Este estudio optimiza el ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) utilizando carbón activado y bentonita para detectar especies patógenas de Vibrio en mariscos. Este tratamiento previo elimina eficazmente los inhibidores de la reacción, produciendo diagnósticos significativamente más rápidos, sensibles y rentables en comparación con los métodos convencionales.
Artículo de investigación
Aumento de la sensibilidad de la amplificación en bucle mediante el uso de carbón activado y bentonita para la detección de Vibrio spp. en productos pesqueros
En este artículo
Resumen
Resumen
El Vibrio el género tiene más de 100 especies, de las cuales 12 se consideran patógenas para los seres humanos; las especies aisladas con mayor frecuencia en alimentos son V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus. El principal problema para identificarlos mediante métodos microbiológicos convencionales es el alto costo y el diagnóstico prolongado. La amplificación isotérmica mediada por horquilla (LAMP) se utilizó para la identificación de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus. Se utilizó carbón activado con bentonita (CAB) para eliminar inhibidores, mejorando así la sensibilidad de la prueba; se evaluaron los valores de pH 6, 7 y 9, así como diferentes tiempos de contacto entre la muestra y el CAB. El método LAMP mejoró su sensibilidad cuando se empleó carbón activado y bentonita para eliminar inhibidores de la reacción en muestras de camarón, pescado y ostra. La sensibilidad del método LAMP, el valor predictivo negativo, el valor predictivo positivo y la especificidad del LAMP fueron iguales o superiores al 90 % para todas las muestras analizadas. El método LAMP podría ser una alternativa para identificar V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus en productos pesqueros debido a su aplicación más rápida, mayor sensibilidad y menores costos en comparación con el método estándar.
Introducción
Especies del Vibrio el género está ampliamente distribuido en ambientes marinos y puede asociarse con peces, moluscos o crustáceos de manera patógena o comensal. Se ha reportado que 12 especies pueden ser patógenas para los seres humanos, con Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus revelando una mayor frecuencia de aislamiento en productos pesqueros. En Estados Unidos, las autoridades sanitarias estiman que Vibrio spp. causan más de 80.000 infecciones por año1,2,3,4,5El aislamiento de Vibrio spp. se logra mediante métodos convencionales que incluyen pre-enriquecimiento, cultivo en medios selectivos y confirmación mediante pruebas bioquímicas y serológicas.6,7. Estos métodos convencionales están limitados por el prolongado tiempo necesario para aislar el patógeno (hasta 5 días) y por su escasa capacidad de resolución, que a menudo no logra diferenciar con precisión especies estrechamente relacionadas dentro del Vibrio género debido a perfiles fenotípicos y bioquímicos similares6,7,8.
Alternativamente, se ha reportado la amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) como una técnica molecular rápida, precisa y económica para la identificación de patógenos9,10. Este método es altamente rentable y más rápido que la PCR convencional, ya que no requiere equipos sofisticados como termocicladores9. El método LAMP permite, en un solo paso, la detección del gen diana mediante la observación de la turbidez en el tubo de reacción causada por la precipitación del pirofosfato de magnesio, que es un producto estable de la reacción a 65 °C, la temperatura utilizada en la técnica LAMP, de modo que el aumento de la turbidez se correlaciona con la cantidad de ADN sintetizado, evitando así el uso de geles de agarosa y transiluminadores11,12,13,14,15.
La detección de la sensibilidad a estos patógenos puede mejorarse mediante la eliminación de inhibidores de la reacción, como proteasas, iones de calcio, glucógeno y lípidos, que pueden inhibir la polimerasa Bst o unirse al ADN diana, evitando así la amplificación13,16,17,18,19,20. Se ha informado que la combinación de carbón activado con bentonita (ACB) tiene una alta eficiencia en la eliminación de inhibidores de la amplificación, aumentando por tanto la sensibilidad en la detección de Escherichia coli en muestras de ostras y reduciendo los costos, ya que el ACB es más económico que el uso de kits comerciales21.
