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Medición de la reparación de roturas de doble cadena del ADN mediante el ensayo DR-white en Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/72635

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14 de agosto de 2026

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

En este artículo

Resumen

El ensayo DR-white es un ensayo genético versátil con función de reportero para detectar los resultados de la reparación de roturas de doble cadena del ADN en el organismo pluricelular Drosophila melanogaster.

Resumen

Los estudios tradicionales sobre la reparación de roturas de doble cadena de ADN (DSB) suelen limitarse a investigaciones bioquímicas o sistemas unicelulares (por ejemplo, células, levaduras). Para facilitar el estudio de la reparación de DSB en un organismo pluricelular, utilizamos el ensayo DR-white en Drosophila melanogaster. El ensayo DR-white es un ensayo sencillo pero versátil de reportero de reparación de DSB que contiene una única secuencia de reconocimiento I-SceI, la cual puede ser escindida mediante la expresión de la meganucleasa I-SceI. La expresión de I-SceI puede inducirse de forma constitutiva, mediante choque térmico o bajo otros promotores, permitiendo investigar la reparación específica de tejidos o etapas del desarrollo. Una ventaja principal de este ensayo es que puede distinguir los resultados de reparación que implican recombinación homóloga (HR), unión de extremos no homólogos (NHEJ) y apareamiento de cadenas simples (SSA). Este artículo proporciona un protocolo detallado para el ensayo DR-white ya establecido, incluyendo un flujo de trabajo paso a paso para inducir DSB en la línea germinal premeiótica y analizar fenotípicamente los eventos de reparación mediante la cuantificación de la descendencia. También describe el análisis molecular de los eventos de reparación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación y el script en R denominado Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). Este protocolo ofrece una herramienta útil para investigar los mecanismos genéticos y moleculares de la reparación del ADN en un modelo de organismo completo.

Introducción

La integridad genómica se ve frecuentemente amenazada por lesiones en el ADN, entre las cuales las roturas de doble cadena (DSBs) son particularmente tóxicas. Si no se reparan, estas roturas pueden provocar pérdida genética, reordenamientos cromosómicos y muerte celular1. Por ello, las células han desarrollado múltiples vías para reparar las DSB. La unión de extremos no homólogos (NHEJ) liga directamente los dos extremos de la DSB, pudiendo introducir indels en el sitio de la rotura; la anillación de cadena sencilla (SSA) aprovecha secuencias complementarias que flanquean el sitio de rotura para la reparación, lo que resulta en deleciones en dicho sitio; mientras que la recombinación homóloga (HR) utiliza una secuencia homóloga como molde para la reparación2,3.

Históricamente, los estudios sobre la reparación de roturas de doble cadena (DSB) se han limitado a ensayos bioquímicos4 o sistemas de célula individual, como bacterias5,6, levaduras7,8 y cultivos de células de mamífero9,10. Aunque estos modelos han sido fundamentales para identificar las proteínas esenciales de la reparación y sus mecanismos, carecen de la complejidad biológica de un organismo pluricelular. Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema modelo pluricelular popular para estudiar la reparación del ADN. Sin embargo, muchos ensayos actuales están diseñados específicamente para vías de reparación concretas11; utilizan aberraciones cromosómicas grandes, como la excisión del elemento P12; o requieren análisis moleculares que consumen mucho tiempo13. El ensayo DR-white aborda estos desafíos al proporcionar un indicador genético sencillo de la reparación del ADN en Drosophila14. Este estudio ofrece un flujo de trabajo completo, práctico y detallado paso a paso para realizar ensayos genéticos y moleculares destinados a medir la reparación de DSB en el ADN mediante el bien establecido ensayo DR-white.

El ensayo emplea dos repeticiones directas del gen Drosophila white (w), que confiere el color rojo silvestre del ojo (Figura 1). Ambas copias son no funcionales: la primera, Sce.white, contiene una inserción que lleva la secuencia de reconocimiento de la meganucleasa I-SceI en un sitio SacI silvestre e introduce un codón de parada prematuro; la segunda, iwhite, está truncada tanto en los extremos 5’ como 3’ y sirve como molde para la reparación por HR. Un transgén Drosophila yellow (y+), que confiere el color marrón silvestre del cuerpo, está presente entre las dos repeticiones de white. Dado que el casete DR-white está integrado en un fondo mutante y w, las moscas DR-white son fenotípicamente de cuerpo marrón silvestre y de ojos blancos mutantes.

Las roturas de doble cadena (DSB) pueden inducirse en Sce.white cruzando moscas DR-white con moscas que portan un transgén I-SceI. La reparación de las DSB en la línea germinal premeiótica puede medirse mediante el análisis de la descendencia de un cruce de prueba. La reparación por NHEJ da como resultado el fenotipo parental de cuerpo marrón y ojos blancos (Figura 1A), mientras que la reparación por HR restaura la secuencia silvestre de white y produce descendencia de cuerpo marrón y ojos rojos (Figura 1B). La reparación por SSA de la DSB o un entrecruzamiento mitótico provoca la pérdida del transgén yellow intermedio, dando lugar a moscas de cuerpo amarillo y ojos blancos (Figura 1C). Para analizar los resultados de la reparación en células somáticas, hemos adaptado el algoritmo Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) para detectar específicamente la reparación por NHEJ con procesamiento y por HR en el ensayo DR-white15,16.

