Este estudio optimiza el ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) utilizando carbón activado y bentonita para detectar especies patógenas de Vibrio en mariscos. Este tratamiento previo elimina eficazmente los inhibidores de la reacción, produciendo diagnósticos significativamente más rápidos, sensibles y rentables en comparación con los métodos convencionales.
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Artículo de investigación
Aumento de la sensibilidad de la amplificación en bucle mediante el uso de carbón activado y bentonita para la detección de Vibrio spp. en productos pesqueros
En este artículo
Resumen
Resumen
El Vibrio el género tiene más de 100 especies, de las cuales 12 se consideran patógenas para los seres humanos; las especies aisladas con mayor frecuencia en alimentos son V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus. El principal problema para identificarlos mediante métodos microbiológicos convencionales es el alto costo y el diagnóstico prolongado. La amplificación isotérmica mediada por horquilla (LAMP) se utilizó para la identificación de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus. Se utilizó carbón activado con bentonita (CAB) para eliminar inhibidores, mejorando así la sensibilidad de la prueba; se evaluaron los valores de pH 6, 7 y 9, así como diferentes tiempos de contacto entre la muestra y el CAB. El método LAMP mejoró su sensibilidad cuando se empleó carbón activado y bentonita para eliminar inhibidores de la reacción en muestras de camarón, pescado y ostra. La sensibilidad del método LAMP, el valor predictivo negativo, el valor predictivo positivo y la especificidad del LAMP fueron iguales o superiores al 90 % para todas las muestras analizadas. El método LAMP podría ser una alternativa para identificar V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus en productos pesqueros debido a su aplicación más rápida, mayor sensibilidad y menores costos en comparación con el método estándar.
Introducción
Especies del Vibrio el género está ampliamente distribuido en ambientes marinos y puede asociarse con peces, moluscos o crustáceos de manera patógena o comensal. Se ha reportado que 12 especies pueden ser patógenas para los seres humanos, con Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus revelando una mayor frecuencia de aislamiento en productos pesqueros. En Estados Unidos, las autoridades sanitarias estiman que Vibrio spp. causan más de 80.000 infecciones por año1,2,3,4,5El aislamiento de Vibrio spp. se logra mediante métodos convencionales que incluyen pre-enriquecimiento, cultivo en medios selectivos y confirmación mediante pruebas bioquímicas y serológicas.6,7. Estos métodos convencionales están limitados por el prolongado tiempo necesario para aislar el patógeno (hasta 5 días) y por su escasa capacidad de resolución, que a menudo no logra diferenciar con precisión especies estrechamente relacionadas dentro del Vibrio género debido a perfiles fenotípicos y bioquímicos similares6,7,8.
Alternativamente, se ha reportado la amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) como una técnica molecular rápida, precisa y económica para la identificación de patógenos9,10. Este método es altamente rentable y más rápido que la PCR convencional, ya que no requiere equipos sofisticados como termocicladores9. El método LAMP permite, en un solo paso, la detección del gen diana mediante la observación de la turbidez en el tubo de reacción causada por la precipitación del pirofosfato de magnesio, que es un producto estable de la reacción a 65 °C, la temperatura utilizada en la técnica LAMP, de modo que el aumento de la turbidez se correlaciona con la cantidad de ADN sintetizado, evitando así el uso de geles de agarosa y transiluminadores11,12,13,14,15.
La detección de la sensibilidad a estos patógenos puede mejorarse mediante la eliminación de inhibidores de la reacción, como proteasas, iones de calcio, glucógeno y lípidos, que pueden inhibir la polimerasa Bst o unirse al ADN diana, evitando así la amplificación13,16,17,18,19,20. Se ha informado que la combinación de carbón activado con bentonita (ACB) tiene una alta eficiencia en la eliminación de inhibidores de la amplificación, aumentando por tanto la sensibilidad en la detección de Escherichia coli en muestras de ostras y reduciendo los costos, ya que el ACB es más económico que el uso de kits comerciales21.
En este trabajo, se propone optimizar el método LAMP utilizando carbón activado y bentonita para aumentar la sensibilidad en la identificación de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. alginolyticus directamente a partir de productos pesqueros. Este método optimizado proporciona una guía práctica para el monitoreo rutinario y el control de calidad en la industria alimentaria, siendo altamente aplicable para el diagnóstico rápido de patógenos, evitando las largas etapas de preenriquecimiento. En cuanto a su rendimiento esperado, el método demuestra una excelente sensibilidad (superior al 98 %) y especificidad (100 %) en matrices como pescado y camarón. Sin embargo, una limitación clave a considerar es que en muestras altamente contaminadas desde su origen, como las ostras, el sistema ACB no puede eliminar por completo toda la materia orgánica interferente, lo que puede disminuir ligeramente la sensibilidad del ensayo (94 %–98 %).
