Plataforma de tinta sacrificial impresa en 3D para el procesamiento de imágenes de alta resolución de la función de las células endoteliales en vasos tortuosos y aneurismas

Resumen

El protocolo detalla cómo diseñar y ensamblar vasos sanguíneos in vitro con segmentos tortuosos o aneurismáticos, utilizando una impresora de extrusión o la aplicación manual de tinta sacrificable pasteurizada, y cómo evaluar el flujo hemodinámico y las respuestas de las células endoteliales.

Resumen

La tortuosidad vascular y los aneurismas representan riesgos significativos para la salud en una variedad de tejidos humanos y tipos de vasos sanguíneos. Estas alteraciones en la forma de los vasos provocan anomalías en la dinámica del flujo sanguíneo, lo que impacta considerablemente la función endotelial. Los modelos animales de estos estados de enfermedad vascular han sido ilustrativos en algunos casos, pero son costosos de establecer y están limitados a la fisiología de la especie animal. En respuesta a esto, los modelos in vitro tridimensionales de órganos-en-un-chip (OOC) se han convertido en una herramienta poderosa para evaluar la función vascular y las respuestas endoteliales en células humanas. Aunque cada uno de los modelos OOC tiene sus fortalezas, se necesita un sistema accesible para estudiar la permeabilidad vascular, un indicador clave de la función vascular en vasos curvados y aneurismas bajo tasas de cizallamiento y presión fisiológicas. Aquí, la metodología presentada permite el estudio de las respuestas de células endoteliales humanas a anomalías del flujo en un sistema modelo de vaso curvado económico, utilizando una biopresora básica que produce vasos compatibles con tasas fisiológicas de flujo de fluidos, estudios de permeabilidad, microscopía óptica de alta resolución y soporte de matriz extracelular con rigidez fisiológica.

Introducción

La morfología de los vasos sanguíneos es un indicador importante de la función vascular, ya que la tortuosidad vascular y los aneurismas son signos clave de diversas enfermedades y riesgos para la salud. La tortuosidad vascular puede ser congénita, como en síndromes como Marfan¹, Turner² y Loeys-Dietz³, o puede desarrollarse más adelante en la vida como característica distintiva de varias enfermedades, incluyendo hipertensión, diabetes, cáncer y posiblemente aterosclerosis^4,5,6. Los aneurismas de tejidos arteriales, incluidas las arterias carótida⁷, coronaria⁸, femoral⁹, aorta¹⁰ y cerebral¹¹, se asocian con morbilidad y riesgos para la salud debido a la disección espontánea o ruptura. Además de causar irregularidades en el flujo y la consiguiente inflamación endotelial, la tortuosidad vascular y los aneurismas pueden indicar disfunción tisular e inflamación subyacentes. Por ejemplo, en recién nacidos y niños, el síndrome de tortuosidad arterial es clínicamente predictivo de accidente cerebrovascular en la infancia¹², hipertensión pulmonar persistente y disección aórtica^4,13. En adultos, la vasculitis retiniana se presenta con vasos retinianos tortuosos que se vuelven menos evidentes conforme remite la inflamación subyacente¹⁴. Cómo se detecta la tortuosidad y se traduce en señales anómalas que impulsan la progresión de la enfermedad sigue siendo un área activa de investigación. Se cree que las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos actúan como sensores primarios en este proceso. El flujo alterado o lento inducido por la tortuosidad vascular o los aneurismas modifica el estrés cortante, provocando cambios endoteliales en la señalización inflamatoria¹⁵ y en la función de barrera¹⁶. Las células endoteliales son altamente sensibles al flujo de líquidos mediante mecanismos que involucran cilios primarios¹⁷, proteínas de adhesión mecanosensibles^18,19 y canales iónicos^20,21, que activan señales capaces de inducir fuga, inflamación y reprogramación endotelial^22,23,24. Por lo tanto, los métodos para estudiar las respuestas endoteliales a la geometría vascular tortuosa son importantes para el desarrollo de terapias vasculares.

Las funciones endoteliales en estados de enfermedades vasculares se han modelado utilizando modelos animales in vivo, sistemas de órgano-en-un-chip (OOC) y enfoques de bioprinting. Los modelos de ratón permiten el control de la expresión de genes relacionados con enfermedades conocidas e incorporan la complejidad de la arquitectura tisular y la fisiología, incluyendo la participación de células murales e inmunitarias. Los modelos de ratón de aterosclerosis²⁵, síndrome de Marfan²⁶ y diversas aneurismas^27,28,29 proporcionan información sobre las patologías asociadas con la disfunción vascular. A pesar de estas ventajas, la observación directa, la manipulación experimental y la cuantificación de células endoteliales son difíciles de lograr, aparte de métodos globales como la secuenciación de ARN. Además, los modelos animales plantean consideraciones éticas y de costo, y están limitados por la fisiología específica de la especie.

Se han desarrollado varios enfoques de órganos-en-un-chip in vitro para estudiar las respuestas endoteliales humanas al flujo laminar y perturbado^30,31,32 tanto en sistemas 2D^33,34 como 3D^35,36,37. La extensa literatura sobre órganos-en-un-chip³⁸ ha estado impulsada principalmente por la ingeniería biomédica, con características de diseño dirigidas a preguntas biomédicas específicas. Muchos modelos vasculares de órganos-en-un-chip utilizan soportes de polidimetilsiloxano (PDMS) para controlar la arquitectura vascular³⁸. Estos modelos permiten un control de alta resolución de geometrías complejas y posibilitan la modelización de interacciones entre órganos y vasos, incluyendo aquellas que involucran al hígado³⁹, el cerebro⁴⁰ y el pulmón⁴¹. Sin embargo, persisten limitaciones. La baja permeabilidad del PDMS y de polímeros similares a macromoléculas puede restringir los estudios de la función de barrera vascular. Además, la mayoría del PDMS curado tiene una rigidez de aproximadamente 0,8–10 MPa⁴², aunque formulaciones alternativas pueden alcanzar rangos más fisiológicos de 8–200 kPa⁴³. Las estimaciones de la rigidez de la membrana basal vascular varían desde ~350 Pa⁴⁴ hasta ~70 kPa⁴⁵, dependiendo del tipo de vaso y del método de medición, encontrándose la mayoría de las membranas basales vasculares sanas en el rango de 2–3 kPa⁴⁶. Dado que enfermedades vasculares como la aterosclerosis y la hipertensión están parcialmente asociadas con un aumento de la rigidez de la matriz extracelular (ECM)^{47,48,49,50,51}, y las células endoteliales responden a la rigidez de la ECM, es importante controlar la rigidez dentro de rangos fisiológicos en modelos in vitro. Enfoques más recientes de órganos-en-un-chip utilizan sustratos fisiológicos que permiten geometrías complejas^52,53, incorporan múltiples tipos celulares para recapitular la función del órgano^{39,54,55,56,57}, o interacciones inmuno-vasculares⁵⁸, modelan estructuras vasculares específicas del paciente^59,60, y apoyan el desarrollo preclínico de fármacos^61,62. En muchos modelos microvasculares que implican interacciones con otros tipos celulares, las células endoteliales forman espontáneamente vasos con geometrías relativamente poco controladas⁶³. Por el contrario, los sistemas de órganos-en-un-chip que permiten geometrías vasculares definidas bajo flujo controlado a menudo requieren una infraestructura, materiales y experiencia técnica considerables^53,64. Por lo tanto, se necesitan métodos robustos accesibles para no expertos que faciliten los estudios del comportamiento celular vascular en condiciones fisiológicamente relevantes.

Las plataformas de bioimpresión compatibles con hidrogeles de matriz extracelular (ECM) fisiológicos proporcionan modelos in vitro versátiles para estudiar la función endotelial en distintas geometrías vasculares⁶⁵. Estos enfoques utilizan ya sea la deposición dirigida de geles que contienen células endoteliales con forma de vaso sanguíneo⁶⁶ o tinta sacrificial para generar lúmenes tubulares abiertos incrustados en la ECM que posteriormente pueden disolverse, dejando un lumen que puede sembrarse con células endoteliales⁵⁴. Los sustratos de ECM biológicamente compatibles, incluyendo gelatina, colágeno y fibrina, pueden ajustarse a rigideces que se aproximan a las de la membrana basal vascular (1–3 kPa⁶⁷) y permiten ensayos de permeabilidad vascular similares a los utilizados in vivo. Aunque estos enfoques no alcanzan la misma resolución de forma y tamaño que la fabricación con PDMS, es posible generar vasos curvados, ramificados y estenóticos^52,66,68. Por lo tanto, estas plataformas son adecuadas para modelar geometrías vasculares, incluyendo vasos tortuosos y aneurismáticos.