El ensayo DR-white ofrece varias ventajas frente a los ensayos de reparación del ADN previamente establecidos en Drosophila. Dado que los cortes se generan y reparan en la línea germinal, los resultados de la reparación pueden detectarse fácilmente mediante análisis fenotípico. Al mismo tiempo, el ensayo es extremadamente versátil. Aunque está diseñado principalmente para medir la reparación por recombinación homóloga (HR), puede detectar las tres vías de reparación. También hemos desarrollado dos plantillas adicionales y funcionales de reparación (Figura 2). La plantilla iwhite.mu contiene 28 polimorfismos de nucleótido único (SNP) silenciosos y produce descendencia de ojos rojos (Figura 2A), lo que facilita los estudios de longitudes de tramos de conversión génica (GCT) y la reparación por HR entre secuencias divergentes14. La plantilla iwhiteΔ9 contiene una deleción de nueve pares de bases en el sitio SacI de tipo silvestre y da como resultado descendencia de ojos anaranjados (Figura 2B). Esta característica permite a los investigadores rastrear la reparación por HR a partir de plantillas distintas, una característica única del ensayo DR-white15.

Protocolo

1. Ensayo DR-white

  1. Cruces genéticos (Figura 3A)
    NOTA: Para protocolos estándar de cultivo y genética de Drosophila, consulte "Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics" por Ralph J. Greenspan17. La información sobre los genotipos de las cepas se proporciona en la Tabla de materiales.
    1. Mantenga las moscas a 25 °C con ciclos de 12 h de luz/oscuridad en alimento estándar para Drosophila, espolvoreado con levadura activa.
    2. Prepare cinco viales de choque térmico cruzando 8–10 hembras vírgenes DR-white con 3–5 machos que porten un transgén I-SceI (Cruce 1, Figura 3A) por vial.
      NOTA: Se pueden utilizar diferentes transgenes I-SceI según la aplicación. En este protocolo, se utilizó el transgén hsp70-I-SceI para la inducción mediante choque térmico11. Para evitar la expresión fuga del I-SceI en generaciones anteriores, es importante asegurarse de que los transgenes DR-white e I-SceI solo se combinen en la misma mosca en esta generación.
    3. El mismo día, prepare botellas de expansión de una cepa y w. Estas serán las moscas de prueba. Tres botellas de expansión son suficientes para aproximadamente 60–80 cruces de prueba.
    4. Cultive los viales de choque térmico y las botellas de expansión y w a 25 °C durante 3 días.
    5. El tercer día, pase los viales de choque térmico y las botellas de expansión y w a alimento fresco para servir como conjunto de respaldo.
  2. Choque térmico/inducción de roturas de doble cadena (DSB)
    NOTA: Si no utiliza un transgén I-SceI inducible por choque térmico, pase al paso 1.2.5, que generalmente se realiza 3 días después del paso 1.1.5.
    1. Envejezca los viales de choque térmico durante 3 h a 25 °C para asegurar que toda la descendencia haya progresado a través de la transición materno- zigótica.
    2. Someta los viales originales a un choque térmico en un baño de agua a 38 °C durante 1 h. Asegúrese de que el nivel de agua esté al menos a la altura de la base del tapón de algodón para que las larvas no puedan trepar por encima del nivel del agua.
    3. Monitoree la temperatura del baño de agua cada 15 min y manténgala dentro de 38 ± 0.5 °C, ya que los resultados de inducción y reparación dependen de la duración y temperatura del choque térmico.
    4. Devuelva los viales a 25 °C.
    5. Al día siguiente, agregue 1/3 de una toalla de laboratorio doblada al alimento para absorber el exceso de humedad. Si el alimento está seco, agregue aproximadamente 100 µL de agua a la toalla de laboratorio. Agregue un tapón de algodón a las botellas de expansión y w.
    6. Cultive los viales sometidos al choque térmico durante 6 días adicionales a 25 °C, o hasta que las moscas comiencen a emerger.
    7. Limpie los viales de respaldo y las botellas de expansión 3 días después del traslado. Agregue un tapón de algodón a las botellas de expansión y w de respaldo aproximadamente 4 días después de la limpieza.
      NOTA: Si es necesario, los viales de respaldo pueden someterse a choque térmico según los pasos 1.2.1 a 1.2.6 y procesarse como se describe a continuación.
  3. Cruces de prueba
    1. Recoja moscas sometidas al choque térmico que porten los transgenes DR-white e I-SceI durante 4–5 días después del inicio de la emergencia para reducir el sesgo por etapa de desarrollo.
      NOTA: Las moscas que han recibido con éxito el choque térmico y portan los transgenes DR-white e I-SceI presentan ojos mosaicistas debido a eventos de reparación durante el desarrollo embrionario y larval que se han incorporado a los tejidos adultos. El grado de mosaicismo no siempre se correlaciona con los eventos de reparación en la línea germinal y, por lo tanto, no debe ser un factor determinante al seleccionar moscas experimentales para los cruces de prueba (paso 1.3.3).
    2. Recoja hembras vírgenes y w durante 5 días. Recoja 5 hembras vírgenes por número esperado de muestras. Recoja de las botellas de expansión de respaldo tan pronto como comiencen a emerger.
    3. Prepare los viales de prueba cruzando un macho sometido al choque térmico con 4–5 hembras vírgenes y w (Cruce 2; Figura 3A). Seleccione machos al azar del conjunto reunido en el paso 1.3.1 para reducir el sesgo por etapa de desarrollo. Cultive los cruces de prueba a 25 °C.
      NOTA: Para evitar el entrecruzamiento entre DR-white e I-SceI, generalmente se analizan las líneas germinales masculinas; sin embargo, también se puede analizar la descendencia femenina. Si se analiza la descendencia femenina, los viales de prueba del Cruce 2 se preparan en una proporción de 2:5 hembras:machos y w y se cultivan durante 5–6 días (paso siguiente) para asegurar la productividad.
    4. Verifique la productividad 4 días después de preparar los viales de prueba para evaluar cuándo deben limpiarse.
      NOTA: Confirme que se han puesto suficientes huevos para garantizar al menos 20 descendientes cuantificables, pero no permita que los cultivos se sobrepoblen, ya que las moscas podrían quedar atrapadas en el alimento.
    5. Cuando los viales de prueba estén listos (hasta 4–5 días después de establecer los cruces de prueba), deseche las moscas y agregue 1/3 de una toalla de laboratorio doblada al alimento para absorber el exceso de humedad.
      NOTA: Los machos pueden recolectarse en este momento si se requieren análisis adicionales (por ejemplo, genotipificación molecular).
    6. Cultive los viales de prueba durante 5–6 días adicionales a 25 °C.
  4. Cuantificación
    NOTA: Aproximadamente 25 viales de prueba se preparan para cada condición en cada experimento genético (por ejemplo, mutantes homocigotos y controles heterocigotos). Cada experimento genético se repite 2–3 veces, y los datos de los viales individuales se agrupan.
    1. Cuantifique la descendencia del Cruce 2 (Figura 3A) durante aproximadamente 9 días después de que las primeras moscas comiencen a emerger.
    2. Anestesie las moscas usando CO2 o transfiriéndolas a un vial vacío sin alimento y congelándolas a -20 °C durante al menos 30 min.
      NOTA: Si las moscas se congelan, pueden cuantificarse hasta varios días después.
    3. Coloque las moscas sobre una almohadilla para moscas y cuantifique los fenotipos adecuados (Figura 3A). Incluya solo viales con al menos 20 moscas cuantificadas en el conjunto de datos.
      1. Para cuantificar, primero separe las moscas que portan el casete DR-white (utilizando la fluorescencia positiva para la proteína fluorescente roja [RFP+] como marcador), luego cuantifique el color de los ojos y del cuerpo.
      2. El transgén y+ ligado al casete DR-white produce un color marrón intermedio del cuerpo que no es completamente silvestre. Para distinguir entre ausencia de DSB/replicación no homóloga (NHEJ) (cuerpo marrón; y+ w-) y recombinación por alineación de extremos (SSA) (cuerpo amarillo; y- w-), compare las moscas con la descendencia y w que no posee el cromosoma DR-white (RFP-). Los eventos de SSA tendrán el mismo color amarillo que estas moscas. Cuantifique como ausencia de DSB/NHEJ a las moscas que sean más oscuras (más marrones) que estas.
        NOTA: Las desviaciones respecto a los fenotipos descritos en la Figura 3A pueden indicar contaminación, y el vial no debe cuantificarse. Aunque pueden cuantificarse moscas muertas completas, las moscas dañadas deben descartarse si no es posible determinar sus fenotipos.

