La infección por nematodos reniformes reduce significativamente el rendimiento del algodón y la calidad de la fibra. La lignina fortalece las paredes celulares de las plantas y contribuye a las defensas estructurales contra plagas, pero su papel en la resistencia al nematodo reniforme en el algodón no ha sido estudiado. Este estudio describe un protocolo histoquímico para visualizar la deposición de lignina en raíces de genotipos de algodón (Gossypium arboreum) resistentes y susceptibles al nematodo reniforme mediante tinción con floroglucinol.
Artículo de investigación
Análisis histoquímico de las diferencias de lignina entre genotipos de algodón resistentes y susceptibles al nematodo reniforme
En este artículo
Resumen
Resumen
Los nematodos reniformes (Rotylenchulus reniformis) son una limitación importante para la producción de algodón, especialmente en el sur de Estados Unidos. El nematodo reniforme es la segunda plaga más importante entre más de 400 especies de nematodos. Estos nematodos representan una amenaza para la seguridad alimentaria mundial. Las crecientes preocupaciones ambientales y de salud humana, junto con el costo de los nematicidas, han intensificado el interés en germoplasma de algodón resistente. La pared celular vegetal, especialmente la lignina, es un biopolímero crítico implicado en la resistencia al estrés biótico. Dado que los nematodos infectan los tejidos radiculares, componentes de la pared celular como la lignina podrían contribuir a la defensa; sin embargo, las barreras mediadas por lignina en las raíces de algodón no están bien caracterizadas. En este estudio se empleó un protocolo histoquímico estandarizado de tinción con ácido floroglucínico-HCl para visualizar las diferencias en la deposición de lignina en genotipos de algodón resistentes (A2-514, A2-995) y susceptibles (Gossypium arboreum) en la etapa de hoja verdadera, bajo condiciones no infectadas. Este colorante se une específicamente a hidroxicinamaldehídos como el aldehído coniférilo y el aldehído sinapil en presencia de ácido y genera un color púrpura rosado para visualizar la lignina. Se observaron patrones de tinción de lignina distintos entre los genotipos resistentes y susceptibles, lo que respalda un posible papel de las defensas estructurales asociadas a la lignina.
Introducción
El algodón se cultiva en todo el mundo por su fibra y es altamente vulnerable a plagas del suelo, particularmente nematodos, que pueden causar pérdidas significativas en el rendimiento. Entre estos, el nematodo reniforme (Rotylenchulus reniformis) es un patógeno importante que afecta al algodón y otros cultivos a nivel mundial, con impactos notorios en el sur de Estados Unidos, donde las infestaciones pueden reducir los rendimientos en más del 50%1. Este organismo microscópico que habita en el suelo parasita las raíces del algodón2, afectando la vitalidad de la planta, la biomasa y el rendimiento de la fibra al interrumpir la absorción de agua y nutrientes y al establecer sitios de alimentación (Figura 1). La infección por el nematodo reniforme altera el crecimiento de la planta de algodón retrasando la floración, reduciendo el tamaño y número de capullos y deteriorando la calidad de la fibra3. Se han reportado pérdidas severas en Misisipi, Alabama y Luisiana4. Comúnmente se emplean nematicidas para controlar las infestaciones de nematodos, pero su alto costo y su impacto negativo en el medio ambiente y la salud humana han hecho necesario buscar alternativas5,6. El desarrollo de germoplasma resistente representa un enfoque prometedor para mitigar los daños causados por el nematodo reniforme4. Dado que los nematodos se alimentan dentro de los tejidos radiculares, se hipotetiza que las defensas basadas en la pared celular, particularmente la lignificación, restringen la invasión, inhiben las enzimas degradadoras de la pared celular producidas por el patógeno y limitan el establecimiento y expansión de los sitios de alimentación del nematodo7,8,9. Se ha observado que una lignificación mejorada se correlaciona con una menor susceptibilidad a patógenos en diversas especies vegetales10,11,12,13,14. Investigaciones previas en algodón han relacionado la expresión de genes de lignina y lacasa con la resistencia contra Verticillium dahliae15, y estudios en cultivares resistentes y susceptibles a Fusarium revelaron niveles más altos de lignina en los cultivares resistentes16. Observaciones similares en Arabidopsis y arroz, donde la supresión de genes biosintéticos de lignina incrementó la susceptibilidad, subrayan la importancia de la lignificación en la defensa vegetal.
