Artículo de método

Activación mecánica de macrófagos inducida por peristaltismo

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DOI:

10.3791/72607

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18 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta la configuración y el funcionamiento de un biorreactor patentado para estudios de mecano-inmunomodulación. Aquí, utilizando un biorreactor personalizado que reproduce fuerzas fisiológicas, demostramos que los macrófagos desarrollan una respuesta proinflamatoria claramente definida ante la estimulación mecánica.

Resumen

La inflamación es un proceso complejo que impulsa enfermedades agudas y crónicas. Está modulada por señales bioquímicas y biofísicas en cascada que resultan en la activación de células inmunitarias. Los macrófagos son un tipo principal de célula inmunitaria implicada en múltiples condiciones inflamatorias, incluyendo cáncer, fibrosis y enfermedades autoinmunes. Los métodos tradicionales para investigar la activación de macrófagos implican la estimulación bioquímica con citocinas o quimioquinas definidas, que inducen a los macrófagos hacia estados proinflamatorios o antiinflamatorios extremos. Evidencia emergente sugiere que las señales biofísicas también desempeñan un papel en la activación de macrófagos, además de las señales bioquímicas presentes en los tejidos. Una de estas señales mecánicas prevalentes es la peristalsis, que consiste en tensión multiaxial y estrés cortante, y ocurre en el tracto gastrointestinal, el útero, las vías respiratorias en desarrollo y los uréteres. Aquí, evaluamos la hipótesis de que la peristalsis podría activar macrófagos. En este protocolo, se describe el uso de un biorreactor peristáltico para investigar la activación mecánica de macrófagos. Membranas de polidimetilsiloxano fueron recubiertas con fibronectina para mejorar la adhesión de macrófagos. Macrófagos derivados de médula ósea de ratón inmortalizados (iBMDM) se sembraron sobre membranas recubiertas con fibronectina y se mantuvieron como controles estáticos o se expusieron a peristalsis durante 4 h. La peristalsis activó los macrófagos, con diferencias significativas en la expresión génica de Il6 (50,9 veces superior a los controles estáticos; p < 0.0001, prueba t) y Nos2 (19,8 veces más que los controles estáticos; p = 0,0046). Curiosamente, no se observaron cambios significativos en Chil3 (1,22 veces por encima de los controles estáticos; p = 0,9726) o Mrc1 (1,16 veces más que los controles estáticos; p = 0.9810) en comparación con los controles estáticos, lo que indica que la activación proinflamatoria estuvo impulsada principalmente por factores mecánicos. Los hallazgos actuales respaldan el concepto de mecano-inmunomodulación de los macrófagos, especialmente en respuesta a la mecánica de la peristalsis, que es prevalente en muchos tejidos basados en músculo liso.

Introducción

Los macrófagos son células inmunitarias innatas que desempeñan funciones esenciales en la defensa del huésped, la remodelación tisular y la regulación de la inflamación mediante la fagocitosis y la secreción de citoquinas1,2,3,4. Dependiendo de los estímulos presentes en el microentorno in vivo, los macrófagos no diferenciados (M0) pueden polarizarse de forma plástica hacia fenotipos proinflamatorios (M1) o antiinflamatorios/proregenerativos (M2)5,6. Los modelos in vitro se utilizan típicamente para aislar estos diferentes estímulos, con el fin de comprender mejor los mecanismos complejos que impulsan la polarización de los macrófagos. Los macrófagos M1 clásicamente activados se inducen habitualmente in vitro mediante estímulos bioquímicos como el lipopolisacárido (LPS) y el interferón gamma (IFN-γ), lo que resulta en un aumento de la expresión de mediadores inflamatorios, incluyendo la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), la interleucina-6 (IL6) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)7,8. Por otro lado, los macrófagos M2 alternativamente activados se inducen comúnmente mediante exposición a interleucina-4 (IL-4) e interleucina-13 (IL-13), promoviendo respuestas de remodelación tisular y curación de heridas8,9. Los macrófagos M2 se subdividen además en fenotipos M2a, M2b y M2c según sus distintas vías de activación y perfiles de expresión de marcadores de superficie10,11. Aunque la regulación bioquímica de la polarización de los macrófagos ha sido ampliamente caracterizada tanto en sistemas in vivo como in vitro, los macrófagos residen en microentornos altamente dinámicos que también contienen estímulos biofísicos significativos12. Además de las citoquinas y quimioquinas solubles, los macrófagos están expuestos a interacciones con la matriz extracelular y entre células, rigidez del sustrato, estrés cortante del fluido, presión hidrostática y deformación cíclica del tejido12,13,14. Como células mecanosensibles, los macrófagos pueden alterar sus fenotipos inflamatorios en respuesta a estas señales físicas, destacando así la importancia de la mecanobiología en la regulación inmunitaria.