2. Análisis TIDE (Figura 4)

  1. Extracción de ADN genómico (ADN-g)18
    1. Recoger moscas (o larvas) sometidas a choque térmico que porten ambos transgenes DR-white e I-SceI, como la progenie del Cruce 1 (Figura 3A).
    2. Colocar una mosca individual en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL y congelar rápidamente (por ejemplo, en un baño de hielo seco/etanol o nitrógeno líquido).
      ADVERTENCIA: Manipular el hielo seco, el nitrógeno líquido, el etanol, el isopropanol y otros productos químicos utilizando equipo de protección personal adecuado y siguiendo los procedimientos de seguridad institucionales.
      PUNTO DE PAUSA:  Las muestras pueden almacenarse a -80 °C y procesarse posteriormente si es necesario. Si se analizan moscas o larvas, utilizar una sola mosca o larva por muestra. Si se analizan tejidos más pequeños (por ejemplo, cerebros, discos imaginales), agrupar muestras para aumentar el rendimiento de ADN.
    3. Homogeneizar cada muestra en 50 µL del tampón A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM ácido etilendiaminotetraacético [EDTA]; 100 mM cloruro de sodio; 0,5 % dodecilsulfato de sodio [SDS]) utilizando un homogeneizador eléctrico.
    4. Incubar las muestras en un baño de agua a 65 °C durante 30 min.
    5. Añadir 100 µL del tampón B (1,4 M acetato de potasio, 4,3 M cloruro de litio) a cada muestra y mezclar brevemente invirtiendo los tubos.
      NOTA: Si se utilizan moscas enteras, puede requerirse un volumen mayor para homogeneizar completamente las muestras. En tal caso, mantener una relación volumétrica de 1:2 entre tampón A y tampón B.
    6. Incubar las muestras en hielo durante al menos 30 min.
    7. Centrifugar las muestras a aproximadamente 16.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    8. Transferir 125 µL del sobrenadante clarificado a nuevos tubos microcentrífugos de 1,5 mL. Evitar cualquier precipitado.
    9. Añadir 100 µL de isopropanol al 100 % a temperatura ambiente por cada 125 µL de sobrenadante y mezclar brevemente invirtiendo los tubos.
    10. Centrifugar las muestras a aproximadamente 16.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    11. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de ADN.
      NOTA: El pellet de ADN puede no ser visible en esta etapa. Anotar la orientación de los tubos al colocarlos en la microcentrífuga y aspirar en la cara opuesta a donde se espera que esté el pellet.
    12. Lavar los pellets con 250 µL de etanol al 70 % frío, luego mezclar brevemente invirtiendo suavemente los tubos.
    13. Centrifugar las muestras a aproximadamente 16.000 x g durante 5 min a 4 °C.
    14. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet.
      NOTA: El pellet puede ser más visible tras el lavado con etanol. Si no lo es, ver la Nota del paso 2.1.11.
    15. Dejar los tubos destapados a temperatura ambiente para evaporar cualquier resto de etanol. Evitar el secado excesivo del pellet, ya que podría no reconstituirse completamente.
    16. Añadir 20 µL de agua libre de nucleasas y permitir que los pellets se reconstituyan durante la noche a 4 °C.
      PUNTO DE PAUSA: Si el pellet de ADN no se ha disuelto completamente, puede añadirse más agua.
    17. Al día siguiente, invertir suavemente los tubos y medir la concentración de ADN. Almacenar las muestras a -20 °C si no se van a procesar inmediatamente.
      NOTA: Para la extracción a partir de una sola mosca, los rendimientos suelen ser aproximadamente de 100 ng/µL. Es importante obtener muestras de alta calidad. La relación de absorbancia A260/A280 debe estar entre 1,7 y 2,0. Valores fuera de este rango indican contaminantes como proteínas. La relación A260/A230 debe estar entre 2,0 y 2,2. Valores fuera de este rango indican contaminantes como etanol y sales del tampón. Las muestras con bajo rendimiento y mala calidad pueden dar lugar a una amplificación por PCR deficiente.
  2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
    1. Amplificar a través de Sce.white mediante PCR utilizando 100 ng de ADN-g y los cebadores DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) y DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC), siguiendo las instrucciones del fabricante. Incluir una muestra de control de mosca DR-white (es decir, la cepa parental DR-white, sin presencia del transgen I-SceI). Utilizar las siguientes condiciones de ciclado: 94 °C durante 3 min; {94 °C durante 30 s; descenso por etapas a 66 °C (-0,5 °C/ciclo) durante 30 s; 72 °C durante 30 s} x 16 ciclos; {94 °C durante 30 s; 58 °C durante 30 s; 72 °C durante 30 s} x 20 ciclos; 72 °C durante 5 min; mantener a 12 °C.
      NOTA: Si se utiliza un reactivo diferente, puede ser necesario ajustar las condiciones de ciclado.
