Presentamos un protocolo para utilizar una plataforma microfluídica con el fin de modelar las interacciones tumor-inmunitarias en un entorno tridimensional (3D). Nuestros resultados revelaron que las células asesinas naturales (NK) conservaron su actividad antitumoral bajo compresión mecánica.
Artículo de método
Una plataforma microfluídica para estudiar las funciones de la compresión mecánica en las interacciones entre células tumorales y células inmunitarias en una matriz extracelular 3D
En este artículo
Resumen
Resumen
Las fuerzas mecánicas influyen significativamente en la capacidad de las células inmunitarias para matar células tumorales en el contexto de la inmunoterapia basada en células. Para destruir células tumorales, las células inmunitarias deben ejercer fuerzas sobre la célula diana y formar una sinapsis inmunitaria, a través de la cual se liberan moléculas citotóxicas, incluida la granzima B. A pesar de su importancia, aún se comprende poco cómo las señales mecánicas pueden aprovecharse para potenciar la muerte mediada por el sistema inmunitario. Esta brecha en el conocimiento se debe en parte a la falta de herramientas capaces de proporcionar un estrés mecánico bien controlado a cultivos celulares en un entorno fisiológicamente realista. Aquí describimos un dispositivo de compresión microfluídico que puede aplicar compresión estática o dinámica a esferoides tumorales incrustados en matriz extracelular (ECM), permitiendo al mismo tiempo la obtención de imágenes en tiempo real de las interacciones tumor-inmunitarias mediante microscopía óptica.
La plataforma microfluídica consta de 12 compartimentos (6 de control y 6 funcionales). Cada compartimento contiene una cámara celular posicionada directamente debajo de la unidad de control de presión. Los esferoides embebidos en la MEC se colocan dentro de la cámara celular. Mediante esta plataforma, investigamos la eficiencia de destrucción de las células asesinas naturales (NK) frente a esferoides tumorales de mama (MCF-7) bajo compresión mecánica definida. Los resultados mostraron que las células NK permanecieron como los principales impulsores de la muerte de los esferoides tumorales, independientemente de la compresión mecánica en colágeno al 1,5 mg/mL. Por lo tanto, se sugiere que las células NK pueden mantener su actividad antitumoral bajo estrés compresivo. Estos hallazgos demuestran la utilidad de esta plataforma para investigar el papel de las fuerzas mecánicas en las interacciones tumor-inmunitarias. Estudios en curso están identificando los mecanismos moleculares que permiten a las células inmunitarias adaptarse al estrés compresivo. Los conocimientos obtenidos de estos estudios podrían revelar una vía terapéutica prometedora.
Introducción
La inmunoterapia contra el cáncer basada en células es un enfoque terapéutico que utiliza células inmunitarias para atacar células cancerosas1. Esta estrategia ha demostrado un éxito notable en el tratamiento de los cánceres de la sangre2,3,4. Sin embargo, el nivel de éxito observado en los cánceres de la sangre aún no se ha trasladado completamente al tratamiento de tumores sólidos5,6,7. Una razón importante de esta limitación es el microentorno tumoral inmunosupresor (TME) específico de los tumores sólidos.
El ME se caracteriza por señales mecánicas distintas que pueden regular el comportamiento celular. La eliminación eficaz de células tumorales por parte de células inmunitarias requiere que estas ejerzan fuerzas sobre las células diana y establezcan una sinapsis inmunitaria a través de la cual se entregan moléculas citotóxicas8. Por lo tanto, comprender cómo las fuerzas mecánicas influyen en la función de las células inmunitarias podría revelar nuevas estrategias terapéuticas para mejorar la eficacia de las inmunoterapias basadas en células contra tumores sólidos.
Una característica mecánica definitoria del microambiente tumoral sólido (TME) es el estrés compresivo que este impone sobre el tumor en crecimiento9,10. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios sobre compresión se han centrado en los efectos sobre el comportamiento de las células tumorales10,11. Solo recientemente se ha comenzado a prestar atención a cómo la compresión influye en las células inmunitarias dentro del TME12. Como resultado, los mecanismos mediante los cuales el estrés compresivo afecta la migración de las células asesinas naturales (NK), la formación de la sinapsis inmunitaria y la actividad citotóxica siguen siendo poco comprendidos e insuficientemente cuantificados. Esta laguna representa una limitación crítica en nuestra comprensión de cómo las señales mecánicas dentro del TME pueden aprovecharse para mejorar el ataque inmunitario contra tumores sólidos.
Una barrera importante para abordar esta pregunta es la falta de plataformas experimentales que puedan aplicar compresión controlada y cuantificable dentro de microentornos tridimensionales fisiológicamente relevantes, al tiempo que permitan la obtención de imágenes en tiempo real de las interacciones tumor-inmunitarias. Los primeros enfoques experimentales para estudiar el estrés compresivo implicaron el encapsulado de esferoides en geles de agarosa13. Aunque este método capturó eficazmente el confinamiento físico, eliminó las interacciones nativas entre la matriz extracelular (ECM) y las células. Dolega et al. aplicaron presión osmótica para inducir estrés compresivo; sin embargo, los esferoides se mantuvieron en suspensión en medio de cultivo y, por lo tanto, carecieron de interacciones con la ECM9. Pandey et al. utilizaron un inserto tipo transwell y pesas para comprimir esferoides embebidos en colágeno, lo que preservó las interacciones entre la ECM y las células, pero limitó la obtención de imágenes de alta resolución necesaria para cuantificar la motilidad de las células inmunitarias y su actividad citotóxica14. En conjunto, estas limitaciones destacan la necesidad de plataformas experimentales que permitan la obtención de imágenes en tiempo real de las respuestas morfológicas de las células frente a la compresión dentro del microambiente tumoral (TME).
