Artículo de método

Generación de embriones modificados genéticamente mediante edición génica y transferencia nuclear de células somáticas para la producción de modelos ovinos de enfermedades humanas

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DOI:

10.3791/72709

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15 de septiembre de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah State University

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un enfoque para producir embriones modificados genéticamente mediante la edición génica CRISPR-Cas9 y la transferencia nuclear de células somáticas para generar modelos ovinos de enfermedades humanas. Este enfoque es ideal para realizar ediciones génicas precisas en células donantes y producir embriones clonados sin mosaicismo genético.

Resumen

Los modelos de animales grandes son herramientas valiosas para investigar enfermedades humanas. Las ovejas, cerdos y cabras suelen reproducir mejor la anatomía y fisiología de los órganos humanos y la complejidad de las enfermedades humanas, aumentando así su relevancia clínica en comparación con los roedores. CRISPR-Cas9 y la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) permiten generar modelos de animales grandes con mayor precisión, versatilidad y uniformidad genética. La principal ventaja de este enfoque, en comparación con la microinyección en cigotos, es la capacidad de confirmar in vitro si la modificación genética deseada y posibles mutaciones fuera del blanco están presentes en las células editadas antes de la producción del animal. Además, la SCNT elimina la posibilidad de mosaicismo genético, que con frecuencia resulta de la microinyección en cigotos. Aquí describimos la generación de células ovinas modificadas genéticamente mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR), seguida de la producción de embriones clonados que portan las mutaciones de interés. Las modificaciones genéticas se introducen transfectando células somáticas cultivadas, típicamente fibroblastos fetales, con el sistema CRISPR-Cas9. La eficiencia de mutación en células agrupadas se evalúa mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación de Sanger de los genes editados, y se analiza utilizando el software Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE)/Tracking of Insertions, Deletions, and Recombination events (TIDER). Se realiza una dilución límite de las células agrupadas para obtener colonias derivadas de una sola célula, que se analizan mediante PCR y secuenciación de ADN de los genes editados. Las células donantes con la(s) edición(es) de interés se amplían posteriormente y se utilizan para la generación de embriones mediante SCNT. Tras la dilución límite y el cribado celular, 22/114 (19,3 %) de las colonias modificadas mediante NHEJ contenían mutaciones de tipo knockout (KO) y 4/56 (7,1 %) de las colonias modificadas con HDR contenían la mutación F508del. Se crearon un total de 370 embriones modificados genéticamente a partir de cuatro colonias. Estos métodos se utilizan con éxito para la edición genética precisa en fibroblastos fetales y la generación de embriones genéticamente modificados para producir modelos ovinos de enfermedades humanas.

Introducción

Los modelos animales son herramientas esenciales para comprender los mecanismos biológicos de las enfermedades humanas y para el desarrollo de nuevos tratamientos terapéuticos. Los modelos in vitro, como los cultivos celulares u organoides, no reproducen la complejidad de los subtipos celulares y las interacciones célula-célula que ocurren in vivo en los órganos1,2. Por lo tanto, los animales proporcionan modelos de organismo completo con mayor detalle en cuanto a interacciones a nivel celular y sistémico, progresión de la enfermedad y seguridad de los tratamientos terapéuticos. Los roedores son organismos modelo prácticos debido a su bajo costo, corto tiempo de generación y caracterización genética completa. Sin embargo, los modelos de roedores para enfermedades humanas están limitados por diferencias fisiológicas y anatómicas con los humanos, así como por su metabolismo más rápido y menor longevidad3,4. Esto queda demostrado por la alta proporción de terapias evaluadas en modelos animales que fracasan en ensayos clínicos, la mayoría de los cuales utilizan roedores5,6,7,8. Ovejas, cerdos, cabras, perros y primates no humanos se han utilizado para generar modelos de una amplia variedad de enfermedades humanas, lo cual podría ayudar a aumentar la tasa de traslación clínica de nuevos tratamientos y medicamentos3,9,10,11,12. Estas especies también ofrecen numerosas ventajas frente a los modelos de roedores debido a su mayor similitud con los humanos. Por lo tanto, los modelos animales grandes para enfermedades humanas proporcionan los modelos más precisos disponibles y desempeñan un papel fundamental en la traslación de estudios animales a aplicaciones clínicas.

Los repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)-Cas9 es un método versátil y programable para la modificación genética de células animales y la introducción de mutaciones causantes de enfermedades precisas. La edición génica mediada por CRISPR-Cas9 emplea un ARN guía (gRNA) complementario al sitio diana, permitiendo que la proteína asociada a CRISPR 9 (Cas9) genere un corte de doble cadena (DSB) de manera específica13. La reparación celular de los DSB ocurre principalmente mediante dos mecanismos: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR). La vía NHEJ repara un DSB uniendo los extremos del ADN, un mecanismo propenso a errores que puede resultar en la formación de inserciones o deleciones aleatorias (indels) en el sitio del corte14. Estas mutaciones pueden inactivar (KO) el gen al crear una mutación por corrimiento del marco de lectura o un codón de terminación prematuro, lo que interrumpe la función del gen. La HDR, que ocurre principalmente durante las fases S y G2 del ciclo celular, se produce cuando la célula repara un DSB utilizando un alelo homólogo como molde de reparación15,16. Es posible incorporar inserciones, deleciones o sustituciones específicas, conocidas como inserciones dirigidas (KI), introduciendo un oligodesoxinucleótido monocatenario sintético (ssODN) u otra molécula de ADN molde que contenga la edición deseada, la cual la célula puede utilizar para reparar el corte. CRISPR-Cas9 también puede emplearse para edición multiplexada, con el fin de introducir múltiples mutaciones simultáneamente para modelar enfermedades multigénicas3. En comparación con técnicas previas de edición génica, como las nucleasas con dedos de zinc (ZFNs) o las nucleasas efectores similares a activadores de transcripción (TALENs), CRISPR-Cas9 es mucho más sencillo y eficiente en cuanto al uso de recursos en células de animales grandes17. Es posible dirigirse fácilmente a diferentes loci mediante el diseño de un nuevo gRNA, lo que ha ayudado a acelerar la creación de nuevos modelos animales grandes utilizando CRISPR-Cas93,13. Sin embargo, aún persisten varias limitaciones, incluyendo la eficiencia de edición de CRISPR-Cas9, que puede variar considerablemente según la especie, el entorno celular y la naturaleza de la edición18,19. Las tasas de HDR, en particular, son más bajas que las de NHEJ y dependen en gran medida del tipo celular, los loci genómicos y la fase del ciclo celular20,21. Además, la introducción de ediciones no deseadas en loci fuera del blanco, o incluso en el blanco mismo, sigue siendo un problema22. A pesar de ello, CRISPR-Cas9 se ha convertido en la plataforma principal para la edición génica en la producción de modelos animales grandes modificados genéticamente.