    2. Correr aproximadamente 2 µL del producto de PCR en un gel diagnóstico de agarosa al 1 % en tampón tris-acetato-EDTA (TAE) para confirmar la amplificación de Sce.white. El tamaño esperado del amplicón es aproximadamente de 1,7 kb.
    3. Purificar los amplicones de Sce.white mediante PCR y medir la concentración de ADN.
    4. Secuenciar el producto de PCR purificado utilizando el cebador DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      NOTA: Normalmente secuenciamos 40 ng de producto de PCR purificado, pero esto puede variar según las instrucciones del servicio de secuenciación.
  3. Análisis TIDE
    NOTA: La mayoría de los errores al usar el script R de TIDE se deben a un formato incorrecto del código.
    1. Descargar los paquetes R necesarios (es decir, sangerseqR y Biostrings) desde Bioconductor.org. Utilizar la barra de búsqueda para localizar la última versión de cada paquete.
    2. Analizar los cromatogramas de secuencia para asegurarse de que sean de buena calidad. Analizar únicamente cromatogramas con poco o ningún fondo antes del sitio de rotura.
    3. Descargar los archivos de trazado de secuencia (con extensión .ab1) y colocar todos los archivos de trazado en una única carpeta del ordenador. Simplificar los nombres de los archivos de secuencia tanto como sea posible (por ejemplo, F1, Het2, Hom3) para facilitar las ediciones del script en los siguientes pasos.
    4. Abrir el script R de TIDE (Archivo Suplementario 1) en el entorno de desarrollo integrado (IDE) de RStudio (ver la Tabla de Materiales). En el panel Fuente, localizar la línea que comienza con Control <- (Archivo Suplementario 2A) y escribir exactamente el nombre del archivo de secuencia de control tal como se guardó, incluyendo la extensión .ab1, entre comillas.
      NOTA: La "secuencia de control" es la secuencia de la PCR obtenida de la cepa parental DR-white sin el transgen I-SceI ni inducción.
    5. Localizar la línea que comienza con samplename <- c( y escribir cada nombre de archivo de secuencia de muestra dentro de los paréntesis (Archivo Suplementario 2A). Incluir la extensión .ab1, colocar cada nombre de archivo entre comillas separadas y separar los nombres con comas.
    6. Guardar el archivo editado del script R de TIDE en la misma carpeta que los archivos de secuencia a analizar. Mantener el nombre del archivo simple para evitar errores en los siguientes pasos.
    7. En el IDE, navegar hasta la carpeta de TIDE utilizando la pestaña Archivos en el panel de Salida (Archivo Suplementario 2B).
    8. Hacer clic en el desplegable Más y seleccionar Abrir Nuevo Terminal Aquí (Archivo Suplementario 2C). Se abrirá un nuevo terminal en el panel de Consola (abajo a la izquierda).
    9. En el terminal recién abierto, escribir “R” y pulsar Intro (Archivo Suplementario 2D).
    10. Una vez que R esté en ejecución en el terminal, ejecutar el script R de TIDE escribiendo source("TIDE_analysis.R") y pulsar Intro (Archivo Suplementario 2E). El terminal ejecutará el script y generará una representación gráfica (Archivo Suplementario 2F) y un archivo .csv que contiene los datos brutos para cada muestra (Archivo Suplementario 2G y Archivo Suplementario 3). Los archivos de salida se guardan en la misma carpeta que el script R y los archivos de secuencia.
      NOTA: Si se vuelve a ejecutar el mismo script R, cualquier nuevo archivo .csv generado sobrescribirá los anteriores. Si se realizan múltiples análisis sobre los mismos archivos, hacer una copia de la carpeta.
    11. Analizar los datos abriendo cada archivo .csv.
      1. Interpretar los datos brutos como proporciones de indels en la secuencia de la muestra. La conversión génica por recombinación homóloga desde la secuencia de reconocimiento de I-SceI hasta la secuencia silvestre de SacI produce la eliminación canónica de 23 pb; el script informa de este valor de HR en una fila separada al final de la salida (Archivo Suplementario 2G). El valor de 0-indel representa ausencia de DSB o NHEJ sin indels. Sumar todos los demás valores de indel para obtener NHEJ con procesamiento. La suma de NHEJ con procesamiento y HR es el número total de eventos detectables de reparación de DSB.
      2. Calcular las proporciones de las vías de reparación entre los eventos detectables de reparación de DSB utilizando las siguientes ecuaciones:
        Proporción de NHEJ con procesamiento = (NHEJ con procesamiento) / (NHEJ con procesamiento + HR)
        Proporción de HR = (HR) / (NHEJ con procesamiento + HR)
        NOTA: Aproximadamente 10–15 muestras se utilizan para cada condición en cada experimento genético (por ejemplo, mutantes homocigotos y controles heterocigotos). Cada experimento genético se repite 2–3 veces, y los datos individuales se agrupan.