Aquí presentamos un protocolo para un dispositivo de compresión microfluídico15 que permite la aplicación controlada de estrés compresivo manteniendo interacciones fisiológicamente relevantes entre la matriz extracelular y las células, y facilitando imágenes en vivo de alta resolución de la dinámica inmune-tumoral. El protocolo consta de la preparación de los componentes del dispositivo (Sección 1), el ensamblaje del dispositivo (Sección 2) y la obtención de imágenes de las interacciones tumor-inmunitarias (Sección 3). Demostramos el procedimiento utilizando un ensayo de lisis por células asesinas naturales (NK) frente a esferoides tumorales marcados con proteína verde fluorescente (GFP). Más allá de esta aplicación, la plataforma puede adaptarse fácilmente para investigar los efectos de las fuerzas mecánicas sobre una amplia variedad de tipos celulares e interacciones celulares en microentornos tridimensionales.
Protocolo
1. Preparación de los componentes del dispositivo
- Activación de la superficie de la cámara de carga de la muestra
- Coloque una máscara sobre la cámara de carga de muestras (Capa 1, L1) de manera que solo queden expuestos los pocillos.
- Exponga la capa 1 enmascarada al plasma de oxígeno durante 15 s utilizando la configuración de alta potencia (45 W).
- Coloque la Capa 1 en una placa de Petri y continúe luego con los siguientes pasos en una cabina de seguridad biológica.
- Tratar cada pocillo con 10 µL de polietilenimina (PEI) al 1 % durante 10 min.
- Retire el PEI de los pocillos mediante aspiración al vacío desde las cuatro esquinas de cada pocillo para evitar rayar la superficie de vidrio.
- Lave los pocillos con 10 µL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego elimine la solución de lavado mediante aspiración al vacío desde el lateral.
- Tratar los pocillos con 10 µL de glutaraldehído al 0,1 % durante 30 min, luego elimine el glutaraldehído mediante aspiración al vacío desde las esquinas.
- Lave los pocillos con PBS tres veces, eliminando el lavado de las esquinas después de cada lavado.
- Envuelva la placa de Petri que contiene la Capa 1 con papel de aluminio y déjela en el gabinete de seguridad biológica durante la noche.
- Esterilización del marco metálico
- Sumerja el disco de 38 mm × Marco metálico de 88 mm y los doce tornillos de cabeza cilíndrica M2.5 en etanol al 70 % durante toda la noche.
- Cebado de la unidad de control de presión
- Exponga la unidad de control de presión al plasma de oxígeno durante 30 s utilizando la configuración de alta potencia (45 W).
- Sumerja la unidad de control de presión, con las características orientadas hacia abajo, en agua desionizada (DI) durante la noche para llenar los canales y las cámaras de la unidad de control de presión.
- Al día siguiente, retire la unidad de control de presión del agua desionizada en la que estaba sumergida.
- Llene un reservorio microfluídico con 50 mL de agua desionizada.
NOTA: El depósito microfluídico consiste en un tubo cónico de 50 mL equipado con una tapa personalizada que contiene dos conexiones para tubos: una línea de tubo neumático y una línea de tubo para la administración de fluidos. - Conecte una jeringa llena de aire a la línea de tubo neumático.
- Presione lentamente el émbolo de la jeringa para presurizar el depósito y hacer pasar agua desionizada a través del tubo de suministro de líquido hasta que el tubo esté completamente lleno y comience a gotear agua por el extremo del tubo.
- Conecte el tubo de suministro de fluido precargado y goteante a través del colector de policarbonato y luego a la entrada de 1,5 mm ubicada en la parte trasera de la unidad de control de presión.
- Deje que la unidad de control de presión y el conjunto del múltiple se sequen al aire durante 2 h. Una vez completamente secos, la unidad de control de presión y el conjunto del múltiple están listos para el siguiente paso.
2. Ensamblar el dispositivo
- Preparación de colágeno con células embebidas
- Retire y seque el marco metálico y los tornillos del 70 % de etanol.
- En la cabina de seguridad biológica, coloque tres microtubos de 600 µL sobre hielo. Etiquete los tubos de la siguiente manera: «N» (neutralización), «sp» (esferoides de MCF-7) y «sp+NK» (esferoides de MCF-7 con células NK).
- Prepare la mezcla de neutralización añadiendo 10× el volumen requerido de Medio 199 (M199) e hidróxido de sodio (NaOH) al tubo «N».
- Transfiera el volumen adecuado de la mezcla M199:NaOH a los tubos «sp» y «sp+NK» para obtener una concentración final de 1×.
- Recupere los esferoides tumorales y centrifugue a 141 × g durante 3 min para permitir que los esferoides se sedimenten en el fondo del tubo.