Una creciente cantidad de literatura ha demostrado que los estímulos mecánicos aislados in vitro pueden influir significativamente en los estados de activación de los macrófagos (Figura 1). La exposición a sustratos más rígidos aumentó la polarización M1 y la producción de citoquinas inflamatorias en comparación con sustratos más blandos, que indujeron un fenotipo proregenerativo15,16,17,18,19,20. De manera similar, el esfuerzo cortante del fluido modula el fenotipo de los macrófagos de forma dependiente de la magnitud, siendo frecuente que niveles bajos de flujo intersticial promuevan una activación proregenerativa21,22, mientras que esfuerzos cortantes más altos, similares a los observados en las arterias, pueden inducir respuestas proinflamatorias23,24,25,26,27,28. Modelos in vitro de estiramiento cíclico diseñados para imitar la mecánica de tejidos musculoesqueléticos, miocárdicos, pulmonares e intestinales también han demostrado un aumento en la expresión de mediadores inflamatorios, aunque los resultados varían según la magnitud, duración, frecuencia y dimensionalidad de la fuerza aplicada29,30,31,32. Además, la mecanosensibilidad de los macrófagos difiere entre especies y fuentes celulares, lo que resalta la importancia de seleccionar modelos experimentales adecuados para estudios de mecanobiología13,14.

Diagrama de activación de macrófagos; estímulos bioquímicos y biomecánicos; cambios fenotípicos; factores de estrés.
Figura 1: Esquema que muestra los estímulos bioquímicos y biomecánicos in vitro de la activación de macrófagos hacia estados proinflamatorios o proregenerativos. Los macrófagos pueden estimularse hacia un estado proinflamatorio in vitro mediante la adición de estímulos químicos, como lipopolisacárido (LPS), interferón γ (IFN-γ), o la exposición a estímulos mecánicos, incluyendo estrés cortante, aumento de rigidez, estiramiento uniaxial cíclico y estático inducido por deformación, compresión y deformación inducida por compresión multiaxial. Los macrófagos pueden estimularse hacia un estado proregenerativo mediante la adición in vitro de estímulos químicos, como interleucina-13 (IL-13) e IL-4. También pueden adoptar un estado proregenerativo cuando se exponen a estímulos mecánicos en forma de estrés cortante oscilante, flujo intersticial, sustratos blandos o niveles bajos de deformación cíclica uniaxial. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Además de investigar de forma independiente estímulos mecánicos aislados, es importante basarse en este trabajo para comenzar a estudiar el impacto de fuerzas físicas combinadas, dado que los macrófagos in vivo comúnmente están expuestos a combinaciones de fuerzas simultáneas. La peristalsis representa un entorno mecánico complejo de este tipo, que consiste en deformación cíclica multiaxial concurrente y estrés cortante de fluido generados por la contracción del músculo liso33. Estas condiciones mecánicas están presentes en múltiples sistemas de órganos, incluyendo el tracto gastrointestinal, las vías respiratorias en desarrollo, el sistema vascular, el útero y los uréteres34,35,36. Es importante destacar que la función peristáltica con frecuencia está desregulada en enfermedades inflamatorias, como la fibrosis, la enfermedad inflamatoria intestinal, el cáncer y los trastornos de remodelación de las vías respiratorias, todas las cuales implican una inflamación sustancial mediada por macrófagos33,37,38,39. A pesar del papel reconocido de los macrófagos en estas enfermedades, aún existe una brecha crítica en la comprensión de cómo las fuerzas mecánicas peristálticas influyen directamente en la activación de los macrófagos.

Este protocolo describe el uso de un sistema de biorreactor de peristalsis para investigar la mecano-inmunomodulación de macrófagos bajo condiciones mecánicas fisiológicamente relevantes. En comparación con los sistemas convencionales de cultivo estático o plataformas de estimulación mecánica con una sola fuerza, este método permite la aplicación simultánea de tensión cíclica multiaxial y estrés cortante de fluido, lo que reproduce de manera más fiel el microentorno mecánico in vivo de los tejidos basados en músculo liso. En este protocolo, macrófagos murinos derivados de médula ósea inmortalizados (iBMDMs) cultivados en biorreactores bajo condiciones peristálticas mostraron un aumento en los marcadores de activación M1, sin presentar tendencias hacia la activación M2. Estos hallazgos demuestran que la mecánica peristáltica es suficiente para modular el comportamiento inflamatorio de los macrófagos y respaldan el concepto más amplio de la mecano-inmunomodulación en tejidos expuestos a fuerzas dinámicas impulsadas por el músculo liso. Este método es particularmente útil para investigadores que estudian la mecanobiología, la inflamación, la ingeniería de tejidos, la fisiología gastrointestinal, el desarrollo pulmonar, la fibrosis y otras enfermedades en las que los macrófagos están expuestos a microentornos mecánicos complejos. Con un ensamblaje cuidadoso, una calibración constante y un monitoreo continuo, los usuarios pueden garantizar un rendimiento reproducible del biorreactor y evitar limitaciones comunes de esta técnica.

Protocolo

El protocolo describe el ensamblaje y funcionamiento de un sistema de biorreactor patentado40 para estudios de mecano-inmunomodulación. Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo celular

  1. Mantenga macrófagos derivados de médula ósea murina inmortalizados (iBMDM) en RPMI 1640 completo suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1% de tampón HEPES, 1% de pirovato de sodio y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C con 5% de CO2.