La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) facilita la creación de embriones genéticamente modificados con alta precisión y homogeneidad. Este proceso, realizado por primera vez con éxito en mamíferos en 1997, implica la transferencia de un núcleo celular a un ovocito enucleado23. La SCNT posee muchas ventajas frente a otras técnicas, como la microinyección en cigoto, en la cual se inyectan directamente material genético o sistemas de edición de ADN en el cigoto o en el embrión temprano24,25,26. La microinyección en cigoto conlleva el riesgo inherente de heterogeneidad genética, o mosaicismo, entre las células del embrión, lo cual puede ocurrir si la replicación del ADN o la división celular ocurre antes de la modificación genética27,28,29. El valor de tales embriones mosaicistas como modelos animales se reduce debido a la dificultad de genotipificación y caracterización fenotípica29. En la SCNT, la edición genética se separa de la producción de embriones; cada embrión clonado se deriva de una sola célula, eliminando así el riesgo de mosaicismo y asegurando que el embrión sea genéticamente homogéneo30,31,32. Además, las células donadoras se editan y examinan cuidadosamente in vitro para confirmar la clonalidad y la presencia de la modificación deseada antes del procedimiento de SCNT, lo que ahorra tiempo y recursos25,26. Esto es especialmente importante al introducir inserciones específicas (KIs). El cribado celular también permite identificar posibles mutaciones en sitios fuera del blanco, reduciendo así el riesgo de alteraciones genéticas en otros loci. Estas ventajas abordan muchas de las preocupaciones asociadas con CRISPR-Cas9. Por lo tanto, la SCNT ofrece un mayor control sobre la genética de los embriones resultantes en comparación con la microinyección en cigoto, especialmente para ediciones más complejas, como ediciones múltiples, inserciones grandes y alelos humanizados33. Aunque la SCNT está limitada por una baja eficiencia de clonación, requisitos técnicos y una reprogrmación epigenética anormal, esta última puede provocar alteraciones moleculares y fenotípicas en los clones, lo que potencialmente enmascara los efectos de la modificación genética en los animales fundadores. Sin embargo, estas alteraciones epigenéticas no se transmiten a la descendencia32,33. A pesar de estas limitaciones, la combinación de SCNT con CRISPR-Cas9 permite una ingeniería genómica precisa con un control estricto sobre la genética de los embriones, favoreciendo la producción confiable de modelos de enfermedades en animales grandes sin mosaicismo. A continuación, describimos un enfoque detallado para la modificación genética de fibroblastos fetales de oveja (SFF) utilizando ya sea NHEJ o HDR, seguido de SCNT para la producción de embriones clonados, con el objetivo final de generar modelos de oveja para enfermedades humanas. Este enfoque es ampliamente aplicable a otras especies de ganado, aunque la edición genética puede requerir optimización en diferentes tipos celulares, sirviendo este protocolo como un punto de partida útil.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC: #15508 y #10089) de la Universidad Estatal de Utah y se realizaron de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). En este estudio, se utilizaron ovejas domésticas Romney (Ovis aries) para aislar fibroblastos fetales de oveja (Archivo Suplementario 134). Véase la Figura 1 para una descripción general del protocolo.

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Figura 1: Resumen de los métodos CRISPR-Cas9 y TCNS utilizados para generar embriones modificados genéticamente. Se muestra un resumen de cada uno de los siete pasos principales del protocolo. Creado en BioRender. Perisse, I. (2026). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Diseño de cebadores de PCR, ARN-g y ADNc de plantilla

  1. Abra la región genómica que se va a editar en Benchling (https://www.benchling.com/academic).
  2. Diseñe cebadores de PCR para amplificar y secuenciar la región genómica de interés.
    1. Destaque la región diana que se va a amplificar, más 200 pares de bases aguas arriba y aguas abajo de la región diana para asegurar una distancia suficiente para llamadas de trazado de calidad y un análisis preciso de la eficiencia de mutación con el software TIDE.
    2. En la barra de navegación derecha, haga clic en Primers > Create Primers > Wizard.
    3. En Region, haga clic en Use Selection. En Amplicon, ajuste el Size según corresponda y modifique cualquier otro parámetro según desee.
    4. Haga clic en Generate Primers. Seleccione uno o más pares de cebadores con puntuaciones de penalización bajas para encargar.
      ​NOTA: Dependiendo de la edición que se introduzca, se recomienda diseñar cebadores que se unan únicamente al ADN editado correctamente para permitir una criba más rápida de colonias positivas.
  3. Diseñe un ARN guía (gRNA) para editar el ADN con CRISPR-Cas9.
    1. En Benchling, destaque la región diana que se va a editar, luego en la barra de navegación derecha, haga clic en CRISPR > Design and analyze guides.
    2. Haga clic en el menú desplegable Genome y seleccione o importe el genoma del organismo modelo. Ajuste cualquier otro parámetro según desee.
    3. Haga clic en Finish > +.
    4. En Genome Region, haga clic en No region set y seleccione o introduzca la región genómica que contiene el sitio diana. Haga clic en Set genome region.
    5. Seleccione una o más guías con puntuaciones altas tanto en el blanco como fuera del blanco para encargar.
  4. Si va a realizar ediciones de inserción (KI), diseñe una plantilla ssODN.
    1. En la barra de navegación derecha, haga clic en CRISPR > Design HR template (ssODN).
    2. Haga clic en el menú desplegable Genome y seleccione o importe el genoma del organismo modelo. Haga clic en Create.
    3. Haga clic en la pestaña SEQUENCE MAP, destaque las bases que se van a editar y cree la versión modificada de la secuencia de ADN escribiendo las ediciones deseadas desde el teclado. Vuelva a la pestaña DESIGN HR TEMPLATE y haga clic en Next.
    4. Ajuste la Template region para incluir al menos 50 pares de bases de brazos de homología a cada lado de la edición, luego haga clic en Next.
    5. Introduzca la secuencia del gRNA seleccionado en el paso 1.3.5 en el cuadro Guide para introducir mutaciones silenciosas que interrumpan el motivo adyacente al espaciador protómero (PAM). Haga clic en Next.
    6. Haga clic en Copy the template y encargue la plantilla ssODN generada.
      NOTA: Las secuencias de los cebadores de PCR, los gRNA de CRISPR-Cas9 y las plantillas ssODN diseñadas mediante Benchling para la generación de un modelo ovino de fibrosis quística que porta una mutación de tipo nulo (KO) o la mutación F508del se presentan en Tabla 1.