NOTA: Los esferoides tumorales de aproximadamente 200 µm de diámetro se generaron utilizando una plataforma de micropozos de agarosa descrita previamente16. En resumen, se sembraron 3 × 106 células MCF-7 en una matriz de micropozos de agarosa de 36 × 36, compuesta por pozos de 200 µm de diámetro y 200 µm de profundidad, y luego se cultivaron durante 7 días para producir los esferoides tumorales utilizados en los experimentos. - Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda los esferoides en 200 µL de medio completo 50:50 MCF-7/NK (Tabla 1 y Tabla 2).
- Recoja las células NK en un tubo cónico de 50 mL, centrifugue a 141 × g durante 4 min y cuente las células.
NOTA: La viabilidad de las células NK debe ser >85 % el día del experimento. - Resuspenda el precipitado resultante en 200 µL de medio completo para células NK.
- Añada el volumen adecuado de la solución stock de colágeno a cada tubo microcéntrifugo.
- Añada el volumen apropiado de suspensión celular a cada tubo para obtener un volumen final de 200 µL que contenga colágeno al 1,5 mg/mL.
NOTA: La suspensión «sp» contiene solo esferoides tumorales, mientras que la suspensión «sp+NK» contiene esferoides tumorales y 1,5 × 106 células NK. - Mezcle suavemente mediante pipeteo para asegurar una distribución uniforme de células y colágeno, minimizando la formación de burbujas.
- Ensamblaje del dispositivo y carga celular
- Coloque la Capa 1 dentro del marco metálico seco.
- Cargue 9 µL de la mezcla de colágeno en cada pozo.
- Alinee la unidad de control de presión y el ensamblaje del colector con las cámaras celulares en la Capa 1 utilizando un microscopio.
- Inserte los tornillos secos a través del colector y dentro del marco metálico, asegurando la unidad de control de presión y la Capa 1 entre el colector y el marco metálico.
- Coloque el dispositivo ensamblado en un incubador a 37 °C y 5 % de CO₂ durante 45 min para permitir la polimerización del colágeno.
- Añada medio completo de cultivo celular 50:50 MCF-7/NK a través de los cuatro puertos de medio.
3. Imagen de las interacciones tumor-inmunitarias
- Coloque el dispositivo ensamblado dentro del incubador de platina montado en un microscopio de epifluorescencia invertido para la obtención de imágenes de células vivas.
NOTA: El incubador de platina mantuvo una temperatura de 37 °C y una humedad de aproximadamente 50 % durante toda la duración de la adquisición de imágenes. - Coloque una caja de alojamiento secundaria sobre el dispositivo ensamblado para mantener el ambiente interno a 37 °C, 100 % de humedad y 5 % de CO₂ durante todo el período de imagen.
- Conecte el dispositivo al controlador de presión utilizando el tubo neumático.
- Adquiera imágenes de campo claro y GFP de los esferoides tumorales antes de aplicar compresión, para permitir la evaluación de la deformación del esferoide tras la compresión.
- Aplique una presión constante de 120 mbar durante todo el período de imagen.
NOTA: El software del controlador de presión permite al usuario definir el perfil y la magnitud de la presión aplicada durante el experimento. Supplementary Figure 1 contiene un esquema del sistema de control de presión. - Inicie la adquisición de imágenes con lapso de tiempo obteniendo imágenes de campo claro y GFP cada 10 minutos durante 18 horas.
NOTA: Las imágenes se adquirieron en el plano Z central de cada esferoide tumoral utilizando un objetivo de 20× en un microscopio de epifluorescencia invertido. Las imágenes de campo claro y de fluorescencia GFP se capturaron con tiempos de exposición de 200.1 ms y 298.9 ms, respectivamente.
Resultados
Para los siguientes experimentos, se utilizó un dispositivo microfluídico de compresión15 para modelar interacciones tumor-inmunes dentro de un microentorno tridimensional fisiológicamente relevante, y al mismo tiempo, puede aplicar compresiones estáticas y dinámicas a esferoides tumorales (Figura 1). Los componentes del dispositivo (Figura 1A1) y su orden de ensamblaje (Figura 1A2) se muestran en la Figura 1A. El marco metálico sirve como base del dispositivo, con la capa de cámara celular (L1) colocada dentro del marco. La unidad de control de presión, compuesta por L2 y L3 unidas mediante enlace por plasma, se coloca encima de L1, seguida por el colector (Figura 1A2). Juntos, L1 y la unidad de control de presión forman el dispositivo microfluídico funcional y quedan sujetos entre el marco metálico y el colector mediante tornillos. El colector contiene puertos de entrada para tubos fluidos que suministran presión al dispositivo, así como reservorios de medio que facilitan experimentos de imagenología en tiempo real de células vivas a largo plazo.
