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Métodos optimizados para investigar la expresión de proteínas y transcritos durante el desarrollo en embriones de ratón completos

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11 de septiembre de 2026

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Cellular Imaging Core Facility, Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford

En este artículo

Resumen

Los modelos de ratón son fundamentales para avanzar en el entendimiento del desarrollo embrionario. Aquí, describimos un protocolo para teñir proteínas y transcritos en embriones de ratón fijados enteros, y cómo analizar cuantitativamente la tinción resultante en tres dimensiones. Estas técnicas permiten la visualización y el análisis de tipos celulares y procesos de desarrollo clave.

Resumen

Los modelos de ratón han sido fundamentales para avanzar en el entendimiento del desarrollo embrionario. Analizar la expresión y localización de proteínas y transcritos dentro de embriones es fundamental para elucidar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al desarrollo y a las enfermedades. Sin embargo, las técnicas tradicionales utilizadas para analizar transcritos y proteínas en embriones de ratón tienen limitaciones. La hibridación in situ de ARN permite la tinción en montaje completo de transcritos, pero carece de capacidad de multiplexión. Por el contrario, el corte en secciones de embriones permite la tinción de múltiples dianas, pero únicamente en dos dimensiones (2D). Más recientemente, se han aplicado técnicas como RNAscope y tinción por inmunofluorescencia a embriones en montaje completo, lo que permite la multiplexión de dianas en tres dimensiones (3D). Estos métodos permiten mapear interacciones clave, vías y tipos celulares necesarios para el desarrollo embrionario sin las limitaciones de las técnicas tradicionales.

Aquí describimos métodos optimizados para la tinción en montaje completo de embriones de ratón fijados en el día embrionario (E) 8,5 y E9,5, utilizando RNAscope o inmunofluorescencia. Ambos permiten la detección multiplexada de hasta 4 objetivos simultáneamente en un solo embrión. También proporcionamos un método para combinar la tinción por inmunofluorescencia con RNAscope en el mismo embrión, con el fin de visualizar la interacción entre proteínas y transcritos durante el desarrollo. Además, describimos una metodología para el análisis confocal y en 3D de la expresión de los objetivos en todo el embrión y dentro de tipos celulares en desarrollo definidos, utilizando el software Zeiss Arivis Pro. En conjunto, estos métodos permiten un análisis exhaustivo de objetivos multiplexados de proteínas y transcritos en 3D, ofreciendo un sistema potente para desentrañar las interacciones celulares y moleculares durante la embriogénesis temprana y media.

Introducción

Los modelos de ratón han sido fundamentales para impulsar el progreso en biología del desarrollo, ya que permiten comprender procesos del desarrollo humano relevantes in vivo gracias a la homología entre el desarrollo del ratón y el humano y a la posibilidad de modular la expresión génica mediante técnicas clave como Cre-LoxP o CRISPR/Cas91,2. Aproximadamente el 90 % de las regiones genómicas se conservan entre ratones y humanos3, y ambos comparten muchos procesos de desarrollo. Por ejemplo, tanto ratones como humanos siguen una cronología similar de embriogénesis, que incluye la formación de un cigoto que progresa hacia un blastocisto, seguido de la implantación y la gastrulación4. Además, el desarrollo de la mayoría de los órganos es similar entre ratones y humanos. Por ejemplo, tanto el corazón humano como el del ratón siguen una secuencia similar de plegamiento cardíaco, septación de aurículas y ventrículos, formación de válvulas y formación del tracto de salida para conformar un corazón de cuatro cámaras5. Por lo tanto, los corazones en desarrollo y completamente formados de ratón y humano presentan una similitud estructural significativa6,7.

Con el fin de investigar los procesos que ocurren en el desarrollo normal y patológico, se han desarrollado múltiples técnicas que permiten la visualización espacial de proteínas y transcritos clave. Dichas técnicas incluyen la tinción por inmunofluorescencia y la hibridación in situ de ARN.

La hibridación in situ de ARN fue descrita por primera vez por Gall y Pardue8 y por John, Brinstall y Jones en 19699, y por Buongiorno-Nardelli y Amaldi10 en 1970. Se utiliza para observar la expresión de transcritos en tejidos8. En resumen, se seleccionan sondas que contienen una secuencia complementaria de ARN al blanco deseado y se marcan con etiquetas para su detección. Dichas etiquetas incluyen marcas radiactivas, biotina o digoxigenina. Las muestras fijadas se permeabilizan para permitir la penetración de la sonda, y luego se hibrida la sonda con el tejido. Posteriormente, los tejidos pueden visualizarse directamente si están marcados radiactivamente, o las etiquetas pueden revelarse mediante anticuerpos conjugados a fosfatasa alcalina o a un colorante fluorescente. La hibridación in situ de ARN tiene la ventaja de poder teñir muestras en montaje completo para la localización tridimensional11. Sin embargo, generalmente está limitada por su capacidad de multiplexión a más de dos blancos, a menos que se utilicen técnicas optimizadas con aplicaciones muy específicas, o se emplee hibridación de ADN, como en el caso del M-FISH, que se utiliza para la marcación fluorescente de cromosomas12,13.

La inmunofluorescencia, desarrollada por primera vez en 1941 por Coons et al.14,15, es un método de detección de proteínas diana en muestras fijadas o congeladas. En resumen, las muestras se bloquean para reducir la unión no específica a áreas no diana del tejido. Luego, se incuba un anticuerpo primario específico para un antígeno diana con las muestras. Los anticuerpos primarios pueden estar directamente conjugados con un colorante o proteína fluorescente, o bien pueden ser reconocidos por un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo que reconoce la especie en la que se generó el anticuerpo primario. La ventaja del uso de anticuerpos secundarios frente a anticuerpos primarios directamente conjugados es que la señal se amplifica, lo que aumenta la sensibilidad. Se pueden utilizar múltiples anticuerpos primarios generados en diferentes especies para detectar simultáneamente varios objetivos, empleando anticuerpos directamente conjugados o anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos con diferentes espectros de excitación y emisión.

Las técnicas tradicionales, como la hibridación in situ de ARN y la inmunofluorescencia, tienen limitaciones. Por lo general, la hibridación in situ de ARN permite únicamente la detección de un solo blanco en una muestra, por lo que el estudio de interacciones entre diferentes tipos celulares y vías resulta extremadamente limitado. Además, tradicionalmente la inmunofluorescencia se realiza en secciones de tejido y no en preparaciones completas (whole-mount), lo que limita la resolución espacial a 2D. Técnicas más recientes se han centrado en la detección multiplex de blancos en sistemas 3D. La optimización de los protocolos de inmunofluorescencia ha permitido aplicar esta técnica en preparaciones completas16. Asimismo, se han desarrollado técnicas que permiten la detección multiplex de transcritos mediante el uso de sondas marcadas con fluoróforos, de manera similar a la inmunofluorescencia.