En este trabajo, se propone optimizar el método LAMP utilizando carbón activado y bentonita para aumentar la sensibilidad en la identificación de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. alginolyticus directamente a partir de productos pesqueros. Este método optimizado proporciona una guía práctica para el monitoreo rutinario y el control de calidad en la industria alimentaria, siendo altamente aplicable para el diagnóstico rápido de patógenos, evitando las largas etapas de preenriquecimiento. En cuanto a su rendimiento esperado, el método demuestra una excelente sensibilidad (superior al 98 %) y especificidad (100 %) en matrices como pescado y camarón. Sin embargo, una limitación clave a considerar es que en muestras altamente contaminadas desde su origen, como las ostras, el sistema ACB no puede eliminar por completo toda la materia orgánica interferente, lo que puede disminuir ligeramente la sensibilidad del ensayo (94 %–98 %).
Protocolo
Este estudio no involucró sujetos humanos ni animales vertebrados; por lo tanto, no se requirió aprobación ética institucional. Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Cepas bacterianas utilizadas y extracción de ADN
Las cepas de Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 y V. alginolyticus ATCC 17749 se cultivaron en caldo de infusión cerebral cardíaca (BHI) con 2% de NaCl a 37 °C durante 24 h. Las cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 y Salmonella Typhimurium ATCC 14028 se cultivaron en caldo BHI sin cloruro de sodio a 37 °C durante 24 h para utilizarse como controles negativos en las pruebas. Para la extracción de ADN, se centrifugó una cultivo nocturno a 16.000 x g durante 6 min a 25 °C en una centrífuga. Se decantó cuidadosamente el sobrenadante para evitar perturbar el botón celular, y el botón se resuspendió completamente mediante pipeteo en 500 μL de solución tampón TAE (Tris-ácido acético-EDTA, pH 8). La suspensión se hirvió durante 6 min para lisar las células y luego se enfrió inmediatamente en hielo durante 5 min. Se realizó una centrifugación final para obtener un botón de restos celulares, obteniéndose un sobrenadante claro que contenía el ADN extraído, el cual se utilizó posteriormente como molde para amplificar mediante LAMP22,23.
2. Procedimiento LAMP
Los cebadores utilizados en LAMP (Tabla 1) se probaron para corroborar la especificidad en la identificación de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, y V. alginolyticus. La identificación de cada Vibrio especies utilizando LAMP se realizó en tubos de reacción preparando un volumen final de 25 μL de la mezcla que contiene: 1.6 μM de cada uno de los cebadores, 1,4 mM de una mezcla de dNTP, 6 mM de MgSO₄, 800 mM de betaina, 8 U de Bst polimerasa de ADN, y 5 μL de ADN molde. La mezcla de reacción se mezcló suavemente e incubó en un baño de agua a 65 °C durante 60 min. Tras el tiempo de incubación, los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa al 1,5%. Los productos de amplificación se tiñeron entonces utilizando 1 μL de un colorante fluorescente de ADN diluido 1:100 y revelado mediante un transiluminador de luz azul. Otra técnica para determinar si la prueba fue positiva en la identificación del patógeno consistió en agregar 4 μL de azul de hidroxinaftol (HNB, 125 μM) a los tubos de reacción y observando el cambio de color a simple vista. Una prueba positiva se indicaba por la formación de un color azul, y una negativa por un color violeta.24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, y Salmonella Typhimurium ATCC 14028 se utilizaron como controles negativos para el método LAMP. Las amplificaciones obtenidas en LAMP se separaron en un gel de agarosa y se observaron utilizando un transiluminador. Las imágenes resultantes se adquirieron y digitalizaron mediante el software MS 1D Analysis.