2. Fabricación de polidimetilsiloxano (PDMS)

  1. Pese y mezcle la base y el agente de curado del kit de elastómero de silicona en una proporción de 10:1 (p/p).
  2. Agite la mezcla durante 5 min para asegurar una mezcla uniforme.
  3. Vierta cuidadosamente el PDMS mezclado en una placa de Petri cuadrada de 100 mm x 15 mm hasta que el PDMS alcance una altura de 3 mm.
  4. Coloque las placas de Petri con PDMS en un desecador.
  5. Degase bajo vacío durante 1 h para eliminar las burbujas de aire.
  6. Retire el PDMS del desecador y confirme que no quedan burbujas de aire.
  7. Transfiera las membranas de PDMS sin curar a un horno precalentado a 60 ˚C y cúralas durante 4 h.
  8. Retire las membranas de PDMS del horno y déjelas enfriar sobre la bancada durante la noche.
  9. Después de 18–24 h, desprenda cuidadosamente las membranas de PDMS curadas de las placas de Petri y córteles para crear membranas de PDMS de 70 mm x 40 mm x 3 mm.

3. Esterilización de la membrana de PDMS

  1. Dentro de una cabina de seguridad biológica, lave las membranas de PDMS con etanol al 70% y colóquelas directamente sobre la superficie de la cabina de seguridad biológica (BSC) (Suplementaria Figura 1).
  2. Someta las membranas a esterilización con UV durante 10 min, luego transfiera la membrana de PDMS a una placa de cultivo de 90 mm no tratada para cultivo celular, con la cara expuesta al UV orientada hacia arriba.
    NOTA: Asegúrese de manipular el PDMS solo por los bordes y nunca cruce las manos por encima de la superficie del PDMS para reducir el riesgo de contaminación.
  3. Para experimentos de peristalsis, utilice las membranas de PDMS en sus dimensiones originales.
  4. Para condiciones de cultivo estático, corte cada membrana de PDMS de 70 mm x 40 mm en dos mitades iguales de 35 mm x 40 mm.

4. Recubrimiento de membranas de PDMS con fibronectina

  1. Dentro de una cabina de seguridad biológica (BSC), prepare un volumen suficiente de una solución estéril de fibronectina a 0,5 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para añadir 100 µL por membrana.
  2. Añada 100 µL de esta solución recubridora en el centro de cada membrana de PDMS, asegurándose de que la región recubierta coincida exactamente con el área de contacto entre la membrana de PDMS y el tornillo.
    NOTA: Utilice una punta de pipeta para extender suavemente la solución formando una capa fina y uniforme.
  3. Deje las membranas de PDMS recubiertas en la placa de cultivo, con la tapa abierta, durante 45 min para permitir la adsorción.
    NOTA: Mantenga la compuerta de la BSC abierta para conservar un flujo continuo de aire.
  4. Tras 45 min, aspire cuidadosamente la solución de fibronectina restante de cada membrana.
  5. Lave suavemente las membranas con 1 mL de PBS estéril.

5. Siembra de células iBMDM sobre la membrana de PDMS

  1. Cuando alcancen una confluencia del 70% al 80%, realizar la tripsinización de las células iBMDM cultivadas en un matraz T25 para desprenderlas de la superficie.
  2. Determinar la concentración celular utilizando un hemocitómetro y preparar una densidad celular de 100.000 células/mL en medio de cultivo.
  3. En cada membrana de PDMS recubierta con fibronectina, sembrar 1 mL de la suspensión celular preparada por membrana.
  4. Para cada experimento, sembrar al menos una membrana estática y una membrana con peristalsis para garantizar una comparación paralela entre condiciones.
  5. Colocar las membranas de PDMS sembradas en un incubador humedecido a 37 °C con 5% CO2 durante al menos 24 h para permitir la adhesión celular tanto en las condiciones estáticas como peristálticas (Suplementaria Figura 1B).

6. Biorreactor

  1. Fabrique el biorreactor utilizando archivos de diseño asistido por computadora (CAD) y las especificaciones proporcionadas en la patente del biorreactor (US12522795)40 u obtenga una unidad preensamblada de los autores.