RNAscope fue descrito por primera vez en 2012 por Wang et al. Se basa en la tecnología de hibridación in situ de ARN17, que permite la identificación espacial de transcritos en muestras fijadas. En resumen, las muestras fijadas se permeabilizan, lo que permite la infiltración de sondas diana que se unen a secuencias complementarias de transcritos. Las sondas de RNAscope tienen un «diseño doble Z» compuesto por una región específica de una secuencia de 18–25 pares de bases del ARN diana, una región cola que contiene 14 pares de bases y una región espaciadora que une dos «sondas Z». Las dos regiones cola juntas forman una región de 28 pb a la que se une un preamplificador. Los pares de sondas Z unidas se amplifican luego mediante la unión de una secuencia de amplificadores que se fijan a sitios en el preamplificador. Los amplificadores pueden dirigirse específicamente utilizando sondas marcadas con indicadores fluorescentes o peroxidasa de rábano picante (HRP). La idea del diseño doble Z de las sondas es evitar la amplificación de sondas no unidas, reduciendo así la amplificación no específica, mientras que el uso de múltiples amplificadores tiene como objetivo aumentar la sensibilidad. La ventaja de RNAscope frente a la hibridación in situ de ARN es la capacidad de multiplexar la detección de transcritos en una sola muestra mediante el uso de marcadores fluorescentes distintos para cada diana. RNAscope se ha utilizado ampliamente en secciones de muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina, permitiendo la detección espacial de transcritos en 2D18. Estudios más recientes han descrito la tinción de RNAscope en montaje completo en embriones de ratón, permitiendo el análisis tridimensional de procesos clave del desarrollo19.

Aquí, describimos métodos optimizados para teñir embriones de ratón fijados de E8.5 y E9.5 en montaje completo utilizando tanto hibridación in situ con RNAscope como inmunofluorescencia. Este protocolo describe un método revisado para combinar inmunofluorescencia y RNAscope que resulta exitoso en embriones completos de E8.5/E9.5, permite añadir un canal adicional al tinción con RNAscope en montaje completo mediante la incorporación de un cuarto sonda de RNAscope combinada con el fluoróforo Opal 780, y detalla un método ampliamente aplicable para el análisis de embriones teñidos. Estos métodos pueden utilizarse para avanzar aún más en el conocimiento de procesos clave del desarrollo, como la migración celular y las vías de señalización, al permitir la visualización multiplexada de hasta cuatro dianas proteicas y de transcritos mediante tinción de inmunofluorescencia y RNAscope, así como el análisis cuantitativo tridimensional en embriones completos de ratón de E8.5/E9.5 durante el desarrollo.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron cumpliendo con la Ley de Animales del Reino Unido (Procedimientos Científicos) de 1986 y fueron aprobados por el comité de bienestar animal de la Universidad de Oxford y por el Ministerio del Interior (licencia de proyecto PP7967396).

1. Disección, deshidratación y almacenamiento de embriones de ratón E8.5 y E9.5

  1. Eliminar hembras preñadas utilizando un método aprobado en el día E8.5 o E9.5 de gestación.
    NOTA: En este estudio, los ratones se eliminaron mediante dislocación cervical seguida de confirmación de la muerte por exsanguinación. La exsanguinación se realiza mediante una incisión en los ventrículos, facilitando la hemorragia. Otros métodos, como la inhalación de CO2, pueden utilizarse, pero no fueron probados en este protocolo.
  2. Abrir el abdomen primero cortando la piel y luego la pared abdominal.
    NOTA: Limpiar los ratones con etanol al 70 % para reducir la descamación y la contaminación bacteriana. Al abrir la pared abdominal, es importante tirar de la pared lejos del abdomen y luego hacer una pequeña incisión. Cortar la pared abdominal en forma de V, evitando cortar accidentalmente el útero.
  3. Extraer el útero cortando donde este se une a la vagina. Para ambos cuernos uterinos, separar el útero de la grasa abdominal mediante pequeñas incisiones hasta alcanzar el ovario.
    NOTA: Es conveniente anotar la posición de cada embrión dentro del útero. Diseccionar el ovario junto con el útero para ayudar a mantener la orientación.
  4. Separar individualmente un solo embrión del cuerno uterino, dentro del útero que lo rodea, y colocarlo en una placa que contenga solución salina básica de Hanks 1× con 5 mM de EDTA.
  5. Usando pinzas finas, desprender suavemente el útero del embrión, la placenta y la decidua materna que los rodea.
  6. Identificar el punto donde la placenta se une a la parte de la decidua materna que rodea el embrión; debe haber una ligera diferencia de color entre estas dos secciones. Separar cuidadosamente el embrión cortando a través de la decidua materna para desconectar la placenta y revelar el embrión.
  7. Soltar suavemente el embrión dentro de su saco vitelino del tejido restante. Usando pinzas finas, retirar el saco vitelino que rodea al embrión. Eliminar el amnios. Contar los somitas para determinar la etapa embrionaria exacta.
    NOTA: El saco vitelino rodea al embrión y es más grueso y opaco. El amnios es delgado, transparente y se adhiere estrechamente al embrión. Debe retirarse cuidadosamente para garantizar la penetración posterior de sondas o anticuerpos. En embriones más avanzados, puede hacerse un pequeño orificio en la cabeza con pinzas finas para evitar que las sondas queden atrapadas en los ventrículos cerebrales en desarrollo. En este punto, es importante retirar la mayor cantidad posible de saco vitelino. El saco vitelino residual fluoresce intensamente cuando se utilizan anticuerpos secundarios anti-ratón.
  8. Opcional: Almacenar el saco vitelino para genotipificación lavándolo con 500 µL de PBS o etanol al 70 %, según el método de genotipificación posterior, en un tubo Eppendorf de 1,5 mL para eliminar la sangre contaminante. Sostener el saco vitelino en el PBS usando pinzas finas y agitar manualmente. Tomar el saco vitelino lavado y colocarlo en un tubo Eppendorf de 1,5 mL limpio o en una placa para genotipificación. Almacenar hasta 4 semanas a -20 °C o proceder a la técnica preferida de extracción de ADN.
  9. Usando una pipeta Pasteur de polietileno de baja densidad (LDPE) de 2 mL, pipetear suavemente el embrión y transferirlo a un tubo Eppendorf redondo de 2 mL que contenga 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 4 % recién preparado o congelado, teniendo cuidado de añadir la menor cantidad posible de medio de disección al PFA.
    NOTA: Al diseccionar embriones de E9.5, cortar el extremo de la pipeta Pasteur en ángulo para aumentar el tamaño de la abertura. Esto es importante para evitar dañar el embrión durante la pipetación. El uso de tubos Eppendorf redondos de 2 mL es fundamental para evitar que el embrión quede atrapado en el fondo del tubo y facilitar su recuperación. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación del PFA.
    ADVERTENCIA: El PFA es tóxico y carcinógeno. Usar equipo de protección personal (EPP) adecuado y no inhalar ni ingerir. El PFA en polvo es peligroso si se inhala; por lo tanto, debe prepararse en una campana extractora.
  10. Incubar el embrión en PFA al 4 % durante 16–24 h a 4 °C con agitación suave, colocando los tubos en ángulo recto respecto a la dirección de la agitación.
  11. Deshidratar el embrión mediante lavados en una serie de metanol. Usando pipetas Pasteur de LDPE y teniendo cuidado de no aspirar el embrión, retirar el PFA y añadir 1 mL de PBS. Lavar durante 10 min a temperatura ambiente (TA) con agitación suave, colocando los tubos a 90° respecto al plano de agitación. Repetir los lavados en 25 %, 50 %, 75 % y 2× 100 % de metanol en PBS.
  12. Reemplazar el último lavado con metanol al 100 % con 1,5 mL de metanol al 100 % fresco y almacenar a -20 °C.
    NOTA: Las muestras pueden almacenarse durante años a -20 °C. Tener cuidado de evitar la evaporación.
    ADVERTENCIA: El metanol es inflamable y tóxico. Usar EPP adecuado y almacenar en un armario para inflamables. No inhalar ni ingerir.