El método presentado aquí utiliza un enfoque de impresión 3D basado en extrusión neumática, posicionamiento tridimensional a escala micrométrica, control de temperatura de la plataforma de impresión y del cabezal de impresión que contiene la tinta, y una tinta sacrificable previamente desarrollada para interacciones renales-vasculares en un chip^67,69. La tinta sacrificable se imprime en la geometría vascular deseada y se incrusta inmediatamente en la MEC. Un cambio de temperatura elimina posteriormente la tinta, dejando una luz abierta en la MEC que se siembra con células endoteliales humanas. La MEC base consiste en gelatina y fibrina, lo que permite una gelificación rápida y la polimerización del fibrinógeno mediada por trombina, a la vez que proporciona rigidez mecánica adecuada para muchas membranas basales vasculares. Se pueden incorporar componentes adicionales de la MEC, como laminina o fibronectina, para imitar mejor la composición de la membrana basal vascular^70,71,72 y promover la adhesión endotelial. El sistema se ensambla en cámaras reutilizables de Rose⁷³ que contienen soportes metálicos, juntas de caucho de silicona y cubreobjetos de microscopio de alta resolución, lo que permite la conexión a una bomba de fluidos mediante agujas con conexión Luer-lock. Alternativamente, las placas superior e inferior pueden fabricarse mediante impresión 3D utilizando ácido poliláctico o material reforzado con fibra de carbono. El sistema ensamblado tolera las presiones generadas por tasas de flujo fisiológicas. Un procedimiento de pasteurización también mejora la esterilidad de la tinta sacrificable sin alterar sus propiedades físicas. Además, un enfoque basado en plantillas de agujas y bio-tinta permite la fabricación de vasos rectos que contienen un aneurisma sin necesidad de una biopresora. Los vasos tortuosos o aneurismáticos endotelializados resultantes pueden examinarse bajo flujo fisiológico mediante microscopía óptica de alta resolución durante aproximadamente una semana, lo que permite investigar las respuestas endoteliales agudas a cambios en la geometría vascular.

Una ventaja importante de este sistema es su compatibilidad con la microscopía óptica. Los vasos generados in vitro mediante este protocolo son adecuados para diversas modalidades de obtención de imágenes y son particularmente apropiados para microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio o con escaneo láser. Deben considerarse la resolución espacial y temporal, la sensibilidad y la distancia de trabajo del objetivo al seleccionar las condiciones de imagen. Para la mayoría de los vasos generados con este sistema, el objetivo debe tener una distancia de trabajo suficiente para alcanzar aproximadamente entre 100 y 300 µm desde la cubeta e imaginar a través del punto medio del vaso. Se requieren objetivos de alta apertura numérica para obtener imágenes de alta resolución de estructuras endoteliales, incluyendo orgánulos y adhesiones celulares, y para imágenes en vivo que requieran alta resolución temporal, como el seguimiento de microesferas de referencia bajo flujo. Algunos ensayos que requieren una captación de fotones menos eficiente, como las mediciones de barrera endotelial basadas en fluorescencia, pueden realizarse utilizando objetivos de menor apertura numérica, como objetivos de aire de 10–20×.

El protocolo describe la generación de vasos tortuosos y aneurismáticos compuestos por células endoteliales humanas en un sistema in vitro que permite el flujo fisiológico de fluidos y microscopía de alta resolución. El flujo de trabajo incluye el diseño del vaso, la fabricación de la cámara, la preparación y la impresión 3D de tinta sacrificial, la preparación de la matriz extracelular y la eliminación de la tinta, la siembra y el cultivo de células endoteliales bajo flujo, la evaluación de la fuga vascular, el mapeo del flujo y la tinción por inmunofluorescencia (Figura 1).

Protocolo

1. Diseñe el recipiente

1. Seleccione un segmento vascular que quepa dentro de la cámara compatible con el microscopio. Para una cámara Rose, mantenga no más de 1,6 cm entre los depósitos de entrada y salida.
2. Importe la angiografía por TC con contraste (Figura 2A), la angiografía por resonancia magnética o la imagen de angiografía fluoroscópica a ImageJ/FIJI u otro programa de análisis de imágenes.
3. Utilice la herramienta de medición de puntos para definir las coordenadas XY a lo largo del centro axial del vaso. Exporte las coordenadas a un programa de hojas de cálculo (Figura 2B).
   NOTA: Los archivos STL derivados de angiografía por TC pueden importarse directamente a la mayoría de los programas de impresión; sin embargo, la impresión basada en polígonos puede requerir múltiples pasadas y producir vasos trenzados (Figura adicional 1). Utilice G-code directo para impresión de una sola pasada. Por esta razón, se prefiere el mapeo de coordenadas y el diseño en G-code. Véase ejemplo de G-code en los Archivos complementarios.
4. Modifique las coordenadas XY en la hoja de cálculo para posicionar el centro del vaso en el origen gráfico. Importe el límite de la cámara, si es necesario, para confirmar que la impresión final quepa dentro de la cámara.
5. Utilice las coordenadas XY del vaso para diseñar el vaso en la primera capa de impresión (Figura 2C). Establezca la altura de la primera capa, incluyendo el vaso y los depósitos de entrada y salida contiguos, en 200µm.
6. Cree depósitos de entrada y salida que permitan la inserción cómoda de agujas. Utilice depósitos en forma de diamante cuando sea apropiado para dirigir eficientemente el fluido hacia la entrada del vaso, minimizando la turbulencia de entrada (Figura 2).
7. Incluya los depósitos en la primera capa de impresión para que permanezcan contiguos al vaso. Añada 5–9 capas encima de la capa base para proporcionar suficiente volumen para colocar las agujas de entrada y salida. Para el diseño en G-code, los siguientes detalles son importantes:
   1. Configure la boquilla de impresión y la plataforma, cuando haya control de temperatura, a 37°C utilizando el software de la impresora o los comandos G-code apropiados al inicio del archivo de impresión.
   2. Especifique la boquilla de impresión o extrusora en el G-code cuando haya múltiples boquillas disponibles. Configure el G-code para usar coordenadas absolutas y distancias de extrusión.
   3. Ajuste la altura de la capa según el tamaño y forma de la aguja, la presión de flujo de tinta y la velocidad de la boquilla. Utilice una altura de capa de 200µm para cada capa de depósito por encima de la primera capa en los ejemplos descritos aquí.
   4. Utilice una contrapresión de 14–17 psi y una velocidad de boquilla de 6 mm/s (G-code: F360) para los depósitos. Aumente la velocidad de la boquilla a 15 mm/s (G-code: F900) para el vaso.
8. Pruebe cada nuevo diseño de vaso sobre un portaobjetos de vidrio sin cámara antes de imprimir el vaso final.

2. Preparar la tinta sacrificial

1. Añada 2.1 g de óxido de polietileno (PEO) a 60 mL de agua estéril fría para preparar una solución al 3,5 % p/v en un recipiente estéril con tapa que contenga una barra de agitación estéril. Agite a 4 °C durante al menos 48 h y verifique periódicamente que todo el polvo se haya disuelto.
   NOTA: Almacene la solución de PEO en un recipiente hermético a 4 °C durante hasta 1 mes.
2. Añada 17,5 g de Pluronic F-127 a 50 mL de agua estéril fría para preparar una solución al 35 % en un recipiente estéril con tapa que contenga una barra de agitación estéril. Agite a 4 °C durante al menos 48 h y verifique periódicamente la completa incorporación del polvo.
3. Combine 11,4 mL de PEO frío al 3,5 % con 28,6 mL de Pluronic F-127 frío al 35 % en un tubo cónico estéril de 50 mL. Mezcle durante al menos 24 h a 4 °C en un mezclador rotatorio.
4. Coloque el tubo en posición vertical a 4 °C durante la noche para permitir que las burbujas asciendan y salgan de la solución.
5. Coloque el tubo cónico que contiene la tinta en un baño de agua y incube a 63 °C durante 3 h. Deje la tapa ligeramente abierta durante el calentamiento para permitir que el aire en expansión escape.
6. Retire el tubo del baño de agua y déjelo enfriar gradualmente hasta temperatura ambiente. Ajuste la tapa una vez que la solución se haya enfriado.
7. Coloque la tinta pasteurizada en hielo durante 2, agitando suavemente de vez en cuando sin introducir burbujas.
8. Retire el émbolo de la jeringa, tape el puerto de la aguja y llene la jeringa hasta un 60 %–70 % de su capacidad. Inserte el émbolo, invierta la jeringa, retire la tapa del puerto de la aguja y expulse todo el aire atrapado.
   NOTA: Almacene las jeringas llenas a temperatura ambiente durante hasta 1 mes.

3. Fabricar la cámara Rose y preparar la tubería

1. Fabrique las placas de sujeción superior e inferior en aluminio o imprima en 3D las placas utilizando los archivos CAD/STL proporcionados (Figura 2). Incluya un puerto inferior biselado suficientemente grande para permitir el acceso de objetivos de alta apertura numérica y un borde de soporte para los tornillos que compriman firmemente las cubreobjetos contra la junta.
   NOTA: El aluminio proporciona una mejor transferencia de calor durante la microscopía con platina calefactable. Las piezas impresas en 3D de PLA o reforzadas con fibra de carbono son adecuadas para prototipos, pero pueden tener una transferencia de calor más pobre y podrían deformarse tras calentamientos repetidos.
2. Corte la lámina de silicona para que coincida con las placas de sujeción de 38 mm × 51 mm. Cree la ventana central de observación utilizando un punzón de 18 mm.
3. Perfore orificios adecuados al diámetro de los tornillos seleccionados. Enjuague exhaustivamente la junta terminada con agua para eliminar los residuos de silicona.
4. Someta las placas de sujeción metálicas, tornillos, tuercas y juntas de silicona a autoclave en una bolsa cerrada de papel de aluminio utilizando un ciclo seco de 20 min.
5. Sumerja las placas impresas en 3D en etanol al 70 % durante 1 min. Seque las placas en un campo estéril.
6. Prepare longitudes de tubo de 10–30 cm equipadas con conectores Luer-lock, pinzas de tubo en línea, tubo adecuado para bomba peristáltica, una llave de paso de tres vías, un amortiguador de pulsos y un depósito de medio de dos puertos (Figura 3).
7. Esterilice los componentes de tubo y depósito compatibles con calor mediante autoclave. Esterilice los componentes que no puedan autoclavarse mediante exposición al etanol.