7. Montaje y calibración del circuito Arduino

  1. Construcción del circuito
    1. Monte el circuito de control en una placa de pruebas utilizando potenciómetros, resistencias, transistores y cables conductores como se muestra en Suplementario Figura 2.
    2. Instale el IDE de Arduino en la computadora y abra un nuevo sketch.
    3. Ajuste la velocidad del motor a 5 revoluciones por minuto (RPM) y la bomba peristáltica a 28 mL/min.
    4. Conecte la placa Arduino al ordenador mediante USB y cargue el código proporcionado en Archivo Suplementario 1 utilizando el botón Cargar en el IDE.
      NOTA: El LED de Arduino se volverá naranja durante la carga y regresará al color verde una vez que esté listo para funcionar. Tras completarse la carga, Arduino ejecutará automáticamente el programa cuando esté encendido.
  2. Calibración del motor
    1. Encienda el motor y cuente las rotaciones durante 1 min utilizando un cronómetro.
      NOTA: Ajuste el parámetro de velocidad del motor en el código de Arduino según sea necesario para alcanzar 5 RPM.
    2. Vuelva a cargar el código después de cada ajuste hasta alcanzar la velocidad deseada.
  3. Calibración de la bomba
    1. Haga funcionar la bomba durante 30 s y mida la masa recogida para verificar un caudal de 28 mL/min (~14 g en 30 s)
    2. Ajuste el potenciómetro y repita hasta que la salida de 30 s sea consistentemente cercana a 14 g.
  4. Una vez que tanto el motor como la bomba estén calibrados, combínelos con una unidad de biorreactor.
    NOTA: El conjunto calibrado de motor–bomba–biorreactor ya está listo para su uso experimentalFigura 2).

Diagrama del biorreactor para el montaje del cultivo de macrófagos; análisis de imágenes y PCR para los resultados del estudio celular.
Figura 2: Esquema del ensamblaje del biorreactor de peristalsis y análisis posterior. Las células iBMDM se siembran sobre una membrana de PDMS recubierta con fibronectina que se encuentra dentro del biorreactor. Tras 4 h de exposición a la peristalsis o mantenimiento como controles estáticos, las células se recolectan para su análisis posterior, que incluye qPCR, tinción inmunofluorescente y obtención de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Ensamblaje y configuración del biorreactor de peristalsis

  1. Preparación de los componentes
    1. Reúna todos los componentes necesarios, incluyendo botella de medio, tapón de medio, tapa impresa en 3D para la botella de medio, tapa impresa en 3D para el biorreactor, base impresa en 3D para el biorreactor, eje de tornillo sinfín impreso en 3D, bridas (tres por biorreactor), alicates de junta deslizante, alicates de corte, placas de cultivo celular de 150 mm, grasa de silicona y soporte para motor impreso en 3D. Rocíe cada artículo con etanol al 70 % antes de colocarlo dentro de la cabina de seguridad biológica (CSB).
    2. Coloque el motor de corriente continua, la bomba peristáltica y un tramo adicional de tubo para bomba dentro de la CSB.
    3. Cierre la tapa de la CSB y active la luz ultravioleta durante 10 minutos para esterilizar todos los componentes (Figura Suplementaria 1C).
  2. Verificación de la adhesión y viabilidad celular
    1. Examine bajo el microscopio ambas membranas de PDMS sembradas, tanto las estáticas como las sometidas a peristalsis. Confirme una adhesión celular >80 % en las superficies de PDMS recubiertas con fibronectina e inspeccione la morfología celular para evaluar la viabilidad.
    2. Capture imágenes representativas de las células según sea necesario antes del ensamblaje.
  3. Preparación de los controles estáticos
    1. Aspire 1 mL de medio RPMI completo de cada membrana estática.
    2. Añada 1 mL de medio RPMI completo fresco a cada membrana.
    3. Etiquete las placas como estáticas y devuélvalas al incubador.
  4. Ensamblaje del biorreactor de peristalsis
    1. Añada 15 mL de medio a cada botella de medio designada para uso en el biorreactor.
    2. Coloque los tapones de medio ajustados con las tapas impresas en 3D (que contienen puertos de entrada y salida) en las botellas de medio. Déjelas apartadas (Figura Suplementaria 1D).
    3. Monte la base del biorreactor.
      1. Introduzca el eje de tornillo sinfín impreso en 3D en el pozo central de la base del biorreactor.
      2. Introduzca el motor de corriente continua en la ranura para motor ubicada en la base del biorreactor.
      3. Asegúrese de que el eje del motor encaje firmemente en el orificio central del eje de tornillo sinfín impreso en 3D.
      4. Deslice el soporte del motor hasta su posición para estabilizar el motor.
  5. Coloque el biorreactor parcialmente ensamblado dentro de una placa de cultivo celular de 150 mm para facilitar su traslado desde la CSB al incubador una vez completado el ensamblaje (Figura Suplementaria 1E).
  6. Aplique una capa fina de grasa de silicona en las ranuras del eje de tornillo sinfín donde la membrana de PDMS hará contacto. Esto permite que el tornillo gire con facilidad, reduciendo la fricción.
  7. Carga de la membrana de PDMS sembrada con células
    1. Transfiera cuidadosamente las membranas de PDMS sembradas con células desde el incubador hasta la CSB.
    2. Aspire el medio de cada membrana y coloque la membrana en el biorreactor con la superficie sembrada hacia arriba, opuesta a la interfaz engrasada del eje de tornillo sinfín.
    3. Posicione la tapa del biorreactor de modo que la muesca de la cámara celular se alinee con la membrana de PDMS. Deslice la tapa dentro de las ranuras guía de la base del biorreactor.
  8. Fijación del biorreactor
    1. Asegure la tapa y la base del biorreactor utilizando bridas y alicates de corte.
    2. Corte el exceso de longitud de las bridas con los alicates.
  9. Conexiones fluidicas y configuración del sistema
    1. Coloque la bomba peristáltica de modo que su conector metálico quede orientado en la misma dirección que el conector del motor.
    2. Conecte el tubo de bomba más cercano al biorreactor al puerto de entrada más próximo al motor en la tapa del biorreactor. Empuje completamente el tubo sobre la boquilla de entrada.
    3. Sumerja el extremo opuesto de este tubo dentro de la botella de medio.
    4. Utilizando el tramo adicional de tubo para bomba, conecte un extremo a la boquilla de salida de la tapa del biorreactor y coloque el otro extremo dentro de la botella de medio, por encima del nivel del medio, para permitir la recirculación sin retroflujo (Figura Suplementaria 1F).
  10. Incubación y funcionamiento
    1. Coloque todo el conjunto del biorreactor (dentro de la placa de 150 mm) dentro del incubador (Figura Suplementaria 1G) y mantenga la placa de circuito/Arduino fuera, conectada a la fuente de alimentación.
    2. Conecte las pinzas cocodrilo
      1. Bomba: positivo con positivo, negativo con negativo.
      2. Motor: invierta la polaridad según el diseño del circuito.
    3. Coloque placas de Petri estériles vacías en el incubador para la recolección posterior de muestras.
    4. Permita que el sistema del biorreactor de peristalsis funcione durante 4 h (o el tiempo deseado) (Figura Suplementaria 1H) bajo condiciones estándar de cultivo en el incubador.