3. Tratamiento de muestras de ostras, camarones y pescado para la eliminación de Vibrio spp. presentes naturalmente en las muestras
Se adquirieron diez muestras de ostras, diez muestras de camarón y diez muestras de pescado, cada una con un peso aproximado de 200 g. Para eliminar las células de Vibrio que ocurren naturalmente, se siguió la metodología publicada previamente21. Se pesaron cincuenta gramos (50 g) de cada muestra y se homogenizaron mecánicamente en una mezcladora con paleta a 260 rpm durante 1 minuto, produciendo una suspensión uniforme de tejido, que luego se almacenó a -70 °C durante 72 h. Posteriormente, las muestras se descongelaron completamente utilizando un baño de agua a 40 °C, y se lavaron con 300 mL de solución salina tamponada con fosfatos (0,85 % de NaCl, pH 9). Para asegurar que el procedimiento anterior había eliminado con éxito Vibrio en las muestras, se realizó la metodología de preenriquecimiento indicada en el capítulo 9 del Manual Analítico Bacteriológico de la Administración de Alimentos y Medicamentos7. La solución salina que contenía la muestra se reemplazó con 450 mL de agua peptonada alcalina (APW, pH 9). Luego se prepararon meticulosamente diluciones seriadas en APW hasta una dilución de 10⁻3 y se incubaron durante 24 h. Finalmente, se realizó un estría de una alícuota de cada tubo en un medio selectivo de agar tioglicolato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS) y se incubó durante 24 h a 37 °C para confirmar visualmente la ausencia de colonias características de Vibrio. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
4. Preparación de carbón activado con bentonita (ACB) y evaluación de la recuperación celular
Para determinar las condiciones en las que el carbón activado-bentonita (ACB) es más eficiente absorbiendo inhibidores presentes en muestras de productos pesqueros, al tiempo que mantiene una absorción mínima de las células diana, se siguió la metodología publicada21 para establecer el pH óptimo y el tiempo de contacto entre el ACB y las muestras alimenticias. El carbón activado se lavó exhaustivamente con agua destilada y se secó a 55 °C. Posteriormente, se mezclaron 32,6 g de carbón activado con 3,04 g de bentonita, se agitó continuamente a 150 rpm durante 24 h para asegurar una distribución uniforme, se secó a 55 °C y se esterilizó, obteniéndose un polvo seco de ACB fino y homogéneo. Para evaluar la recuperación celular después de mezclar células de Vibrio con la mezcla de carbón activado-bentonita (ACB), las cepas se cultivaron por separado en caldo BHI con 2% de NaCl hasta alcanzar una densidad celular de 1,5 x 104 UFC/mL. Luego, se inocularon 1 mL de cada cepa de Vibrio por separado en 100 mL de tampón fosfato (PBS, 0,85% NaCl), ajustado a pH 4, 6 y 9. La suspensión bacteriana se combinó entonces con 4,6 g del ACB previamente preparado y se dejó agitando a 150 rpm durante 15, 30 y 60 min para facilitar el contacto. Tras cada tiempo de contacto establecido, se separó cuidadosamente una alícuota de 0,1 mL, se extendió sobre agar TCBS, y se incubó a 37 °C durante 24 h antes de realizar el recuento de colonias.
5. Evaluación del límite de detección de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. alginolyticus en muestras de ostras, camarones y pescado tratadas con carbón activado y bentonita
Cada una de las especies de Vibrio utilizadas en este estudio se cultivó en caldo BHI, y sus densidades celulares se ajustaron con precisión a 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 y 76 UFC/mL (A600 nm ~0,25), según se midió mediante un espectrofotómetro. Posteriormente, se utilizó 1 mL de cada cultivo de Vibrio para inocular 50 g de cada muestra (ostras, pescado, camarón) que previamente habían sido tratadas para eliminar cualquier presencia de Vibrio. Las muestras inoculadas se homogenizaron en un mezclador con paletas a 360 rpm durante 30 s y se diluyeron con 450 mL de APW (pH 6). La mezcla se centrifugó luego a 260 x g durante 5 min a 4 °C para separar los residuos grandes. El sobrenadante resultante se decantó en matraces que contenían 23 g de ACB, se agitó a 150 rpm durante 15 min para absorber inhibidores y se filtró mediante papel filtro, obteniéndose un eluyente claro libre de partículas grandes. Este eluyente se centrifugó entonces a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C, obteniéndose un pellet celular visible en el fondo del tubo, que posteriormente se utilizó para extraer ADN. Cada especie de Vibrio se identificó mediante el método LAMP. Los controles negativos consistieron en muestras inoculadas con cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 y Salmonella Typhimurium ATCC 14028. La mezcla de reacción se incubó en un baño de agua a 65 °C durante 60 min. Tras el tiempo de incubación, los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa al 1,5% y se tiñeron con un colorante fluorescente de ADN. Los geles se visualizaron en un transiluminador de luz azul. Finalmente, se añadieron 4 μL de azul de hidroxinaftol (125 μM) a cada tubo para la detección a simple vista24.