La lignina es un biopolímero fenólico complejo presente en las paredes celulares secundarias de las plantas vasculares, donde aporta rigidez estructural, resistencia mecánica e hidrofobicidad17. Sintetizada a través de las vías del shikimato y del fenilpropanoide, la lignina es el segundo biopolímero terrestre más abundante después de la celulosa, representando aproximadamente el 30 % del carbono orgánico de la Tierra18,19. Al reforzar la red de celulosa-hemicelulosa, la lignina fortalece los tejidos portantes y apoya el desarrollo general de la planta. La lignina es especialmente prominente en tejidos altamente especializados como el xilema, el esclerénquima, las fibras del floema y el peridermo, creando una barrera hidrófoba esencial para el transporte eficiente de agua y minerales. Además de sus funciones estructurales, la lignina actúa como una barrera de defensa bioquímica y física, limitando la entrada de patógenos y minimizando los daños causados por estrés biótico y abiótico20,21,22. La lignificación es un proceso dinámico central en la resistencia frente a un amplio espectro de patógenos, incluyendo necrótrofos, biótrofos y hemibiótrofos. Su biosíntesis a partir de los monolignoles primarios, el alcohol sinapílico, el coniférilico y el p-coumarílico, varía según la especie, el tipo de tejido y la etapa de desarrollo, influyendo en el grado de resistencia. La invasión por patógenos o el estrés abiótico suele desencadenar la deposición localizada de lignina, reforzando aún más las defensas de la planta23,24.
Es fundamental esclarecer el papel de la lignina en la resistencia al nematodo reniforme para avanzar en las estrategias de manejo del algodón. La caracterización visual y bioquímica de la distribución de lignina ofrece información sobre la dinámica espacial y temporal de las modificaciones en la pared celular que sustentan las respuestas defensivas tempranas. Este estudio utiliza tinción histoquímica con floroglucinol para analizar los patrones de deposición de lignina que existen naturalmente en genotipos de algodón resistentes y susceptibles al nematodo reniforme, proporcionando un marco preliminar práctico para evaluar rasgos de resistencia asociados a la pared celular e informar programas de mejoramiento dirigidos a mejorar la resiliencia de los cultivos.
Protocolo
Los experimentos se realizaron en un invernadero utilizando los materiales vegetales descritos a continuación. Todos los productos químicos, equipos y reactivos utilizados en este estudio se detallan en la Tabla de Materiales.
Material vegetal
Se obtuvieron semillas de germoplasma susceptible (A2‑20, PI 129742; A2‑40, PI 183202) y resistente (A2‑514, PI 616008; A2‑995, PI 629323). Además, se incluyó en este estudio el cultivar susceptible Deltapine 16. Las semillas se colocaron en agua estéril y se remojaron durante 24 h a temperatura ambiente. Tras el remojo, las semillas se enjuagaron cuidadosamente con agua estéril fresca para eliminar contaminantes residuales. Luego, las semillas enjuagadas se transfirieron a placas de Petri estériles forradas con toallas de papel autoclavadadas y previamente humedecidas, y se incubaron durante 2 días a temperatura ambiente para facilitar la germinación (Figura 2).
Plantación en invernadero
Se llenaron macetas de plástico con una mezcla para macetas de control de humedad prehumedecida. El suelo se humedeció previamente durante dos días antes del trasplante. Las plántulas germinadas se trasplantaron cuidadosamente al suelo prehumedecido y se mantuvieron bajo condiciones controladas de invernadero a ciclos de 28 °C/25 °C día/noche hasta el estadio de hojas verdaderas (Figura 2). Se plantaron tres réplicas biológicas para cada genotipo.
Recolección de muestras
Las plantas en la etapa de hojas verdaderas se retiraron suavemente del suelo aflojando el medio circundante para minimizar el daño en las raíces. Las raíces se enjuagaron 2–3 veces con agua para eliminar las partículas de suelo adheridas. Se recolectaron tejidos de raíz y tallo de cada genotipo para su seccionamiento (Figura 3).