2. Preparación del medio

  1. Prepare el medio de cultivo celular suplementando el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alta concentración de glucosa con 15% de suero bovino fetal (SBF) y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen/Estrept) (v/v). Precaliente en un baño de agua a 37 °C antes del uso.
  2. Prepare el medio de congelación suplementando el DMEM con 45 % de FBS y 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO).
  3. Prepare el medio de recolección de ovocitos suplementando el medio M199 con 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep), 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) fracción V, 1% de suero bovino fetal (FBS) y 0,06% de heparina sodio.
  4. Ordenar la maduración in vitro (IVM) y Cultivo In Vitro (IVC) medios, que son medios libres de suero disponibles comercialmente y formulados específicamente para la maduración de ovocitos bovinos y el cultivo de embriones, respectivamente.
    NOTA: Los platillos postfusión y de CIV se preparan con siete 40 µL gotas de medio IVC y cubiertas con aceite mineral probado para embriones.
  5. Prepare el medio de ayuno celular suplementando el DMEM con alta glucosa con 0.5% de SFB y 1% de Pen/Estrep (v/v). Precaliente en un baño de agua a 37 °C antes del uso.
  6. Preparar el medio de fluido oviductal sintético suplementado con HEPES (HSOF) como se describió previamente35.
  7. Prepare el medio de enucleación suplementando 500 µL de medio HSOF con 4,5 mM de sacarosa y 10 µg/mL Citocalasina B (CB).
  8. Preparar el medio de inyección suplementando 500 µL del medio HSOF con 10 µg/mL Citocalasina B (CB).
    NOTA: Los medios de enucleación e inyección se preparan frescos el día de la TCNI. Una gota (200 µL) de cada medio se coloca en placas de 100 mm y se cubre con aceite mineral probado en embriones.
  9. Prepare el medio de fusión como se describió previamente35. Retire 5–10 mL del medio de fusión de 4 °C y mantener a temperatura ambiente hasta su uso.
  10. Prepare el medio CB suplementando el medio IVC con 10 µg/mL CB.
    NOTA: Un plato de CB se prepara con siete 40 µL gotas de medio CB y cubiertas con aceite mineral probado en embriones.
  11. Prepare el medio de ionomicina suplementando el medio HSOF con 5 µM sal de calcio de ionomicina
  12. Prepare el medio de activación suplementando el medio IVC con 2 mM de 6-dimetilaminopurina (DMAP) y 10 µg/mL Cicloheximida (CHX).
    NOTA: Se prepara un plato de activación con siete 40 µL gotas de medio de activación y cubiertas con aceite mineral testado para embriones.

3. Transfección de CRISPR-Cas9 en SFFs

  1. (Condiciones) Realice todos los procedimientos de cultivo celular en una cabina de seguridad biológica o en una campana de flujo laminar. Cultive los SFF en un matraz T-25 con medio de cultivo celular a 37 °C en 5% CO2, 5% O2 y 90% N2 hasta que alcancen una confluencia aproximada del 70%–80% antes de la transfección.
  2. Retire todo el medio del matraz y lave las células una vez con 5 mL de solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco (DPBS). Incube con 1 mL de enzima de disociación tipo tripsina durante 5–10 min hasta que las células se disocien.
  3. Diluya la enzima de disociación tipo tripsina usando un volumen igual de medio de cultivo celular y centrifugue las células a 200 × g durante 5 min.
  4. (Momento) Prepare el complejo ribonucleoproteico (RNP) gRNA:Cas9 incubando 2.5 µL de gRNA 100 µM con 2.5 µL de proteína Cas9 5 µg/µL durante 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Las proporciones de RNP Cas9:gRNA pueden requerir optimización dependiendo del tipo celular, el gen diana y el número de dianas.
  5. Prepare la solución de nucleofección combinando 82 µL de solución de nucleofección con 18 µL de solución suplemento.
  6. Combine la solución de nucleofección con el complejo RNP y, si se utiliza un ssODN, añada 2 µL de ssODN 200 µM, luego mezcle suavemente mediante pipeteo.
  7. Tras la centrifugación, deseche cuidadosamente el sobrenadante y coloque el tubo boca abajo sobre un tejido libre de partículas para eliminar el medio residual.
    NOTA: El medio de cultivo residual puede afectar la eficiencia de transfección y la viabilidad celular. Asegúrese de eliminar completamente el exceso de líquido antes de resuspender el botón celular en la solución de nucleofección.
  8. (Paso crítico) Resuspenda los fibroblastos en la solución de nucleofección, luego transfiera la mezcla a una nucleocubeta de 100 µL, evitando la formación de burbujas. Toque suavemente la nucleocubeta sobre una superficie dura para hacer que la mezcla descienda al fondo de la cubeta.
    NOTA: Las burbujas dentro de la nucleocubeta pueden interferir con la electroforesis.
  9. (Configuración relevante) Electroforesis las células utilizando el programa EH-100, o según las recomendaciones del fabricante. Permita que las células se recuperen durante 10 min a temperatura ambiente.
  10. Transfiera las células electroporadas utilizando una pipeta de transferencia a 5 mL de medio de cultivo celular pre-equilibrado suplementado con potenciador de HDR a una concentración final de 1–2 µM, lo cual puede requerir optimización en otros tipos celulares.
  11. (Condiciones) Cultive las células en medio de cultivo celular a 37 °C en 5% CO2, 5% O2 y 90% N2 durante 48 h antes del aislamiento de ADN genómico.
  12. Retire el medio de las células, lávelas una vez con DPBS y añada 1 mL de enzima de disociación tipo tripsina.
  13. Una vez que las células se hayan desprendido, añada 1 mL de medio de cultivo celular para diluir la enzima de disociación tipo tripsina.
  14. Asigne aproximadamente dos tercios de la suspensión celular para criopreservación y un tercio para extracción de ADN genómico en tubos etiquetados de 1.5 mL. Centrifugue todos los tubos a 200 × g durante 5 min.
  15. Resuspenda el botón celular destinado a criopreservación en 500 µL de medio de congelación. Transfiera las células resuspendidas a viales criogénicos y colóquelos en un contenedor de congelación con tasa controlada a -80 °C, minimizando el tiempo que las células permanecen en el medio de congelación antes de su traslado a -80 °C.
  16. Resuspenda el botón celular destinado a la extracción de ADN en 200 µL de DPBS. Extraiga el ADN genómico utilizando un kit de purificación de ADN genómico según las instrucciones del fabricante.

