel de agarosa al 1% a 240 V durante 30 minutos. Extirpa la banda correspondiente a la longitud esperada de ADN y purifica usando un kit de extracción en gel.
      NOTA: Cada 50 μL de digestión de restricción produciría aproximadamente entre 0,5 y 1,0 μg de ADN total. Dado que cada electroporación requiere 4 μg de vector linealizado, se escalan las reacciones digestivas en consecuencia.

2. Electroporación

Nota: Seguir los procedimientos de seguridad institucionales para el manejo de materiales y reactivos biológicos, usar el EPI adecuado y eliminar los residuos biológicos y químicos conforme a las directrices institucionales.

1. Preparación de buffers, placas y medios (2 días antes de la electroporación)
   1. Preparar medios de cultivo (1 × YPD; 2 × YPD; Ácidos de Casamino de dextrosa sintética, SDCAA+; y Ácidos Cásaminos de Galactosa Sintética, SGCAA+), placas (YPD y SDCAA), amortiguador de electroporación y agua estéril siguiendo las recetas de la Tabla 5. Guárdalos a 4 °C.
2. Preparación de una placa estriada de EBY100.
   1. Extraer levadura EBY100 sobre agar de YPD desde una reserva de glicerol. Cultiva a 30 °C durante 2 días.
   2. Guarda la placa a 4 °C después del crecimiento.
      NOTA: Una placa con rayas permanece utilizable hasta un mes; Marca la fecha de la racha en la placa.
3. Preparación del precultivo de EBY100 (1 día antes de la electroporación)
   1. Prepara 125 mL de 1 × YPD en un matraz Erlenmeyer de 500 mL.
   2. Prepare 25 mL de 1 × YPD en un tubo cónico de 50 mL. Usando una punta de micropipeta, recoge las células EBY100 de la placa cultivada durante 2 días. Luego, transfiere las células de levadura desde la punta de la pipeta al tubo cónico que contiene 1 × YPD.
      NOTA: La franja de células debe formar una mancha de aproximadamente 1–2 mm de longitud.
   3. Quita la punta de la micropipeta y haz un vórtice en el tubo cónico para asegurar una mezcla adecuada.
   4. Prepara un precultivo de 150 mL transfiriendo 25 mL de 1 × YPD que contiene las células de levadura al matraz de 500 mL que contiene 125 mL de 1 × YPD. Haz un remolino para mezclar.
   5. Usando un espectrofotómetro, mide el OD₆₀₀ preparando dos microcuvetas con un recorrido de 1 cm: una con 1 mL de 1 × YPD como control en blanco y otra con 1 mL de precultivo
   6. Cultivar 150 mL de pre-cultivo durante la noche (16–20 h) a 30 °C con vibración orbital a 270 rpm.
4. Preparación de la subcultura en el OD_{inicial deseado 600} (el día de la electroporación)
   1. Prepare el tampón de acondicionamiento y el medio de crecimiento, como se describe en la Tabla 5.
   2. Mide el OD₆₀₀ del precultivo nocturno (el OD₆₀₀ esperado es 17–22). Para estar dentro del rango lineal del espectrofotómetro, medir una dilución 1:20 del pre-cultivo.
   3. Calcula el volumen de precultivo necesario para inocular una subcultura de 100 mL. Se recomienda una subcultura inicial OD₆₀₀ de 3,0–4,0.
   4. Diluir el cultivo hasta el OD inicial_{deseado de 600} en 100 mL de 2 × YPD en un matraz Erlenmeyer de 500 mL.
   5. Incubar la subcultura de 100 mL a 30 °C con agitación orbital a 270 rpm durante 4 horas.
5. Preparación de medios durante la incubación de 4 horas
   1. Mantén a mano el amortiguador de electroporación helado y el agua estéril (desde el paso 2.1.1).
   2. Preparar el tampón de acondicionamiento (100 mL), siguiendo la receta de la Tabla 5. Utiliza 20 mL de buffer de acondicionamiento por transformación; Escala en consecuencia. Conservar a temperatura ambiente (20–23 °C).
      NOTA: PRECAUCIÓN: El tampón acondicionador contiene ditiotreitol (DTT) y acetato de litio (LiAc), que son irritantes químicos que pueden causar irritación en la piel y los ojos. Llevar el EPI adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad, y manejar estos reactivos conforme a los procedimientos de seguridad química institucional. Eliminar las soluciones no utilizadas y los amortiguadores gastados como residuos químicos conforme a las directrices institucionales.
   3. Preparar el medio de crecimiento (50 mL): Mezclar 25 mL de 2 × YPD y 25 mL de 1 M sorbitol. Usa 8 mL de medio de crecimiento por transformación. Conservar a temperatura ambiente (20–23 °C).
6. Preparación de células de levadura electrocompetentes tras incubación de 4 horas.