4. Preparar los reactivos de la matriz extracelular

1. Añada 12.5 mL de PBS tibio a 37°C a 1 g de fibrinógeno de plasma humano para preparar una solución stock de 80 mg/mL. Incube a 37°C y agite suavemente de vez en cuando sin usar vórtex.
2. Deje que el fibrinógeno se disuelva durante 1–2 h, formando una solución turbia. Aliquote la solución en tubos estériles y almacénela a −20°C durante hasta 3 meses.
3. Añada 22.5 g de gelatina a 135 mL de PBS estéril en un frasco estéril que contenga una barra magnética de agitación. Agite durante 16 h a 70°C, agitando periódicamente el frasco para asegurar una disolución completa.
4. Ajuste la solución de gelatina a pH 7.5 usando NaOH 1 M. Filtre al vacío la solución mientras esté caliente, alíquotela y almacénela a 4°C durante hasta 6 meses.
   NOTA: Permita que la gelatina se hidrate durante al menos 16 h antes de la filtración. Mantenga la solución y el aparato de filtración a 37°C durante la filtración al vacío para minimizar la obstrucción del filtro.
5. Disuelva trombina de plasma humano en PBS estéril hasta obtener una concentración de 1.000 U/mL. Mezcle suavemente, alíquotela y almacénela a −20 °C durante hasta 1 año.
6. Disuelva 300 mg de transglutaminasa en 5 mL de PBS e incube a 37°C durante 1 h con mezclas ocasionales. Filtre estérilmente la solución en un tubo nuevo y manténgala a temperatura ambiente.
   NOTA: Prepare la solución de transglutaminasa fresca cada día. Almacene la transglutaminasa en polvo desecada a 4°C.
7. Disuelva cloruro de calcio en agua para preparar una solución 1 M. Filtre estérilmente la solución y almacénela a temperatura ambiente durante hasta 1 año.

5. Preparar y activar las laminillas

1. Sumerja laminillas limpias en etanol, luego pásalas cuidadosamente sobre la llama de un mechero Bunsen para evaporar el etanol.
   ADVERTENCIA: El etanol es inflamable. Mantén el etanol en grandes cantidades alejado de la llama abierta y realiza la esterilización con llama siguiendo los procedimientos adecuados de seguridad contra incendios en el laboratorio.
2. Coloca las laminillas en una rejilla de acero inoxidable sin agrietar ni astillar el vidrio.
3. Sumerge las laminillas en silano (3-aminopropil) al 0,5 % diluido en agua durante 30–60 min a temperatura ambiente. Aplica agitación suave durante la incubación.
   ADVERTENCIA: Manipula el silano (3-aminopropil) trimetoxi utilizando equipo de protección química adecuado y controles de ingeniería apropiados.
4. Lava las laminillas con seis cambios de agua con agitación suave. Evita que las laminillas se salgan al transferir la rejilla.
5. Saca la rejilla del agua, seca el exceso de agua con papel absorbente y sécala a 50 °C durante 30 min.
6. Deja que las laminillas se enfríen a temperatura ambiente mientras preparas glutaraldehído al 0,5 % en PBS.
   ADVERTENCIA: El glutaraldehído es tóxico e irritante. Prepara y manipula la solución en una campana extractora de gases adecuada, utilizando equipo de protección personal apropiado.
7. Incuba las laminillas en glutaraldehído al 0,5 % durante 60 min con agitación suave para minimizar la acumulación de burbujas y favorecer una activación uniforme.
8. Enjuaga las laminillas con tres cambios de agua estéril y déjalas secar al aire a temperatura ambiente.
   NOTA: Almacena las laminillas activadas bajo desecación al vacío hasta por 2 meses.

6. Recubra las laminillas con la capa base de matriz extracelular

1. Caliente 1× PBS, el stock de gelatina y el stock de fibrinógeno a 37°C durante 30–60 min.
2. Forre una placa de Petri estéril de 15 cm con parafina limpia, rocíe la superficie con etanol al 70%, drene el exceso y deje secar al aire en un gabinete de seguridad biológica.
3. Agregue secuencialmente a un tubo cónico de 15 mL: 1,68 mL de PBS tibio, 2,5 mL de stock de gelatina, 12,5 µL de CaCl₂ 1 M, 625 µL de stock de fibrinógeno y 167 µL de solución de transglutaminasa.
4. Coloque la mezcla de matriz extracelular (ECM) en un baño de agua a 37°C durante 30 min.
5. Prepare un tubo de 1,7 mL que contenga 5 µL de stock de trombina por cada cubreobjetos.
6. Agregue 400 µL de la preparación de ECM al tubo de trombina y mezcle pipeteando una vez, minimizando la formación de burbujas.
7. Inmediatamente, dispense 200 µL de la mezcla sobre la parafina estéril y coloque un cubreobjetos activado sobre la gota usando pinzas. Presione suavemente para lograr una cobertura completa.
   NOTA: Realice este paso dentro de aproximadamente 20 s después de combinar la mezcla de ECM con trombina.
8. Cubra la placa de Petri e incube los cubreobjetos recubiertos durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de 2 h a 37°C en un incubador humedecido.
9. Desprenda cuidadosamente cada cubreobjetos de la parafina doblando esta última lejos del cubreobjetos.
10. Coloque los cubreobjetos recién recubiertos con el lado del gel hacia arriba en una placa de Petri limpia dentro de un incubador humedecido y úselos dentro de 1 día.
11. Alternativamente, incube los cubreobjetos recubiertos durante la noche en un incubador no humedecido y úselos dentro de 2 días.

7. Bioprinte la tinta de sacrificio y encápsulela en la MEC

1. Realice impresiones de prueba antes de imprimir el vaso para confirmar que la tinta y los parámetros de impresión produzcan las dimensiones deseadas del vaso. Cargue el archivo de impresión en el software de la impresora.
   NOTA: Una aguja dispensadora cónica de 32 G con tinta de Pluronic F127 al 25 %/PEO al 1 % produce de forma confiable diámetros de vaso de hasta aproximadamente 150 µm bajo las condiciones descritas aquí. Optimice la velocidad del cabezal de impresión y la contrapresión utilizando impresiones de líneas simples sobre vidrio.
2. Monte la placa de sujeción inferior, la cubreobjetos inferior recubierta con matriz extracelular (ECM), la junta de silicona, la placa de sujeción superior sin cubreobjetos superior y los dos tornillos. Coloque el ensamblaje en una placa de Petri de 100 mm tapada y manténgalo a 37 °C hasta su uso el mismo día.
3. Conecte la aguja de impresión al jeringa de tinta e instale la jeringa en la impresora de extrusión neumática. Precaliente la plataforma de impresión, el cabezal de impresión y una placa calefactora adyacente a 37 °C.
4. Prepare la matriz ECM según se describe en la Sección 6 y manténgala en un baño de agua a 37 °C. Prepare 1,5 mL de matriz por cámara Rose en lotes de 5 mL.
5. Coloque 5 µL de solución stock de trombina en un tubo estéril de 1,7 o 2 mL para cada cámara. Mantenga cubreobjetos adicionales activados y sin recubrir disponibles en la cabina de seguridad biológica.
6. Coloque la cámara que contiene el cubreobjetos recubierto con ECM sobre la plataforma de la impresora y colóquela centrada en el origen XY. Baje la aguja hasta que haga contacto con la superficie de ECM o vidrio en el centro de la ventana de la cámara, y defina esta posición como el origen XYZ.
7. Eleve la aguja y aplique presión máxima para llenarla completamente con tinta y expulsar cualquier burbuja visible. Limpie la punta de la aguja con un tejido estéril de laboratorio.
8. Imprima la geometría del vaso y los depósitos utilizando el archivo G-code cargado. Eleve inmediatamente la aguja y retire la cámara tras la impresión.
9. Examine el vaso impreso en busca de burbujas y discontinuidades. Descarte e imprima nuevamente cualquier estructura que presente alguno de estos defectos.
10. Coloque la cámara sobre la placa calefactora a 37 °C, retire los tornillos y la placa de sujeción superior, y mezcle 1 mL de la matriz ECM preparada con la alícuota de trombina pipeteando una vez.
11. Transfiera la mezcla de ECM activada dentro de la cámara del vaso sin introducir burbujas y coloque inmediatamente un cubreobjetos activado con la cara hacia abajo sobre el ECM. Vuelva a colocar la placa de sujeción superior y apriete los tornillos hasta que queden firmes sin sobreapretarlos.
12. Coloque la cámara terminada en una placa de Petri de 100 mm tapada e incube a 37 °C durante 2 h.