4. Análisis de la eficiencia de edición del genoma

  1. Amplifique los loci diana a partir del ADN aislado utilizando una ADN polimerasa de alta fidelidad y los cebadores de PCR diseñados previamente.
  2. Confirme la amplificación por PCR mediante electroforesis en gel de agarosa usando un gel de agarosa al 1% con una escalera de ADN de 1 kb.
  3. Purifique los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR y envíe para secuenciación Sanger.
  4. Si se realizó una KO, utilice el software TIDE (https://apps.datacurators.nl/tide) para evaluar la eficiencia de edición36. Utilice cromatogramas de alta calidad con señal de fondo mínima para un análisis preciso de la eficiencia de edición.
    1. Abra TIDE y asigne un nombre a la muestra en el cuadro Título de la gráfica. En Secuencia guía, introduzca la secuencia del ARN-g utilizado.
    2. En Cromatograma de la muestra control, haga clic en Examinar y cargue el cromatograma de la muestra control sin editar.
    3. En Cromatograma de la muestra de prueba, haga clic en Examinar y cargue el cromatograma de la muestra de prueba editada.
    4. Vaya a la pestaña Descomposición para visualizar el espectro de inserciones y deleciones (indel) y la eficiencia de mutación. Verifique el valor de R2 en la esquina superior derecha del espectro de indel.
    5. Si el valor de R2 es menor que 0,9, marque la casilla Configuración avanzada en Parámetros y ajuste los controles deslizantes para la ventana de alineamiento, la ventana de descomposición y el tamaño de indel hasta que el valor de R2 sea mayor que 0,9 y se logre un alineamiento adecuado.
  5. Si se realizó una KI, utilice el software TIDER (https://apps.datacurators.nl/tider) para evaluar la eficiencia de edición37.
    1. Abra TIDER. Asigne un nombre a la muestra en el cuadro Título de la gráfica. En Secuencia guía, introduzca la secuencia del ARN-g utilizado.
    2. En Cromatograma de la muestra control, haga clic en Examinar y cargue el cromatograma de la muestra control sin editar.
    3. En Cromatograma de referencia, haga clic en Examinar y cargue un cromatograma de una muestra de referencia que contenga la edición deseada.
      NOTA: Si no existe tal secuencia, puede generarse mediante amplificación por PCR utilizando cebadores adicionales diseñados para introducir la mutación en una secuencia de ADN38.
    4. En Cromatograma de la muestra de prueba, haga clic en Examinar y cargue el cromatograma de la muestra de prueba editada.
    5. Vaya a la pestaña Descomposición para visualizar el espectro de indel, la eficiencia de mutación y la eficiencia de reparación dirigida por homología (HDR). Verifique el valor de R2 en la esquina superior derecha del espectro de indel.
    6. Si el valor de R2 es menor que 0,9, marque la casilla Configuración avanzada en Parámetros y ajuste los controles deslizantes para la ventana de alineamiento, la ventana de descomposición, la distancia aguas arriba del sitio de corte y el tamaño de indel hasta que el valor de R2 sea mayor que 0,9 y se logre un alineamiento adecuado.
      NOTA: (Crítico) Puede ser necesaria una nueva secuenciación si la calidad del archivo de secuenciación es deficiente.

5. Aislamiento y selección de colonias de células individuales

  1. (Condiciones) Descongele y cultive los SFF transfectados en un matraz T-25 durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2, 5 % de O2 y 90 % de N2, o hasta que las células alcancen aproximadamente el 80 % de confluencia.
  2. Retire el medio, lave las células una vez con 5 mL de DPBS y disocie las células con 1 mL de enzima de disociación tipo tripsina.
  3. Añada medio de cultivo celular para diluir la enzima de disociación tipo tripsina y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugue las células a 200 × g durante 5 min.
  4. Descarte el sobrenadante y re suspenda el sedimento celular en 1 mL de medio de cultivo celular. Mezcle suavemente pero completamente para obtener una suspensión homogénea de células individuales.
  5. (Crítico) Prepare una dilución 1:10 de la suspensión celular y cuente las células utilizando un hemocitómetro con azul de tripano.
  6. Calcule el volumen de suspensión celular diluida necesario para sembrar aproximadamente una célula por pocillo.
    NOTA: Para cinco placas de 96 pocillos, prepare aproximadamente 500 células.
  7. Prepare 10 mL de medio de cultivo celular por placa de 96 pocillos en un tubo cónico de 50 mL.
  8. Añada el volumen calculado de la suspensión celular diluida 1:10 al medio de cultivo y mezcle bien mediante pipeteo suave e inversión.
  9. Vierta la suspensión celular diluida en un depósito estéril para reactivos.
  10. Dispense 100 µL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
  11. (Condiciones) Incube las placas a 37 °C en 5 % de CO2, 5 % de O2 y 90 % de N2 durante 5 días.
  12. Examine cada pocillo bajo el microscopio y marque los que contengan una sola colonia. Excluya los pocillos que contengan más de una colonia.
    NOTA: Las colonias derivadas de una sola célula suelen ser redondas, compactas y morfológicamente homogéneas.
  13. Devuelva las placas al incubador y cultive durante 2 días adicionales en las mismas condiciones.
  14. Después de 7 días totales de cultivo en placas de 96 pocillos, retire el medio de los pocillos que contengan una colonia en crecimiento único. Lave cada pocillo seleccionado una vez con DPBS.
  15. Añada 100 µL de enzima de disociación tipo tripsina a cada pocillo seleccionado e incube hasta que las células se desprendan. Añada 100 µL de medio de cultivo celular a cada pocillo para diluir la enzima de disociación tipo tripsina.
  16. Transfiera todo el volumen de cada pocillo a un solo pocillo de una placa de 24 pocillos.
  17. Lave la placa original de 96 pocillos con medio de cultivo celular adicional y transfiera el lavado al pocillo correspondiente de la placa de 24 pocillos para maximizar la recuperación celular. Ajuste el volumen final en cada pocillo de la placa de 24 pocillos a 500 µL con medio de cultivo celular.
  18. (Condiciones) Incube las placas de 24 pocillos a 37 °C en 5 % de CO2, 5 % de O2 y 90 % de N2 durante 3 días.
  19. Examine los pocillos bajo el microscopio y seleccione las colonias cercanas a la confluencia.
  20. Retire el medio de los pocillos seleccionados para recolección, lávelos una vez con DPBS y añada 500 µL de enzima de disociación tipo tripsina.
  21. Una vez que las células se hayan desprendido, añada 1 mL de medio de cultivo celular para diluir la enzima de disociación tipo tripsina.
  22. Congele las células y aísle el ADN genómico según los pasos 3.14–3.16.
  23. Amplifique los loci diana mediante PCR y confirme el genotipo mediante secuenciación Sanger.
  24. Identifique las colonias de tipo salvaje, KO y KI según los resultados de secuenciación. Utilice el análisis TIDE/TIDER descrito en los pasos 4.4 y 4.5 para estimar las tasas de HDR y los espectros de indel, con el fin de validar la edición correcta y la identificación de colonias no derivadas de una sola célula.
    NOTA: En este paso también se puede realizar un análisis de efectos fuera del blanco (Archivo Suplementario 1).
  25. Expanda únicamente las colonias con el genotipo deseado y morfología celular normal para experimentos posteriores de SCNT.