   1. Divide la subcultura de 100 mL en dos tubos cónicos de 50 mL. Recoge las pilas por centrifugación a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos, luego decanta el medio. Mantén las celdas en hielo hasta que se complete el paso 2.6.4.
   2. Resuspende suavemente cada pellet celular con 25 mL de agua estéril helada. Centrifugar a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos, luego decantar el medio.
   3. Repite el paso 2.6.2.
   4. Resuspende suavemente cada pellet celular con 25 mL de tampón de electroporación helado. Centrifugar a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos, luego decantar el medio.
   5. Retira las células del hielo y vuelve a suspender suavemente cada pellet celular con 10 mL de buffer de acondicionamiento a temperatura ambiente (20–23 °C). Luego, se agrupa en un solo matraz Erlenmeyer de 125 mL e incuba a 30 °C con agitación orbital a 270 rpm durante 30 minutos.
   6. Vierte las celdas en un tubo de 50 mL. Centrifugar a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos. Descarta los medios.
   7. Resuspende suavemente el pellet celular con 50 mL de tampón de electroporación helado. Centrifugar a 4 °C y 1.500 × g durante 3 minutos, luego decantar el medio.
   8. Resuspende el perdigón de celda a un volumen final de 1 mL añadiendo aproximadamente 100–200 μL de tampón de electroporación. Mantén las células en hielo hasta la electroporación.
      NOTA: Las pilas electrocompetentes pueden congelarse (es decir, colocarse en un congelador a –80 °C) y usarse posteriormente sin una pérdida significativa de eficiencia de electroporación.
7. Electroporación, crecimiento y chapado
   1. Cubeta(s) de electroporación pre-enfriada con un espacio de 0,2 cm sobre hielo.
   2. Transfiere 380 μL del pellet resuspendido a un tubo estéril de 1,5 mL. Mezclar con 4 μg de ADN plásmido o con 4 μg de vector plásmido lineal y 12 μg de inserto. Mezcla suavemente pipeteando.
      NOTA: Para maximizar el número de células electroporadas, las concentraciones de ADN vector e insertado deberían ser idealmente de 700–800 ng/μL. Si las concentraciones son menores, usa un concentrador de vacío.
   3. Transfiere la suspensión a la(s) cubeta(s) de electroporación preenfriada(s). Mantente en hielo durante 5 minutos.
   4. Limpia los laterales de la cuveta después de 5 minutos con una toallita de laboratorio sin pelusa para eliminar la humedad residual, que puede provocar arcos eléctricos durante la electroporación. Evita cualquier burbuja o celda por encima de las placas metálicas de la cubeta, ya que también pueden provocar arcos eléctricos. Para mantener la temperatura fría de la cubeta, no toques los electrodos de la placa.
   5. Prepara 8 mL de medio de crecimiento en un tubo cónico de 50 mL.
   6. Electroporar las pilas con los siguientes ajustes: un voltaje de 2,5 kV, una capacitancia de 25 μF y una resistencia de 200 Ω⁹. El rango de constantes de tiempo aceptable es de 2,8–4,5 ms.
      NOTA: PRECAUCIÓN: La electroporación implica pulsos eléctricos de alto voltaje. Asegúrate de que las cubetas estén bien colocadas y sigue las instrucciones de funcionamiento del fabricante. Eliminar las cubetas de electroporación usadas como residuos biopeligrosos según las directrices institucionales.
   7. Inundar inmediatamente la cubeta, aproximadamente 200 μL de medio de crecimiento del tubo cónico y transferir las células electroporadas al tubo cónico de 50 mL. Añade otros 200–350 μL de medio de crecimiento hasta que no quede líquido visible en la cubeta.
   8. Incubar el tubo cónico de 50 mL de células electroporadas en 8 mL de medio de crecimiento a 30 °C sin agitar durante 1 hora. Invierte el tubo cada 15 minutos para mezclar.
   9. Recoge las pilas por centrifugación a 1.500 × g, 25 °C durante 3 minutos. Luego decantar los medios.
   10. Resuspender las células en medios adecuados de caída de levadura para mantener la selección de las células transformadas. Para plásmidos que contienen el marcador de selección TRP1, se resuspenden las células en 250 mL de SDCAA+ (que carece de triptófano) para recuperar selectivamente levaduras que retuvieron el plásmido.
   11. Incubar durante la noche (16–20 h) a 30 °C con agitación orbital a 270 rpm.