6. Determinación del valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, especificidad y sensibilidad del método LAMP
La sensibilidad, especificidad y valores predictivos del método LAMP se determinaron utilizando 30 muestras (10 de camarón, 10 de ostra y 10 de pescado). Cada muestra se inoculó con la concentración mínima detectable establecida para cada especie de Vibrio. Para determinar el porcentaje de sensibilidad y especificidad, así como el valor predictivo negativo (VPN) y el valor predictivo positivo25, se utilizó una tabla de contingencia para resumir los verdaderos positivos (VP), verdaderos negativos (VN), falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN) obtenidos durante los experimentos. (Tabla 2). A partir de estos datos, se aplicaron las siguientes fórmulas:
Resultados
CEPAS BACTERIANAS UTILIZADAS Y LA EXTRACCIÓN DE ADN
Se extrajo con éxito ADN de todas las cepas patógenas y de control negativo para utilizarlo como plantillas en los ensayos de LAMP posteriores.
Procedimiento LAMP
Los cebadores utilizados en este trabajo fueron específicos para la amplificación del objetivo molecular en cada especie de Vibrio. Los productos de amplificación obtenidos mediante LAMP cuando se utilizaron cepas de Vibrio demostraron que cada cebador fue específico en la amplificación del gen objetivo de cada especie de Vibrio (Figura 1).
Tratamiento de muestras de ostras, camarones y pescado para la eliminación de Vibrio spp. presentes naturalmente en las muestras
El tratamiento para eliminar Vibrio spp. presentes naturalmente en las muestras fue adecuado, permitiendo la reducción del 100 % de Vibrio spp. No hubo crecimiento de Vibrio spp. cuando se siguió el método BAM7.
Preparación de carbón activado con bentonita (ACB) y evaluación de la recuperación celular
La eliminación de los inhibidores de la reacción mediante el carbón activado-bentonita permitió aumentar la sensibilidad en la detección del patógeno por el método LAMP. Esto se debe a la capacidad del carbón activado-bentonita para absorber sustancias inhibidoras que pueden afectar a la polimerasa durante el procedimiento de amplificación, además de la retención limitada de células bacterianas (Figura 2). El porcentaje de recuperación de Vibrio utilizando diferentes valores de pH y tiempos de contacto mostró una mayor recuperación celular (93,4% ± 2,9%) cuando el pH era 6 con un tiempo de contacto de 15 min. Cuando se utilizó un pH de 4, no hubo crecimiento de ninguna Vibrio, y los valores a pH 7 y 9 fueron de 33,4% ± 7,6% y 67,2% ± 5,8%, respectivamente. Este trabajo sugiere el uso de un pH de 6 para mejorar la sensibilidad de detección del método.
Evaluación del límite de detección de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. alginolyticus en muestras de ostras, camarones y pescado tratadas con carbón activado y bentonita
En las muestras de ostras, el límite de detección para V. cholerae fue de 150 UFC/g, para V. alginolyticus, V. vulnificus y V. parahaemolyticus fue de 3 x 102 UFC/g; en muestras de camarón y pescado, V. cholerae se detectó a una concentración mínima de 150 UFC/g, mientras que para V. alginolyticus, V. vulnificus y V. parahaemolyticus fue de 76 UFC/g. Los resultados obtenidos mediante el método LAMP revelaron que el uso de hidroxinaftol azul aumentó la sensibilidad del LAMP al eliminar los inhibidores de la reacción en las muestras que no fueron tratadas con ACB (Figura 3). Observamos que la sensibilidad del LAMP fue mayor cuando las muestras fueron tratadas con ACB.