Resultados

Drosophila requiere Rad51 para la reparación mediante recombinación homóloga

Los experimentos exitosos en la línea germinal producen las clases fenotípicas esperadas mostradas en la Figura 3A y al menos 20 descendientes analizables por frasco. Los fenotipos inesperados o menos de 20 descendientes analizables indican contaminación o productividad insuficiente y deben excluirse según se especifica en el paso 1.4.3. Para el análisis TIDE, las muestras exitosas producen un amplicón de aproximadamente 1,7 kb y cromatogramas con poco fondo antes del sitio de rotura; el ADN de bajo rendimiento o contaminado y los cromatogramas ruidosos son subóptimos y no deben analizarse.

Al utilizar el DR-blanco ensayo con una fuente inducible al choque térmico de I-SceI, la frecuencia de reparación por HR en moscas de tipo salvaje es del 38,5 ± 1,2 % (media ± EE), mientras que el SSA ocurre aproximadamente en un 3,2 ± 0,35 % (Figura 3B y Archivo Suplementario 4). Rad51 (codificada por el homólogo spnA en Drosophilaes necesario para el paso de invasión de la cadena en la recombinación homóloga14,19. Por lo tanto, la pérdida de Rad51 debería dar como resultado una recombinación homóloga ineficiente. De hecho, en un DmRad51-/- el fondo, la reparación HR se reduce a 1,3 ± 0,4 %, con un aumento concomitante de la reparación SSA (34,5 ± 1,8 %); Figura 3B y Archivo Suplementario 4)14. Esto probablemente se deba a que los eventos de reparación destinados a la recombinación homóloga son reparados alternativamente mediante la unión de cadenas simples del blanco secuencias repetidas