3. Inducción, tinción y clasificación citométrica de flujo de células de levadura

1. Inducción de la biblioteca de proteasas y el casete de sustrato (1 día antes de la clasificación)
   1. Medir OD₆₀₀ como en el paso 2.4.2 tras el crecimiento nocturno de transformantes en medios dropout.
   2. Alicuota 12 mL de transformantes de levadura y centrifugadora a 3.200 × g durante 5 minutos.
   3. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en medio de inducción SGCAA+ a un OD_{de 600} de 0,5. Calcular el volumen de resuspensión requerido usando la ecuación de dilución, C₁V₁ = C₂V_2.
   4. Transfiere a un matraz Erlenmeyer de 125 mL y cultiva durante la noche durante 18–24 horas a 30 °C con vibración orbital a 270 rpm.
2. Tinción por anticuerpos fluorescentes (el día de la clasificación)
   1. Mide el OD₆₀₀ de células tras la inducción. Utiliza dos cubetas: una con 1 mL de SGCAA+ y otra con 950 μL de SGCAA+ mezclada con 50 μL de celdas. Multiplica el valor medido_{de OD 600} por 20 para obtener el verdadero OD₆₀₀ de las celdas postinducción.
   2. Normaliza cada muestra a 3 × 10⁷ células para la tinción por anticuerpos y la clasificación FACS. Utiliza C₁V₁ = C₂V₂ para calcular el volumen de celdas que se deben transferir desde el matraz de inducción.
      NOTA: Para la mutagénesis de saturación de NNS en cuatro sitios, el tamaño teórico de la biblioteca es de 10⁶ variantes. Para muestrear suficientemente la biblioteca, revisa al menos 10 veces el tamaño de la biblioteca, o 10^{celdas de 7} . Ejemplo: si se desea C₁V₁ = 3 × 10⁷ celdas y C₂ = postinducción_{ED 600} de 6 (es decir, 6 × 10⁷ celdas/mL), entonces alicuota 500 μL de celdas inducidas (es decir, V₂ = 3 × 10⁷ celdas / 6 × 10⁷ celdas/mL = 500 μL).
   3. Transfiere el volumen calculado de las celdas a un tubo de 1,5 mL y centrifuga a 5.000 × g durante 5 minutos.
   4. Retirar el sobrenadante y volver a suspender en 500 μL de solución fisiológica salina tamponada con fosfato (PBS) + 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA).
   5. Centrifugar a 5.000 × g durante 5 minutos y repetir el paso 3.2.4.
   6. Centrifugar a 5.000 × g durante 5 minutos y, mientras tanto, completar el paso 3.2.7.
   7. Preparar una mezcla de tinción por anticuerpos en un tubo de 1,5 mL que contenga isotiocianato de fluoresceína anti-HA (FITC) (0,5 μg/10⁷ células), anti-FLAG ficoeritrina (PE) (0,05 μg/^{10 7} células) y PBS + 0,5% de BSA (100 μL/10⁷ células). Mantén el tubo en hielo.
   8. Quita el sobrenadante y vuelve a suspender con la mezcla de tinte. Usa 300 μL de la mezcla de tinte por cada 3 × 10⁷ celdas. No pongas el tubo en vórtice; Solo invierte o lanza un flick.
   9. Mantén las celdas en hielo en la oscuridad durante 1 hora tras la resuspensión.
3. Lavado posterior al tinte
   1. Teñir las células en centrifugadora a 5.000 × g durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en PBS que contenga 0,5% de BSA usando 0,5 mL por cada 1 × 10⁷ celdas (por ejemplo, 500 μL para 1 × 10⁷ celdas o 1,5 mL para 3 × 10⁷ celdas).
   2. Centrifugar a 5.000 × g, 5 min. Retirar el sobrenadante, volver a suspender en 750 μL de PBS + 0,5% de BSA.
   3. Transfiere otros 750 μL de PBS + 0,5% de BSA a un tubo de recogida de 10 mL.
4. FACS
   1. Realizar el arranque y preparación necesarios del citómetro para un nuevo experimento.
   2. Crea tres puntos de diagrama. En el primer diagrama de puntos, selecciona el nombre del eje X para mostrar el canal de área de dispersión directa (FSC-A) y el nombre del eje Y para mostrar el canal de área de dispersión lateral (SSC-A).
      NOTA: Esto facilitará la selección de células vivas.
   3. Mantén el nombre del eje X para mostrar el canal FSC-A mientras se cambia el canal del eje Y para mostrar la altura de dispersión directa (FSC-H) en el segundo gráfico de puntos.
      NOTA: Esto facilitará la selección de singles.
   4. Selecciona el nombre del eje X para mostrar el canal PE y el nombre del eje Y para mostrar el canal FITC en el tercer diagrama de puntos.
   5. Ejecuta control negativo en el citómetro usando los canales de 530/30 nm (FITC) y 585/42 nm (PE). Realizar la clasificación usando una boquilla de 70 μm a 70 psi de presión de vaina. Adquirir muestras a una velocidad de 4000–5000 eventos/s.
   6. Dibuja una compuerta de polígonos alrededor de la población principal de células de levadura intactas para excluir restos y pequeñas partículas con señales bajas de FSC-A y SSC-A en el primer gráfico de puntos (FSC-A frente a SSC-A).
   7. Singlets de puerta en un gráfico FSC-H frente a FSC-A dentro de esta puerta, seleccionando la población lineal que exhibe una relación proporcional entre FSC-H y FSC-A. Excluye los eventos que se desvían de la distribución lineal y corresponden a dobletes y agregados de celdas.
      NOTA: El tercer gráfico de puntos para PE frente a FITC mostrará un grupo diagonal de puntos para el control negativo (es decir, células de levadura que expresan el casete del sustrato intacto).
   8. Toma muestras y clasifica las células de levadura según los valores deseados de PE/FITC en un o varios tubos de recogida. Analizar un número total de celdas que corresponda al menos 10 veces al tamaño teórico de la biblioteca para asegurar una representación adecuada de todas las variantes (por ejemplo, analizar ~1 × 10⁷ celdas para una biblioteca con diversidad teórica de ~1 × 10⁶ variantes).
   9. Posiciona la puerta de clasificación por debajo de la diagonal PE/FITC de la población de control negativo.
      NOTA: Las compuertas más estrictas mejoran el enriquecimiento de las variantes deseadas pero reducen la recuperación celular.
5. Después de FACS
   1. Tubo de recogida de centrifugadora a 3.200 × g durante 5 minutos. Retira cuidadosamente el sobrenadante, dejando 1 mL, y vuelve a suspender en 5 mL de PBS.
      NOTA: Deje 1 mL de sobrenadante, ya que el pellet celular en la parte inferior no será visible tras la centrifugación.
   2. Centrifugar de nuevo las celdas a 3.200 × g durante 5 minutos. Quita el sobrenadante, quedando 1 mL. Resuspende con 4 mL de SDCAA+.
   3. En un matraz Erlenmeyer de 250 mL, añade 15 mL de SDCAA+. Transfiere las celdas resuspendidas del paso 3.5.2 a este matraz.
   4. Incubar durante la noche durante 18–24 horas a 30 °C con vibración orbital a 270 rpm.
   5. Repite los pasos 3.1, 3.2, 3.3 y 3.4 en cada ronda de evolución dirigida.