Determinación del valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, especificidad y sensibilidad del método LAMP
El rendimiento diagnóstico del método optimizado de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), con y sin pretratamiento con carbón activado-bentonita (ACB), se evaluó sistemáticamente en 150 ensayos para evaluar su robustez (Tabla 3). La eliminación de inhibidores naturales presentes en los alimentos mediante el sistema ACB mejoró significativamente todos los parámetros diagnósticos (sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (PPV) y valor predictivo negativo (NPV)) a valores iguales o superiores al 90 % en todas las matrices, en comparación con las muestras no tratadas.
En muestras de pescado y camarón tratadas con ACB, el ensayo demostró un rendimiento diagnóstico máximo, alcanzando una sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) del 100% (Figura 4). Por el contrario, en muestras no tratadas de pescado y camarón, la presencia de inhibidores derivados de la matriz comprometió gravemente el ensayo, reduciendo la sensibilidad de detección al 62,5% y al 52,5%, respectivamente. Para la matriz altamente compleja de ostra, el tratamiento con ACB mitigó con éxito las interferencias principales, obteniendo una sensibilidad general alta del 95,0% y un VPN del 71,4% (Figura 5). En contraste, las muestras de ostra no tratadas mostraron una caída crítica en la sensibilidad de detección hasta el 32,5% y un VPN del 15,6% debido a la presencia masiva de compuestos orgánicos como el glucógeno y los lípidos que inhiben la polimerasa.
La especificidad diagnóstica del método LAMP se mantuvo en 100 % en los 150 ensayos, independientemente del tipo de matriz o del pretratamiento, sin registrar ningún resultado falso positivo. Esta especificidad absoluta se atribuye al diseño altamente selectivo de los conjuntos de cebadores dirigidos a genes específicos de especie (gyrB para V. alginolyticus, ompW para V. cholerae, tlh para V. parahaemolyticus y vvhA para V. vulnificus). Estos hallazgos estadísticos demuestran que el método ACB-LAMP optimizado es una herramienta altamente confiable y robusta para la detección rápida y sin cultivo de especies patógenas de Vibrio en diversos productos pesqueros.
Finalmente, consideramos que el uso del método LAMP en combinación con un tratamiento previo para eliminar inhibidores de la reacción puede aumentar la sensibilidad de detección de patógenos en alimentos mediante el método LAMP. Por lo tanto, esta técnica aplicada a la búsqueda de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, y V. vulnificus debería ser útil en el monitoreo para prevenir infecciones causadas por estos microorganismos.
DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:
Todos los datos brutos que respaldan los hallazgos de este estudio, incluidos los conteos numéricos de colonias recuperadas de bacterias (UFC/g) bajo diferentes valores de pH y tiempos de contacto, así como los resultados completos del rendimiento diagnóstico para las 150 pruebas de validación, están disponibles públicamente en el repositorio Zenodo en https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272. El conjunto de datos asociado contiene el archivo completo de hoja de cálculo (Archivo Suplementario 1).