8. Genere un aneurisma utilizando una plantilla de alambre

1. Inserte agujas de calibre 21 a través de los lados opuestos de la junta de silicona y alínelas.
2. Someta a sonicación un alambre de mandril médico de acero inoxidable 304 de 0,0190 pulgadas de diámetro en PBS que contenga 1 % de BSA en un tubo cónico de 15 mL. Retire el alambre y déjelo secar al aire en una placa de Petri estéril dentro de una cabina de seguridad biológica.
3. Pase el alambre recubierto con BSA a través de ambas agujas en la junta (Figura 2). Doble ligeramente un extremo sobresaliente para facilitar la rotación posterior.
4. Someta a autoclave el conjunto de junta, agujas, alambre y placa de sujeción en un envoltorio de papel de aluminio.
5. Coloque el conjunto de agujas/junta sobre un cubreobjetos activado y recubierto con matriz extracelular (ECM).
6. Fije una aguja de 21 G a una jeringa que contenga tinta de Plurónico/PEO pasteurizada.
7. Dispense una pequeña gota de tinta sacrificial sobre el lateral del alambre en el centro de la cámara. Aplique una pequeña gota de tinta en cada unión entre aguja y alambre para crear un sello.
8. Prepare la mezcla de ECM y arme la cámara según se describe en las secciones 7.10–7.12.
9. Una vez que la ECM haya gelificado, gire suavemente el extremo doblado del alambre para liberarlo de la ECM y de la tinta sacrificial. Retire lentamente el alambre del dispositivo.
10. Llene la aguja de entrada con PBS utilizando una pipeta de 200 µL y permita que el PBS drene a través del lumen. Repita una vez y continúe con la sección 9.

9. Lave la tinta de sacrificio de la cámara del recipiente

1. Conecte un tubo a un reservorio que contenga PBS frío (4 °C) suplementado con antibióticos, incorpore una llave de paso de tres vías y termine el tubo con una conexión macho Luer-lock y una aguja estéril de 23 G.
2. Llene el tubo de suministro con PBS frío utilizando la jeringa conectada a la llave de paso hasta que el PBS salga por la luz de la aguja. Pinche el tubo.
3. Llene una segunda sección de tubo con PBS y termínela con una aguja de 23 G. Pinche el tubo y retire la jeringa de llenado.
4. Introduzca la aguja de suministro a través de la junta hasta el reservorio de entrada y la aguja de drenaje hasta el reservorio de salida. Confirme la colocación correcta utilizando un microscopio invertido o un estereomicroscopio.
5. Transfiera el conjunto a 4 °C y coloque el reservorio de suministro a 30 cm por encima de la entrada. Coloque la salida a 5–10 cm por debajo de la aguja de salida del recipiente, sobre un recipiente de desecho.
6. Suelte las pinzas y pase al menos 250 mL de PBS frío a través de la cámara. Inspeccione el sistema en busca de fugas y burbujas durante el lavado.

10. Recubrir y pretratar la luz del vaso con componentes adicionales de la matriz extracelular

1. Diluya la fibronectina a 20 µg/mL, la laminina a 10 µg/mL o la matriz de membrana basal a una dilución 1:30 en 3 mL de PBS.
2. Añada transglutaminasa recién preparada al reactivo de matriz extracelular diluido.
3. Deje el tubo inmediatamente proximal al vaso conectado a la entrada y salida.
4. Inyecte lentamente la solución de matriz extracelular/transglutaminasa a través del vaso utilizando una jeringa de 1 mL. Repita hasta que los 3 mL completen el paso a través del vaso.
5. Coloque pinzas en los conectores, tape la entrada y salida con tapones Luer estériles e incube a 37 °C durante 1 h hasta toda la noche.
6. Lave el vaso con 100 mL de medio endotelial completo que contenga penicilina/estreptomicina. Coloque pinzas en los conectores del tubo y tape las salidas.
   NOTA: Almacene el vaso lleno de medio a 4 °C durante hasta 1 semana. Asegúrese de que no queden burbujas en la luz.

11. Celularizar el vaso

1. Incubar la cámara que contiene la plantilla del vaso ECM a 37 °C durante 2 h. Calentar el medio endotelial completo que contiene penicilina/estreptomicina a 37 °C.
2. Realizar una tripsinización de las células endoteliales de un plato de cultivo de 10 cm o de un matraz T75, y neutralizar la tripsina con medio completo. Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 mL y retirar una alícuota para el recuento celular.
3. Centrifugar las células a 1.000 × g durante 5 min. Suspender el sedimento para preparar 150 µL de suspensión celular a 5 × 10⁶ células/mL.
4. Conectar el tubo de salida a un depósito estéril de desecho y mantener la pinza del tubo cerrada.
5. Desconectar el tubo de entrada y eliminar el medio residual del cono de la aguja de entrada. Sostener el vaso en posición vertical y pipetear la suspensión celular dentro del cono de la aguja.
6. Soltar la pinza de salida para permitir que la suspensión celular entre en el vaso. Volver a pinzar la salida una vez que toda la suspensión haya entrado en la luz.
7. Añadir medio completo caliente al cono de la aguja de entrada, luego cerrarlo con una tapa Luer estéril. Desconectar y tapar la salida.
8. Incubar la cámara en posición normal a 37 °C durante 3 h.
9. Repetir las secciones 11.5–11.8 e incubar la cámara boca abajo a 37 °C durante 3 h.
10. Lavar suavemente el vaso con 1 mL de medio completo e incubar a 37 °C durante 3 h.
11. Confirmar la adhesión endotelial mediante microscopía, enjuagar suavemente con medio fresco para eliminar las células no adheridas y incubar a 37 °C durante 12–24 h.

12. Incubar el vaso bajo flujo

1. Caliente 200 mL de medio completo durante 1 h y desgasifique bajo vacío utilizando una unidad de filtro estéril. Vuelva a calentar el medio en un incubador de CO₂ humedecido.
2. En una cabina de seguridad biológica estéril, conecte en secuencia la salida del depósito de medio, la llave de paso de tres vías, el tubo de la bomba, el amortiguador de pulso, el trampa de burbujas opcional, el tubo de entrada, la cámara del vaso, el tubo de salida y el tubo de retorno al depósito de medio (Figura 3).
3. Llene todo el circuito de flujo con medio y confirme que no queden burbujas ni bolsas de aire.
   NOTA: Llene con líquido las conexiones y los extremos de las agujas antes de volver a conectarlas. La entrada de burbujas de aire en un vaso celularizado puede provocar la pérdida de células endoteliales debido a fuerzas de cizalladura bruscas.
4. Transfiera el conjunto a un incubador a 37 °C e inicie un flujo de 1 dyn/cm² en el vaso. Mantenga este flujo durante 12 h.
5. Aumente el flujo para generar 12–16 dyn/cm² y manténgalo durante 18–24 h antes de realizar los ensayos posteriores. Para calcular el caudal necesario para su vaso, determine la longitud impresa del vaso y su diámetro medio. Utilizando una calculadora en línea, introduzca los parámetros determinados y seleccione una sección transversal circular, medio con 10% de suero y resistencia de tubo despreciable (el tubo tiene un diámetro mucho mayor que el del vaso impreso).
   NOTA: Utilice el vaso lo antes posible tras el acondicionamiento con flujo. Cultivos superiores a 1 semana pueden provocar espacios entre las células endoteliales, posiblemente asociados con pérdida celular o modificación de la matriz extracelular por proteasas endoteliales.

13. Realizar el ensayo de fuga vascular

1. Añada BSA marcada con Alexa 647 o dextrano de 10 kDa marcado con Alexa 647 a 35 mL de medio completo para obtener una concentración final de 5 mg/mL. Caliente la solución a 37 °C.
2. Preincube el vaso con el agente de prueba, como 250 ng/mL de TNFα, durante 1–2 h e incluya el mismo agente en el medio del ensayo.
3. Prepare un baño de agua a 37 °C y coloque la bomba cerca del microscopio. Encienda el microscopio, el software de adquisición y el sistema de calentamiento de la platina, y equilibre la platina a 37 °C durante 30 min antes de la adquisición de imágenes.
4. Detenga el flujo en el incubador, desconecte el depósito de medio de cultivo y transfiera la cámara y los tubos asociados a la platina del microscopio previamente calentada.
5. Conecte la bomba a aproximadamente 20 cm de tubo equipado con una micropipeta de vidrio que contenga medio sin marca. Introduzca el tubo de la micropipeta en el medio del marcador fluorescente y coloque el tubo de salida en un recipiente de recolección.
6. Ajuste la bomba para que proporcione un caudal equivalente a 0,2 mL/min, y no inicie el flujo hasta que esté listo para la adquisición de imágenes.
7. Enfoque la línea media del vaso utilizando la imagen de contraste de fase y cambie al canal de fluorescencia 647. Inicie el flujo a la velocidad establecida en la Sección 13.6 y adquiera imágenes cada 1–5 min según el tiempo de respuesta esperado.
8. Genere cromatogramas a partir de las imágenes adquiridas y ajuste una pendiente lineal a los valores de intensidad umbralizados. Reporte la fuga como la distancia en µm recorrida por el marcador desde la superficie externa del vaso por minuto.