Figura 1: Dispositivo de compresión microfluídico para estudios de interacciones entre células inmunitarias y esferoides tumorales bajo compresión mecánica. (A1) Fotografía de los componentes necesarios para el ensamblaje del dispositivo, mostrados de izquierda a derecha: colector, unidad de control de presión (L2 + L3), capa de la cámara de células (L1) y marco metálico. (A2) Esquema tridimensional de los componentes del dispositivo, mostrados de arriba hacia abajo: colector, unidad de control de presión (L2 + L3), capa de la cámara de células (L1) y marco metálico. Las capas de PDMS L2 y L3 están unidas por plasma para formar la unidad de control de presión, que se coloca encima de la cámara de células. El colector y el marco metálico aseguran el dispositivo ensamblado. (B1) Esquema de corte transversal de una unidad de compresión antes y después de la compresión. Esferoides tumorales embebidos en matriz extracelular (ECM) y células NK se colocan en la cámara de células. La distancia inicial entre la parte inferior de L1 y la parte inferior de L2 antes de la compresión se denota como h. Al aplicar presión a la unidad de control de presión, L2 se desplaza hacia abajo, haciendo que el pistón de PDMS comprima el esferoide tumoral. El desplazamiento descendente de L2 tras la compresión se denota como Δh. (B2) Imágenes superpuestas de campo brillante y GFP de un esferoide tumoral MCF-7 con células NK antes (izquierda) y después (derecha) de la compresión. Las células MCF-7 están marcadas con GFP, mientras que las células NK no están marcadas. Células NK representativas están circuladas en azul, mientras que contornos amarillos marcan los periferias de los esferoides tumorales. Barra de escala = 50 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una vez ensamblado, el dispositivo microfluídico de compresión puede utilizarse para comprimir esferoides tumorales como se ilustra en la Figura 1B. Aquí, los esferoides tumorales embebidos en colágeno con células NK se introducen en la cámara celular (L1). Al aplicar presión a la cámara de presión (L3), la capa de membrana deformable (L2) se desvía hacia abajo, haciendo que el pistón de polidimetilsiloxano (PDMS) transmita fuerzas compresivas al esferoide. La cámara de presión se controla mediante una fuente de presión externa. Otros detalles adicionales sobre el diseño, la fabricación y la caracterización del dispositivo microfluídico de compresión han sido publicados previamente en otro estudio15.
Definimos la distancia entre la parte inferior de la cámara de la célula (L1) y la parte inferior de la membrana deformable (L2) como h (Figura 1B1, panel izquierdo). Antes de la compresión, esta distancia es de 200 µm. Al aplicar presión de fluido a la unidad de control de presión, la membrana deformable se desvía hacia abajo, reduciendo la distancia h en Δh (Δh; Figura 1B1, panel derecho) y comprimiendo así el esferoide tumoral embebido en colágeno. En este sistema, la deformación compresiva se define como Δh/h, donde h es la distancia inicial entre L1 y L2 antes de la compresión, y Δh es el desplazamiento hacia abajo de L2 tras la compresión. El desplazamiento de la membrana fue calibrado previamente mediante la visualización de microesferas fluorescentes adheridas al fondo de L2. En un estudio previo se puede encontrar una descripción detallada del procedimiento de calibración y del cálculo de la deformación compresiva17. Un ejemplo de curva de calibración se muestra en la Figura Suplementaria 2.
Figura 1B2 muestra imágenes representativas combinadas de campo claro y GFP de un esferoide MCF-7 con células NK incrustadas en colágeno 1,5 mg/mL antes (panel izquierdo) y después de la compresión (panel derecho). Los límites del esferoide tumoral se destacaron en amarillo. Tras la compresión, el esferoide mostró un aumento en el área proyectada, lo que indica deformación en respuesta a la aplicación exitosa de carga mecánica. Para todos los experimentos presentados en este manuscrito, utilizamos una deformación por compresión de Δh/h = 50%. Cabe señalar que el diámetro del esferoide varía entre 140 µm y 200 µm. Esto significa que la deformación por compresión real sobre el esferoide es ligeramente menor que el 50%. Vídeo Suplementario 1 y Vídeo Suplementario 2 muestran pilas Z-X-Y representativas adquiridas en el canal de fluorescencia GFP de un esferoide MCF-7 incrustado en colágeno 1,5 mg/mL antes y después de la aplicación de la deformación compresiva del 50%, respectivamente.
El dispositivo microfluídico de compresión se utilizó para investigar los efectos de las células NK, la compresión y su combinación sobre la muerte de esferoides tumorales (Figura 2). Esto es posible gracias al diseño del dispositivo, que contiene 12 pocillos de cultivo. De estos pocillos, seis pueden someterse a compresión, mientras que los otros seis sirven como controles sin compresión. Esta configuración permite cuatro condiciones experimentales (Figura 2A): esferoides solos sin compresión (sp), esferoides con células NK pero sin compresión (+NK), esferoides sometidos a compresión (+comp) y esferoides expuestos tanto a compresión como a células NK (+comp+NK).