Figura 1: Análisis de especificidad de los productos amplificados por LAMP en un gel de agarosa al 1,5%. Carril M, marcador molecular de tamaño de 100 pb; Carril 1, control negativo (Escherichia coli ATCC 25922); Carril 2, control negativo (Listeria monocytogenes ATCC 49594); Carril 3, V. alginolyticus ATCC 17749; Carril 4, V. cholerae no O1 CECT 557; Carril 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802; Carril 6, V. vulnificus ATCC 29037. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Porcentaje de recuperación de cepas de Vibrio utilizando diferentes condiciones de pH y tiempos de contacto con la mezcla de carbón activado-bentonita (ACB). La recuperación celular (%) se determinó tras inocular cepas de Vibrio a 1.5 × 104 UFC/mL en PBS ajustado a pH 4.0, 6.0, 7.0 y 9.0, y tratar con 4.6 g de ACB durante 15 min, 30 min y 60 min. El punto de datos a pH 6.0 y 15 min de contacto demuestra una recuperación celular óptima (93,4% ± 2,9%), lo que indica que un breve tiempo de contacto es suficiente para recuperar las células diana manteniendo una alta eficiencia en la eliminación de inhibidores. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: Límite de detección de productos amplificados por LAMP en muestras de mariscos artificialmente contaminadas. Resultados de amplificación en muestras de (A) ostra, (B) camarón y (C) pescado contaminadas con diluciones seriadas de especies de Vibrio y pretratadas con ACB. Tubos: (1) Control negativo; (2) V. alginolyticus; (3) V. parahaemolyticus; (4) V. vulnificus; (5) V. cholerae no O1; y (6) V. mimicus (utilizado como control objetivo). Panel superior: Detección colorimétrica visual utilizando 4 μL de hidroxinaftol azul (HNB, 125 μM) mediante inspección a simple vista, donde las reacciones positivas se tornan azules y las negativas permanecen violetas. Panel inferior: Detección basada en fluorescencia utilizando el colorante Midori Green Advanced (MGA), visualizado bajo un transiluminador de luz azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Parámetros comparativos de rendimiento diagnóstico del método LAMP con y sin eliminación del inhibidor. Comparación de la sensibilidad general, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) en muestras de pescado, camarón y ostra contaminadas a los límites mínimos detectables (n = 10 ensayos por combinación especie/matriz, para un total de 150 ensayos). Las barras comparan muestras pretratadas con la mezcla optimizada de carbón activado-bentonita (ACB) frente a controles no tratados (sin eliminación del inhibidor). Los niveles de contaminación se establecieron en 150 UFC/g para V. cholerae en todas las matrices; 300 UFC/g para V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. vulnificus en ostra; y 76 UFC/g en pescado y camarón. El pretratamiento con ACB restauró con éxito todos los parámetros diagnósticos a ≥90% en todas las matrices. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Sensibilidad y especificidad específicas para cada diana del método ACB-LAMP optimizado en diferentes matrices de mariscos. Rendimiento diagnóstico individual de V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus en muestras de pescado, camarón y ostra (n = 10 pruebas por combinación diana/alimento) pretratadas con ACB. La especificidad alcanzó el 100 % para todas las dianas debido al diseño de cebadores específicos de especie dirigidos a los genes gyrB, ompW, tlh y vvhA. La sensibilidad alcanzó el 100 % en matrices de pescado y camarón, con una ligera disminución al 90 % observada en las ostras debido a la alta complejidad basal de la matriz orgánica que interfiere con la reacción. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Tabla 1: Cebadores utilizados en ensayos de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). Descripción de los cebadores internos directos e inversos (FIP, BIP), cebadores externos (F3, B3) y cebadores de bucle (LF, LB) diseñados para el reconocimiento específico de especies de V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA) y V. cholerae (ompW). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Tabla de contingencia para evaluar los parámetros de rendimiento diagnóstico del método LAMP. Configuración matricial estándar de 2x2 utilizada para clasificar y resumir los verdaderos positivos (VP), verdaderos negativos (VN), falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN) con el fin de calcular la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) en muestras de mariscos enriquecidas y no enriquecidas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Archivo suplementario 1: Conjuntos de datos brutos que respaldan los hallazgos de este estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Este estudio establece condiciones optimizadas para aumentar la sensibilidad de la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) en la detección de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. vulnificus en muestras de mariscos contaminados. Al omitir la etapa tradicional de pre-enriquecimiento, el tiempo diagnóstico se reduce significativamente, ofreciendo un enfoque altamente eficiente y rápido para identificar directamente patógenos en productos pesqueros.