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Protocolo
Este estudio no involucró sujetos humanos ni animales vertebrados; por lo tanto, no se requirió aprobación ética institucional. Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Cepas bacterianas utilizadas y extracción de ADN
Las cepas de Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 y V. alginolyticus ATCC 17749 se cultivaron en caldo de infusión cerebral cardíaca (BHI) con 2% de NaCl a 37 °C durante 24 h. Las cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 y Salmonella Typhimurium ATCC 14028 se cultivaron en caldo BHI sin cloruro de sodio a 37 °C durante 24 h para utilizarse como controles negativos en las pruebas. Para la extracción de ADN, se centrifugó una cultivo nocturno a 16.000 x g durante 6 min a 25 °C en una centrífuga. Se decantó cuidadosamente el sobrenadante para evitar perturbar el botón celular, y el botón se resuspendió completamente mediante pipeteo en 500 μL de solución tampón TAE (Tris-ácido acético-EDTA, pH 8). La suspensión se hirvió durante 6 min para lisar las células y luego se enfrió inmediatamente en hielo durante 5 min. Se realizó una centrifugación final para obtener un botón de restos celulares, obteniéndose un sobrenadante claro que contenía el ADN extraído, el cual se utilizó posteriormente como molde para amplificar mediante LAMP22,23.
2. Procedimiento LAMP
Los cebadores utilizados en LAMP (Tabla 1) se probaron para corroborar la especificidad en la identificación de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus. La identificación de cada Vibrio especies utilizando LAMP se realizó en tubos de reacción preparando un volumen final de 25 μL de la mezcla que contiene: 1.6 μM de cada uno de los cebadores, 1,4 mM de una mezcla de dNTP, 6 mM de MgSO₄, 800 mM de betaina, 8 U de Bst polimerasa de ADN, y 5 μL de ADN molde. La mezcla de reacción se mezcló suavemente e incubó en un baño de agua a 65 °C durante 60 min. Tras el tiempo de incubación, los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa al 1,5%. Los productos de amplificación se tiñeron entonces utilizando 1 μL de un colorante fluorescente de ADN diluido 1:100 y revelado mediante un transiluminador de luz azul. Otra técnica para determinar si la prueba fue positiva en la identificación del patógeno consistió en agregar 4 μL de azul de hidroxinaftol (HNB, 125 μM) a los tubos de reacción y observando el cambio de color a simple vista. Una prueba positiva se indicaba por la formación de un color azul, y una negativa por un color violeta.24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, y Salmonella Typhimurium ATCC 14028 se utilizaron como controles negativos para el método LAMP. Las amplificaciones obtenidas en LAMP se separaron en un gel de agarosa y se observaron utilizando un transiluminador. Las imágenes resultantes se adquirieron y digitalizaron mediante el software MS 1D Analysis.
3. Tratamiento de muestras de ostras, camarones y pescado para la eliminación de Vibrio spp. presentes naturalmente en las muestras
Se adquirieron diez muestras de ostras, diez muestras de camarón y diez muestras de pescado, cada una con un peso aproximado de 200 g. Para eliminar las células de Vibrio que ocurren naturalmente, se siguió la metodología publicada previamente21. Se pesaron cincuenta gramos (50 g) de cada muestra y se homogenizaron mecánicamente en una mezcladora con paleta a 260 rpm durante 1 minuto, produciendo una suspensión uniforme de tejido, que luego se almacenó a -70 °C durante 72 h. Posteriormente, las muestras se descongelaron completamente utilizando un baño de agua a 40 °C, y se lavaron con 300 mL de solución salina tamponada con fosfatos (0,85 % de NaCl, pH 9). Para asegurar que el procedimiento anterior había eliminado con éxito Vibrio en las muestras, se realizó la metodología de preenriquecimiento indicada en el capítulo 9 del Manual Analítico Bacteriológico de la Administración de Alimentos y Medicamentos7. La solución salina que contenía la muestra se reemplazó con 450 mL de agua peptonada alcalina (APW, pH 9). Luego se prepararon meticulosamente diluciones seriadas en APW hasta una dilución de 10⁻3 y se incubaron durante 24 h. Finalmente, se realizó un estría de una alícuota de cada tubo en un medio selectivo de agar tioglicolato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS) y se incubó durante 24 h a 37 °C para confirmar visualmente la ausencia de colonias características de Vibrio. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
4. Preparación de carbón activado con bentonita (ACB) y evaluación de la recuperación celular
Para determinar las condiciones en las que el carbón activado-bentonita (ACB) es más eficiente absorbiendo inhibidores presentes en muestras de productos pesqueros, al tiempo que mantiene una absorción mínima de las células diana, se siguió la metodología publicada21 para establecer el pH óptimo y el tiempo de contacto entre el ACB y las muestras alimenticias. El carbón activado se lavó exhaustivamente con agua destilada y se secó a 55 °C. Posteriormente, se mezclaron 32,6 g de carbón activado con 3,04 g de bentonita, se agitó continuamente a 150 rpm durante 24 h para asegurar una distribución uniforme, se secó a 55 °C y se esterilizó, obteniéndose un polvo seco de ACB fino y homogéneo. Para evaluar la recuperación celular después de mezclar células de Vibrio con la mezcla de carbón activado-bentonita (ACB), las cepas se cultivaron por separado en caldo BHI con 2% de NaCl hasta alcanzar una densidad celular de 1,5 x 104 UFC/mL. Luego, se inocularon 1 mL de cada cepa de Vibrio por separado en 100 mL de tampón fosfato (PBS, 0,85% NaCl), ajustado a pH 4, 6 y 9. La suspensión bacteriana se combinó entonces con 4,6 g del ACB previamente preparado y se dejó agitando a 150 rpm durante 15, 30 y 60 min para facilitar el contacto. Tras cada tiempo de contacto establecido, se separó cuidadosamente una alícuota de 0,1 mL, se extendió sobre agar TCBS, y se incubó a 37 °C durante 24 h antes de realizar el recuento de colonias.