6. Recolección de ovocitos ovinos y maduración in vitro

  1. Recoger ovarios de oveja de un matadero local y transportarlos al laboratorio en solución salina al 0,9 % a 25 °C en un plazo de 4 h desde la recolección.
  2. Óvulos maduros in vitro.
    1. Libere los complejos cumulus-ovocito (COC) de los ovarios utilizando una hoja de bisturí, cortando la superficie ovárica mientras está sumergida en medio de recolección de ovocitos.
    2. (Tiempo) Seleccione COCs con al menos 1–3 capas de células del cumulus compactas y citoplasma uniforme para la MIV. Lave los COCs en medio fresco de recolección de ovocitos y cultive en medio de MIV previamente equilibrado, con hasta 40 COCs por pocillo de 500 µL de medio IVM en una placa de 4 pocillos e incubar a 38.5 °C con 5% de CO₂2 durante 21–22 h.
  3. Verifique la maduración de los ovocitos.
    1. Mueva el número deseado de COCs utilizando una 200 µL pipetear en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL, añadiendo el mismo volumen (1:1) de hialuronidasa al 0,6 mg/mL en el tubo.
    2. Pipetee la solución mezclada hacia arriba y hacia abajo hasta que se hayan eliminado todas las células del cumulus. Transfiera los ovocitos a una gota de HSOF de 1 mL y lave los ovocitos pasándolos por tres gotas adicionales de HSOF.
    3. Usando una pipeta bucal o una 10 µL pipeta y punta, ruede y seleccione los ovocitos que presenten un cuerpo polar bajo un estereomicroscopio. Las tasas aceptables de extrusión del cuerpo polar son del 50% al 80%.

7. Transferencia nuclear de células somáticas

  1. Preparar las células donadoras antes de la TCNE.
    1. Descongelar las células criopreservadas 3–5 días antes de la TCNE en un baño de agua a 37 °C durante 1–2 min hasta que no quede hielo en el tubo.
    2. Retirar la suspensión celular y añadir un volumen igual de medio de cultivo celular en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 406 x g durante 5 min.
    3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 µL de medio de cultivo celular.
    4. (Condiciones) Sembrar las células en diferentes concentraciones en una placa de 4 pocillos con un volumen final de 500 µL por pocillo y cultivar a 37 °C con 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2.
    5. Renovar el medio de cultivo celular cada 48 h. Cuando las células alcancen confluencia completa, sustituir por medio de ayuno celular entre 24 h y 48 h antes de la TCNE.
      ​NOTA: El ayuno celular superior a 48 h puede aumentar la proporción de apoptosis39,40.
  2. Preparar las células donadoras (día de la TCNE).
    1. Eliminar el medio de ayuno del pocillo y lavar una vez con 500 µL de DPBS (-).
    2. Añadir 250 µL de enzima de disociación tipo tripsina e incubar a 37 °C durante 5 min, o hasta que las células se desprendan del recipiente.
    3. Añadir 500 µL de medio de cultivo celular para diluir la enzima de disociación tipo tripsina.
    4. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 406 x g durante 5 min.
    5. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 60–80 µL de medio HSOF y mantenerlas a 4 °C hasta su uso.
  3. Enuclear los ovocitos.
    1. Preparar las pipetas de sujeción tirando capilares de vidrio de pared delgada con un tirador de micropipetas y moldeándolos con un microforjador para obtener un diámetro interno de 30 µm y un diámetro externo de 100 µm.
      NOTA: Ambas pipetas también pueden adquirirse de proveedores comerciales.
    2. Preparar las pipetas de inyección tirando capilares de vidrio de pared delgada con un tirador de micropipetas, afilándolas con un microesmerilado a un ángulo de 45° y moldeándolas con un microforjador para obtener un diámetro interno de 20–25 µm. Los parámetros del tirador de micropipetas, microforjador y microesmerilado pueden encontrarse en un informe previo41.
    3. Transferir los ovocitos en estadio de metafase II (MII) que presenten un cuerpo polar al gota de medio de enucleación. Inmovilizar el ovocito usando una pipeta de sujeción mientras el cuerpo polar se encuentra en la posición de las 4–5 en punto.
      ​NOTA: Los procedimientos operativos estándar para la micromanipulación pueden consultarse en el informe anterior41.
    4. (Crítico) Utilizar una pipeta de inyección afilada con punta para perforar la zona pelúcida y aspirar el cuerpo polar y el 10%–20% del citoplasma situado debajo del cuerpo polar.
    5. Expulsar el citoplasma extraído en la gota y liberar el ovocito de la pipeta de sujeción.
    6. Repetir los pasos 7.3.2–7.3.4 para todos los ovocitos hasta que todos hayan sido enucleados. Devolver los ovocitos enucleados al medio de MIV e incubar a 38.5 °C y 5% de CO2 durante 30 min.
  4. Inyectar células donadoras en ovocitos enucleados.
    1. Añadir la suspensión celular preparada al fondo de la gota de medio de inyección y transferir los ovocitos enucleados a la misma gota.
    2. Seleccionar 1–10 células redondas y sanas y aspirarlas en la pipeta de inyección.
    3. Utilizar la pipeta de sujeción para inmovilizar un ovocito y usar la pipeta de inyección para perforar la zona pelúcida e introducir una célula entre la zona y el ooplasma.
    4. Repetir los pasos 7.4.2–7.4.3 para todos los ovocitos enucleados y transferirlos a 2–3 mL de medio HSOF en una placa de 35 mm antes de la fusión celular.
  5. Fundir ovocitos enucleados y células donadoras.
    1. Conectar los cables del generador de pulsos electrofusión a los alambres de la cámara de microdeslizamiento (0.5 mm) y colocar la cámara sobre la platina del microscopio.
    2. Añadir 600 µL de medio de fusión a la cámara.
    3. (Ajuste crítico/relevante) Alinear 4–6 pares citoplasma-célula entre los dos alambres de la cámara, con la célula donadora situada en la posición de las 6 o las 12 en punto. Aplicar dos pulsos eléctricos de fusión de corriente continua de 2.0 kV/cm durante 40 µs.
    4. Retirar los pares citoplasma-célula de la cámara de fusión y mantenerlos en una nueva placa de 35 mm que contenga 2–3 mL de medio HSOF.
    5. (Condiciones) Repetir los pasos 7.5.3–7.5.4 hasta que todos los ovocitos inyectados hayan completado el proceso de fusión. Lavar los cúmulos en una placa post-fusión e incubar a 38.5 °C con 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2 durante 30 min. Renovar el medio de fusión en la cámara cada 15–20 min.
  6. Activar y cultivar embriones.
    1. (Condiciones) 30 min después de la fusión, todos los embriones fusionados se incuban primero en medio CB a 38.5 °C con 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2 durante 45 min.
    2. Posteriormente, los cúmulos se activan en ionomicina 5 µM diluida en HSOF durante 5 min, seguido de incubación en medio de activación durante 4 h.
      NOTA: El medio de ionomicina se prepara fresco antes de su uso. Se recomienda la activación a las 24–26 h post-maduración para mejorar el desarrollo hasta término completo.
    3. (Condiciones) Tras la activación, los embriones reconstruidos se lavan y cultivan en medio MIV, con un máximo de 40 embriones por gota de 40 µL a 38.5 °C con 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2 durante la noche o hasta el trasplante embrionario.