Drosophila contribución de CtIP a la reparación eficiente mediante HR en tejidos somáticos

El algoritmo TIDE permite la medición de la elección de la vía de reparación en células somáticas. En un fondo no mutante, la NHEJ con procesamiento ocurre en el 59,0 % de los eventos de reparación detectables, y la HR ocurre en el 41,0 % (Figura 4B y Archivo Suplementario 4). CtIP desempeña un papel importante en la iniciación de la reparación por HR al promover la resección de extremos de ADN20. Por consiguiente, en un fondo DmCtIP-/-, la elección de la vía de HR se reduce notablemente en células somáticas, del 41,0 % en controles heterocigotos al 10,9 % en mutantes homocigotos (Figura 4B y Archivo Suplementario 4)16. Esto sugiere que en Drosophila, CtIP contribuye a la reparación por HR, pero no es esencial para ella.

Diagrama del ensayo DR-white que muestra las vías de reparación del ADN; métodos HR, NHEJ, SSA con elementos del gen Sce.white.
Figura 1: Ensayo del reportero de ruptura de doble cadena DR-white y sus resultados de reparación. El ensayo de repetición directa white contiene dos copias no funcionales del gen white: Sce.white (con una inserción de 23 pb que incluye el sitio de reconocimiento I-SceI y un codón de parada prematuro) e iwhite (secuencia dadora truncada en los extremos 5′ y 3′). El cruce de moscas que contienen DR-white y un transgén I-SceI produce una ruptura de doble cadena (DSB) específica de sitio que puede analizarse fenotípicamente o molecularmente. Los fenotipos resultantes son: (A) descendencia con ojos blancos (y+ w−), lo que indica ausencia de DSB, recombinación homóloga entre cromátidas hermanas o NHEJ; (B) descendencia con ojos rojos (y+ w+), lo que indica recombinación homóloga intracromosómica que restaura la secuencia SacI de tipo silvestre a partir de la dadora iwhite; y (C) descendencia con cuerpo amarillo y ojos blancos (y− w−), lo que indica unión de hebras simples (SSA) o entrecruzamiento mitótico (CO). Figura adaptada de Do et al.14. Abreviaturas: CO = entrecruzamiento; DR-white = repetición directa de white; DSB = ruptura de doble cadena; HR = recombinación homóloga; NHEJ = unión de extremos no homólogos; SSA = unión de hebras simples. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de edición genética: recombinación homóloga, escisión I-SceI, DR-white.mu, ADN, iwihiteΔ9, sitios SacI.
Figura 2: Derivados del ensayo DR-white. (A) El ensayo DR-white.mu contiene 28 SNP silenciosos en la secuencia donadora iwhite.mu, lo que genera una divergencia de secuencia del 1,4 % entre las repeticiones directas. La conversión génica de polimorfismos individuales varía entre los eventos de RH y puede determinarse mediante secuenciación. (B) DR-white con el donador iwhiteΔ9 distingue la recombinación interhomóloga de la intracromosómica. La RH a partir del donador intracromosómico iwhite restaura la secuencia silvestre de SacI y produce descendencia con ojos rojos. La RH a partir del donador interhomólogo iwhiteΔ9 produce descendencia con ojos anaranjados porque la deleción de 9 pb disminuye la expresión de white. La figura adaptada de Do et al.14 y Fernandez et al.15. Abreviaturas: DSB = rotura de doble cadena; HR = recombinación homóloga; SNP = polimorfismo de un solo nucleótido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vías de reparación génica en Drosophila, diagrama de cruces genéticos, análisis de gráfico de barras de distribución de descendencia.
Figura 3: Flujo experimental para detectar los resultados de la reparación de roturas de doble cadena en la línea germinal premeiótica. (A) El cruce 1 combina el gen reportero DR-white (o un derivado) con un transgén I-SceI (en este ejemplo, en el cromosoma dos). La descendencia que contiene tanto el ensayo DR-white como el transgén I-SceI mantiene los eventos de reparación en sus tejidos germinales y somáticos. Para analizar eventos individuales de reparación en la línea germinal premeiótica, la descendencia que porta ambos transgenes se cruza con moscas de prueba y w (cruce 2), y la descendencia se cuantifica como se describe en la Figura 1. (B) Eventos individuales de reparación de roturas de doble cadena en la línea germinal de moscas silvestres (n = 106 líneas germinales) y en mutantes homocigotos DmRad51 (n = 46 líneas germinales). **P < 0,01; ****P < 0,0001 mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Las barras representan las medias; las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Los datos fueron reanalizados de Do et al.14. Abreviaturas: ANOVA = análisis de varianza; CO = entrecruzamiento; DSB = rotura de doble cadena; HR = recombinación homóloga; NHEJ = unión de extremos no homólogos; SEM = error estándar de la media; SSA = unión de extremos por hibridación de cadena sencilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proceso de edición genética mediante secuenciación Sanger con análisis TIDE; incluye gráfico comparativo de métodos de reparación.
Figura 4: Protocolo experimental para detectar los resultados de la reparación de roturas de doble cadena utilizando el seguimiento de inserciones y deleciones mediante descomposición (Tracking of Indels by DEcomposition). (A) Moscas portadoras del transgén DR-white y del transgén inducible I-SceI se analizan mediante extracción de ADN genómico, amplificación por PCR del sitio de rotura de doble cadena, secuenciación Sanger y análisis TIDE con un script en R. (B) Datos representativos de mutantes DmCtIP-/- (n = 23) y controles heterocigotos DmCtIP+/- (n = 31). Los eventos de reparación detectables se calculan como recombinación homóloga más unión de extremos no homólogos con procesamiento, excluyendo la ausencia de rotura de doble cadena o unión sin inserciones o deleciones. ****P < 0,0001 mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Las barras representan las medias; las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Los datos fueron reanalizados de Thomas et al.16. Abreviaturas: ANOVA = análisis de varianza; DSB = rotura de doble cadena; gDNA = ADN genómico; HR = recombinación homóloga; NHEJ = unión de extremos no homólogos; PCR = reacción en cadena de la polimerasa; SEM = error estándar de la media; TIDE = seguimiento de inserciones y deleciones mediante descomposición (Tracking of Indels by DEcomposition). Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Script de R para TIDE que identifica inserciones y deleciones en cromatogramas de secuencias en relación con un control sin DSB. El nombre de archivo del control editable por el usuario, los nombres de archivo de las muestras y la secuencia diana de I-SceI se indican cerca del final del script. Las entradas requeridas, los archivos de salida y su interpretación se describen en la sección 2.3. Se requieren los paquetes sangerseqR y Biostrings.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Guía paso a paso con capturas de pantalla del flujo de trabajo del script de R para TIDE. Los paneles ilustran las acciones del software descritas en la sección 2.3.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Ejemplo de resultados de TIDE y cálculos de eventos de reparación. El valor 0-indel representa ausencia de DSB o NHEJ sin indels; la fila HR separada representa el producto canónico de deleción de 23 pb; y todos los porcentajes restantes de indels se suman como NHEJ con procesamiento. La reparación detectable total se calcula como HR más NHEJ con procesamiento.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Datos brutos que sustentan la Figura 3B y la Figura 4B, organizados en hojas de trabajo editables separadas. Estos datos fueron reanalizados a partir de los estudios previamente publicados citados en las leyendas correspondientes de las figuras.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La versatilidad del sistema DR-white es un factor clave que contribuye a su impacto pasado y futuro en el campo de la reparación del ADN. En primer lugar, la secuencia de integración attB dentro del constructo informador DR-white permite a los investigadores dirigir el informador a numerosas ubicaciones dentro del genoma de Drosophila21, y ya existen varias líneas dirigidas disponibles22. En segundo lugar, la disponibilidad de diferentes transgenes I-SceI, como la expresión inducida por choque térmico mediante el promotor hsp70 (este estudio), la expresión constitutiva mediante el promotor ubiquitin23 y la expresión en la línea germinal premeiótica mediante el promotor Bam24, proporciona múltiples contextos de desarrollo y específicos de tejido para explorar la reparación de roturas de doble cadena. Independientemente del I-SceI transgén utilizado, los cruces genéticos deben planificarse cuidadosamente para asegurar que el transgén I-SceI solo se introduzca en el cruce final, garantizando así la inducción adecuada de roturas de doble cadena. Es importante tener en cuenta que las frecuencias de reparación pueden variar significativamente según la ubicación genómica del DR-white y/o el transgén I-SceI utilizado. Experimentos futuros podrían comparar aún más las ubicaciones genómicas y los transgenes I-SceI para determinar si el contexto genómico o la especificidad tisular influyen en la reparación de roturas de doble cadena.