14. Mapear el flujo de fluidos

1. Vortex las microesferas fluorescentes de 10 µm durante 1 min, luego sométalas a sonicación en un baño ultrasónico durante 1 min. Diluya las microesferas a 1,8 × 10⁵ microesferas/mL en 10 mL de medio completo.
2. Configure el sistema de flujo sobre la platina del microscopio según se describe en la Sección 13 para el ensayo de fuga vascular. Incluya un recipiente colector de salida y ajuste el caudal a 0,2 mL/min.
3. Enfóquese en el plano central del vaso utilizando un objetivo con una distancia de trabajo adecuada. Adquiera imágenes a la frecuencia máxima prácticamente posible permitida por el tiempo de exposición, la sensibilidad del detector, la intensidad de excitación y la eficiencia de recolección de luz.
4. Analice la secuencia de imágenes de lapso de tiempo utilizando software de velocimetría por imágenes de partículas.

15. Fijar y realizar la inmunotinción del vaso endotelializado

1. Prepare 40 mL de paraformaldehído al 4% en PBS que contenga 10 mM de CaCl₂ y 10 mM de MgCl₂.
   ADVERTENCIA: El paraformaldehído es tóxico. Prepare y manipule soluciones que contengan paraformaldehído en una campana extractora adecuada, utilizando equipo de protección personal apropiado.
2. Detenga el flujo, sujete el tubo de entrada con una pinza, desconéctelo de la bomba y conéctelo al tubo de aspiración utilizado para el ensayo de fuga vascular. Introduzca el tubo de aspiración en el fijador y permita que 35 mL pasen a través del vaso por gravedad.
3. Pinche el tubo y incube el vaso en el fijador a temperatura ambiente durante 30 min.
4. Lave el vaso por gravedad con 25 mL de tampón de permeabilización que contenga 0,4% de Triton, 20 mM de PIPES a pH 6,1, 138 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl₂, 2 mM de EGTA y 5,5 mM de glucosa. Pinche el tubo e incube durante 10 min a temperatura ambiente.
5. Lave el vaso con tampón bloqueante que contenga 1% de BSA, 0,05% de Tween 20, 20 mM de Tris a pH 7,4, 140 mM de NaCl y 5 mM de KCl. Incube durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
6. Diluya el anticuerpo primario seleccionado entre 1:50 y 1:500 en 100–500 µL de tampón bloqueante. Retire el tubo de entrada e introduzca la solución de anticuerpo utilizando el procedimiento descrito en la Sección 11 para la siembra celular.
7. Incube el vaso durante la noche a 4 °C.
8. Vuelva a conectar el tubo de entrada y lave el vaso con 20 mL de PBS.
9. Diluya los anticuerpos secundarios apropiados entre 1:200 y 1:1.000 en tampón bloqueante y, cuando sea necesario, agregue faloídicina fluorescente a 1:250. Introduzca la solución utilizando el procedimiento descrito en la Sección 15.6 e incube durante 2 h a temperatura ambiente.
10. Lave el vaso con 40 mL de PBS, cierre las pinzas del tubo y coloque tapones en los extremos.
    NOTA: Almacene el vaso teñido a 4 °C e image dentro de las 2 semanas.
11. Tiña la F-actina con faloídicina fluorescente, el aparato de Golgi con anti-GM130 y los núcleos con DAPI.
12. Analice las imágenes de faloídicina utilizando FibrilTool⁷⁴ para determinar la orientación promedio de las fibras de estrés de F-actina.
13. Determine el eje entre los centros de masa de cada núcleo y el aparato de Golgi. Analice y represente gráficamente las orientaciones resultantes en un software de cálculo numérico según lo descrito previamente⁷⁵.

Resultados

El uso de tintas sacrificables para imprimir diversos tejidos tubulares ha sido bien establecido por varios grupos, notablemente el laboratorio de Lewis, que ha fabricado túbulos renales junto con vasos sanguíneos^67,76. Enfoques similares se han utilizado para imprimir estructuras alveolares⁷⁷ y tumores vascularizados⁷⁸. Aquí, estos enfoques se adaptaron para generar geometrías vasculares destinadas a investigar las respuestas endoteliales bajo flujo fisiológico de fluidos (Figura 2). Las geometrías de los vasos se convirtieron a partir de una imagen vascular en un mapa de coordenadas y posteriormente en código G para definir la trayectoria de impresión (Figura 2A–C). El enfoque resultante permitió la fabricación de moldes de vasos para estudiar cómo las funciones endoteliales y la organización del citoesqueleto se alteran por vasos tortuosos y aneurismas (Figura 2D–G). También se incorporó un diseño de cámara Rose imprimible en 3D para eliminar la necesidad de acceder a servicios de maquinaria (Figura 2H). Se proporciona un ejemplo de archivo de código G para la impresión de vasos en Archivo Suplementario 1, y los archivos CAD correspondientes para la cámara Rose y el soporte para microscopio se proporcionan en Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3, respectivamente. La impresión basada en STL puede requerir múltiples pasadas de la boquilla, lo que da lugar a geometrías de vasos trenzados con lúmenes separados (Figura Suplementaria 1). La plataforma resultante fue diseñada para ser accesible a biólogos celulares vasculares con experiencia mínima en bioingeniería, al tiempo que soporta presiones y tasas de flujo fisiológicas y permite el acceso a microscopía de alta resolución (Figura 2I).

Después de la fabricación del vaso y su celularización, el dispositivo vascular se incorporó a un sistema de perfusión en circuito cerrado para permitir la circulación controlada del medio (Figura 3). El sistema constaba de una bomba peristáltica, una llave de paso de tres vías conectada a una jeringa de cebado, un trampa de burbujas, un amortiguador de pulso, el dispositivo vascular y un depósito de medio dispuestos secuencialmente dentro del circuito de flujo (Figura 3A). Esta configuración permitió que el medio circulase continuamente a través del vaso ingenierizado, incorporando componentes para el cebado del sistema, la eliminación de burbujas y la amortiguación de las pulsaciones generadas por la bomba peristáltica. El sistema ensamblado podía operarse con el dispositivo vascular colocado dentro del montaje experimental, como se muestra en la Figura 3B, proporcionando una configuración práctica para la posterior perfusión de vasos celularizados bajo condiciones de flujo controladas.

Una modificación respecto a los enfoques previamente descritos con tintas sacrificables fue la pasteurización de la tinta antes de la impresión. Esta modificación fue necesaria porque la aplicación de los protocolos publicados para la preparación de la tinta resultaba en cultivos contaminados con moho. Al igual que otras tintas basadas en Pluronic utilizadas para esta aplicación, la tinta de Pluronic F127 al 25 % y PEO al 1 % permanece líquida a bajas temperaturas y transita a un gel micelar compacto al aumentar la temperatura. Esta formulación presenta una temperatura de transición de 15°C, lo cual es conveniente para la elaboración de estructuras a temperaturas de incubadora y para eliminar la tinta en 4°C. De forma similar al Plurónico puro, este material también muestra un adelgazamiento sustancial por cizallamiento a la temperatura de impresión (Figura 4A). Sin embargo, incluso a bajas temperaturas, la tinta es demasiado viscosa para la esterilización por filtración utilizando filtros estándar para cultivo de tejidos y vacío. Aunque la tinta puede esterilizarse mediante pasteurización a 70°C o superior durante 20 s, estas temperaturas alteran irreversiblemente la tinta y reducen su viscosidad a la temperatura de impresión (datos no mostrados). La pasteurización a temperaturas más bajas y mayor duración en 63°C para >1 h reduce la contaminación por hongos y otros microorganismos sin alterar la viscosidad compleja de la tinta a temperaturas adecuadas para la impresión. La caracterización reológica mediante un reómetro equipado con una geometría de cono y plato de 25 mm mostró que la tinta cruda y la tinta pasteurizada presentaron viscosidades similares en un rango de velocidades de deformación a las temperaturas de impresión (Figura 4B), demostrando que la pasteurización no compromete la capacidad de impresión. La tinta pasteurizada también permite el cultivo vascular a largo plazo sin necesidad de fármacos antimicóticos, que pueden alterar la función endotelial.

Una vez que el vaso se ha cellularizado, las células endoteliales confluentes deben recubrir todo el vaso, como se muestra en la Figura 5, con la proyección de intensidad máxima en la Figura 5A y la sección transversal en la Figura 5B. Luego, el flujo del medio puede aumentarse hasta alcanzar tasas de cizallamiento fisiológicas, que pueden estimarse para vasos aproximadamente circulares utilizando la ecuación de Hagen-Poiseuille⁷⁹. En la práctica, la velocidad de flujo necesaria para alcanzar un estrés cortante deseado puede estimarse considerando la viscosidad del medio y la resistencia microfluídica. En un cultivo típico 2D in vitro, el flujo del medio a 12 dyn/cm² induce a la mayoría de los tipos de células endoteliales a orientarse a lo largo del eje del flujo. Esta respuesta puede visualizarse mediante tinción fluorescente con faloídicina de la F-actina (Figura 5D,E) o mediante el análisis del eje Golgi-núcleo (Figura 5D,F), ambos muestran una orientación anisotrópica consistente con la polarización endotelial, como se ha descrito previamente¹⁸. Aunque en el organismo in vivo ocurren esfuerzos cortantes superiores a 40 dyn/cm², tales condiciones no fueron modeladas aquí.