Figura 2: La compresión mecánica modula la eliminación de esferoides tumorales mediada por células NK. (A) Imágenes de fluorescencia con lapse de tiempo de esferoides MCF-7 embebidos en colágeno 1,5 mg/mL bajo cuatro condiciones: control solo con esferoide (sp), esferoides con células NK (+NK), esferoides con compresión (+comp) y esferoides con compresión y células NK (+comp+NK). La fluorescencia GFP marca células tumorales MCF-7 viables. El contorno amarillo indica la región de interés (ROI), definida mediante la imagen a las 18 h y aplicada a todos los puntos temporales para la cuantificación de la fluorescencia. Se midió la intensidad total de fluorescencia GFP dentro de la ROI y se utilizó para el análisis posterior. Barra de escala = 50 µm. (B) Intensidad total de fluorescencia GFP de un esferoide a lo largo del tiempo bajo 4 condiciones. Cada línea de color representa la intensidad total de fluorescencia de un único esferoide, normalizada respecto a su intensidad inicial en t = 0. La línea negra corresponde al ajuste polinómico de segundo orden de los datos de intensidad de fluorescencia agrupados procedentes de 7 esferoides cultivados en la condición de control y se utilizó como referencia para calcular la pérdida de células tumorales en (C).C) La pérdida normalizada de GFP para las condiciones +comp, +NK y +comp+NK se calculó restando la intensidad de GFP en t = 18 h de cada esferoide respecto a la línea de referencia de esferoide solo (sp). Por lo tanto, cada punto de datos representa la pérdida normalizada de GFP de un único esferoide. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los efectos de las células NK, la compresión y su combinación sobre los esferoides tumorales pueden visualizarse en las imágenes representativas de esferoides MCF-7 en colágeno al 1,5 mg/mL (Figura 2A). Dado que las células MCF-7 utilizadas para generar los esferoides tumorales estaban marcadas con GFP, la viabilidad tumoral pudo monitorizarse mediante los cambios en la fluorescencia de GFP. Se adquirieron imágenes de GFP y de campo brillante cada 10 minutos durante 18 horas utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia. Cabe destacar que los esferoides sometidos a compresión presentaron un área proyectada mayor que los esferoides sin compresión, lo que confirma la transmisión exitosa de la carga mecánica desde la membrana deformable al esferoide tumoral. Con el tiempo, se observó una pérdida progresiva de la fluorescencia de GFP en las condiciones +NK y +comp+NK (Figura 2A), lo que indica la eliminación de células tumorales mediada por células NK.
Utilizamos la pérdida de la fluorescencia GFP como medida de la muerte celular tumoral. Las células MCF-7 marcadas con GFP utilizadas en este estudio se generaron mediante transducción lentiviral. En resumen, se utilizó un vector lentiviral para introducir un casete de expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (eGFP) controlado por el promotor del factor de elongación-1α (EF1α), junto con un gen de resistencia a puromicina controlado por el promotor del virus de la sarcoma de Rous (RSV). Tras la infección, los casetes de expresión lentiviral se integraron en el ADN genómico de las células MCF-7, lo que resultó en una expresión estable de GFP. Posteriormente, se utilizó la selección con puromicina para eliminar las células no transducidas. El marcado con GFP de las células MCF-7 permitió cuantificar la viabilidad de las células tumorales mediante el seguimiento de los cambios en la intensidad de la fluorescencia GFP a lo largo del tiempo (Figura 2B). Se ha establecido previamente una fuerte correlación entre la pérdida de fluorescencia GFP y marcadores reconocidos de muerte celular, incluyendo el marcador vitalicio/muerte propidio yoduro (PI) y el marcador de apoptosis anexina-V, lo que valida la pérdida de fluorescencia GFP como una medida sustituta de la muerte celular tumoral.18
Para cuantificar los efectos de las cuatro condiciones experimentales sobre la viabilidad tumoral, se midió la intensidad total de fluorescencia GFP de cada esferoide tumoral en cada punto temporal, se restó el fondo y se normalizó respecto al valor inicial (Figura 2B). La fluorescencia total del esferoide se calculó dentro de una región de interés (ROI) predeterminada. Esta ROI se obtuvo delineando manualmente el contorno del esferoide tumoral en la imagen de 18 h (contorno amarillo en el panel de 18 h, Fig. 2A) mediante un script personalizado en MATLAB. Luego, se calculó la intensidad total de fluorescencia dentro de esta ROI para cada punto temporal y se corrigió restando la fluorescencia de fondo promedio medida a partir de una ROI separada seleccionada en otra parte de la imagen. Los valores de fluorescencia corregidos por fondo resultantes se normalizaron posteriormente respecto a la intensidad de fluorescencia inicial del esferoide.
Cada curva de color representa la intensidad normalizada de GFP de un esferoide individual bajo una condición experimental específica en la Figura 2B. La curva se obtiene mediante un ajuste polinómico de segundo orden a los datos experimentales. Las curvas púrpuras representan esferoides sometidos únicamente a compresión (+comp, Figura 2B), las curvas rojas representan esferoides con células NK (+NK, Figura 2B), y las curvas azules representan esferoides expuestos tanto a compresión como a células NK (+comp+NK, Figura 2B). En contraste, la curva negra es el ajuste polinómico de segundo orden a los datos de siete esferoides cultivados bajo la condición de solo esferoide, que sirve como control (sp, Figura 2B). En la Figura 2B, solo se presentan los datos ajustados mediante polinomios, pero no los puntos de datos experimentales, por claridad. Nótese que la intensidad de fluorescencia GFP de las condiciones de solo esferoide (sp) y esferoide + compresión (+comp) mostró una tendencia general ascendente a lo largo del tiempo (Figura 2B), lo que es consistente con un crecimiento tumoral continuo o la mantenimiento de la viabilidad. En contraste, las condiciones +NK y +comp+NK mostraron una disminución progresiva en la intensidad de fluorescencia GFP (Figura 2B), lo que indica muerte de células tumorales.