2. Tinción de embriones completos de E8.5 y E9.5 para proteínas usando inmunofluorescencia

NOTA: Todos los pasos de lavado se realizan con un volumen de 1 mL en un tubo Eppendorf de fondo redondo de 2 mL. Realice los lavados de 1 mL con agitación suave y los tubos colocados a 90° respecto al plano de la agitación. Retire y reemplace el líquido utilizando una pipeta Pasteur de LDPE de 2 mL, teniendo cuidado de no aspirar el embrión. Al trabajar con embriones de E9.5, corte el extremo de la pipeta Pasteur para evitar dañar el embrión en caso de aspiración accidental. Diluya el metanol en PBS. Los embriones pueden teñirse individualmente o en un tubo con hasta 12 embriones agrupados. Para embriones de E9.5: se pueden teñir hasta 2 condiciones en un solo tubo. Si se utilizan múltiples condiciones, corte la cola de uno de los grupos para poder distinguirlos durante la obtención de imágenes.

  1. Retire los embriones del almacenamiento a -20 °C y déjelos alcanzar la temperatura ambiente (TA) de 20–26 °C durante 10–20 min. Asegúrese de que los embriones tengan un número similar de somitas para garantizar la comparación de etapas de desarrollo equivalentes.
  2. Bleaque y permeabilice los embriones en una solución de metanol al 100 %: dimetilsulfóxido (DMSO):peróxido de hidrógeno al 30 % en una proporción de 4:1:1 durante 2 h.
    ADVERTENCIA: El peróxido de hidrógeno es corrosivo e irritante. Puede causar daños oculares graves y ser perjudicial si se ingiere. Si el peróxido de hidrógeno entra en contacto con los ojos, enjuáguelos con agua durante varios minutos. El peróxido de hidrógeno representa un peligro para los organismos acuáticos; deseche en una instalación autorizada para eliminación de residuos. Use equipo de protección personal adecuado, incluyendo protección ocular. No ingerir.
  3. Caliente previamente el bloque térmico a 98 °C y prepare el tampón desenmascarante de citrato diluyendo 100 µL de tampón desenmascarante de citrato en 10,7 mL de agua destilada.
  4. Rehidrate las muestras enjuagándolas en metanol al 70 %, luego lavándolas en metanol al 50 %, metanol al 25 % y finalmente en PBS durante 10 min cada uno a TA con agitación.
  5. Caliente previamente el tampón desenmascarante de citrato a 98 °C utilizando el bloque térmico precalentado durante al menos 20 minutos. Lave los embriones en el tampón desenmascarante de citrato durante 3 × 10 min a TA.
  6. Después de los lavados a TA, agregue el tampón desenmascarante de citrato precalentado a los embriones y caliente en el bloque térmico a 98 °C durante 10 min. Retire del calor y deje enfriar durante al menos 40 min.
    NOTA: No utilice el tampón desenmascarante de citrato para la recuperación de antígenos en embriones E8.5, ya que puede provocar la disociación de los embriones. Los embriones pueden volverse pegajosos en el tampón desenmascarante de citrato, por lo que mantenga los lavados sin agitación para evitar daños por agrupamiento.
  7. Lave los embriones durante 3 × 10 min en PBS + 0,1 % Triton-X a TA con agitación. Bloquee los embriones durante 16–24 h en un mínimo de 150 µL/tubo de PBS + 0,1 % Triton-X + 10 % de suero de burro normal a 4 °C con agitación.
  8. Prepare los anticuerpos primarios diluyéndolos en PBS + 0,1 % Triton-X + 10 % de suero de burro normal en las concentraciones recomendadas 1 h antes de aplicarlos sobre los embriones y manténgalos a 4 °C.
  9. Retire la solución de bloqueo de los embriones y agregue un mínimo de 150 µL/tubo de la solución de anticuerpos diluida. Incube durante 1–3 días a 4 °C con agitación.
    NOTA: Los anticuerpos primarios pueden multiplexarse siempre que cada anticuerpo se haya producido en una especie diferente. El uso de anticuerpos producidos en ratón, y los correspondientes anticuerpos secundarios anti-ratón, puede provocar tinción inespecífica intensa. Alternativamente, en algunos casos, se pueden multiplexar anticuerpos primarios de una misma especie si son de isotipos diferentes y se combinan con anticuerpos secundarios específicos para cada isotipo.
  10. Enjuague los embriones en PBS + 0,1 % Triton-X y lávelos durante 6 × 30 min en PBS + 0,1 % Triton-X a TA.
  11. Bloquee el anticuerpo secundario diluyendo los anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromos y DAPI (o marcador nuclear alternativo) en 0,1 % Triton-X + 10 % de suero de burro normal en las concentraciones recomendadas 1 h antes de aplicarlos sobre los embriones a 4 °C en la oscuridad.
  12. Retire el lavado y agregue la solución de anticuerpos secundarios diluida a los embriones e incube durante 16–24 h a 4 °C con agitación en la oscuridad.
    NOTA: Recomendamos usar anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromos en fragmentos F(ab) en lugar de anticuerpos completos. Los fragmentos F(ab) son más pequeños, por lo tanto tienen mejor penetración tisular, y la ausencia de la región Fc ayuda a reducir el fondo inespecífico.
  13. Enjuague los embriones en PBS + 0,1 % Triton-X, luego lávelos durante 6 × 30 min en PBS + 0,1 % Triton-X a TA con agitación en la oscuridad. Almacénelos hasta 4 semanas en PBS + 0,1 % Triton-X a 4 °C en la oscuridad.