Resultados

Los principales pasos del protocolo se resumen en la Figura 1. Utilizamos CRISPR-Cas9 y TCNE para desarrollar un modelo ovino de fibrosis quística (FQ) que contiene ya sea una mutación indel de interrupción génica (KO) generada mediante reparación de extremos no homólogos (NHEJ), o la mutación F508del mediante recombinación dirigida (HDR). Parte de estos resultados ya han sido publicados previamente42,43. Diseñamos ARN-g y cebadores de PCR para ambas estrategias, dirigidos al exón 11 del gen del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), basándonos en la secuencia de GenBank de oveja (NC_019461.2.0). También se diseñó un oligonucleótido de cadena sencilla (ssODN) para la inserción dirigida (KI) de la mutación F508del, una deleción de tres pares de bases que es la mutación más común que causa FQ en pacientes humanos. La Figura 2A muestra el exón 11 de CFTR y ambas estrategias de edición (KO y KI), incluyendo las ubicaciones relativas de los ARN-g, los cebadores de PCR y las mutaciones. Primero se aislaron fibroblastos fetales de oveja (SFF) de un feto ovino doméstico de raza Romney macho y hembra (O. aries) al día 45 de gestación. A continuación, se realizó la transfección con ARN-g 1 para la interrupción génica (KO) de CFTR mediante electrotransferencia del plásmido pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene plasmid 42230), tal como se describió previamente43. La transfección de los complejos RNP CRISPR-Cas9:ARN-g con ARN-g 2 y ssODN 1 se realizó mediante electrotransferencia para la inserción dirigida (KI) de la mutación F508del. El análisis TIDE reveló que el 46,9 % de las células en la población presentaban la deleción de 3 nucleótidos (nt), con un valor de R2 de 0,96. El espectro de indels y la eficiencia estimada se muestran en la Figura 2B. Se utilizó dilución límite para aislar un total de 170 colonias derivadas de células individuales, que fueron cribadas mediante PCR y secuenciación de Sanger. De las colonias obtenidas, 114 procedían de transfecciones sin ssODN, de las cuales 22 (19,3 %) contenían mutaciones KO. Otras 56 colonias se obtuvieron tras la transfección con el ssODN que llevaba la mutación F508del, de las cuales cuatro (7,1 %) eran homocigotas para F508del. Se seleccionaron dos colonias con mutaciones KO que se utilizaron como células donantes para producir embriones CFTR-/- mediante TCNE. Las mutaciones KO correspondían a deleciones de 2 y 7 nt, respectivamente. Los resultados de la secuenciación de Sanger de estas colonias se muestran en la Figura 2C. Se seleccionaron dos colonias con la mutación F508del para producir embriones CFTRF508del/F508del , cuyos resultados de secuenciación de Sanger se presentan en la Figura 2D. En total, se produjeron 370 embriones, de los cuales 233 contenían una mutación KO y 137 presentaban la mutación F508del (Tabla 2). Para el desarrollo in vitro, la tasa de blastocisto de los embriones ovinos obtenidos mediante TCNE fue aproximadamente del 10 %–15 %. Este protocolo se implementó con éxito para editar el gen CFTR en SFF y producir embriones destinados a la generación de un modelo ovino de FQ.

figure-results-1
Figura 2: Generación de células  CFTR -/- y CFTRF508del/F508del SFF. (A) Diagrama esquemático del Exón 11 del gen CFTR y los sitios diana del sistema CRISPR-Cas9 utilizados para introducir mutaciones de interrupción mediante NHEJ (izquierda) y mutaciones de inserción dirigida del F508del mediante HDR (derecha). Las flechas representan los cebadores directo e inverso 1 (azul) y los cebadores directo e inverso 2 (rosa) utilizados para amplificar el Exón 11. (B) Gráfico que muestra el espectro de inserciones y deleciones (indels) y la eficiencia de edición estimada globalmente, basado en datos de secuenciación Sanger de células agrupadas transfectadas con Cas9: gRNA 2 y ssODN1 para la introducción de la mutación F508del. La frecuencia de deleciones de 3 pb en estas células fue del 46,9 %, lo que corresponde a la mutación F508del, con un valor de R2 de 0,96. (C) Resultados de la secuenciación Sanger para las colonias celulares CF19F y CF49 que contienen mutaciones de interrupción bialélicas aleatorias. Ambas colonias presentan deleciones cortas (CF19F, -2 pb; CF49, -7 pb). (D) Resultados de la secuenciación Sanger para colonias celulares que contienen la mutación F508del, con la eliminación de la secuencia «CTT». Creado en BioRender. Perisse, I. (2026) https://BioRender.com/v74agcd. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

NombreMutaciónSecuencia
Primer directo 1KOGCATAGCAGCATACCCAA
Primer inverso 1KOGTAACCAAACCAGCCCAC
gRNA 1KOGGGAGAATTGGAACCTTCAG
Primer directo 2F508delTGAACTCAGCACCCCATCTCTG
Primer inverso 2F508delTGCAGGCTTCTTATAGCAGGGG
gRNA 2F508delATTAAAGATAACATCATCTT
ssODN 1F508delT*G*CTCTCAGTATTCCTGGATCATG
CCTGGAACCATTAAAGATAACATCA
TTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGA
TATAGGAGTGTCATCAAAGCATG*C*C

Tabla 1: Secuencia de los oligonucleótidos diseñados. Secuencias de cebadores de PCR, ARN-g CRISPR-Cas9 y ADNc de plantilla diseñados en Benchling y utilizados para la generación de un modelo ovino de fibrosis quística que contiene ya sea una mutación de interrupción génica (KO) o la mutación F508del. Un «*» indica una modificación de fosforotioato.

ColoniaGenotipoNúmero de embriones
CF19F-/-134
CF49-/-99
Fd78F508del/F508del110
Fd92F508del/F508del27
Total370

Tabla 2: Resumen de colonias utilizadas como células donantes y embriones producidos. Se utilizaron un total de cuatro colonias para producir 370 embriones con mutaciones en el gen CFTR. Dos colonias contenían mutaciones de tipo knock-out (KO), y dos contenían la mutación knock-in (KI) F508del. Todas las colonias derivan de células masculinas, excepto CF19F, que proviene de una línea celular femenina.