Se cuantificó la pérdida acumulativa de células tumorales restando la intensidad ajustada de fluorescencia GFP normalizada de cada esferoide bajo una condición dada (+comp, +NK o +comp+NK) respecto a la condición control a las 18 h (Figura 2C). Como resultado, cada punto de datos representa la pérdida normalizada de GFP de un esferoide individual en relación con el control de solo esferoide (Figura 2C). Por consiguiente, la condición +comp refleja la pérdida de GFP resultante únicamente de la compresión (púrpura, Figura 2C), la condición +NK refleja la pérdida de GFP debida únicamente a las células NK (rojo, Figura 2C), y la condición +comp+NK refleja la pérdida de GFP debida a los efectos combinados de la compresión y las células NK (azul, Figura 2C). La condición +comp mostró el menor grado de pérdida de GFP (Figura 2C), lo que sugiere que la compresión por sí sola tuvo un efecto mínimo sobre la viabilidad del esferoide. En contraste, tanto la condición +NK como la +comp+NK mostraron una pérdida significativamente mayor de GFP que la condición +comp (Figura 2C), lo que indica que las células NK son los principales factores responsables de la muerte celular tumoral. Aunque la condición +comp+NK mostró una pérdida media de GFP mayor que la condición +NK, esta diferencia no alcanzó significancia estadística (Figura 2C). Estos hallazgos sugieren que la compresión no afecta la capacidad de las células NK para inducir la muerte de células tumorales. En conjunto, estos resultados demuestran que el dispositivo microfluídico de compresión puede utilizarse con éxito para cuantificar los efectos independientes y combinados de la compresión y las células NK sobre la viabilidad de esferoides tumorales en un entorno tridimensional fisiológicamente relevante.
En contraste, pueden surgir resultados subóptimos cuando (1) los esferoides se encuentran fuera del límite del pistón, (2) los esferoides están posicionados demasiado cerca del límite del pistón, y (3) múltiples esferoides se localizan dentro de un diámetro de esferoide entre sí (Figura 3). En estos casos, los campos correspondientes deben excluirse del análisis.
Figura 3: Ejemplo representativo de una secuencia de imágenes de esferoides excluidos del análisis. Se muestran imágenes de lapso de tiempo de campo claro (BF), fluorescencia GFP e imágenes fusionadas de esferoides MCF-7 con células NK en colágeno al 1,5 mg/mL antes (columna izquierda) y después de la compresión (dos columnas derechas). Las imágenes previas a la compresión se adquirieron 20 min antes de aplicar presión y 10 min antes del inicio de la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Posteriormente, las imágenes se recopilaron cada 10 min durante 18 h, donde 0 h corresponde a la primera imagen adquirida inmediatamente después de la compresión y 18 h representa el final del experimento. La flecha azul indica el borde del pistón de PDMS (L2). Este campo de imagen fue excluido del análisis porque había dos esferoides dentro de la región de compresión y estaban demasiado cerca del límite del pistón. Como resultado, no fue posible cuantificar de forma confiable la deformación del esferoide ni la intensidad de la fluorescencia GFP durante la compresión. Barra de escala = 50 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(1) Los esferoides ubicados fuera del límite del pistón no experimentan compresión porque la presión se aplica únicamente dentro de la región del pistón. Por lo tanto, estos esferoides deben excluirse tanto de las condiciones comprimidas como de las de control. (2) Deben excluirse los esferoides posicionados sobre o cerca del límite del pistón (Figura 3, esferoide superior), ya que el esferoide está sometido a una carga mecánica no uniforme. (3) Deben excluirse los esferoides ubicados a una distancia menor o igual al diámetro de un esferoide respecto a esferoides vecinos (Figura 3). La proximidad cercana entre esferoides complica la cuantificación de la intensidad de fluorescencia de GFP porque la región de interés (ROI) se define utilizando el punto final del tiempo. Con el tiempo, los límites de los esferoides pueden volverse indistinguibles, lo que dificulta delimitar una ROI que abarque con precisión un solo esferoide. Estos problemas pueden minimizarse asegurando que los esferoides estén centrados dentro de la región de compresión durante la carga del dispositivo. Es fundamental prestar atención cuidadosa a la distribución, posición de los esferoides y configuración del dispositivo para lograr una compresión uniforme y generar resultados experimentales confiables y reproducibles.
| Componentes | Concentración |
| Medio α-MEM | |
| Suero bovino fetal (FBS) | 10% |
| Penicilina/estreptomicina | 1% |
Tabla 1: Medio completo para MCF-7.
| Componentes | Concentración |
| Medio α-MEM | |
| Myo-inositol | 0,2 mM |
| 2-mercaptoetanol | 0,1 mM |
| Suero bovino fetal (FBS) | 12,50% |
| Ácido fólico | 0,02 mM |
| Suero de caballo (HS) | 12,50% |
| Penicilina/estreptomicina | 1% |
Tabla 2: Medio completo para NK.