3. Tinción de embriones en montaje completo de E8.5 y E9.5 para transcritos mediante RNAscope

NOTA: Todos los pasos de lavado tienen un volumen de 1 mL y se realizan en un tubo Eppendorf de 2 mL. Realice los lavados de 1 mL con agitación suave y los tubos colocados a 90° respecto al plano de movimiento. Retire y reemplace el líquido utilizando una pipeta Pasteur de LDPE de 2 mL, teniendo cuidado de no aspirar el embrión. Al trabajar con embriones de E9.5, corte el extremo de la pipeta Pasteur para evitar dañar el embrión en caso de aspiración accidental. El metanol debe diluirse con PBS. Encienda el horno de hibridación antes de comenzar, ajustándolo a 40 °C y colocando un poco de papel humedecido en el fondo. Los embriones pueden teñirse individualmente o en un tubo con hasta 12 embriones agrupados. Para embriones de E9.5: se pueden teñir hasta 2 condiciones en un solo tubo. Si se utilizan múltiples condiciones, corte la cola de uno de los grupos para poder distinguirlos durante la obtención de imágenes.

  1. Prepare el banco, las pipetas y el portaprobeta limpiándolos con etanol al 70 % seguido de una solución descontaminante contra RNasas.
  2. Rehidrate los embriones mediante una serie graduada de metanol diluida en PBS al 75 %, 50 %, 25 %, PBS y PBS + 0,1 % Tween 20, durante 5 min por paso con agitación suave.
  3. Permeabilice los embriones incubándolos en aproximadamente 75 µL (3 gotas) de proteasa III durante 20 min a temperatura ambiente con agitación suave y tubos en posición vertical.
    NOTA: El tiempo de permeabilización puede optimizarse según la etapa o tamaño embrionario. 20 min es adecuado para embriones E8,5/E9,5, pero pueden requerirse incubaciones más largas para observar estructuras más profundas en embriones E9,5. Permeabilizaciones excesivamente largas pueden provocar la disociación de los embriones.
  4. Lave los embriones en PBS + 0,01 % Tween 20 durante 3 × 5 min.
  5. Prepare las sondas RNAscope colocando aproximadamente 150 µL (alrededor de 6 gotas) por tubo de sondas C1 en un tubo Eppendorf. Diluya cualquier sonda C2–C4 en la sonda C1 a una concentración de 1:50 e incube en posición vertical en un horno de hibridación a 40 °C durante 10 min antes de aplicarlas sobre los embriones.
    NOTA: Para cada conjunto de sondas RNAscope en un experimento, ‘C’ indica la designación del canal. Se requiere una sonda C1, ya que todas las demás sondas se diluyen en ella. Asegúrese de usar solo una sonda por designación de canal en cada mezcla. Las mezclas de sondas pueden reutilizarse al menos una vez si se almacenan a 4 °C durante hasta 6 semanas.
  6. Retire el último lavado y añada 150 µL de mezcla de sondas a cada tubo de embriones. Incube en un horno de hibridación en posición vertical durante 16–24 h a 40 °C.
  7. Retire la mezcla de sondas y lave en tampón 0,2× Salino-Citrato Sódico (SSC) + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
  8. Fije posteriormente los embriones en PFA al 4 % a temperatura ambiente con agitación suave, colocando los tubos a 90° respecto al plano de agitación.
  9. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
  10. Incube las muestras en aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo del reactivo Amp1 durante 30 min a 40 °C en un horno de hibridación, manteniendo los tubos en posición vertical.
  11. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
  12. Incube las muestras en aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo del reactivo Amp2 durante 30 min a 40 °C en un horno de hibridación, manteniendo los tubos en posición vertical.
  13. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
  14. Incube las muestras en aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo del reactivo Amp3 durante 15 min a 40 °C en un horno de hibridación, manteniendo los tubos en posición vertical.
  15. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
  16. Incube en 150 µL (6 gotas) de HRP-C1 durante 15 min a 40 °C en posición vertical en un horno de hibridación. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
  17. Incube las muestras con un fluoróforo diluido en tampón TSA durante 30 min a 40 °C en un horno de hibridación, manteniendo los tubos en posición vertical.
    NOTA: Los fluoróforos RNAscope pueden usarse con diferentes sondas. TSA-vivid 570 es el más brillante, seguido de TSA-vivid 650 y luego TSA-vivid 520. Seleccione los fluoróforos según la abundancia esperada de las sondas.
  18. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
  19. En la oscuridad, incube las muestras en aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo del reactivo bloqueador de HRP durante 15 min a 40 °C en un horno de hibridación, manteniendo los tubos en posición vertical.
  20. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Aquí puede interrumpirse el protocolo durante 16–24 h dejando los embriones en el último lavado a temperatura ambiente.
  21. Repita los pasos 3.16–3.20 para cada una de las sondas C2–C4 si se utilizan, sustituyendo HRP-C1 por HRP-C2/C3/C4 según sea necesario. Use un fluoróforo diferente para cada sonda separada.
    NOTA: Si se usan sondas C4, se requiere el kit auxiliar RNAscope 4-plex y el fluoróforo Opal 780. Opal 780 solo debe usarse cuando se necesite multiplexar 4 sondas y debe ser el último fluoróforo aplicado, ya que es sensible a la degradación. Al seleccionar fluoróforos, es importante considerar las capacidades de la plataforma de microscopía que se utilizará. Verifique siempre que el sistema de imagen tenga longitudes de onda de excitación, filtros de emisión y sensibilidad del detector adecuados para todas las sondas utilizadas. Al teñir con Opal 780, sustituya los pasos 3.17–3.19 por los siguientes:
    1. Incube las muestras en 150 µL/tubo de TSA-DIG (diluido 1:100 en tampón TSA) durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
    2. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
    3. En la oscuridad, incube las muestras en aproximadamente 150 µL (6 gotas)/tubo del reactivo bloqueador de HRP durante 15 min a 40 °C en un horno de hibridación, manteniendo los tubos en posición vertical.
    4. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente.
    5. Incube las muestras en 150 µL/tubo de Opal Polaris 780 diluido en Diluyente/Bloqueador de anticuerpos durante 45 min a 40 °C en un horno de hibridación, manteniendo los tubos en posición vertical.
  22. En la oscuridad, incube las muestras en aproximadamente 150 µL de DAPI diluido en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 (concentración de trabajo 1 µg/mL) durante 16–24 h a 4 °C con agitación suave, manteniendo los tubos en posición vertical.
  23. Lave en tampón 0,2× SSC + 0,1 % Tween 20 durante 3 × 8 min a temperatura ambiente. Almacene las muestras a corto plazo en PBS a 4 °C.

4. Tinción combinada de RNAscope e inmunofluorescencia en embriones completos de E8.5

  1. Siga los pasos 3.1–3.21 del protocolo RNAscope.
    NOTA: La reducción del tiempo del paso de permeabilización en el protocolo RNAscope podría ayudar a mejorar el rendimiento del anticuerpo en inmunofluorescencia.
  2. Lave las muestras durante 16–24 h en 1 mL de tampón 0.2× SSC + 0.1% Tween 20 a temperatura ambiente con agitación.
  3. Siga los pasos 2.7–2.12 del protocolo de inmunofluorescencia.