9. Desmontaje del biorreactor

  1. Abra el incubador y levante el tubo de entrada del frasco del medio para permitir que entre aire al sistema y para drenar completamente el medio residual del biorreactor.
  2. Una vez que haya cesado el flujo de medio, desconecte los cables del motor y/o de la bomba de la placa de circuito para detener el movimiento mecánico.
  3. Mueva todo el conjunto del biorreactor al CAB, retire los tubos, corte las bridas de sujeción y levante la tapa del biorreactor.
  4. Aspire el medio residual de la membrana de PDMS y transfiera la membrana de vuelta al mismo plato de Petri utilizado durante la preparación.
  5. Verifique la adhesión y viabilidad celular evaluando la morfometría celular bajo un microscopio de cultivo celular, luego continúe con los análisis posteriores según sea necesario.

10. Análisis posterior

  1. Recolección de muestras para qPCR
    1. Dentro de la cabina de seguridad biológica (BSC), etiquete tubos microcentrífugos de 1,5 mL con identificadores de muestra, incluyendo el tipo celular y la condición experimental.
    2. Verifique que las células aún estén presentes sobre el PDMS utilizando un microscopio de cultivo celular, tanto para condiciones estáticas como de peristalsis.
    3. Aspire el medio residual de cada membrana de PDMS.
    4. Prepare fresco el tampón de lisis de ARN añadiendo β‑mercaptoetanol al tampón RLT en una proporción de 1:100.
    5. Añada 370 µL de tampón RLT + β-mercaptoetanol a cada membrana de PDMS para lisar las células.
    6. Utilizando un raspador celular estéril, raspe firmemente la región de PDMS sembrada con células para desprender todas las células.
    7. Transfiera aproximadamente 350 µL del lisado al tubo de 1,5 mL correspondiente.
    8. Continúe con la extracción de ARN o almacene las muestras a -80 °C hasta su uso posterior.
    9. Descontamine la cabina de seguridad biológica.
      NOTA: El tampón RLT y el β-mercaptoetanol deben manipularse según sus respectivas hojas de datos de seguridad (SDS) y desecharse en los recipientes adecuados para residuos.
  2. Tinción por inmunofluorescencia
    1. Añada 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% a cada membrana e incube a temperatura ambiente durante 20 min.
    2. Aspire el PFA y deseche en el recipiente designado para residuos peligrosos.
    3. Añada 1 mL de PBS a cada membrana para eliminar el fijador residual.
    4. Continúe con el protocolo de tinción por inmunofluorescencia apropiado para los marcadores objetivo.

11. Limpieza de los biorreactores y componentes asociados

  1. Rocíe todos los componentes del biorreactor que tengan contacto con el medio, las células o las membranas de PDMS con etanol al 70%, incluyendo los puertos de entrada y salida del biorreactor.
  2. Aspire cualquier medio residual de la botella de medio, luego enjuague el interior rociando abundantemente etanol al 70% y aspire nuevamente.
  3. Retire todos los componentes sanitizados de la cabina de seguridad biológica (BSC) y guárdelos en un área limpia designada.
  4. Para las botellas de medio:
    1. Limpie con lejía al 20%, agite y deseche el contenido en el fregadero con el agua corriendo.
    2. Restriegue con vinagre diluido 1:10, lave con jabón y agua ultrapura, luego enjuague con etanol al 70% y seque boca abajo.
    3. Limpie las tapas de las botellas de medio y los insertos de la bomba con etanol al 70%.
  5. Limpieza de las bombas peristálticas
    1. Prepare vasos de precipitados de 250 mL con (1) etanol al 70%, (2) agua ultrapura o (3) un recipiente vacío para desechos.
    2. Conecte la bomba con tubos en un circuito de flujo cerrado y enciéndala utilizando la placa de circuito controlada por Arduino.
    3. Haga funcionar la bomba con etanol al 70% durante 1 min, luego con agua ultrapura durante 1 min para lavar hacia el vaso de desechos vacío.