Preparación de la solución de tinción con floroglucinol
Se preparó una solución al 3% de floroglucinol disolviendo 0,45 g de floroglucinol en una mezcla de dos partes de etanol al 100% (10 mL) y una parte de HCl concentrado (5 mL) en un campanario. La solución de tinción se preparó siguiendo un método descrito previamente16.
Preparación de la sección y procedimiento de tinción para el análisis histoquímico de lignina
Los tejidos de raíz y brote se seccionaron usando una cuchilla de afeitar estéril para obtener secciones transversales delgadas (Figura 3). Las secciones frescas se transfirieron a portaobjetos y se cubrieron con 20 µL de la solución de tinción al 3% de floroglucinol durante 1 min. Luego, las secciones se enjuagaron con agua estéril, se montaron bajo cubreobjetos y se capturaron imágenes (Figura 4, Figura 5, Figura 6). El mismo procedimiento se utilizó para los tejidos del tallo (Figura Suplementaria 1).
Imagen por microscopía
Se realizó la imagenología utilizando un microscopio digital. Se colocaron en la plataforma del microscopio portaobjetos de vidrio preparados que contenían muestras de tejido teñidas para su imagenología. Tras la inicialización del software de imagenología del microscopio, se seleccionaron las ampliaciones deseadas de 100x, 200x y 300x en modo de campo claro. Se realizaron ajustes de enfoque grueso y fino para visualizar claramente los patrones de tinción de lignina en las secciones de tejido. Las imágenes se registraron y guardaron con sus respectivos números de identificación de muestra. Luego, se realizó un análisis comparativo examinando imágenes de genotipos resistentes y susceptibles para evaluar las diferencias en la tinción de lignina. Se compararon imágenes de genotipos resistentes y susceptibles utilizando ImageJ para determinar las diferencias en el porcentaje de área teñida, empleando umbrales uniformes. Los resultados se exportaron como archivos CSV tras procesar las tres réplicas. Posteriormente, se elaboraron gráficos para comparar los genotipos resistentes y susceptibles.
Resultados
Análisis histoquímico de genotipos de algodón resistentes y susceptibles
El examen histoquímico de secciones transversales de raíz y tallo en la etapa de hoja verdadera reveló diferencias visuales entre genotipos resistentes y susceptibles, como se muestra en la Figura 4, la Figura 5 y la Figura suplementaria 1 (secciones transversales del tallo). Ampliaciones mayores (100x–300x) permitieron observar con mayor detalle estas diferencias (Figura 4A–C y Figura 5A–C para genotipos resistentes y Figura 4D–F y Figura 5D–F para genotipos susceptibles). Los patrones de tinción de lignina variaron según los tipos de tejido: los genotipos resistentes mostraron patrones de tinción de lignina menores o similares en los tallos, mientras que los genotipos susceptibles presentaron una lignificación del tallo relativamente mayor a simple vista (Supplementary Figure 1A–D).
Análisis cuantitativo de imágenes de tinción de lignina
Deltapine 16, un cultivar susceptible incluido en este estudio, mostró una tinción de lignina menor (Figura 6A–C) con valores del porcentaje de área teñida de 12, 17,8 y 16,3 (Figura 6D). El genotipo susceptible A2-40 presentó valores del porcentaje de área teñida de 25,2, 19,9 y 28,75, mientras que el genotipo resistente, A2-995, mostró valores del porcentaje de área teñida de 54,95, 58,71 y 69,85 (Figura 7). Sin embargo, A2-20 tuvo valores del porcentaje de área teñida de 16,6, 21,3 y 20,4, mientras que A2-514 mostró valores del porcentaje de área teñida de 49,8, 34,1 y 43,38 (Figura 8). La comparación arrojó un valor p de 0,06. Dado que estos valores se generaron utilizando umbrales diferentes, se realizó un análisis en ImageJ con umbral uniforme, empleando umbrales idénticos de matiz, saturación y brillo para garantizar la reproducibilidad entre réplicas. El genotipo resistente (A2-514) mostró una tinción relativamente mayor que el genotipo susceptible (A2-20). El porcentaje de área teñida se calculó como la relación entre píxeles positivos para lignina y el total de píxeles del tejido dentro de la sección. La comparación cuantitativa con umbral uniforme del genotipo susceptible A2-20 y del genotipo resistente A2-514 se muestra en la Figura 9. En conjunto, el análisis con umbral uniforme demuestra que existen diferencias específicas de lignificación según el genotipo entre estos genotipos.
DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:
Los datos brutos se incluyen como un archivo complementario.
Figura 1: Vista microscópica de nematodos reniformes alimentándose de raíces de algodón. Se muestra nematodos reniformes alimentándose de raíces de algodón con un aumento de 50x tras teñirse con colorante alimentario rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación del material vegetal para el análisis histológico de lignina. El procedimiento consta de los siguientes pasos: (1) remojar semillas de algodón en agua; (2) colocar las semillas sobre toallas de papel húmedas en una placa de Petri estéril etiquetada; (3) permitir que las semillas germinen durante 2 días y transferir las plántulas a macetas etiquetadas que contengan suelo; (4) cultivar las plántulas hasta la etapa de cotiledones; (5) continuar el crecimiento de las plantas hasta la etapa de hojas verdaderas y preparar secciones transversales de los tallos y raíces; y (6) teñir las secciones de tejido recolectadas y observarlas bajo el microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recolección y tinción de secciones de raíz y tallo de algodón utilizando ácido floroglucínico-HCl. El procedimiento consta de los siguientes pasos: (1) cultivar tres réplicas biológicas hasta la etapa de hojas verdaderas; (2) extraer suavemente las plantas del suelo, lavarlas con agua y prepararlas para el corte en secciones; (3) usar una cuchilla estéril para preparar secciones transversales del tallo; (4) usar una cuchilla estéril para preparar secciones transversales de la raíz; (5) teñir las secciones del tallo con ácido floroglucínico-HCl al 3 %, enjuagar con agua y observar bajo el microscopio; (6) teñir las secciones de la raíz con ácido floroglucínico-HCl al 3 %, enjuagar con agua y observar bajo el microscopio; y (7) observar las secciones teñidas bajo el microscopio para visualizar las diferencias en la tinción con floroglucinol y registrar las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 4: Tinción de lignina en secciones transversales de raíces de los genotipos de algodón A2-514 y A2-20. Secciones transversales de raíces teñidas para lignina del genotipo resistente A2-514 a un aumento de (A) 100x, (B) 200x y (C) 300x. Secciones transversales de raíces teñidas para lignina del genotipo susceptible A2–20 a un aumento de (D) 100x, (E) 200x y (F) 300x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tinción de lignina en secciones transversales de raíces de los genotipos de algodón A2-995 y A2-40. Secciones transversales de raíces teñidas para lignina del genotipo resistente A2-995 a un aumento de (A) 100x, (B) 200x y (C) 300x. Secciones transversales de raíces teñidas para lignina del genotipo susceptible A2-40 a un aumento de (D) 100x, (E) 200x y (F) 300x. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 6: Tinción de lignina y análisis cuantitativo de secciones transversales de raíces de Deltapine 16. Secciones transversales de raíces teñidas para lignina de tres réplicas biológicas del cultivar susceptible Deltapine 16 a 100x de aumento: (A) réplica biológica 1, (B) réplica biológica 2 y (C) réplica biológica 3. (D) Porcentaje de área teñida para las tres réplicas biológicas determinado mediante análisis cuantitativo con ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis cuantitativo de la tinción de lignina en los genotipos de algodón A2-40 y A2-995. Porcentaje de área teñida determinado mediante análisis con ImageJ para tres réplicas biológicas del genotipo susceptible A2-40 y del genotipo resistente A2-995. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Análisis cuantitativo de la tinción de lignina en los genotipos de algodón A2-20 y A2-514. Porcentaje de área teñida determinado mediante análisis con ImageJ para tres réplicas biológicas del genotipo susceptible A2-20 y del genotipo resistente A2-514. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Cuantificación con umbral uniforme de la tinción de lignina en los genotipos de algodón A2-20 y A2-514. Porcentaje de área teñida en el genotipo susceptible A2-20 y en el genotipo resistente A2-514 tras el análisis de imágenes con umbral uniforme. La comparación estadística se realizó mediante la prueba t de Welch (t = −1.52, p = 0.267). Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 10: Visualización de la tinción de lignina en diferentes regiones de la raíz. Imágenes representativas que muestran la tinción de lignina en las regiones de maduración de la raíz, elongación de la raíz y ápice de la raíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Tinción de lignina en secciones transversales del tallo de genotipos de algodón resistentes y susceptibles. Secciones transversales del tallo teñidas para lignina a 100x de magnificación de (A) A2-20 susceptible, (B) A2-514 resistente, (C) A2-40 susceptible y (D) A2-995 resistente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