Archivo suplementario 1: Protocolo para el aislamiento de fibroblastos fetales de oveja y análisis de efectos fuera del blanco.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este procedimiento, el diseño de cebadores, ARN-g y ssODN eficaces es fundamental para una edición génica exitosa. La unión deficiente de estas moléculas puede dificultar la edición génica y la identificación de colonias deseadas, lo que inhibe el avance hacia la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT). Se recomienda adquirir varias variantes de cada secuencia para su prueba y optimización antes de proceder al aislamiento de colonias monoclonales. La transfección de plásmidos Cas9 para la eliminación (KO) en fibroblastos generalmente produce una eficiencia de edición subóptima, por lo que se recomienda el uso de ribonucleoproteínas Cas9 (RNP) para lograr una eficiencia mayor (70%–90%)44,45,46. Una dilución limitante exitosa debería dar como resultado una proporción similar de colonias con una eliminación (KO). La eficiencia de edición esperada para la inserción génica (KI) depende en gran medida del tipo de modificación introducida; en nuestra experiencia, las deleciones suelen ser más eficientes que las inserciones o sustituciones. Por lo tanto, la proporción de colonias con la mutación KI tras la dilución limitante también variará. En nuestros resultados, la tasa de colonias que portaban la mutación F508del (7,1%) fue mucho menor que la tasa de edición estimada (46,9%), lo cual no es ideal. Aunque las tasas de ediciones correctas en colonias derivadas de una sola célula sean bajas, aún es posible producir muchos embriones. Sin embargo, cuanto mayor sea la proporción de colonias útiles, menos tiempo y recursos se requerirán, por lo que la optimización es importante. Para solucionar problemas de baja eficiencia en la edición génica, asegúrese de que no haya burbujas de aire en la cubeta durante la electrotransferencia, optimice la relación Cas9:ARN-g mediante titulación y pruebe ARN-g o ssODN alternativos. Además, el uso de la RNP Cas9 es fundamental para la eficiencia de edición, ya que los resultados demuestran que la entrega mediante plásmidos conduce a una edición con menor eficiencia43. En caso de baja viabilidad y crecimiento deficiente de colonias durante la dilución limitante, considere aumentar el porcentaje de suero en el medio, añadir suplementos de factores de crecimiento o ajustar la densidad de siembra. Asegúrese de contar con precisión las células antes de la siembra y mezcle bien la suspensión celular.

Como una herramienta valiosa para generar modelos animales, la técnica de transferencia nuclear de células somáticas también implica varios pasos críticos que pueden influir en los resultados del desarrollo. En primer lugar, la calidad del ovocito suele verse afectada por la edad del donante y las estaciones, ya que la mayoría de las razas de ovejas son reproductoras estacionales. Sin embargo, nuestros resultados anteriores mostraron que la estación no afectó el desarrollo embrionario in vitro cuando los ovarios u ovocitos se obtuvieron de ovejas prepuberales procedentes de mataderos47. Además, cuando se utilizaron ovocitos de adultos, el desarrollo in vivo fue comparable al observado con ovocitos prepuberales35. El momento de activación de los embriones de transferencia nuclear de células somáticas en ovejas es crucial para el desarrollo hasta término completo. Se ha demostrado que una activación temprana entre 24 y 26 horas posteriores a la maduración reduce la pérdida temprana del embarazo y aumenta el desarrollo hasta término completo35. Esto podría estar relacionado con un entorno con un alto factor promotor de maduración (MPF), asociado con la activación temprana, que favorece una mayor tasa de condensación cromosómica prematura (PCC) del núcleo somático, lo cual se considera beneficioso para la reprogramación48.

CRISPR-Cas9 tiene muchas ventajas sobre otras técnicas de edición génica debido a su versatilidad, programabilidad y simplicidad17. A pesar de sus fortalezas, también existen limitaciones. La eficiencia de edición de CRISPR-Cas9 y la actividad fuera del blanco pueden variar según la especie, el tipo celular, los loci genómicos, el diseño del ARN guía (gRNA) y la edición deseada, y la eficiencia suele optimizarse para células de roedores o humanas18,49. Además, no todas las ediciones pueden dirigirse utilizando el PAM NGG tradicional de SpCas9. Existen numerosas estrategias para superar estas limitaciones, incluyendo la optimización del diseño del gRNA y la entrega del complejo Cas9-ARN como ribonucleoproteína (RNP)50. Se han descubierto o diseñado muchas variantes de la nucleasa Cas con mayor actividad de edición, mayor fidelidad y un rango de dianas más amplio para abordar estas limitaciones. Asimismo, se han desarrollado varios sistemas alternativos de edición del genoma, incluyendo editores de bases, editores primarios y editores basados en recombinasas, muchos de los cuales dependen de proteínas guiadas por CRISPR50. La edición mediante recombinasas es particularmente útil para introducir inserciones grandes. Cualquiera de estas estrategias podría emplearse potencialmente para mejorar los resultados de edición con este protocolo.

En comparación con la microinyección cigótica, la TCNS permite un mayor control sobre la genética del embrión debido a la posibilidad de analizar las células donadoras in vitro para verificar clonalidad, así como mutaciones específicas y fuera de objetivo antes de la producción del embrión. Esto permite confirmar la modificación genética deseada y elimina el riesgo de mosaicismo en los embriones resultantes24,25,26. Notablemente, bajo condiciones de alta MPF, los núcleos donantes en fase G0/G1 pueden experimentar una CPC con una replicación del ADN más normal, mientras que los núcleos donantes en fase S y G2 son propensos a daño del ADN y anomalías cromosómicas51,52. Por lo tanto, coordinar las fases del ciclo celular de las células donantes y receptoras es esencial para una reprogrmación exitosa. Además, los medios de MVI y CIV pueden afectar el desarrollo del embrión por TCNS. El síndrome de cría grande (SCG) ocurre frecuentemente en embriones fertilizados in vitro y en embriones por TCNS en bovinos y ovinos. Uno de los factores que podrían contribuir es la presencia de suero en los medios de maduración de ovocitos y cultivo de embriones. Por consiguiente, el uso de medio sin suero podría reducir la incidencia de SCG en la producción de ovinos por TCNS y mejorar la eficiencia general de la TCNS. La TCNS sigue limitada por su baja eficiencia, altos costos, equipos especializados, experiencia técnica en la manipulación de embriones y la necesidad de un gran número de receptoras, aunque se han desarrollado varias estrategias para mejorar la eficiencia de clonación mediante la regulación de la reprogrmación epigenética53. Estas estrategias incluyen fármacos modificadores del epigenoma o la inhibición por interferencia de ARN de reguladores epigenéticos que controlan la metilación del ADN, modificaciones de histonas o la inactivación del cromosoma X. Aunque el traslado de estos resultados desde ratones a especies ganaderas ha tenido éxito limitado, varias de estas técnicas se han utilizado para mejorar la eficiencia de clonación en cerdos y cabras54,55,56,57.