Figura suplementaria 1: Esquema del sistema de control de presión. Un compresor de aire suministra aire comprimido (hasta 20 psi) al controlador de presión. El controlador regula la presión de aire entregada al depósito de presión según los ajustes definidos por el usuario. El controlador tiene una presión máxima de operación de 200 mbar, una estabilidad de presión de 0,005 % de la escala completa (FS), una resolución de presión de 0,003 % FS y un tiempo de respuesta de 9 ms, lo que permite un control de presión preciso y reproducible. El controlador se conecta a una computadora mediante un bus serial universal (USB), lo que permite al usuario programar la magnitud y el perfil de la presión aplicada mediante el software suministrado. El software admite múltiples formas de onda de compresión, incluyendo compresión constante, sinusoidal, triangular y periódica. En este esquema, la presión se establece en 120 mbar, y el aire comprimido a esta presión se entrega al depósito presurizado a través del tubo neumático. El depósito presurizado contiene 50 mL de agua desionizada (DI) y sirve para convertir la presión neumática en presión fluida. Una vez presurizado, el depósito impulsa el fluido a través de un tubo de entrega hasta la unidad de control de presión del dispositivo microfluídico de compresión (véase Figura 1 para obtener detalles del dispositivo), donde la presión fluida se utiliza para aplicar compresión al esferoide tumoral. Téngase en cuenta que se utiliza presión de fluido para evitar burbujas de aire en el dispositivo de PDMS. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2: Curva de calibración para el dispositivo de compresión microfluídico que muestra la relación entre el desplazamiento del pistón (, µm) y la presión aplicada a la cámara de control de presión (KPa). Las mediciones experimentales están representadas por puntos, mientras que la línea continua corresponde a la simulación COMSOL. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM) a partir de ocho mediciones experimentales independientes, pero son demasiado pequeñas para ser visibles. Esta figura se reproduce de Suh et al.15 con permiso de la Royal Society of Chemistry. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Vídeo suplementario 1: Micrografía en z-stack X-Y de un esferoide de MCF-7 marcado con GFP antes de la compresión. El esferoide fue embebido en colágeno 1,5 mg/mL dentro del dispositivo microfluídico de compresión e imagenado mediante el canal de fluorescencia GFP con un paso z de 1 µm. Luego, se utilizó ImageJ para mejorar el contraste. Barra de escala = 50 µm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Vídeo suplementario 2: Se aplicó una deformación compresiva del 50 % (Δh/h = 50 %) al esferoide de MCF-7 marcado con GFP incrustado en colágeno 1,5 mg/mL. Tras la compresión, se adquirió un z-stack X–Y en el canal de fluorescencia GFP utilizando un tamaño de paso de 1 µm y se procesó en ImageJ para mejorar el contraste. Barra de escala = 50 µm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Este método describe el uso de un dispositivo microfluídico de compresión para investigar los efectos del estrés compresivo sobre las interacciones tumor-inmunitarias. Este sistema puede aplicar compresión mecánica controlada a esferoides tumorales embebidos en una matriz tridimensional de colágeno. El sustrato de vidrio que forma la base de la cámara celular (L1) permite imágenes en vivo de alta resolución, lo que hace que la plataforma sea adecuada para estudios destinados a cuantificar la motilidad, infiltración y actividad citotóxica de las células inmunitarias. Es importante destacar que el sistema preserva las interacciones célula-célula y célula-matriz al tiempo que permite un control preciso del entorno mecánico. En contraste, muchos enfoques experimentales existentes para estudiar el estrés compresivo requieren un compromiso entre las interacciones celulares mediadas por la MEC9,13 y el imagenológico de alta resolución14.
En el presente estudio, se utilizaron células NK y esferoides tumorales de mama MCF-7 como sistema modelo. Sin embargo, el dispositivo microfluídico de compresión no se limita a estos tipos celulares. Hasta la fecha, la plataforma se ha aplicado con éxito a múltiples modelos celulares de mama, incluyendo esferoides tumorales de mama MDA-MB-231 y esferoides de mama MCF-10A15,17. La plataforma puede adaptarse fácilmente para investigar interacciones tumor-inmunitarias en una variedad de otros modelos tumorales, incluyendo esferoides tumorales cerebrales y pulmonares. De manera similar, la plataforma es compatible con una amplia gama de poblaciones de células inmunitarias más allá de las células NK, lo que permite investigar diversas interacciones tumor-inmunitarias bajo compresión mecánica. Además, el dispositivo no se restringe a estudios basados en esferoides y puede adaptarse para experimentos con células individuales. En conjunto, estas características convierten a la plataforma en una herramienta versátil para examinar cómo las fuerzas mecánicas regulan el comportamiento celular en una amplia variedad de contextos biológicos y patológicos.
Otra ventaja de este sistema es el control preciso sobre la magnitud y el patrón de compresión aplicados a las muestras. En el presente estudio, se aplicó una deformación compresiva estática del 50 % durante toda la duración del experimento. Sin embargo, el nivel de deformación puede modificarse fácilmente según el objetivo experimental. Además, mediante el sistema de control de presión externo, se puede aplicar compresión dinámica con diversas formas de onda, incluyendo ondas cuadradas y ondas sinusoidales, a los esferoides. La compresión en forma de onda cuadrada implica intervalos alternos de compresión y liberación17, mientras que la compresión sinusoidal implica aumentos y disminuciones graduales de la compresión a lo largo del tiempo15. Estas capacidades, combinadas con imágenes cuantitativas y modelado predictivo, pueden utilizarse para estudiar la influencia de la compresión dinámica en la eficiencia de eliminación inmune.
Señalamos que este dispositivo de compresión fue desarrollado originalmente para caracterizar las propiedades mecánicas de tumores17. Al incorporar un sensor de fuerza in situ y una capa de gel de poliacrilamida (PAA) debajo del esferoide tumoral, las propiedades mecánicas del esferoide, como la rigidez y la viscoelasticidad, pueden caracterizarse cuantitativamente15,17. Esta modificación amplía la utilidad de la plataforma más allá de la modelización del estrés compresivo, para incluir la medición directa del comportamiento mecánico del tumor.