5. Preparación de embriones en montaje completo para imágenes mediante microscopía confocal de barrido puntual o disco giratorio

  1. Después de la tinción, utilizando una pipeta Pasteur de polietileno de baja densidad (LDPE), pipetear suavemente el embrión y transferirlo a una placa de imágenes de múltiples pocillos o a una placa con cavidad, teniendo cuidado de que el embrión no se seque. Si es necesario, orientar el embrión según se desee, teniendo cuidado de no dañar la muestra.
    NOTA: Las placas con cavidad son útiles para asegurar la orientación de los embriones, pero pueden provocar compresión del embrión y daño tisular. Las placas de imágenes de múltiples pocillos son más suaves con los embriones, pero pueden generar variaciones en la orientación durante la adquisición de imágenes y podrían introducir artefactos en los bordes de los pocillos.
  2. Opcional – Aclarado tisular: aclara los tejidos eliminando suavemente el último lavado del embrión y añadiendo hasta 200 µL de solución CUBIC-R en el recipiente de imagenación a temperatura ambiente (RT). Mantener el embrión en una incubación única con CUBIC-R durante un mínimo de 40 minutos antes de la imagenación. Las muestras aclaradas deben observarse en la misma solución de CUBIC-R utilizada para la incubación.
    ADVERTENCIA: CUBIC-R es tóxico si se inhala y puede causar irritación ocular y cutánea. Evite la inhalación y utilice equipo de protección personal (PPE) adecuado al manipularlo.
    NOTA: Los embriones se vuelven completamente transparentes poco después de la exposición a CUBIC-R. Añadir CUBIC-R directamente al recipiente de imagenación solo después de haber orientado el embrión, y tener cuidado de no perder el embrión. Se produce una reversión parcial del aclarado si se elimina CUBIC-R del embrión y se sustituye por PBS.
  3. Si no se realiza el aclarado tisular, completar los pocillos con PBS para asegurar que los embriones no se sequen demasiado. Si se utiliza una placa con cavidad, cubrir la muestra con una cubreobjetos #1.5. Colocar una tapa en la placa de imagenación de múltiples cámaras.
    NOTA: Los embriones pueden observarse con una amplia gama de microscopios de luz. Debido al grosor de la muestra, es fundamental seleccionar un microscopio capaz de adquirir imágenes a la profundidad adecuada. Elegir un objetivo apropiado para la estructura deseada. Un objetivo de 10x con baja apertura numérica proporciona una buena visión general de la tinción del embrión completo, pero puede ser necesario un objetivo de mayor aumento y mayor apertura numérica para resolver estructuras más pequeñas o profundas con alta resolución. A veces los embriones se mueven dentro del recipiente de imagenación, lo que introduce errores; por ello, es importante reducir el tiempo de adquisición de imágenes tanto como sea posible.

6. Análisis de núcleos para conteos e intensidad de señal

NOTA: Este protocolo cubre el análisis de núcleos utilizando Zeiss Arivis Pro; es posible que análisis similares se puedan realizar con otros programas de análisis de imágenes. Funciona mejor con muestras que son nucleares, por ejemplo, transcritos o proteínas nucleares. Si se analizan proteínas no nucleares, puede ser conveniente usar un tinte para visualizar la estructura celular, por ejemplo, CellMask, que tiñe las membranas celulares, y examinar la expresión de marcadores dentro de toda la célula.