4. Recuperación de plásmidos y secuenciación de clones individuales

1. Cultivar colonias individuales
   1. Haz un fondo de glicerol mezclando 500 μL del cultivo líquido tras el paso 3.5.4 y 500 μL de glicerol estéril al 50%, lo que resulta en una solución de glucerol al 25%. Vórtice para mezclar bien las células.
   2. Guárdalos en el congelador a –80 °C durante la noche. Para almacenamiento a largo plazo, transfiere al nitrógeno líquido.
   3. Raspa el material de glicerol usando una punta estéril de 1000 μL y mézclalo con 100 μL de SDCAA+. Emplata esta mezcla sobre una placa SDCAA e incubala boca abajo a 30 °C.
   4. Recoge las colonias después de 3 días y hazlas crecer durante la noche en 1,5 mL de SDCAA+ en tubos de 14 mL.
2. Realizar minipreparación de levaduras para extraer plásmidos
   1. Pelleta el cultivo durante la noche centrifugando a 16.000 × g durante 1 minuto y vuelve a suspender 200 μL de la Solución 1 de un kit de purificación de plásmidos de levadura.
   2. Añadir 5 μL de solución enzimática lítica (5 U/μL).
   3. Incuba en una incubadora a 37 °C durante 4 horas en una batidora de extremo a extremo.
   4. Realiza un ciclo de congelación y descongelación a -80 °C durante 20 minutos y descongelando a 42 °C durante 10 minutos en baño maría.
   5. Añade 200 μL de la Solución 2 de un kit de purificación de plásmidos de levadura, mezcla invirtiendo 2–3 veces y deja reposar 5 minutos.
   6. Añade 400 μL de la Solución 3 de un kit de purificación de plásmidos de levadura y mezcle invirtiendo 2–3 veces. Centrifugar a 16.000 × g durante 5 minutos.
   7. Purificar el ADN plasmídico usando un kit de purificación con una columna de alta capacidad de unión al ADN.
      NOTA: Debido a la gran cantidad de ADN genómico de levadura cortado que proviene de las células lisadas, es necesario utilizar una columna basada en sílice con mayor capacidad de unión al ADN (35 μg) en lugar de una columna de purificación de ADN plasmídico de levadura de menor capacidad (5 μg⁾¹⁵.
   8. Mide la concentración de ADN usando un espectrofotómetro. Los rendimientos de ADN son de 10–30 ng/μL.
3. Transformar plásmidos purificados en células químicamente competentes de E. coli
   1. Prepara medios SOC, siguiendo la receta de la Tabla 5, y placas de LB-cloranfenicol. Además, precalienta un baño maría a 42 °C.
   2. Calienta una placa de LB-cloranfenicol para cada plásmido a 37 °C durante 20 minutos.
   3. Saca un tubo de células químicamente competentes del congelador a –80 °C y descongela sobre hielo.
   4. Alicuota de 30 μL de células competentes para cada plásmido en un tubo de 1,5 mL sobre hielo.
   5. Pipetear 3 μL de plásmido en células competentes. Haz un toque para mezclar y déjalo reposar 5 minutos sobre hielo.
   6. Realiza el choque térmico incubando brevemente las células en el baño maria a 42 °C durante 40 segundos.
   7. Incuba en hielo durante 2 minutos.
   8. Añade 300 μL de medio SOC a las células e incuba durante 15 minutos a 37 °C a 220 rpm.
   9. Placa 50–100 μL de celdas competentes transformadas sobre placas precalentadas.
   10. Incuba las placas a 37 °C boca abajo durante 18 horas.
4. Recogida de colonias
   1. Añade 5 mL de medio líquido de LB-cloranfenicol a tubos de cultivo de fondo redondeado de 14 mL.
   2. Elige una colonia usando una punta estéril de 1000 μL y métela en un tubo de cultivo.
   3. Colocar los tubos en un agitador (220 rpm, ángulo de 30°–45° para maximizar la aireación) a 37 °C durante 18 horas.
5. Extracción de plásmidos a partir de cultivo líquido bacteriano
   1. Centrifuga los cultivos líquidos a 3.200 × g durante 4 minutos. Decanta el sobrenadante.
   2. Extrae plásmidos de cultivos nocturnos usando un kit de purificación de plásmidos.
   3. Mide la concentración de plásmidos purificados usando un espectrofotómetro.
6. Enviar plásmidos para secuenciación
   NOTA: Utiliza servicios como la secuenciación de nanoporos de plásmidos completos o, alternativamente, la secuenciación Sanger con un cebador flanqueando la región mutagenizada.