Resultados

Este protocolo tuvo como objetivo demostrar un método reproducible para determinar cómo las fuerzas mecánicas peristálticas modulan directamente la activación de macrófagos. Antes de los experimentos con el biorreactor, se confirmó que los iBMDM polarizaban adecuadamente en respuesta a condiciones estándar de estimulación bioquímica. Tras seguir este protocolo, las membranas de PDMS se recubrieron con fibronectina y se sembraron con iBMDM. Se permitió que las células se adhirieran durante 24 h antes de la inspección visual para confirmar una adhesión exitosa, una distribución uniforme sobre la superficie de la membrana y viabilidad, evidenciada por la morfología irregular tipo «huevo frito», según la descripción del proveedor (Figura 3A,B). Las membranas con mala adhesión, siembra desigual o evidencia de desprendimiento celular se excluyeron del experimento, ya que estas condiciones pueden generar una estimulación mecánica inconsistente y una señalización variable en etapas posteriores. Las membranas correctamente sembradas se ensamblaron en el sistema del biorreactor para someterlas a estimulación peristáltica o se mantuvieron como controles estáticos. Tras 4 h de cultivo, las muestras se reevaluaron para confirmar que las células permanecían adheridas tras la estimulación mecánica (Figura 3C,D). Tras confirmar la retención celular en todas las condiciones, se evaluó la activación de macrófagos mediante qPCR y tinción inmunofluorescente.

Se realizó un análisis de qPCR para evaluar los cambios en la expresión de genes asociados con el fenotipo M1 proinflamatorio. Il6, Nos2, y CD40, así como genes asociados con M2, Chil3 y Mrc1 (Tabla 1). Estos resultados demostraron que la estimulación peristáltica promovió la activación de macrófagos hacia un fenotipo proinflamatorio. El cultivo peristáltico aumentó significativamente Il6 expresión en 50,9 veces en comparación con los controles estáticos (p < 0.0001, no apareado prueba t) y Nos2 expresión en 19,8 veces (p = 0,0046, prueba t no apareada) (Figura 4A). CD40 la expresión también aumentó 7,7 veces, aunque este cambio no fue significativo (p = 0,1106, prueba t no pareada)Figura 4A). En contraste, no se observaron cambios significativos en Chil3 (1,22 veces superior a los controles estáticos; p = 0,9726, no apareado prueba t) o Mrc1 (1,16 veces superior a los controles estáticos; p = 0,9810, no apareado prueba t) (Figura 4B). En conjunto, estos hallazgos indican que las fuerzas peristálticas aplicadas promovieron preferentemente la activación de macrófagos proinflamatorios en lugar de las vías de activación alternativas.

Para evaluar más a fondo la polarización de macrófagos, se realizó tinción por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra el marcador pan-macrófago F4/80 y bien el marcador asociado a M1 CD40 (Figura 5A) o el marcador asociado a M2 YM1/YM2 (Figura 5B). Las muestras se contratiñeron con DAPI y se capturaron imágenes bajo condiciones idénticas de adquisición para permitir la comparación entre condiciones. Se cuantificó la intensidad media de fluorescencia (MFI) para cada marcador y se normalizó respecto a la señal correspondiente de F4/80 dentro de la misma imagen. Los macrófagos peristálticos exhibieron un MFI normalizado de CD40 de 1,74 ± 0,72, lo que representa un aumento del 64,80 % en comparación con los controles estáticos, aunque este aumento no fue estadísticamente significativo (Figura 5C). De acuerdo con los resultados de qPCR, no se observaron cambios significativos en la expresión normalizada de YM1/YM2 tras la estimulación peristáltica, con solo un aumento del 5 % respecto a los controles estáticos (Figura 5D). Estos resultados representativos demuestran que el protocolo induce de forma reproducible una respuesta predominantemente proinflamatoria en macrófagos únicamente mediante estimulación mecánica.