Una consecuencia importante de la geometría alterada de los vasos es el flujo de fluido modificado, al cual las células endoteliales responden a través de varias vías de señalización^80,81. Existen varios métodos disponibles para monitorear la velocidad del flujo sanguíneo, incluyendo ultrasonido Doppler 4D⁸², resonancia magnética de flujo 4D⁸³ e imagenología por mancha láser⁸⁴. Aunque estas técnicas ofrecen ventajas importantes in vivo, puede ser difícil detectar diferencias locales de flujo a lo largo de un solo vaso. La alta capacidad de apertura numérica de este sistema permite el seguimiento directo de partículas fluorescentes (Figura 6B) y la obtención de mapas con alta resolución espacial de las anomalías de flujo inducidas por la curvatura del vaso mediante la técnica de velocimetría por imágenes de partículas (Figura 6C). Por ejemplo, se observa un flujo más lento a lo largo de la curvatura interna del vaso en comparación con la curvatura externa (Figura 6C), lo cual podría contribuir a respuestas endoteliales alteradas⁸⁵.

Una vez establecido un vaso confluyente, la permeabilidad y la función de barrera se pueden evaluar perfundiendo macromoléculas marcadas con fluorescencia, como dextranos o proteínas, a través de la luz del vaso. Los vasos permeables revestidos con CUEVH resisten el paso de dextranos marcados con fluorescencia (Figura 6D,F). En contraste, la exposición a estímulos que alteran la barrera, como el TNFα, aumenta la fuga vascular (Figura 6H, J). Las tasas locales de fuga se pueden visualizar mediante análisis de cimógrafos (Figura 6E,G,I,K). Dado que el cimógrafo representa la distancia en el eje X y el tiempo en el eje Y, las tasas relativas de fuga se pueden comparar cuantificando las pendientes de las líneas ajustadas a las intensidades de fluorescencia segmentadas (Figura 6E,G,I,K). Estos análisis permiten evaluar cómo la geometría local del vaso influye en la función de barrera endotelial en respuesta a estímulos definidos.

Una ventaja clave de esta plataforma es el acceso microscópico mejorado en comparación con lo posible in vivo. El sistema también facilita el análisis inmunohistoquímico de la organización molecular endotelial, particularmente el citoesqueleto de actina. Las células endoteliales son muy delgadas y están rodeadas por células musculares lisas in vivo, lo que puede complicar la localización de estructuras citoesqueléticas específicamente dentro del endotelio. Esta plataforma permite la tinción e imagen directa de moléculas de adhesión y actina filamentosa en células endoteliales (Figura 5) y soporta análisis multicomponente difíciles de realizar in vivo, incluyendo la evaluación de la polarización y división endotelial bajo flujo fisiológico (Figura 5D–F). La combinación de estos ensayos en una sola plataforma permite el examen directo de las relaciones entre la geometría del vaso, el flujo alterado, la función de barrera, la organización molecular endotelial y la adhesión intercelular.

Figura 1: Flujo de trabajo para imprimir y utilizar vasos sanguíneos tridimensionales en un chip. Diagrama de flujo de los protocolos para generar y utilizar vasos sanguíneos tridimensionales en un chip. Los círculos negros indican los números de protocolo correspondientes. Los colores de los recuadros indican la temperatura a la que se realiza cada protocolo o se incuba la muestra. El flujo de trabajo incluye modelado de la forma del vaso, preparación de la tinta, preparación de la matriz extracelular (ECM), preparación de la cámara, impresión del vaso, lavado y recubrimiento del vaso, celularización, cultivo con flujo, ensayos funcionales y análisis histológico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Impresión de vasos y diseño de la cámara. Los vasos pueden diseñarse a partir de imágenes vasculares in vivo para reproducir geometrías vasculares específicas del paciente. (A) Vaso coronario pequeño captado mediante tomografía computarizada (TC) con contraste, reproducido con autorización de Parekh et al.⁸⁶ Barra de escala = 2 mm. (B) Mapa de coordenadas de puntos fiduciales de una porción del vaso mostrado en el panel A, generado mediante el registro de puntos en FIJI. (C) Salida de código G generada a partir del mapa de coordenadas utilizando software de control de impresora. Las coordenadas X, Y y Z se indican en la esquina inferior derecha. (D) Esquema de una cámara Rose que contiene un vaso bioprintado. El diseño con tuercas de mariposa superiores es compatible con la cámara de ácido poliláctico (PLA) impresa en 3D. (E) Cámara Rose que contiene un vaso y depósitos impresos con bio-tinta sacrificable sobre un cubreobjetos recubierto con matriz extracelular (ECM). Barra de escala = 9 mm. (F) Esquema de una cámara Rose configurada para el modelo de aneurisma. Un alambre insertado a través de las agujas de entrada y salida sirve como molde del vaso, y la bio-tinta sacrificable depositada sobre el alambre sirve como molde del aneurisma. (G) Cámara Rose que contiene el alambre y el molde de bio-tinta sacrificable sobre un cubreobjetos recubierto con ECM. (H) Adaptador impreso en 3D de PLA para platina de microscopio (izquierda) y cámara Rose (derecha), que ofrecen alternativas a los componentes mecanizados de aluminio. Las abrazaderas metálicas del adaptador se fijan a la placa del adaptador. Barra de escala = 30 mm. (I) Vaso impreso y lavado dentro de una cámara Rose de aluminio montada sobre la platina de un microscopio, con agujas y tubos de entrada y salida conectados. Barra de escala = 20 mm. Abreviaturas: CT = tomografía computarizada; ECM = matriz extracelular; PLA = ácido poliláctico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Sistema de flujo de fluido para un vaso celularizado en una cámara de Rose. (A) Esquema de la configuración de los tubos utilizada para establecer el flujo de fluido a través de una cámara de Rose que contiene un vaso celularizado. Las flechas indican la dirección del flujo. Los componentes numerados son (1) bomba peristáltica, (2) llave de paso de tres vías con jeringa de cebado, (3) trampa de burbujas, (4) amortiguador de pulsos, (5) dispositivo del vaso y (6) depósito de medio. Todos los componentes que entran en contacto con el medio de cultivo se esterilizan antes de su uso. (B) Sistema de flujo de fluido que contiene un vaso celularizado en una cámara de Rose dentro de un incubador de cultivo de tejidos. Los números corresponden a los componentes mostrados en el panel A. Las agujas de entrada y salida se aseguran con cinta para mayor estabilidad. Barra de escala = 40 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Caracterización reológica de la bio-tinta sacrificial. (A) Viscosidad al corte de la tinta de Pluronic F127 al 25 % y óxido de polietileno (PEO) al 1 % sin pasteurizar en función de la velocidad de corte a 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C y 23 °C. (B) Viscosidad compleja en función de la frecuencia angular para la tinta de Pluronic F127/PEO sin pasteurizar y pasteurizada a 25 °C y 37 °C. Abreviatura: PEO = óxido de polietileno. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Imagen y análisis cuantitativo de vasos endotelializados fijados y teñidos. (A) Proyección de intensidad máxima de imágenes de fluorescencia confocal de disco giratorio de un vaso completamente celularizado tras la siembra inicial y cultivo bajo bajo estrés cortante (1 dyn/cm²). El vaso fue teñido para VE-cadherina (verde), F-actina (rojo) y ADN con DAPI (azul). Barra de escala = 50 µm. (B) Sección transversal xz reconstruida de una serie de z de imágenes de fluorescencia confocal de disco giratorio de un vaso completamente celularizado teñido con faloídicina fluorescente para marcar la F-actina (rojo). Barra de escala = 50 µm. (C) Proyección de intensidad máxima de una serie de z de imágenes de fluorescencia confocal de disco giratorio de un vaso completamente celularizado tras 24 h de flujo a 12 dyn/cm². La F-actina fue marcada con faloídicina fluorescente (rojo). Barra de escala = 100 µm. (D) Imagen de fluorescencia confocal de disco giratorio de una región vascular tras 24 h de cultivo bajo un estrés cortante de 16 dyn/cm². El vaso fue teñido para VE-cadherina (amarillo), F-actina (magenta), el marcador del aparato de Golgi GM130 (verde) y ADN con DAPI (azul). La flecha indica la dirección del flujo. Barra de escala = 30 µm. (E) Cuantificación representativa de la orientación media de los fibras de estrés a partir del canal de F-actina en el panel D utilizando FibrilTool74. Se analizó una cuadrícula de 45 regiones, cada una con un área de 1.600 µm², y las orientaciones medias de las fibras se muestran como un histograma radial respecto a la dirección del flujo. (F) Cuantificación representativa del eje núcleo-aparato de Golgi del panel D como medida de la polarización de las células endoteliales. Los vectores desde el centro de cada núcleo hasta el centro del aparato de Golgi correspondiente se representan como un histograma radial respecto a la dirección del flujo; n = 75 vectores. Abreviatura: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Análisis del flujo de fluidos y la fuga vascular. (A) Esquema de la geometría del vaso utilizada para los análisis en los paneles B–K. Las letras indican las regiones aproximadas del vaso que corresponden a los respectivos paneles. (B) Proyección temporal codificada por colores de una secuencia de imágenes de fluorescencia confocal de disco giratorio con lapso de tiempo que muestra microesferas fluorescentes moviéndose por flujo en una región curvada del vaso. El color indica el número de cuadro de 1 a 100; se indican las curvaturas externa e interna. (C) Análisis de velocimetría por imágenes de partículas (PIV) que muestra la velocidad relativa del flujo a través de la región curvada del vaso. Los colores representan la velocidad relativa, y las flechas indican la dirección y magnitud del flujo. Barra de escala = 50 µm. (D–G) Ensayo representativo de barrera vascular de un vaso no tratado perfundido con dextrano marcado con Alexa 647 de 10 kDa. (D,D′,D″) Imágenes de una región recta del vaso adquiridas a los 0, 70 y 150 min, respectivamente. La línea blanca indica la región utilizada para el cimograma en el panel E. (E) Cimograma de la región recta en el panel D que muestra una tasa de fuga de 0,39 µm/min, que es la pendiente de la línea punteada. (F,F′,F″) Imágenes de la región curvada del vaso adquiridas a los 0, 70 y 150 min. La línea blanca indica la región utilizada para el cimograma en el panel G. Barra de escala = 150 µm. (G) Cimograma de la región curvada en el panel F que muestra una tasa de fuga de 1,01 µm/min, que es la pendiente de la línea punteada. (H–K) Ensayo representativo de barrera vascular tras preincubación con 250 ng/mL de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα). (H,H′,H″) Imágenes de una región recta del vaso adquiridas a los 0, 200 y 400 min, respectivamente. La línea blanca indica la región utilizada para el cimograma en el panel I. Barra de escala = 250 µm. (I) Análisis del cimograma de la región recta del vaso en el panel H muestra una tasa de fuga de 2,1 µm/min, que es la pendiente de la línea punteada. (J,J′,J″) Imágenes de la región curvada del vaso adquiridas a los 0, 200 y 400 min. La línea blanca indica la región utilizada para el cimograma en el panel K. Barra de escala = 250 µm. (K) Análisis del cimograma de la región curvada del vaso en el panel J muestra una tasa de fuga de 6,7 µm/min, que es la pendiente de la línea punteada. Los asteriscos en los paneles D–K identifican los extremos correspondientes de las líneas utilizadas para generar los cimogramas. Abreviaturas: PIV = velocimetría por imágenes de partículas; TNFα = factor de necrosis tumoral alfa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Impresión de vasos mediante programación de impresora basada en STL. (A) Imagen de contraste por interferencia diferencial de un vaso impreso generado mediante programación de impresora basada en STL, que dirige la cabeza de impresión a realizar dos pasadas, produciendo una estructura de vaso trenzado. Barra de escala = 250 µm. (B) Representación tridimensional del vaso trenzado lavado y lleno con albúmina sérica bovina (BSA) marcada con Alexa 647. Es visible una separación entre las luces de los dos filamentos trenzados. Barra de escala = 100 µm. Abreviaturas: BSA = albúmina sérica bovina; STL = lenguaje de teselación estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Código G para la impresión de vasos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: dibujo CAD de la cámara Rose. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: dibujo CAD del adaptador para montaje en la platina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Se describe un sistema robusto para modelar geometrías vasculares asociadas con flujo alterado, incluyendo vasos tortuosos, aneurismas y puntos de bifurcación. El método permite imágenes de alta resolución, mapeo de flujo y evaluación de la función de barrera vascular dentro de una plataforma accesible para biólogos celulares con experiencia limitada en bioingeniería. Aunque el enfoque principal requiere una biopresora, las impresoras comerciales basadas en extrusión abarcan desde sistemas de código abierto hasta plataformas más avanzadas con múltiples cabezales de impresión. Las capacidades clave de la impresora incluyen control de la temperatura del cabezal de impresión y de la tinta, regulación precisa de la presión y temperatura de la plataforma de impresión. Además de los vasos tortuosos y ramificados fabricados mediante bioprintado, el método también incluye un modelo de aneurisma que puede generarse sin una biopresora. En conjunto, estos enfoques facilitan la investigación de la función de las células endoteliales en vasos tortuosos utilizando métodos de microscopía comúnmente disponibles en laboratorios de biología celular.