Resultados

La construcción eficiente de bibliotecas es fundamental para asegurar una cobertura suficiente del espacio mutacional. Para evitar la pérdida de variantes funcionales raras, el número de transformantes debe alcanzar al menos el 10× al 100× el tamaño teórico de la biblioteca. Debido a que la eficiencia de transformación en S. cerevisiae está influida por la concentración celular y es mayor en las células de fase^{logarítmica temprana a media 16}, optimizamos la densidad celular inicial antes de la electroporación. Los cultivos de levadura se subcultivaron con valores iniciales de_{OD 600} que iban de 1,0 a 4,0 e incubaron durante 4 horas (n = 2–4 experimentos biológicos independientes), tras lo cual los valores finales de_{OD 600} se mapearon sobre la curva de crecimiento de S. cerevisiae para confirmar que las células permanecieron dentro de la fase de crecimiento de la fase de logaritaritmia media (Figura 5A, Figura suplementaria 1).

La electroporación de estos cultivos con ADN plasmídico de 4 μg (n = 2 experimentos biológicos independientes) mostró que la eficiencia de transformación difería significativamente en condiciones iniciales de OD₆₀₀ (ANOVA unidireccional, p = 8,92 × 10⁻⁷). En relación con cultivos iniciados en OD₆₀₀ = 1,0, todas las densidades celulares iniciales más altas produjeron eficiencias de transformación significativamente mayores (prueba de comparaciones múltiples de Dunnett; OD₆₀₀ = 1,5, ajustado p = 0,0020; OD₆₀₀ ≥ 2,0, ajustado p < 0,0001), con la mayor eficiencia de transformación observada en un OD_{inicial de 600} de 4,0. Para aprovechar la capacidad natural de las células de levadura para realizar recombinación homóloga, también electroporamos 4 μg del vector plásmido linealizado y 12 μg del inserto (es decir, la biblioteca de proteasas) en células de levadura (n = 2 experimentos biológicos independientes). La eficiencia de transformación difería significativamente entre las condiciones iniciales probadas de OD₆₀₀ (ANOVA unidireccional, p = 0,0023). En comparación con los cultivos iniciados en el diámetro_{de 600} = 1,0, las eficiencias de transformación fueron significativamente mayores en el diámetro₆₀₀ = 3,0 ( ajustado p = 0,0018), 3,5 ( ajustado p = 0,0062) y 4,0 ( ajustado p = 0,0024) (prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). Observamos la mayor eficiencia de transformación a una densidad inicial de subcultivo moderada (OD₆₀₀ = 3,0), lo que indica un equilibrio óptimo entre la competencia celular y la eficiencia de recombinación bajo estas condiciones (Figura 5B). En comparación con la transformación solo con plásmidos, la coelectroporación de un vector linealizado y un inserto de biblioteca de proteasas (n = 2 réplicas biológicas independientes) produjo eficiencias de transformación significativamente mayores en las condiciones iniciales probadas de OD₆₀₀ (ANOVA bidireccional en eficiencias de transformación transformadas log10, p = 9,40 × 10⁻¹²). De media, la coelectroporación produjo un aumento medio de 121 veces en la eficiencia de transformación (IC 95%, 63–233 veces) en comparación con la transformación solo por plásmidos (Figura 5B).

Durante una secuencia FACS de células de levadura que contienen la biblioteca de proteasas mutantes y el casete de selección de sustrato (Figura 6A), las células mostrarán un casete truncado o una proteasa que aún corte el sustrato de contraselección (Q1), expresarán variantes de proteasa no funcionales (Q2) o expresarán variantes de proteasas que solo corten con éxito el sustrato de selección (Q3). Las células de levadura que expresaban variantes no funcionales aparecieron como una población dominante distribuida a lo largo de la diagonal en los gráficos PE frente a FITC, reflejando la co-retención de ambas señales (Figura 6A, Q2). En contraste, las variantes funcionales que cortaron el sustrato de selección mientras preservaban el sustrato nativo (de contraselección) formaron una población fuera de la diagonal distinta caracterizada por una PE de alta e alta intensidad de FITC (Figura 6A, Q3). Aplicar una estrategia estricta de gating para aislar esta población fuera de la diagonal resultó en un enriquecimiento progresivo de variantes funcionales a lo largo de rondas sucesivas de clasificación¹⁰. Este enriquecimiento se observa visualmente como un grupo cada vez más definido de celdas separadas del grupo diagonal (Figura 6B, de izquierda a derecha). Si no se observa una población fuera de la diagonal definida, esto puede indicar baja calidad de la biblioteca, expresión insuficiente o condiciones de tinción subóptimas. Como control negativo, la Figura 6C,D muestra las células de levadura electroporadas, inducidas y sin teñir, así como los correspondientes histogramas de fluorescencia FITC y PE.