Comparación de la dispersión celular, estático frente a peristalsis, a 0 h y 4 h; análisis de imágenes de microscopio.
Figura 3: Las imágenes de campo claro muestran la confirmación visual de la adhesión celular antes y después de la peristalsis. Imágenes de campo claro de células sobre membranas de PDMS en condiciones estáticas (A,C) y con peristalsis (B,D), tomadas antes del montaje del biorreactor (t = 0 h) y tras la finalización del experimento (t = 4 h). Barras de escala = 200 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de barras de expresión génica; cambio de expresión en M1 y M2 con condiciones estáticas frente a peristálticas.
Figura 4: Análisis de la expresión génica muestra la activación proinflamatoria de macrófagos vía estimulación peristáltica Cambio en el plegamiento de la expresión génica de (A) Marcadores M1 Il6, Nos2 y Cd40, y (B) Marcadores M2 Chil3 y Mrc1. *p < 0.05, ****p < 0,0001, ns = no significativo. Todos los datos se representan como media ± DE; n = 3 para cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Experimento de polarización de macrófagos; marcadores CD40, YM1/2, microscopía de fluorescencia, gráfico de análisis de datos.
Figura 5: La tinción inmunofluorescente confirma la activación proinflamatoria de los macrófagos tras la activación de la peristalsis. Imágenes inmunofluorescentes representativas de macrófagos teñidos para el marcador pan-macrófago F4/80 (verde) y para los marcadores (A) M1 CD40 (rosado) o (B) M2 YM1/YM2 (rojo). Barras de escala = 20 µm. (C) Cuantificación de la intensidad media de fluorescencia (IMF) de CD40 normalizada respecto a F4/80. (D) Cuantificación de la IMF de YM1/YM2 normalizada respecto a F4/80. Todos los datos se representan como media ± DE; n = 3 para cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

GenPrimerSecuencia (5′–3′)
GapdhFAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GapdhRGGGGTCGTTGATGGCAACA
Chil3FCAG GTC TGG CAA TTC TTC TGA A
Chil3RGTC TTG CTC ATG TGT GTA AGT GA
Nos2FGGA GTG ACG GCA AAC ATG ACT
Nos2RTCG ATG CAC AAC TGG GTG AAC
Mrc1FCTC TGT TCA GCT ATT GGA CGC
Mrc1RTGG CAC TCC CAA ACA TAA TTT GA
Il-6FTCTATACCACTTCACAAGTCGGA
Il-6RGAA TTG CCA TTG CAC AAC TCT TT
Cd40FTTGTTGACAGCGGTCCATCTA
Cd40RGCCATCGTGGAGGTACTGTTT

Tabla 1: Secuencias de cebadores para los genes analizados mediante qPCR.

Figura suplementaria 1: Flujo de trabajo para la preparación de PDMS, ensamblaje del biorreactor y configuración de perfusión. (A) Preparación de PDMS en la cabina de seguridad biológica (BSC). (B) Siembra celular. (C) Esterilización por UV de los componentes del biorreactor. (D) Ensamblaje del biorreactor. (E) Biorreactor asegurado. (F) Conexión de la bomba. (G) Configuración en la incubadora a las 0 h. (H) Configuración en la incubadora a las 4 h. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Circuito de biorreactor con placa de pruebas, bomba, motor y cableado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Código Arduino del biorreactor. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La comprensión actual sobre cómo las fuerzas peristálticas influyen en la función de los macrófagos sigue siendo limitada, a pesar de la prevalencia de una peristalsis desregulada en enfermedades inflamatorias. Aunque se sabe que estímulos mecánicos individuales, como el estrés cortante y la deformación cíclica, modulan la activación de los macrófagos, los efectos de la deformación multiaxial y el flujo de fluidos simultáneos, que en conjunto constituyen la peristalsis, no se han investigado ampliamente en el contexto de la mecanobiología de los macrófagos. El protocolo descrito aquí proporciona una plataforma reproducible para estudiar cómo estas fuerzas mecánicas combinadas regulan el comportamiento inflamatorio de los macrófagos bajo condiciones fisiológicamente relevantes. Mediante este sistema, se demostró que la exposición a estimulación peristáltica durante 4 h promueve un fenotipo de macrófago predominantemente proinflamatorio, caracterizado por un aumento significativo en la expresión de Il6 y Nos2.

Es importante destacar que la mecanosensibilidad de los macrófagos depende en gran medida de la magnitud, la frecuencia y la duración de la fuerza aplicada12,13,14. Estudios previos que investigaron estímulos mecánicos aislados han demostrado que los estados de activación de los macrófagos varían considerablemente según estos parámetros. Por lo tanto, estudios futuros deberían investigar un rango más amplio de condiciones peristálticas, incluyendo deformaciones y tensiones cortantes alteradas, así como un mayor tiempo bajo estimulación mecánica, para definir mejor el espectro de respuestas de los macrófagos inducidas por la mecánica peristáltica. Además, este estudio tuvo la limitación de que decidimos centrarnos en la peristalsis como entrada mecánica, en lugar de la tensión cortante del fluido o la deformación cíclica de forma aislada. Estudios futuros podrían utilizar esta plataforma de biorreactor para explorar la activación de macrófagos en función de diferentes entradas mecánicas, utilizando un único entorno experimental riguroso. Ampliar estos estudios podría ayudar a identificar umbrales mecánicos que promuevan fenotipos inflamatorios o proregenerativos en diferentes contextos tisulares.

La mecanosensibilidad de los macrófagos también depende en gran medida de la rigidez y la topografía del sustrato. Es importante tener en cuenta que la rigidez del PDMS elegido para este estudio podría tener un impacto en la activación de los macrófagos independiente de los efectos de las fuerzas peristálticas15,16,17,18,19. Para controlar la rigidez como variable, comparamos nuestros macrófagos expuestos a peristalsis con macrófagos sobre PDMS de rigidez equivalente en condiciones estáticas. En estudios futuros se podría controlar aún más la rigidez como variable mediante la variación de la proporción de PDMS, el uso de materiales adicionales para el sustrato o el cultivo de macrófagos en una placa de cultivo tisular 2D para su comparación. Además, aunque no modificamos la topografía del PDMS, nuestro dispositivo permite estudios futuros sobre esta variable.