  1. Convierta los archivos de imágenes al formato SIS utilizando el convertidor Zeiss Arivis SIS. Abra el convertidor y seleccione «Agregar archivos», luego «Examinar carpeta». Seleccione la carpeta de imágenes de origen. Elija la conversión 1 a 1. Seleccione el directorio de salida y haga clic en «Iniciar conversión».
  2. Importe archivos SIS a Zeiss Arivis Pro seleccionando «archivo», luego «abrir» y finalmente el archivo SIS deseado.
  3. Prepare los datos para el análisis mediante la rotación de las imágenes. Para ello, seleccione 'Datos' y luego 'Galería de transformaciones'. Seleccione la función de 'rotación' y gire el embrión de modo que la región de interés pueda alinearse dentro de un rectángulo rígido.
  4. Recorte las regiones de interés seleccionando «Datos», luego «Galería de transformaciones», y seleccionando la opción «Recortar». Arrastre los bordes para recortar hasta la región de interés y seleccione «Aceptar».
    NOTA: Para la región cefálica de embriones E8.5, recorte la imagen a la cabeza, cortando en la muesca cercana a la vesícula ótica. Para la región cardíaca de embriones E8.5, recorte desde debajo de la muesca cercana a la vesícula ótica hasta la parte inferior del tubo cardíaco. Al recortar imágenes rotadas, elimine las regiones negras creadas como artefacto de la rotación.
  5. Inicie una nueva canalización seleccionando 'Análisis' y luego 'Panel de análisis'. Seleccione 'nueva canalización'.
  6. Región de interés de entrada: Establezca la ROI en „conjunto de imágenes actual“, los canales en „todos los canales“ y la escala en „100 %“. Asegúrese de seleccionar „incluir Z“.
    NOTA: Las imágenes pueden reducirse de tamaño (por ejemplo, al 50 %) si son demasiado grandes o si el procesamiento es demasiado lento; esto reducirá la resolución de las imágenes.
  7. Buscar núcleos (marcador #1) utilizando la herramienta de detección de blobs: Seleccionar "Agregar operación", luego buscar "Detección de blobs". En el canal, seleccionar el canal que contiene el marcador de núcleos. Establecer el diámetro en 6 µm y optimice el umbral de probabilidad en función de la intensidad de tinción. Los núcleos en el plano deben detectarse con una separación adecuada entre ellos. Ajuste la sensibilidad de división. Un valor del 55 % es razonable para la mayoría de las muestras. Establezca la «Normalización» en el primer punto temporal. Establezca el nombre de salida, por ejemplo, Buscador de blobs (núcleos). Los objetos detectados pueden visualizarse seleccionando el icono de «ojo» en la barra superior de la operación.
  8. Encuentre la expresión del marcador #2 utilizando la herramienta de detección de blobs: seleccione 'Agregar operación' y luego busque 'Detección de blobs'. En el canal, seleccione el canal que contiene el marcador de núcleos. Establezca el diámetro en 6 µm y optimice el umbral de probabilidad según la intensidad de tinción. Deben detectarse 'agregados' positivos para el marcador #2 en el plano con una separación adecuada. Ajuste la sensibilidad de división. El valor del 55 % es razonable para la mayoría de las muestras. Establezca la 'Normalización' en el primer punto temporal. Asigne un nombre de salida, por ejemplo, Buscador de agregados (canal 2). Los objetos detectados pueden visualizarse seleccionando el icono de 'ojo' en la barra superior de la operación.
  9. Encuentre la expresión del marcador #3 utilizando la herramienta de detección de blobs: seleccione "Agregar operación", luego busque "Detección de blobs". En el canal, seleccione el canal que contiene el marcador de núcleos. Establezca el diámetro en 6 µm y optimice el umbral de probabilidad según la intensidad de tinción. Deben detectarse los 'agregados' positivos para el marcador #3 en el plano con una separación adecuada. Ajuste la sensibilidad de división. El valor del 55 % es razonable para la mayoría de las muestras. Establezca la 'Normalización' en µ first punto temporal. Establecer el nombre de salida, por ejemplo, Buscador de blobs (canal 3). Los objetos detectados pueden visualizarse seleccionando el icono de ‘ojo’ en la barra superior de la operación.
  10. Opcional: filtro de volumen – Si hay mucha suciedad en la imagen, puede utilizarse un filtro de volumen para eliminar artefactos. Seleccione 'Agregar operación' y luego busque 'Filtro por característica de objeto'. Establezca la entrada como Buscador de blobs (núcleos) (o cualquier otro nombre de conjunto del paso 6.7). Establezca 'es tipo' en 'cualquiera'. En el menú desplegable, seleccione Volumen (volume) y fije el valor en > 6 µm3. Seleccione 'Add filter'. En el menú desplegable, seleccione Volume (volumen) y establezca el valor en <3000 µm3. Asigne un nombre a la salida, por ejemplo, 'núcleos'. Ejecute la canalización hasta este punto seleccionando el botón de tres líneas en el módulo y haciendo clic en 'ejecutar canalización hasta aquí'.
    NOTA: Los filtros de volumen también pueden utilizarse para los otros canales si es necesario. Optimice los valores de mayor que y menor que para asegurar que se seleccionen todos los objetos positivos, pero excluyendo los restos.
  11. Para identificar núcleos positivos para otro marcador, utilice la herramienta de intersección. Seleccione «Agregar operación» y busque la herramienta «compartimentos». En el primer cuadro desplegable, agregue la salida de núcleos (por ejemplo, buscador de blobs (núcleos) o los «núcleos» filtrados por volumen) y asegúrese de que el botón a la izquierda del cuadro esté seleccionado. En el cuadro desplegable insertado, seleccione el canal deseado (por ejemplo, buscador de blobs (canal 2)). Asigne un nombre a la salida, por ejemplo, «núcleos con canal 2». Repita este procedimiento para todos los marcadores deseados.
  12. Para encontrar núcleos positivos para 2 o más marcadores adicionales, seleccione "Agregar operación" y busque la herramienta "Filtro de característica de objeto". Configure la entrada en el marcador de núcleos (por ejemplo, "núcleos", tipo= cualquiero) y agregue filtros del paso anterior después de "Tiene etiqueta", por ejemplo, "Núcleos con canal 2" y "Núcleos con canal 3". Asigne un nombre a la salida, por ejemplo, "Núcleos con canal 2 y canal 3". Ejecute la canalización hasta este punto.
  13. Cree características personalizadas para contar núcleos seleccionando el icono de tabla de datos en la barra superior, luego seleccione «crear» y elija «recuento de objetos». Asigne una etiqueta adecuada a la característica (por ejemplo, recuento de núcleos) y seleccione en el menú de etiquetas la salida deseada para cuantificar (por ejemplo, núcleos). Repita este paso para cada grupo que deba cuantificarse.
  14. Cree grupos de objetos seleccionando 'Agregar operación' y luego 'Crear grupos de objetos'. Seleccione cada uno de los grupos que se utilizarán en los análisis en las entradas. Etiquete las salidas como 'Crear grupos de objetos'. Ejecute la canalización hasta este punto.
  15. Exportar recuentos resumidos seleccionando "Agregar operación" y luego "Exportar características de objetos". En las entradas, seleccionar "crear grupos de objetos". Seleccionar un directorio para guardar los datos. El modo es "tabla única". Hacer clic en características y seleccionar las características personalizadas creadas en el paso 6.13.
  16. Exportar detalles de los núcleos seleccionando 'Agregar operación' y luego 'Exportar características de objetos'. En las entradas, seleccionar la detección de núcleos creada en el paso 6.7 (o 6.10 si se utiliza un filtro de volumen). Seleccionar un directorio para guardar los datos. El modo es 'tabla única'. Hacer clic en características y seleccionar 'intensidades' para cada canal (#1, #2, #3, etc.) y otras características deseadas para exportar, por ejemplo, volumen (volume).
  17. Almacene objetos seleccionando los objetos necesarios para la visualización/análisis en el cuadro de almacenamiento de objetos.
  18. Guarde el flujo de trabajo revirtiendo todos los pasos, seleccionando las 3 líneas en la esquina superior derecha y haciendo clic en 'Exportar'. Seleccione la 'carpeta' en la que guardar el 'flujo de trabajo' y guarde.
  19. Para ejecutar una canalización en modo por lotes, recargue Arivis. En la barra superior, seleccione «Análisis» y luego «Análisis por lotes». En la ventana, seleccione la canalización guardada en el paso 6.18. En «archivos», seleccione los archivos para el análisis y haga clic en «Aceptar». Una vez cargados, las vistas no deseadas pueden eliminarse. Seleccione «Aceptar». En la siguiente pantalla, seleccione el directorio donde guardar los datos. Haga clic en «Ejecutar». Los datos se guardarán automáticamente en la carpeta de salida seleccionada.

Se muestra una descripción general del flujo de trabajo en la Figura 1.

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Figura 1: Protocolo de tinción por inmunofluorescencia y RNAscope. Esquema que representa las etapas clave de la recolección de embriones, inmunofluorescencia, RNAscope, inmunofluorescencia combinada con RNAscope, adquisición de imágenes de la muestra y análisis. Los recuadros de colores corresponden a diferentes etapas del protocolo. Creado en BioRender. Sparrow, D. (2026) https://BioRender.com/q6rmax8 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Los embriones E8.5 se tiñeron mediante inmunofluorescencia siguiendo este protocolo para analizar el número de células de la cresta neural migratorias que se encontraban en la fase G2/M del ciclo celular. Las muestras se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra PHH3 para visualizar la fase G2/M del ciclo celular y contra SOX10 para visualizar las células de la cresta neural migratorias. Los embriones se tiñeron además con los anticuerpos secundarios adecuados. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las muestras se imaginarón utilizando el microscopio confocal de disco giratorio Olympus SpinSR con un objetivo de 10x (NA = 0.4). Las imágenes se adquirieron con una cámara Hamamatsu Orca Fusion BT y un disco giratorio con un pinhole de 50 µm. Las imágenes se capturaron utilizando la función de mosaico y unión como pilas Z, con un espaciado Z de 1,99 µm. La delaminación de las células de la cresta neural y su posterior migración mediante la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) requiere que las células de la cresta neural pre-migratorias se encuentren en la fase S o G2/M del ciclo celular20. Aquí, somos capaces de visualizar células en la fase G2/M del ciclo celular, indicadas por la tinción de PHH3 (verde), dentro de la población de células de la cresta neural migratorias, indicadas por SOX10 (magenta) (Figura 2A). El número de células de la cresta neural migratorias en G2/M en embriones control y en embriones expuestos al tratamiento puede cuantificarse para determinar si nuestro tratamiento afecta la cantidad de células de la cresta neural migratorias en G2/M, y por lo tanto, si nuestro tratamiento también podría alterar la delaminación de la cresta neural mediante EMT. Algunos embriones tenían un saco vitelino residual adherido procedente de la disección (Figura 2A’, punta de flecha roja). El saco vitelino residual es sensible a la tinción con anticuerpos secundarios anti-ratón, frecuentes en esta muestra, ya que el anticuerpo anti-PHH3 fue producido en ratón. Por lo tanto, todo el saco vitelino fluoresce intensamente con el fluoróforo conjugado al anticuerpo anti-ratón. En este ejemplo extremo, la tinción inespecífica podría afectar la cuantificación de PHH3, y por consiguiente, esta muestra debe excluirse del análisis. Además, el uso de anticuerpos anti-ratón deja una "estela" inespecífica adyacente al tubo cardíaco en embriones E8.5 (Figura 2A’, punta de flecha roja). Esta región debe tenerse en cuenta al cuantificar la señal de un anticuerpo primario producido en ratón.