Sin embargo, CRISPR-Cas9 y la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) son una combinación eficaz de técnicas para la producción de embriones modificados genéticamente. CRISPR-Cas9 es más sencillo y más fácil de programar que las nucleasas con dominios de activación de transcripción (TALENs) o las nucleasas fúngicas de dedo de zinc (ZFNs), lo que ha llevado a su predominio en el campo de la edición genética. La SCNT mejora la precisión en la producción de embriones al permitir la selección genética antes de la transferencia nuclear y al eliminar el riesgo de mosaicismo. Más allá de los modelos animales de enfermedades, este método tiene amplias aplicaciones en agricultura y biomedicina. En ganado, puede utilizarse para mejorar la resistencia a enfermedades, la tolerancia al clima y los rasgos productivos25,58. Además, existe el potencial de que los animales desarrollen órganos con ingeniería inmunológica para xenotrasplantes en humanos o actúen como biorreactores al producir anticuerpos, enzimas o proteínas terapéuticas valiosas con fines médicos o industriales33,59. En resumen, CRISPR-Cas9 y la SCNT son enfoques potentes que permiten una edición genómica precisa y versátil, junto con un control estricto de la genética embrionaria, para generar modelos animales grandes de enfermedades humanas.

Divulgaciones

Los autores utilizaron Grammarly (Grammarly Inc.) y ChatGPT (OpenAI) para mejorar el lenguaje y la legibilidad del manuscrito según los usos aceptados por las editoriales científicas. Estas herramientas no se utilizaron para generar texto original, conceptos de investigación, datos, imágenes o figuras en esta propuesta. Después de usar estas herramientas, los autores revisaron y editaron el contenido según fuera necesario y asumen toda la responsabilidad sobre este contenido.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por la Estación Experimental Agrícola de Utah (UTAO1328) y la Fundación de Fibrosis Quística (premio POLEJA23PO).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Escalera de ADN de 1 kbThermo Fisher ScientificSM0313Marcador de tamaño de ADN
Tubo centrífugo de 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
Tubo microcentrífugo de 1,5 mLThermo Fisher Scientific05-408-129
Unidad 4D-Nucleofector CoreLonzaAAF-1003B
Unidad 4D-Nucleofector XLonzaAAF-1003X
Placa de 4 pocillosNunc144444
Tubo centrífugo de 50 mLThermo Fisher Scientific12-565-270
6-DMAPSigma-AldrichD2629
Placa de 24 pocillosCorning3524Expansión celular
Placa de 96 pocillosCorning3596Aislamiento de colonias monoclonales
AgarosaThermo Fisher ScientificBP160-100Electroforesis en gel de agarosa
Vaso de precipitados (250 mL)Kimble14000-250
Software BenchlingBenchlinghttps://www.benchling.com/academicAlineación y análisis de secuencias
Medio IVCIVF Bioscience71005
Medio IVMIVF Bioscience71001
BSAGold BioA-421-250
BTX ECMBTXECM-200Equipo (descatalogado)
Cámara para microporta BTXBTX450103
Proteína Cas9Integrated DNA TechnologiesPersonalizadoEdición genómica CRISPR-Cas9
Clorhexidina gluconato (2 %)Aspen Vet11584915
CHXSigma-AldrichC7698
Software CRISPORCRISPORhttps://crispor.gi.ucsc.edu/Software de predicción de efectos fuera de blanco
CriovialThermo Fisher Scientific12-565-163N
Citocalasina BSigma-AldrichC6762
DMSO (dimetilsulfóxido)Fisher ScientificBP231-100Reactivo para criopreservación
DMEM con alta glucosaCytivaSH30022Medio de cultivo para fibroblastos
Kit de purificación de ADNThermo Fisher ScientificK0781Purificación de ADN genómico de sangre total
DPBS sin Ca/MgCytivaSH30256Utilizado para lavar células y tejidos
EthanolPharco111000200CSGL
Suero bovino fetalCytivaSH30396Suplemento para cultivo celular
PinzasSkylar66-6112
Kit de purificación de ADN genómicoQiagen69504Extracción de ADN genómico
Solución de gentamicinaGibco15750-060Utilizado en medio de enjuague
ARN guíaIntegrated DNA TechnologiesPersonalizadoARN guía CRISPR
Potenciador de reparación por recombinación homóloga (HDR)Integrated DNA Technologies10007921Potencia la reparación dirigida por homología
HemocitómetroHausser Scientific02-671-10Conteo celular
HemostatosRoboz SurgicalRS-7884
Sales de sodio de heparinaSigma-AldrichH3149
ADN polimerasa Hot-StartPromegaM5123Amplificación por PCR
HialuronidasaSigma-AldrichH3506
IonomicinaSigma-AldrichI0634
Medio M199CytivaSH30253.01
Pantalla de malla (40 mallas)Sigma-AldrichS-0770Tamaño de apertura 380 μm
MicroforjadoraNarishigeMF-9
MicromoliendaNarishigeEG-4
Extractor de micropipetasSutter Instrument CoP-87
Aceite mineralKitazato/Dibimed96014
Pipeta de bocaThermo Fisher Scientific13-678-20DPipetas Pasteur desechables
Recipiente de congelación Mr. FrostyThermo Fisher Scientific15-350-50Recipiente de congelación con tasa controlada
NucleocubetaLonzaV4XP-3032Cubeta para electroforesis
Kit P3 para células primarias 4D-Nucleofector X, tamaño LLonzaV4XP-3024Incluye solución de nucleofección, solución suplemento, nucleocubetas y pipetas de transferencia
Kit de purificación de PCRQiagen28006Purificación de productos de PCR
Penicilina-estreptomicinaGibco15070-063Suplemento antibiótico
Placa de Petri (100 mm)Nunc172958
Placa de Petri (35 mm)Nunc150460
Reservorio de reactivoCELLTREAT3054-1003
EscalpeloMedBladesMB 2-22
TijerasRoboz SurgicalRS-6802
Plantilla donadora de oligodesoxinucleótidos monocatenariosIntegrated DNA TechnologiesPersonalizadoPlantilla donadora HDR
Cloruro de sodioThermo Fisher ScientificBP358-212Para solución salina
SacarosaSigma-AldrichS1888
Bandeja quirúrgicaProveedor aprobado74262
Tinte SYBR Safe para geles de ADNThermo Fisher ScientificS33102Tinte para geles de ADN
Frascos T-25Thermo Fisher Scientific156367Frascos para cultivo celular
Frascos T-75Corning430641UFrascos para cultivo celular
Capilar de vidrio de pared delgadaWorld Precision InstrumentsTW100-6
Software TIDE/TIDERTIDE/TIDERhttps://tide.nki.nl/Software de análisis de edición genómica
Azul de tripanoCytivaSV30084
TrypLE ExpressGibco12605-010Enzima de disociación tipo tripsina

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