5. Evaluación del límite de detección de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. alginolyticus en muestras de ostras, camarones y pescado tratadas con carbón activado y bentonita
Cada una de las especies de Vibrio utilizadas en este estudio se cultivó en caldo BHI, y sus densidades celulares se ajustaron con precisión a 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 y 76 UFC/mL (A600 nm ~0,25), según se midió mediante un espectrofotómetro. Posteriormente, se utilizó 1 mL de cada cultivo de Vibrio para inocular 50 g de cada muestra (ostras, pescado, camarón) que previamente habían sido tratadas para eliminar cualquier presencia de Vibrio. Las muestras inoculadas se homogenizaron en un mezclador con paletas a 360 rpm durante 30 s y se diluyeron con 450 mL de APW (pH 6). La mezcla se centrifugó luego a 260 x g durante 5 min a 4 °C para separar los residuos grandes. El sobrenadante resultante se decantó en matraces que contenían 23 g de ACB, se agitó a 150 rpm durante 15 min para absorber inhibidores y se filtró mediante papel filtro, obteniéndose un eluyente claro libre de partículas grandes. Este eluyente se centrifugó entonces a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C, obteniéndose un pellet celular visible en el fondo del tubo, que posteriormente se utilizó para extraer ADN. Cada especie de Vibrio se identificó mediante el método LAMP. Los controles negativos consistieron en muestras inoculadas con cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 y Salmonella Typhimurium ATCC 14028. La mezcla de reacción se incubó en un baño de agua a 65 °C durante 60 min. Tras el tiempo de incubación, los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa al 1,5% y se tiñeron con un colorante fluorescente de ADN. Los geles se visualizaron en un transiluminador de luz azul. Finalmente, se añadieron 4 μL de azul de hidroxinaftol (125 μM) a cada tubo para la detección a simple vista24.
6. Determinación del valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, especificidad y sensibilidad del método LAMP
La sensibilidad, especificidad y valores predictivos del método LAMP se determinaron utilizando 30 muestras (10 de camarón, 10 de ostra y 10 de pescado). Cada muestra se inoculó con la concentración mínima detectable establecida para cada especie de Vibrio. Para determinar el porcentaje de sensibilidad y especificidad, así como el valor predictivo negativo (VPN) y el valor predictivo positivo25, se utilizó una tabla de contingencia para resumir los verdaderos positivos (VP), verdaderos negativos (VN), falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN) obtenidos durante los experimentos. (Tabla 2). A partir de estos datos, se aplicaron las siguientes fórmulas:
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Resultados
CEPAS BACTERIANAS UTILIZADAS Y LA EXTRACCIÓN DE ADN
Se extrajo con éxito ADN de todas las cepas patógenas y de control negativo para utilizarlo como plantillas en los ensayos de LAMP posteriores.
Procedimiento LAMP
Los cebadores utilizados en este trabajo fueron específicos para la amplificación del objetivo molecular en cada especie de Vibrio. Los productos de amplificación obtenidos mediante LAMP cuando se utilizaron cepas de Vibrio...
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Discusión
Este estudio establece condiciones optimizadas para aumentar la sensibilidad de la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) en la detección de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. vulnificus en muestras de mariscos contaminados. Al omitir la etapa tradicional de pre-enriquecimiento, el tiempo diagnóstico se reduce significativamente, ofreciendo un enfoque altamente eficiente y rápido para identificar directamente patógenos en productos pesqueros.
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Carbón activado | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonita | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaina | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transiluminador Bio-Image Systems | Bio-Image Systems | MBE-CP-01 | |
| Polimerasa Bst de ADN | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrífuga (modelo J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| Mezcla de dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Azul de hidroxinaftol | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Software de análisis MS 1D | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Espectrofotómetro (modelo 6300) | Jenway | 630531 | |
| Circulador Stomacher (modelo 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae no O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Papel Whatman | Whatman | 1001-055 |
Referencias
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