Dentro de la población enriquecida fuera de la diagonal, las subpoblaciones pueden resolverse aún más en función de la intensidad del FITC. Las celdas que presentan una señal FITC media pueden clasificarse por separado de aquellas con una señal FITC baja. La secuenciación de estas poblaciones distintas reveló perfiles de mutación únicos (Tabla 11), lo que indica que las diferentes eficiencias de la clivaje están asociadas con diferentes variantes de proteasa.

Figura 1: Preparación de vectores e insertos. (A) Generación de bibliotecas de proteasas potyvirales mediante mutagénesis por saturación de sitios. (B) Ensamblaje e integración de casetes de sustrato en el vector de visualización de levadura (pDD1523). (C) Linealización del vector de visualización de levaduras (pDD1524) mediante digestión por restricción. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Electroporación del casete sustrato y la biblioteca de proteasas mutantes amplificadas por PCR en células competentes EBY100. (Cuadro discontinuo) Circularización in vivo del plásmido que contiene tanto proteasa como casete sustrato. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Inducción, tinción y clasificación citométrica de flujo de células de levadura. (A) Inducción de biblioteca de proteasas y casete de sustrato. (B) Tinción por anticuerpos fluorescentes: Tinción con anticuerpos anti-HA fluoresceína isotiocianato (FITC) y anti-FLAG de ficoeritrina (PE). (C) Las células teñidas se clasifican mediante Clasificación Celular Activada por Fluorescencia (FACS). (D) Recuperación de células clasificadas por FACS en medios de selección. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Recuperación de plásmidos y secuenciación de células de levadura clasificadas. (A) Emplatado de células de levadura clasificadas. (B) Extracción de plásmidos de colonias individuales de levadura. (C) Transformación de plásmidos extraídos por E. coli. (D) Extracción de plásmidos de colonias individuales de E. coli. (E) Secuenciación nanoporosa de plásmidos extraídos. Iconos de matraz y tubo adaptados de DBCLS y Helicase 11, respectivamente, vía Bioicons (https://bioicons.com) y adaptados bajo los términos de la Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Curvas de crecimiento de levaduras en diferentes medios de cultivo e influencia de la densidad óptica inicial a 600 nm (DO₆₀₀) de subcultura en la eficiencia de electroporación de levaduras. (A) Curvas de crecimiento de levaduras en 1 × Extracto de levadura Peptona Dextrosa (YPD), 2 × YPD, Ágar de Casaminoácidos de Dextrosa Sintética sin antibióticos (SDCAA-) y Ágar de Ácidos Casamino de Dextrosa Sintética con antibióticos (SDCAA+). (B) Eficiencia de transformación de levaduras electroporadas con un vector plásmido de 4 μg en varios OD iniciales de_{subcultura 600}, y eficiencia de transformación usando vector linealizado (4 μg) e inserción de biblioteca de proteasas (12 μg) en los mismos valores iniciales de OD₆₀₀ . Los datos en (A) se presentan como OD₆₀₀ ± SD de dos experimentos biológicos independientes (n = 2). Los datos en (B) se presentan como el número medio de transformantes por electroporación en un eje y logarítmico, con réplicas biológicas individuales representadas como círculos (n = 2). La significación estadística para los experimentos de optimización por electroporación de plásmidos y vector más inserto se determinó usando ANOVA unidireccional sobre eficiencias de electroporación transformadas log10, seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett usando OD₆₀₀ = 1,0 como control. ns, no significativo; p < 0,01 (**); p < 0,0001 (****). La significación estadística de la diferencia entre eficiencias de transformación solo en plásmidos y vector más inserto se determinó usando ANOVA bidireccional sobre eficiencias de transformación transformadas log10. p < 0,0001 (****). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Enriquecimiento basado en clones de levadura mediante Filtración Celular Activada por Fluorescencia (FACS). (A) Representación esquemática de la estrategia de acceso. Las células se dividieron en tres regiones: Q1, células de ficoeritrina (PE) con bajo nivel; Q2, PE alto/fluoresceína isotiocianato (FITC)-células altas; y Q3, células PE altas con fluorescencia FITC baja a intermedia. Se recogieron células dentro de Q3 para enriquecimiento. (B) Gráficos representativos de FACS de una campaña evolutiva independiente que muestran rondas secuenciales de clasificación con una creciente rigurosidad de bloqueo FITC. Las células de FITC medio y bajo se recogieron por separado para su secuenciación. Los porcentajes indican la fracción de células vivas y individuales de levadura dentro de la población controlada. (C) Gráfico representativo FACS que muestra células de levadura electroporadas y sin teñir como control negativo. (D) Histogramas de las intensidades de fluorescencia FITC-A (izquierda) y PE-A (derecha) correspondientes a los datos mostrados en (C). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Mezcla de reacción para la amplificación por PCR en la primera ronda de la biblioteca de proteasas. Composición de la reacción PCR utilizada para la amplificación inicial de la biblioteca de proteasas, incluyendo las concentraciones finales y cantidades de cada reactivo en una reacción de 50 μL. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Condiciones de ciclo para la amplificación PCR en primera ronda de la biblioteca de proteasas. El programa de ciclo térmico se utilizó para la primera ronda de amplificación por PCR de la biblioteca de proteasas. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Mezcla de reacción para la amplificación de segunda ronda por PCR de la biblioteca de proteasas. Composición de la reacción PCR utilizada para la amplificación de segunda ronda de la biblioteca de proteasas, incluyendo las concentraciones finales y cantidades de cada reactivo en una reacción de 50 μL. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Condiciones de ciclo para la amplificación de la segunda ronda de PCR de la biblioteca de proteasas. El programa de ciclo térmico se utilizó para la amplificación de segunda ronda por PCR de la biblioteca de proteasas. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Medios y reactivos para la electroporación y crecimiento de levaduras. Descripción tabular de la masa requerida de cada componente químico para formular cantidades específicas de 1 × y 2 × Extracto de levadura, peptona Dextrosa (YPD), tampón de electroporación, tampón de acondicionamiento, medio de crecimiento, Ácidos de Casamino de Dextrosa sintéticos con antibióticos (SDCAA+), Ácidos de casamino de galactosa sintética con antibióticos (SGCAA+), medios de caldo de lisógeno (LB), medios LB-cloranfenicol, medios de caldo Super Óptimo (SOB) y Caldo Súper Óptimo con medios de represión catabólica (SOC). Se incluyen instrucciones para preparar soluciones estándar, como 2 M de sorbitol, 1 M ditiotreitol (DTT) y 2 M acetato de litio (LiAc). Se proporcionan instrucciones adicionales para preparar placas de agar SDCAA, LB y YPD. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6: Mezcla de reacción para recocido y fosforilación de oligos. Composición de la mezcla de reacción utilizada para el recocido y fosforilación simultáneos de oligonucleótidos para el ensamblaje de casetes de sustrato. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 7: Condiciones de ciclo para el recocido y fosforilación de oligos. Programa de temperatura utilizado para el recocido y fosforilación de oligonucleótidos para el ensamblaje de casetes de sustrato. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 8: Mezcla de reacción para el ensamblaje Golden Gate de clásmidos de casete y vector en sustrato. Composición de la reacción de ensamblaje Golden Gate utilizada para ligar el casete sustrato en el plásmido vectorial. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 9: Condiciones de ciclo para el ensamblaje Golden Gate de casete sustrato y plásmido vectorial. Programa de ciclo térmico utilizado para el montaje Golden Gate. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 10: Mezcla de reacción para la linealización de plásmidos vectoriales. Composición de la reacción de digestión de restricción utilizada para linealizar el plásmido vectorial antes de la construcción de la biblioteca. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 11: Resultados de secuenciación nanoporosa de variantes TEVp que cortan ENLYFES. Los plásmidos se extrajeron de las células de levadura tras la cuarta y última sesión de FACS. Las mutaciones en cada clon se muestran en relación con la secuencia de tipo salvaje. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Figura suplementaria 1: Relación entre la densidad de cultivo inicial y final de EBY100 durante la subcultura. Los cultivos EBY100 se subcultivaron con valores iniciales variables de_{DO 600} , y el OD_{final 600} se midió tras la incubación bajo condiciones de crecimiento idénticas (30 °C, 220 rpm). La densidad final de cultivo aumentó linealmente con el aumento del diámetro exterior_{inicial 600} (R² = 0,969, p = 5,77 × 10⁻⁵). Los puntos de datos representan medias ± DE de (n = 2–4) réplicas biológicas independientes. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Diseño racional de la biblioteca de mutagénesis TEVp. Representación caricaturizada de TEVp (PDB ID: 1LVB) con los cuatro residuos (dorados) <5Å alejados del residuo P1 (morado) dirigidos a la mutagénesis de saturación del sitio. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La evolución dirigida es un método de alto rendimiento que utiliza ciclos iterativos de diversificación y selección para identificar proteínas con función bioquímica mejorada^{o novedosa 17}. En este protocolo, detallamos un flujo de trabajo optimizado para evolucionar el reconocimiento de proteasa y sustrato utilizando un sistema de visualización de superficie celular en S. cerevisiae. El sistema de visualización superficial mapea la actividad de la proteasa a un fenotipo detectable basado en fluorescencia, permitiendo el enriquecimiento basado en FACS de clones deseados. Proporcionamos los pasos detallados para el ensamblaje de bibliotecas de proteasas y casetes de sustratos, electroporación de alta eficiencia, filtración y clasificación FACS, y secuenciación final de variantes de proteasas.