Embriones de E9.5 fueron teñidos mediante inmunofluorescencia utilizando este protocolo para examinar la estructura de los vasos sanguíneos y la distribución de las células progenitoras cardíacas. Las muestras fueron teñidas con anticuerpos dirigidos contra ISLET1 (ISL1) para visualizar el segundo campo cardíaco, SOX10 para visualizar las células de la cresta neural migratorias, ENDOMUCIN (EMCN) para visualizar las células endoteliales venosas y capilares, y los correspondientes anticuerpos secundarios. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. Se utilizó un método de clarificación del tejido para obtener una mejor profundidad de imagen. Las muestras fueron observadas mediante un microscopio confocal de disco giratorio Olympus SpinSR con un objetivo de 10x (NA = 0.4). En E9.5, se observa la migración de las células de la cresta neural cardíaca, que forman parte del arco aórtico (SOX10, amarillo), y de las células progenitoras del segundo campo cardíaco (ISL1, verde), que forman partes de las aurículas, el tracto de salida y el ventrículo izquierdo21 (Figura 2B). La alteración de las células progenitoras cardíacas es un factor clave en la enfermedad cardíaca congénita22,23. Mediante este método, es posible visualizar el patrón y el número de células progenitoras cardíacas. La siguiente etapa consistiría en comparar el patrón de distribución de las células progenitoras cardíacas entre los grupos control y de tratamiento para determinar si nuestra intervención altera la migración o provoca la pérdida de tipos celulares clave.

Para determinar la relación entre la etapa de las células de la cresta neural y la señalización Wnt, embriones de E8.5 fueron teñidos mediante RNAscope utilizando este protocolo para examinar células de la cresta neural en diferentes etapas de migración y diferenciación, así como un marcador de la señalización Wnt. Se utilizaron sondas que indican el borde de la placa neural, de donde emergen las células de la cresta neural (Msx1), células de la cresta neural migratorias (Sox10) y diferenciación de las células de la cresta neural (Dlx2), y se compararon con una sonda que indica la señalización Wnt (Sp5). Se emplearon fluorocromos TSA-vivid 520, 570 y 650, y Opal 780 para visualizar las sondas. Las muestras se imagaron utilizando un microscopio Evident FV4000 con un objetivo de 10x (NA=0.4), una abertura de 144 µm y un tamaño de píxel de 621 nm. Las imágenes se capturaron utilizando la función de mosaico y unión como pilas en Z, con un espaciado Z de 4,32 µm. El borde de la placa neural (Msx1, verde) y las células de la cresta neural migratorias (Sox10, magenta) ocupan regiones distintas en la cabeza, con cierto solapamiento cuando las células comienzan a migrar desde el tubo neural (Figura 3A). Algunas regiones de las células de la cresta neural migratorias se localizan conjuntamente con Dlx2 (cian), lo que sugiere que algunas células están progresando hacia la diferenciación craneofacial (Figura 3A). La señalización Wnt (Sp5, amarillo) ocupa regiones del borde de la placa neural, lo cual es relevante ya que la modulación de la señalización Wnt es necesaria para la delaminación y diferenciación de las células de la cresta neural24,25, pero también una región distinta adyacente a las células de la cresta neural migratorias (Figura 3A).

Una tinción adicional tuvo como objetivo analizar la relación entre la migración de las células de la cresta neural y la señalización Wnt en E9.5, mediante la tinción para marcadores del estado de la cresta neural y de la señalización Wnt. Sondas que indican el borde de la placa neural (Msx1) y células de la cresta neural migratorias (Sox10) se utilizaron y compararon con una sonda que indica la señalización Wnt (Sp5). Se utilizaron fluorocromos TSA-vivid 520, 570 y 650 para visualizar las sondas. Las muestras se imagaron utilizando un microscopio de disco giratorio Olympus SpinSR con un objetivo de 10x (NA = 0,4). Aquí podemos observar el borde de la placa neural (Msx1, verde), distintas de las células de la cresta neural migratorias (Sox10 magenta) (Figura 3B). Señalización de Wnt (Sp5, amarillo) se observa fuertemente en la región dorsal del embrión, donde las células de la cresta neural del tronco están desprendiéndose, así como en regiones distintas de la cabeza, alrededor del 1st y 2nd arco branquial, por debajo del tracto de salida, y dentro de la vesícula ótica (Figura 3B). La comparación del patrón espacial de las células de la cresta neural y la señalización Wnt entre los grupos control y de tratamiento mediante este método nos permitiría determinar si nuestra intervención altera la delaminación y migración de las células de la cresta neural, y si cualquier alteración se debe a cambios en la señalización Wnt.

Para determinar el estado del ciclo celular de las células en el borde de la placa neural, utilizamos este protocolo para combinar tinción de inmunofluorescencia y RNAscope. Se empleó una sonda de RNAscope que indica el borde de la placa neural (Msx1). Las muestras se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra PHH3 y PCNA para visualizar las fases G2/M y S del ciclo celular, respectivamente. Los embriones se tiñeron además con anticuerpos secundarios adecuados. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las muestras se observaron mediante un microscopio de disco giratorio Olympus SpinSR con objetivo de 10x (NA = 0.4) (Figura 4A,B), o un microscopio confocal Evident FV4000 con objetivo de 10x (NA = 0.4), diafragma de 127 µm y tamaño de píxel de 311 nm (Figura 4B’). Aquí podemos observar células tanto en fase G2/M (PHH3, amarillo) como en fase S (PCNA, magenta) que coinciden con el borde de la placa neural (Figura 4A). Mediante este método, podemos cuantificar la proporción de células dentro del borde de la placa neural en cada fase del ciclo celular y determinar si estas proporciones se alteran por nuestros grupos de tratamiento. Es notable en este embrión la presencia de orificios que resultan de daños durante la disección causados por una manipulación excesiva del embrión con pinzas finas. Esto resalta la necesidad de tener cuidado durante la disección para evitar daños, especialmente en E8.5 cuando los embriones son particularmente frágiles.