Existen numerosos sistemas de modelos in vitro disponibles para estudiar la función vascular^87,88, cada uno con fortalezas y limitaciones específicas. El sistema descrito aquí, adaptado de trabajos previos^54,67,69, es particularmente adecuado para investigar los efectos de la tortuosidad vascular en la función endotelial, ya que permite modelar directamente geometrías de vasos derivadas de pacientes y variar sistemáticamente la curvatura vascular dentro de un solo dispositivo. Otros enfoques han modelado vasos coronarios de pacientes utilizando gelatina metacrilada fotopolimerizable para generar estructuras de vasos a escala reducida bajo flujo fisiológico⁶⁰. Dichos sistemas ofrecen modelado preciso de vasos, análisis de flujo y la posibilidad de incorporar capas de la túnica media. Sin embargo, su tamaño general y los requisitos de soporte de vidrio pueden limitar la obtención de imágenes de alta resolución y los ensayos localizados de filtración. Por el contrario, sistemas más pequeños basados en el autoensamblaje de células endoteliales derivadas de iPSC permiten imágenes de alta resolución y pueden incorporar tanto células endoteliales como células musculares lisas vasculares⁸⁹. No obstante, estos modelos ofrecen menor control sobre la geometría del vaso, y resulta difícil establecer flujos elevados y altas tasas de cizallamiento. Por lo tanto, el sistema actual representa un enfoque intermedio práctico que combina una geometría de vaso definida con imágenes de alta resolución de la tortuosidad vascular.

Una ventaja importante de esta plataforma es la capacidad de generar vasos que contienen regiones tanto curvas como rectas, lo que permite la comparación directa de la geometría vascular local dentro de la misma muestra mientras otras variables experimentales permanecen constantes, como se muestra en la Figura 6. Otra ventaja es la posibilidad de utilizar imágenes de vasos derivadas de pacientes obtenidas mediante angiografía o tomografía computarizada con contraste. La limitación principal para la reproducción de vasos de pacientes es el tamaño. Los vasos con un diámetro menor a 150 µm son difíciles de imprimir de manera reproducible, mientras que los segmentos vasculares que se extienden más allá de varios centímetros requieren cámaras de montaje más grandes. Los segmentos vasculares también deben permanecer relativamente planos en la tercera dimensión para que puedan imprimirse sobre la capa de matriz base y mantenerse dentro de la distancia de trabajo del objetivo durante la adquisición de imágenes microscópicas.