Una de las principales fortalezas de este protocolo es su adaptabilidad a una amplia variedad de estudios de inflamación. Aunque este trabajo utiliza macrófagos derivados de médula ósea inmortalizados (iBMDM), el sistema puede modificarse fácilmente para acomodar macrófagos primarios, monocitos, macrófagos residentes en tejidos o sistemas de co-cultivo multicelulares. Por ejemplo, podrían incorporarse células epiteliales, estromales o musculares lisas para recapitular mejor el microambiente celular del tracto gastrointestinal, el útero o los uréteres. Además, la composición de la matriz extracelular puede ajustarse al tejido de interés modificando el recubrimiento aplicado a la membrana de PDMS. En este estudio, la fibronectina fue necesaria para mantener la adhesión de los iBMDM durante la estimulación peristáltica, mientras que los recubrimientos de colágeno I y colágeno IV provocaron una desprendimiento celular considerable. Sin embargo, los recubrimientos óptimos de matriz pueden variar según el origen de los macrófagos o la configuración del co-cultivo. Por consiguiente, es fundamental validar cuidadosamente la adhesión celular en los puntos de control recomendados para garantizar una estimulación mecánica reproducible y análisis posteriores.

Varias consideraciones técnicas son esenciales para la implementación exitosa de este protocolo, incluido el mantenimiento rutinario, que ayuda a prevenir los fallos más comunes. El ensamblaje y sellado adecuados del biorreactor utilizando bridas plásticas es particularmente importante, ya que un sellado incompleto puede provocar fugas del medio, perfiles alterados de esfuerzo cortante y deformación, riesgo de contaminación o pérdida de viabilidad celular. Además, las bombas y los motores requieren una calibración estable para mantener una estimulación peristáltica reproducible, y el lavado regular de los tubos de la bomba con etanol y agua ultrapura evita la acumulación de residuos. Por último, las células sembradas sobre las membranas de PDMS deben revisarse para verificar una correcta adhesión y una confluencia del 80 % antes de colocarlas en el biorreactor. En conjunto, estos pasos de solución de problemas y limitaciones del sistema destacan la necesidad de un ensamblaje cuidadoso, una calibración constante y un monitoreo continuo para garantizar un rendimiento reproducible del biorreactor.

En general, este protocolo proporciona una plataforma versátil y fisiológicamente relevante para investigar la mecano-inmunomodulación en entornos mecánicos dinámicos complejos. Al permitir la aplicación simultánea de tensión cíclica multiaxial y estrés cortante de fluido, este sistema amplía los modelos tradicionales in vitro de una sola fuerza y ofrece una herramienta valiosa para estudiar la inflamación en tejidos impulsados por músculo liso. Este enfoque podría ser ampliamente aplicable a investigaciones sobre enfermedades gastrointestinales, fibrosis, cáncer y otras patologías en las que los macrófagos están expuestos a microentornos mecánicos dinámicos.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Premio de la National Science Foundation número 2440798. Figura 1 y Figura 2 fueron creadas con una versión con licencia de BioRender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tripsina-EDTA al 0,25 %Fisher25200056
Tubos microcentrífugos de 1,5 mLUSA Scientific1615-5510
Placas de Petri de 100 mm × 15 mmFisher50-190-0276
Placas de cultivo de 150 mmFisherFB012925
Paraformaldehído al 4 %Santa Cruzsc-281692
Placas de cultivo de 90 mmFisherFB012923
Anticuerpo Alexa Fluor 488 Anti-F4/80Abcamab204266
Anticuerpo Alexa Fluor 647 Anti-CD40Abcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
ProtoboardAmazon
Buffer RLTQiagen79216
Raspador celularFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
DesecadorMilliporeSigmaZ119008
Alicates diagonalesAmazon
Suero bovino fetalInnovative Biosciences11-01-500
FibronectinaMilliporeSigmaF1141-1MG
Buffer HEPESFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
Motor RobotshopFT-SPARK16-360
Anticuerpo PE Anti-Ym-1 + Ym-2Abcamab211621
Penicilina-EstreptomicinaFisher15140122
Bomba peristálticaDigiKey1150
Solución salina tamponada con fosfatoFisher14190250
Filamento PLAAmazonB0D7ZYCVTY
Potenciómetro B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
Grasa de siliconaAmazonB000XBH9HI
Alicates de articulación móvilAmazon
Piruvato de sodioCytiva HycloneSH3023901
Kit de elastómero de silicona Sylgard 184FisherNC9285739
Matraz de cultivo T-25Fisher229331
TransistorDigiKeyIRF520NPBF-ND
Cables/CocodrilosAmazon
Cabestrillos de 18 pulgadasAmazon
β-mercaptoetanolFisherAC125472500

Referencias

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