Una mejora metodológica clave en este estudio es la optimización del paso de eliminación del inhibidor. Las metodologías previas utilizaban un pH de 4 antes de la amplificación.21; sin embargo, esto dio como resultado una recuperación nula de cepas de Vibrio, principalmente porque Vibrio las especies son altamente sensibles a ambientes ácidos26. Para abordar esto, se modificaron sistemáticamente las condiciones con el fin de mejorar simultáneamente la recuperación celular y eliminar los inhibidores de reacción que ocurren naturalmente. Resultó ser la condición óptima resuspender el carbón activado con bentonita (ACB) en una solución tampón a pH 6, seguido de una agitación de 15 minutos con la muestra. Esta modificación maximiza la repulsión electrostática entre las bacterias y el ACB al aproximarse al punto isoeléctrico de la membrana bacteriana.21,27,28, minimizando así la pérdida de células diana. En consecuencia, esta mejora metodológica produjo una sensibilidad de detección 2 a 50 veces mayor que la de muestras procesadas sin tratamiento con ACB.
A diferencia de estas mejoras metodológicas, la implementación exitosa de este protocolo puede requerir una solución explícita de problemas si surgen dificultades comunes. Un problema frecuente durante la implementación es la eliminación incompleta de materia orgánica, lo cual puede interferir con la polimerasa y reducir la sensibilidad de la LAMP, particularmente en matrices altamente contaminadas. Si falla la amplificación o disminuye la sensibilidad, el primer paso para la solución de problemas debe consistir en verificar el pH de la mezcla de muestra con ACB; desviaciones del pH 6 pueden provocar la muerte celular (si es demasiado ácido) o una absorción insuficiente de inhibidores. Además, si ocurren falsos negativos a pesar de un tratamiento adecuado con ACB, los investigadores deben asegurarse de que el tiempo de contacto no exceda los 15 minutos, ya que una exposición prolongada puede provocar la retención involuntaria de células diana por la matriz. Para la detección a simple vista, los cambios de color ambiguos pueden resolverse asegurando la eliminación completa de los iones calcio de la matriz, ya que de lo contrario podrían interferir con la precipitación de pirofosfato de magnesio en el ensayo de LAMP.
Este trabajo informa, por primera vez, la identificación de Vibrio spp. en muestras de pescado utilizando el método LAMP en combinación con un tratamiento previo con ACB. Esta investigación impulsa el campo científico al establecer un método rápido, confiable y rentable para la identificación de productos pesqueros.13,19,23,29. Si bien la PCR convencional representa un enfoque alternativo para probar esta hipótesis, la alta especificidad y los valores predictivos obtenidos aquí demuestran que el ensayo ACB-LAMP es una opción superior. Una ventaja metodológica fundamental de esta técnica es su independencia de equipos sofisticados y costosos, como termocicladores, cámaras de electroforesis y transiluminadores.9,30. Además, la detección visual de los resultados vía el azul de hidroxinaftol simplifica significativamente la interpretación de los datos.
A pesar de la alta sensibilidad y especificidad alcanzadas, se observa una limitación notable del estudio en matrices con alta contaminación basal, como las muestras de ostra. En estos casos, el sistema ACB no puede eliminar por completo todas las sustancias orgánicas interferentes, lo que disminuye ligeramente la sensibilidad del ensayo en comparación con muestras de pescado o camarón. Por último, las aplicaciones potenciales de este método destacan su utilidad para el monitoreo rutinario y de alto rendimiento en la industria alimentaria, con el fin de prevenir infecciones relacionadas con Vibrio. Las líneas futuras deben priorizar la automatización de la extracción de ADN y de la eliminación del inhibidor ACB. La automatización de estos pasos metodológicos clave constituye una ventaja fundamental que reducirá significativamente el tiempo de manipulación, minimizará los errores humanos y estandarizará las variables de solución de problemas, facilitando así la aplicación a gran escala de esta técnica en laboratorios industriales de control de calidad.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Carbón activado | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonita | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaina | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transiluminador Bio-Image Systems | Bio-Image Systems | MBE-CP-01 | |
| Polimerasa Bst de ADN | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrífuga (modelo J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| Mezcla de dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Azul de hidroxinaftol | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Software de análisis MS 1D | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Espectrofotómetro (modelo 6300) | Jenway | 630531 | |
| Circulador Stomacher (modelo 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae no O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Papel Whatman | Whatman | 1001-055 |
Referencias
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
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