La lignina asociada con las paredes celulares de las plantas actúa como una barrera física importante contra plagas, incluidos los nematodos. En el presente estudio, los genotipos de algodón resistentes y susceptibles mostraron diferencias visuales distintas en la tinción de lignina, siguiendo un patrón similar al previamente descrito en cultivares resistentes y susceptibles a Fusarium. La tinción permitió visualizar claramente la distribución de la lignina en las distintas regiones de la raíz—maduración, elongación y el ápice radicular—donde la intensidad de lignina aumentó progresivamente desde la parte superior de la raíz hacia el ápice (Figura 10). Aunque estos patrones proporcionan información anatómica útil, en el presente estudio no se evaluaron las dinámicas de la lignina en respuesta a la infección por nematodos, lo cual requiere confirmación en investigaciones futuras. Estudios previos sugieren que la presencia de patógenos puede inducir la biosíntesis de lignina, reforzando la necesidad de examinar los cambios en la lignina bajo presión de nematodos. La incorporación de análisis bioquímicos de la cantidad y composición de la lignina fortalecería aún más la interpretación de los patrones de tinción observados en estos genotipos. En conjunto, estos hallazgos resaltan el papel de las defensas estructurales mediadas por lignina en la resistencia del algodón al nematodo reniforme y demuestran la utilidad de la tinción con floroglucinol para caracterizar estos rasgos. La integración continua de enfoques anatómicos, bioquímicos y moleculares profundizará la comprensión de la biosíntesis de lignina y su contribución al desarrollo de resistencia duradera frente a los nematodos reniformes.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
RENUNCIAS
El USDA es un proveedor, empleador y prestamista que ofrece igualdad de oportunidades. La mención de nombres comerciales o productos en esta publicación tiene únicamente el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. Los hallazgos y conclusiones en este artículo son responsabilidad del o de los autores y no deben interpretarse como una determinación o política oficial del USDA o del Gobierno de los Estados Unidos.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Dra. Katherine Parys por proporcionar acceso a las instalaciones del laboratorio de microscopía utilizadas en este estudio. Los autores también agradecen al Dr. Junping Chen y al Dr. Abdulraheem sus sugerencias y asistencia para mejorar el manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el proyecto USDA-ARS 6066-21000-053-00D.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mezcla de envasado para control de humedad | Miracle-Gro | 073561005197 032247557832 | Sitio web de Amazon |
| Microscopio | Keyence VHX | VHX3000 | Se puede usar cualquier microscopio de campo claro comparable |
| Cuchillas estériles | Workpro | W018057 | Sitio web de Amazon |
| Tablero de corte | Freshware | 15.75"L x 9.8"W x 0.3"Th | Sitio web de Amazon |
| Portaobjetos y cubreobjetos | Amscope | BS-50P-100S-22X4 | Se puede usar cualquier marca. Este está disponible en Amazon. |
| Agua estéril / Agua destilada / Agua autoclavada | Gibco | 15230147 | Se puede usar cualquier marca / agua autoclavada estéril |
| Tinción con floroglucinol | Fischer Scientific | AC241761000 | Disponible en Fischer Scientific |
| HCl concentrado | Fischer Scientific | CAS: 7647-01-0 | Disponible en Fischer Scientific |
| Ethanol absoluto | Fischer Scientific | 64-17-5 | Disponible en Fischer Scientific |
| Macetas | BTPLASTIK | B0DSBQMXHN | Se pueden usar macetas de plástico cualquiera, disponibles en Amazon |
| Placas de Petri | Kingdder | B0BS95MCGS | Disponible en Amazon y se puede usar cualquier otra marca |
| Toallas de papel | Tork | MB540A | Disponible en Amazon y se puede usar cualquier otra marca |
| Image J | Software | Disponible en línea | Software gratuito disponible para usar |
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