Una ventaja particular del ensayo DR-white y sus derivados es que pueden identificar la reparación de roturas de doble cadena (DSB) mediante recombinación homóloga, NHEJ con procesamiento y, en la mayoría de los casos, SSA. Aunque fue diseñado para detectar fenotípicamente eventos de reparación en la línea germinal, el sistema también permite el análisis de tejidos somáticos mediante el algoritmo de análisis TIDE. A pesar de estas ventajas, existen algunas limitaciones de este ensayo que deben tenerse en cuenta. En particular, el ensayo DR-white podría subestimar las frecuencias de recombinación homóloga (HR). Como ocurre en otros ensayos con reporteros genéticos que utilizan DSB inducidas por nucleasas, la reparación mediante HR a partir de una cromátida hermana (HR entre cromátidas hermanas) es indistinguible de un evento sin DSB o de NHEJ sin procesamiento. Por lo tanto, al menos algunos eventos de la clase Sin DSB/NHEJ podrían ser en realidad eventos de HR. Dada esta limitación, los resultados que comparan factores genéticos (como líneas mutantes) deben interpretarse con cautela. Otras limitaciones del ensayo incluyen la imposibilidad de cuantificar eventos preméioticos que no produjeron progenie viable. Por ejemplo, eventos de DSB que no se repararon y que provocaron la muerte celular no se registrarán en la progenie. Aunque la fertilidad general podría ser una medida cualitativa de la muerte de células germinales, podrían requerirse ensayos celulares (como TUNEL). Además, el análisis mediante el script de R de TIDE solo proporciona la proporción de eventos detectables en una población celular. Para determinar los resultados específicos de secuencias de indel, se requiere la secuenciación de eventos individuales de reparación mediante secuenciación de ADN multiplex.