Uno de los pasos más esenciales en la evolución dirigida es garantizar suficiente diversidad bibliotecaria y cobertura de posibles^{mutaciones 17}. Nuestros experimentos de eficiencia de electroporación muestran que una subcultura inicial OD₆₀₀ de 3.0 produce la mayor eficiencia de transformación, superando^10,9 UFC. Esta escala, lograda con electroporación optimizada de levaduras, supera sustancialmente a la de los métodos convencionales de transformación química y permite una cobertura adecuada de grandes bibliotecas combinatorias ^8,9. Un filtrado y clasificación precisos de FACS son esenciales para separar celdas que muestran las propiedades deseadas de corte de aquellas que presentan clivagen inespecífico. Durante múltiples rondas de selección basada en FACS, la estrategia de gating se vuelve cada vez más estricta para enriquecer selectivamente las variantes de proteasas deseadas. Si la compuerta es demasiado amplia, se pueden clasificar las células no deseadas junto con las variantes deseadas. Un gating estricto (por ejemplo, umbrales cada vez más bajos para la señal FITC entre rondas) permite que la población celular se enriquezca para variantes de proteasas con mayor especificidad y actividad hacia la nueva secuencia de sustrato^{objetivo 10}. En consonancia con campañas^{anteriores 7,18}, realizamos mutagénesis de codones NNS de cuatro residuos en el bolsillo de unión al sustrato de TEVp que interactúan con el residuo P1 del sustrato, Q (T146, D148, H167, S170) (Figura suplementaria 2). Los gráficos FACS mostrados en la Figura 6B representan un único experimento de clasificación representativa que ilustra la estrategia de acceso y el flujo de trabajo de enriquecimiento. Curiosamente, los resultados de nuestra campaña produjeron variantes TEVp con un conjunto diferente de mutaciones en aminoácidos (Tabla 11). Estos resultados apoyan una característica clave de la evolución de la proteasa: múltiples caminos evolutivos pueden conducir al mismo objetivo.

Puede ser necesario realizar modificaciones y estrategias de solución de problemas al realizar los experimentos. Por ejemplo, durante la electroporación, trabajar sobre hielo cuando sea necesario y volver a suspender cuidadosamente los pellets celulares en cada paso garantiza que las células estén vivas y sanas antes de la electroporación. Las células de levadura son delicadas durante los pasos de electroporación hasta la etapa de recuperación del crecimiento exterior. Además, puede ser necesaria modificar el fluido de la vaina FACS para evitar la floculación de las células de levadura. El líquido de vaina se utiliza comúnmente en máquinas FACS y puede contener conservantes que inhiben el crecimiento bacteriano y fúngico. Por lo tanto, el líquido de la vaina puede sustituirse por PBS puro para evitar la muerte celular durante la clasificación.

El sistema de visualización superficial de la levadura requiere proteínas correctamente plegadas para atravesar con éxito la vía secretora. Algunas variantes de proteasas pueden perder actividad debido a un plegamiento incorrecto, lo que provoca falsos positivos durante la selección de FACS causados por clivages inespecíficos o fluorescencia de fondo. Merece la pena destacar las fuentes bien caracterizadas de falsos positivos en campañas basadas en plásmidos como esta. Como la cissión se interpreta como pérdida de la etiqueta epitópica C-terminal, cualquier mutación que altere esa etiqueta produce el mismo fenotipo de bajo FITC que un evento genuino de clivación; Estas mutaciones en etiquetas surgen durante la recombinación homóloga a gran escala y pueden enriquecerse a lo largo de rondas de clasificación sucesivas. Recientemente se ha demostrado que la integración cromosómica del casete de sustrato constante mitiga este^{problema 19}. El protocolo se basa en el uso de una biblioteca de inserción manteniendo constante el vector (que contiene el casete sustrato). Por lo tanto, este protocolo no es adecuado para quienes desean evolucionar tanto bibliotecas de proteasas como de sustratos.

La plataforma YESS fue pionera en una vía general para reprogramar la especificidad^{proteasa-sustrato 18}. Las mejoras recientes incluyen: añadir control enzimático/sustrato titulable en YESS2.0⁷, acoplamiento a secuenciación de próxima generación, permitir un perfil de especificidad^{de alta resolución 20} e integración cromosómica de los reporteros para reducir el ruido de expresión y los falsos^{positivos 19}. Otras estrategias ortogonales, como la evolución continua asistida por fagos, también se han aplicado en la ingeniería de la especificidad de proteasas para dianas^{terapéuticas 21}. Estas herramientas han encontrado aplicaciones más allá de la ingeniería de proteasas TEV, como el perfilado de alta resolución de la proteasa principal del SARS-CoV-2 para guiar el diseño del^{inhibidor 22}. Un determinante crucial de cualquier campaña de este tipo es generar suficientes transformantes para cubrir grandes bibliotecas combinatorias (>10⁹), que no habían sido optimizadas sistemáticamente en la cepa EBY100 S. cerevisiae . Al definir las condiciones de fase de crecimiento y de electroporación que impulsan la transformación EBY100 por encima de^10,9 UFC, este protocolo elimina ese cuello de botella, permitiendo un cribado exhaustivo basado en FACS de millones de variantes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software