En general, el dispositivo de compresión microfluídico tiene una amplia gama de aplicaciones, desde la medición de las propiedades mecánicas de esferoides hasta la investigación de las interacciones tumor-inmunes en un entorno con modulación mecánica. Sin embargo, existen varios pasos críticos necesarios para el funcionamiento exitoso del dispositivo. Los esferoides tumorales deben colocarse cerca del centro de cada pocillo para garantizar una compresión uniforme. La unidad de control de presión debe alinearse correctamente con la capa de la cámara celular (L1) para asegurar una transmisión precisa de la presión. Pueden introducirse burbujas de aire cuando la unidad de control de presión se coloca encima de L1, lo cual puede afectar negativamente la calidad de la imagen y los resultados experimentales. Para prevenir este problema, debe tenerse cuidado de evitar la introducción de burbujas al cargar la mezcla de colágeno, y deben añadirse 8 µL de mezcla de colágeno a cada pocillo para llenar ligeramente en exceso la cámara antes de colocar la unidad de control de presión. Esto ayuda a garantizar un contacto completo entre las capas y reduce la probabilidad de atrapamiento de aire.
En conclusión, este dispositivo permite modelar de manera controlada el estrés compresivo dentro de una matriz tridimensional de colágeno fisiológicamente relevante que favorece las interacciones tumor-inmunitarias. Esta plataforma ofrece una herramienta para investigar cómo las fuerzas mecánicas estáticas y dinámicas regulan la eliminación inmunitaria y el comportamiento tumoral dentro del microambiente tumoral. Actualmente, estamos identificando el mecanismo molecular que subyace a la modulación mecánica de la eliminación inmunitaria de células tumorales. Estos estudios podrían conducir a posibles nuevos blancos terapéuticos farmacológicos.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención del Instituto Nacional del Cáncer (subvención R01CA221346), de la Beca Lance R. Collins del Colegio de Ingeniería de la Universidad de Cornell otorgada a FM, y del Fondo del Rector de Cornell para la Resiliencia en la Investigación otorgado a FM. Este trabajo se realizó en parte en la Instalación de Escala Nanométrica de Cornell, miembro de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología (NNCI), la cual recibe apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (subvención NNCI-2025233).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| NaOH 1 N | Sigma-Aldrich | 79724 | 7 µL |
| Medio M199 10× | Sigma-Aldrich | M0650 | 200 µL |
| 2-mercaptoetanol | ThermoFisher | 313500100 | |
| Compresor de aire | Elveflow | Jun-Air Model 3 Compressor | |
| Etapa microscópica automatizada X-Y | Applied Scientific Instrumentation | MS-2000 | |
| Cámara CCD | Hamamtsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Suero bovino fetal (FBS) | GeminiBio | S11150 | |
| Tubo para suministro de fluidos | Eleveflow | PTFE tubing spare roll | Diámetro exterior de 1/16 pulgadas |
| Fuente de luz de fluorescencia | Excelitas Technologies | X-Cite series 120 PC unit | |
| Ácido fólico | Sigma | F7876 | |
| Glutaraldehído | EM Sciences | 16019 | 0,10% |
| Limpieza de plasma Harrick | Harrick Plasma | PDC-001-HP | Configuración de alta potencia (45 W) |
| Suero de caballo (HS) | ThermoFisher | 16050-122 | |
| Microscopio invertido con epifluorescencia | Olympus | IX81 | Lente objetivo 20x (NA = 0,25), operado con el software Olympus CellSens |
| Máscara | Artus | 10 Sheet Aluminum Shim Stock | Grosor de 0,0125 pulgadas (0,75 mm) |
| Línea celular estable MCF-7/GFP (Puromicina) | GenTarget Inc | SC050-G | |
| Marco metálico | Hecho a medida | Hecho a medida | |
| Reservorio microfluídico | Eleveflow | 50 mL microfluidic reservoir | |
| Microscopio | Olympus | CKX41 | Lente objetivo 4x (NA = 0,1) |
| Mio-inositol | Sigma | I7508 | |
| NK-92 MI | ATCC | CRL-2407 | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | ThermoFisher | 10010072 | |
| Tubo neumático | Eleveflow | PUR polyether clear pipe input | Diámetro exterior de 4 mm |
| Polietilenimina (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 1% |
| Controlador de presión | Elveflow | OB1 NK4 | Operado con el software Elveflow Smart Interface |
| Colágeno tipo I de cola de rata | Corning | 354249 | 31,3 µL de colágeno stock a 9,6 mg/mL |
| Tornillos | Phillips | M2.5 Pan-head | 12 tornillos |
| Incubadora para platina | Precision Plastic | Hecho a medida | |
| Jeringa | Becton Dickinson | 303134 | Emparejada con un conector macho luer integral a barbijo de 3/32 pulgadas de diámetro exterior de Eleveflow |
| Medio α-MEM | ThermoFisher | 12561056 |
Referencias
- Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
- Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
- Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
- Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
- Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
- Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
- Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
- Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
- Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
- Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
- Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
- Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
- Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
- Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
- Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
- Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
- Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
- Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.
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