El ensayo DR-white ya ha tenido un profundo impacto en el estudio de la reparación de roturas de doble cadena (DSB). Su aplicación ha identificado factores que contribuyen a la reparación de DSB en organismos multicelulares, incluyendo la edad25, el sexo26, la ubicación de la DSB22,26, la ubicación de la secuencia donadora15, el ciclo celular y el tipo de tejido26. Además, hemos utilizado este ensayo para identificar varias proteínas que también determinan la elección de la vía de reparación y/o la reparación de secuencias divergentes en Drosophila, incluyendo Msh627, Blm28, Rif116 y CtIP16,29. De hecho, el uso bien establecido de Drosophila como organismo modelo genético, con proteínas conservadas de reparación del ADN, proporciona un sistema simple y multicelular para investigar los factores genéticos, celulares y del organismo que contribuyen a la reparación de DSB en contextos biológicos complejos.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos financieros ni no financieros que revelar.

Agradecimientos

Este método fue desarrollado mientras J.R.L. era beneficiario de una beca de investigación de la AFAR otorgada por la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento.  Este trabajo también fue financiado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (1R15GM110454 y 1R15GM129628) concedido a J.R.L. Las figuras fueron elaboradas con la ayuda de BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pestillos de 0,5 mL libres de RNAsa/DNAsaFisher Scientific12141363Para la homogenización de muestras para la extracción de ADN genómico
Bolas de algodónGenesee Scientific51-101Para el cultivo estándar de Drosophila
Incubadora refrigerada por Peltier para DrosophilaShel LabSRI6PFPara el cultivo estándar de Drosophila
Línea de Drosophila: y[1] w[1]Centro de Líneas de Drosophila Bloomington RRID:BDSC 1495
Línea de Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} Laboratorio LaRocqueN/ACreada por el laboratorio LaRocque mediante recombinación estándar de la línea RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) del Centro de Líneas de Drosophila Bloomington; disponible bajo solicitud al autor correspondiente
Línea de Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]Laboratorio LaRocqueN/AEnsayo DR-white integrado en la línea RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponible bajo solicitud al autor correspondiente
Línea de Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]Laboratorio LaRocqueN/AEnsayo DR-white.mu integrado en la línea RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponible bajo solicitud al autor correspondiente
Línea de Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]Laboratorio LaRocqueN/ADonador iwhiteΔ9 integrado en la línea RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponible bajo solicitud al autor correspondiente
Cierres para frascos de Drosophila FlugsGenesee Scientific49-100Para el cultivo estándar de Drosophila
Stereo microscopio fluorescente (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLPara el manejo y clasificación estándar de Drosophila"fly pushing" basado en fluorescencia
Almohadilla FlyStuff para DrosophilaGenesee Scientific59-172Para el manejo estándar de Drosophila"fly pushing"
KimwipesKimberly-Clarke06-666A
Baño de agua MyBath de 4 LMidwest ScientificMB-2000-4Para  choque térmico
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYPara la cuantificación de ADN
Medio Nutri-fly Fórmula BloomingtonGenesee Scientific66-121Para el cultivo estándar de Drosophila
Homogeneizador motorizado sin cordón Pellet PestleDWK Life SciencesK749540-0000Para la homogenización de muestras para la extracción de ADN genómico
Botellas de polipropilenoGenesee Scientific32-130Para el cultivo estándar de Drosophila
Viales de poliestirenoGenesee Scientific32-116Para el cultivo estándar de Drosophila, incluyendo choque térmico
Primer/oligonucleótido DR-white_8fN/A; cualquier servicio de síntesis de oligonucleótidos es suficienteN/A5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
Primer/oligonucleótido DR-white_8aN/A; cualquier servicio de síntesis de oligonucleótidos es suficienteN/A5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
Primer/oligonucleótido DR-white_9fN/A; cualquier servicio de síntesis de oligonucleótidos es suficienteN/A5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioPositVersión 2023.06.1+524Versión gratuita descargable; cualquier versión de R Studio es aceptable, aunque los datos presentados fueron analizados usando  la versión 2023.06.1+524
Paquetes de R Studio: BiostringsBioconductor.org (Versión 3.24)Versión 2.76.0El script de R solicitará al usuario instalar este paquete
Paquetes de R Studio: sangerseqRBioconductor.org (Versión 3.24)Versión 1.44.0El script de R solicitará al usuario instalar este paquete
SapphireAMP Fast PCRTakaraRR350B
Stereo microscopioLeicaM60Para el manejo estándar de Drosophila"fly pushing"
Wizard SV Gel and PCR Clean up PromegaA9281

Referencias

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