En trabajos futuros, el sistema descrito aquí podría modificarse aún más para modelar enfermedades como la aterosclerosis, en la cual la geometría del vaso puede contribuir a la fisiopatología. Podrían incorporarse células endoteliales modificadas genéticamente u otros tipos celulares adicionales, incluyendo células musculares lisas y células inmunitarias, con el fin de aumentar la complejidad fisiológica. La inclusión de células musculares lisas debajo de la capa endotelial, tal como se ha demostrado en sistemas más simples, podría proporcionar mayor comprensión sobre las interacciones entre el músculo liso y el endotelio en la tortuosidad vascular y las enfermedades⁹⁰. Otras modificaciones podrían incluir células tumorales para investigar la intravasación^68,91 y la influencia de la tortuosidad en este proceso. La plataforma también podría utilizarse para examinar cómo el flujo alterado modifica las respuestas inflamatorias^92,93 y posiblemente contribuye a complicaciones vasculares asociadas con infecciones como la COVID-19⁹⁴. Dada la amplia participación del sistema vascular en la salud y enfermedad humanas, sistemas accesibles como este podrían facilitar investigaciones adicionales sobre la función endotelial en diversos contextos patológicos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(3-Aminopropil)trimetoxisilano (APTMS), 97%	Sigma-Aldrich	281778	Utilizado para la silanización y activación de cubreobjetos de vidrio antes de la fijación de la MEC.
Jeringa estéril de 1 mL	Fisher Scientific	14-823-434	Utilizada para la administración de reactivos, recubrimiento de recipientes y manipulación de fluidos.
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS)	Thermo Fisher Scientific	J61196.AP	Utilizada para la preparación de reactivos, lavados y enjuagues de recipientes.
Jeringa estéril de 10 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Utilizada para la preparación de reactivos y transferencia de fluidos.
Tubos cónicos de 15 mL con tapa	Fisher Scientific	05-538-59A	Utilizados para la preparación de reactivos, manipulación celular y almacenamiento de soluciones.
Placa de Petri de poliestireno de 150 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Utilizada como recipiente estéril para trabajo o incubación.
Aguja de 21G	Fisher Scientific	14-817-227	Utilizada para la preparación del molde del recipiente y acceso a la cámara.
Aguja de 23G	Fisher Scientific	14-817-237	Utilizada para las conexiones de entrada y salida del recipiente durante el enjuague y la perfusión.
Aguja dispensadora transparente cónica de 27G	Nordson	7018417	Utilizada para la extrusión de tinta sacrificial y visualización de burbujas de aire durante la impresión.
Jeringa estéril de 3 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Utilizada para la transferencia de fluidos y administración de reactivos. Confirmar el número de catálogo, ya que el número proporcionado también está listado para la jeringa de 10 mL.
Alambre de mandril médico de acero inoxidable 304, diámetro de 0,0190 pulgadas	Component Supply	GWX-0190-36	Utilizado como molde extraíble para el lumen recto en el modelo de aneurisma basado en alambre.
Tubos cónicos de 50 mL con tapa	Fisher Scientific	05-526B	Utilizados para la preparación, mezcla, pasteurización y almacenamiento de reactivos.
Anticuerpo secundario anti-ratón Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A32723TR	Anticuerpo secundario fluorescente utilizado para inmunotinción.
Anticuerpo secundario anti-conejo Alexa 555	Thermo Fisher Scientific	A-21428	Anticuerpo secundario fluorescente utilizado para inmunotinción.
Albúmina sérica bovina marcada con Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A34785	Rastreador macromolecular fluorescente utilizado en ensayos de barrera vascular o de fuga.
Dextrano marcado con Alexa 647, 10 kDa	Thermo Fisher Scientific	D22914	Rastreador fluorescente utilizado para evaluar la función de barrera endotelial y la fuga vascular.
Faloidina Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A22287	Utilizada para etiquetar fluorescentemente la F-actina para imágenes del citoesqueleto y análisis de orientación.
Albúmina, suero bovino, Fracción V, libre de ácidos grasos	Sigma-Aldrich	126575-10GM	Utilizada para bloqueo y preparación de soluciones que contienen proteínas.
Antibiótico-antimicótico, 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Suplemento antimicrobiano opcional para la MEC y el medio de cultivo.
Anticuerpo anti-GM130, clon 4A3	Sigma-Aldrich	MABT1363	Anticuerpo primario utilizado para etiquetar el aparato de Golgi en el análisis de polaridad endotelial.
Anticuerpo monoclonal anti-VE-cadherina, conejo, D87F2	Abcam	65707	Anticuerpo primario utilizado para visualizar las uniones intercelulares de las células endoteliales.
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C7902	Utilizado en la preparación de la MEC y en tampones de fijación. Verificar si el reactivo deseado es cloruro de calcio anhidro o hidratado.
Kit de conectores	World Precision Instruments	504954	Conectores Luer-a-tubo utilizados para armar el circuito de perfusión microfluídico.
Portaobjetos para tinción de cubreobjetos	Electron Microscopy Sciences	72240	Utilizado para sostener cubreobjetos durante la limpieza, silanización, activación y lavado.
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G7021-100G	Componente del tampón de permeabilización utilizado durante la inmunotinción.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	Tinción nuclear fluorescente utilizada para imágenes celulares y análisis de polaridad.
Placa calefactora digital	Fisher Scientific	11-475-028	Utilizada para mantener la cámara del vaso y los reactivos a aproximadamente 37 °C durante el ensamblaje.
Sal tetrasódica de EGTA	Sigma-Aldrich	E8145-10G	Agente quelante utilizado en el tampón de permeabilización.
Conector Luer hembra con punta barbada para tubo de 1/16 pulgadas de diámetro interno	Scientific Commodities Inc.	BB330A	Utilizado para conectar tubos dentro del circuito microfluídico.
Luer hembra con punta barbada de 1/16 pulgadas de diámetro interno, CrystalVu QC	Fisher Scientific	01-000-123	Utilizado para conexiones de tubos y cámaras de vasos.
Fibrinógeno	Sigma-Aldrich	F8630	Componente de la MEC utilizado junto con gelatina y trombina para formar el hidrogel que soporta el vaso. Verificar la fuente: el manuscrito describe fibrinógeno de plasma humano, mientras que la tabla proporcionada indica plasma bovino.
Amortiguador de pulso de fluido	Darwin Microfluidics	SE-D1606-3NB-PC-31	Utilizado para reducir las fluctuaciones pulsátiles generadas por la bomba peristáltica.
Tira de caucho de silicona de alta temperatura para la industria alimentaria	McMaster-Carr	8417K51	Utilizada para fabricar la junta de la cámara Rose.
Gelatina de piel porcina, resistencia al gel 300, Tipo A	Sigma-Aldrich	G2500	Componente principal de la MEC utilizado para formar el hidrogel que rodea el lumen del vaso.
Cubreobjetos de vidrio, No. 1.5	VWR	EN-MAS-25X25-1-5-CS	Sustrato para microscopía de alta resolución y superficie de cámara.
Glutaraldehído, 25%	Electron Microscopy Sciences	16220	Diluido para la activación de cubreobjetos antes de la fijación de la MEC.
Kit de crecimiento-BBE	ATCC	PCS-100-040	Kit de suplementos utilizado con medio basal para células vasculares en cultivo de células endoteliales.
Kit de crecimiento-VEGF	ATCC	PCS-100-041	Suplemento de crecimiento endotelial utilizado con medio basal para células vasculares cuando sea necesario.
Fibronectina de plasma humano	Sigma-Aldrich	FC010	Recubrimiento opcional de la MEC luminal utilizado para promover la adhesión endotelial.
Abrazadera de tubo en línea	Sigma-Aldrich	Z503371-1PAK	Utilizada para detener y regular el flujo a través del tubo durante la manipulación y la incubación de la cámara.
Bomba peristáltica digital Ismatec Reglo	Masterflex	78018-12	Utilizada para generar flujo de fluido controlado a través de vasos celularizados.
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Recubrimiento opcional de la MEC luminal para modificar la adhesión y polarización endotelial.
Kit de variedad de acopladores Luer-a-tubo	World Precision Instruments	504954	Utilizado para conectar tubos, jeringas y componentes de entrada/salida de la cámara. Duplicado del número de catálogo del kit de conectores; conservar una entrada si son idénticos.
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M2393-100G	Componente de los tampones de fijación y permeabilización.
Conector Luer macho con punta barbada deslizante para tubo de 1/16 pulgadas de diámetro interno	Scientific Commodities Inc.	BB329A	Utilizado para conexiones de tubos microfluídicos.
Adaptador Luer macho, 1/16 pulgadas de diámetro interno	World Precision Instruments	13160-100	Utilizado para conectar tubos a jeringas y componentes de la cámara.
Matrigel	Sigma-Aldrich	CLS356234-1EA	Recubrimiento opcional de la MEC luminal utilizado para la adhesión endotelial.
Tapas para botellas de medio	Fisher Scientific	05-719-310	Tapas de dos orificios utilizadas para construir reservorios estériles de medio de cultivo para el circuito de flujo.
Tubo de silicona Nalgene Pharma-Grade, 1/16 pulgadas de diámetro interno	Thermo Fisher Scientific	8600-0020	Tubo flexible utilizado en los circuitos de perfusión y enjuague microfluídicos.
Parafilm	Electron Microscopy Sciences	70990-125	Utilizado como superficie no adherente durante la polimerización de recubrimientos de MEC sobre cubreobjetos.
PBS, 10x, pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	70011044	Tampón concentrado utilizado para preparar soluciones de PBS de trabajo.
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Suplemento antibiótico utilizado en el medio de cultivo endotelial y soluciones de enjuague.
PIPES	Sigma-Aldrich	P1851-25G	Componente tampón de la solución de permeabilización.
Plurónico F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Componente termorresponsivo de la tinta de impresión sacrificial.
Válvula de tres vías de policarbonato con Luer macho	Fisher Scientific	NC9593742	Utilizada para cebado, conmutación y control de los caminos de fluido en el circuito de perfusión.
Óxido de polietileno (PEO)	Sigma-Aldrich	372781	Componente polimérico de la formulación de tinta sacrificial.
Mezclador rotatorio	Fisher Scientific	88861050	Utilizado para mezclar la tinta sacrificial de PEO/Plurónico a 4 °C.
Bandeja de tinción tipo unidad deslizante	MSE Supplies	DWK90020	Utilizada para lavado, tinción o incubación de reactivos en cubreobjetos.
Cubreobjetos cuadrado, No. 2, 25 mm x 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS285525-1000EA	Cubreobjetos de cámara; el vidrio más grueso No. 2 proporciona mayor resistencia a la rotura y es compatible con objetivos de aire o agua adecuados.
Aguja dispensadora roma de acero inoxidable, 21 G, 1 pulgada	Component Supply	NE-212PL	Utilizada para administración de fluidos o construcción del modelo de vaso con molde de alambre.
Unidades de filtro de vacío Steriflip	MilliporeSigma	SE1M179M6	Utilizadas para filtrar estérilmente gelatina caliente y otras soluciones compatibles.
Jeringas plásticas estériles de 5 mL	Allevi	PSYR5-S	Utilizadas para cargar tinta sacrificial para impresión por extrusión neumática.
Trombina, plasma humano, alta actividad	Sigma-Aldrich	605195	Utilizada para iniciar la polimerización del fibrinógeno durante la formación del gel de la MEC.
Transglutaminasa	Moo Gloo	1201	Enzima de reticulación utilizada durante la preparación y modificación del gel de gelatina/fibrina de la MEC.
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	648466	Detergente utilizado para la permeabilización de células endoteliales antes de la inmunotinción.
Enzima TrypLE Express, 1x, rojo de fenol	Thermo Fisher Scientific	12605010	Reactivo de disociación celular utilizado para recolectar células endoteliales antes de la siembra en el vaso.
Tween 20	Sigma-Aldrich	11332465001	Componente detergente del tampón de bloqueo para inmunotinción.
Medio basal para células vasculares	ATCC	PCS-100-030	Medio basal utilizado para el cultivo de células endoteliales y experimentos de perfusión.