La combinación de RNAscope e inmunofluorescencia puede provocar una tinción más tenue del sonda de RNAscope en comparación con la realización de RNAscope por separado. Cuando se combina con un anticuerpo primario que presenta una fluorescencia muy intensa y un fluoróforo cercano (por ejemplo, Fluoresceína y Cy3), esto puede provocar un derrame de señal desde el canal más brillante hacia el más tenue (Figura 4B). La forma de prevenirlo es utilizar una concentración más diluida del anticuerpo muy brillante, seleccionar fluoróforos que sean más espectroscópicamente distintos, o modificar los parámetros de adquisición de imágenes en las muestras. Los microscopios de disco giratorio permiten obtener imágenes de embriones muy rápidamente, pero como utilizan filtros de emisión de banda pasante con ventanas de emisión fijas, no es posible ajustar dinámicamente las ventanas de detección para adaptarlas a fluoróforos específicos. Al usar un microscopio de escaneo puntual, por ejemplo el Evident FV4000, el operador puede reducir la ventana de detección con precisión de nanómetros, lo que permite disminuir el derrame de señal cuando se utilizan fluoróforos cuyos espectros de emisión presentan una ligera superposición (Figura 4B’).

Para determinar las proporciones de células en diferentes fases del ciclo celular en embriones E8.5, utilizamos este protocolo para analizar la proporción de núcleos y la intensidad de señal tanto en la fase S como en la fase G2/M del ciclo celular. Las muestras se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra PHH3 y PCNA para visualizar las fases G2/M y S del ciclo celular, respectivamente. Los embriones se tiñeron además con anticuerpos secundarios adecuados. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las muestras se observaron mediante un microscopio de disco giratorio Olympus SpinSR con un objetivo de 10x (NA = 0,4). Se utilizó el software Zeiss Arivis Pro para identificar todos los núcleos, los núcleos positivos para PHH3, los núcleos positivos para PCNA y los núcleos doble-positivos (Figura 5A). Mediante este método, pudimos comparar las proporciones de células en las fases G2/M (PHH3+) y S (PCNA+) del ciclo celular (Figura 5B), así como la intensidad de tinción de PHH3 o PCNA en cada núcleo individual (Figura 5C). Se observó una proporción ligeramente mayor de núcleos PCNA+ en la región del corazón en comparación con la cabeza y el embrión completo (Figura 5B). Además, la cabeza presentó una proporción mayor de núcleos PHH3+ y doble-tiñidos en comparación con el corazón y el embrión completo (Figura 5B). No hubo diferencias evidentes en la intensidad de tinción de PHH3 o PCNA entre las regiones (Figura 5C). Estos datos provienen de un único embrión representativo (n = 1) y se presentan para demostrar el flujo de trabajo del análisis; no se realizó ningún análisis estadístico inferencial. En conjunto, este método nos permite determinar los patrones de propagación del ciclo celular en una etapa de desarrollo crucial para el desarrollo cardíaco y craneofacial. Este método nos permitirá determinar si nuestro tratamiento afecta la propagación del ciclo celular en diferentes regiones del embrión.

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Figura 2: Tinción de inmunofluorescencia de proteínas en embriones E8.5 y E9.5. (A, A’) Los embriones de ratón E8.5 se tiñeron mediante inmunofluorescencia para PHH3 con el fin de visualizar células en la fase G2/M del ciclo celular, SOX10 para visualizar células de la cresta neural migratorias y DAPI para visualizar núcleos. N = 11 embriones de 1 experimento. (B) Los embriones E9.5 se tiñeron para ISL1 con el fin de visualizar precursores del segundo campo cardíaco, SOX10 para visualizar células de la cresta neural migratorias, EMCN para visualizar vasos sanguíneos capilares y venosos, y DAPI (para visualizar núcleos). Las flechas rojas indican tinción no específica del saco vitelino y tinción no específica dentro del embrión debida a anticuerpos secundarios anti-ratón (n = 15 embriones de 1 experimento). Barra de escala = 200 µm. DAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol; PHH3: fosfohistona H3; EMCN: endomucina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Tinción de transcritos en embriones E8.5 y E9.5 mediante RNAscope. (A) Los embriones E8.5 fueron teñidos mediante RNAscope con sondas dirigidas contra Msx1 para visualizar el borde de la placa neural, Sox10 para visualizar la cresta neural migratoria, Dlx2 para visualizar la cresta neural en diferenciación y Sp5 para la señalización de Wnt. n = 13 embriones de 1 experimento. (B) Los embriones E9.5 fueron teñidos mediante RNAscope con sondas dirigidas contra Msx1 para visualizar el borde de la placa neural, Sox10 para visualizar la cresta neural migratoria y Sp5 para visualizar la señalización de Wnt. n = 4 embriones de 1 experimento. Barra de escala = 200 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Tinción combinada de inmunofluorescencia y RNAscope en embriones de E8.5. (A, B, B’) Los embriones de E8.5 fueron teñidos mediante RNAscope con sondas dirigidas contra Msx1 para visualizar el borde de la placa neural y mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra PCNA para visualizar las células en fase S y contra PHH3 para visualizar las células en fase G2/M del ciclo celular. Las flechas naranjas indican tinción específica de Msx1, las flechas rojas indican fluorescencia de paso cruzado, (B), o tinción específica de PHH3 sin paso cruzado al canal de Msx1 (B'). N = 2 embriones de 1 experimento. Barra de escala = 200 µm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Análisis de la fase del ciclo celular en embriones E8.5 utilizando Arivis Pro. (A) Los embriones de ratón E8.5 se tiñeron mediante inmunofluorescencia para PCNA con el fin de visualizar las células en fase S del ciclo celular (verde), PHH3 para visualizar las células en fase G2/M del ciclo celular (magenta) y DAPI para visualizar los núcleos (azul). Los objetos tridimensionales detectados (esferas multicolores) se superpusieron y visualizaron utilizando el visor 4D de Zeiss Arivis Pro. (B) El gráfico muestra la proporción de núcleos positivos para PCNA+, PHH3+ y doble positivos en el cuerpo completo, la cabeza y el corazón de un único embrión. (C) El gráfico muestra la intensidad media de la tinción de PCNA y PHH3 por núcleo en el cuerpo completo, la cabeza y el corazón de un único embrión. Los círculos representan la media; las barras de error representan la desviación estándar de todos los núcleos dentro de una sola muestra. Los gráficos se elaboraron utilizando GraphPad Prism. Barra de escala = 200 µm. El análisis cuantitativo se realizó en n = 1 embrión. No se realizaron estadísticas inferenciales. Las barras de error indican la desviación estándar entre núcleos individuales. 3D: tridimensional; DAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aquí, describimos un método optimizado para analizar espacialmente la expresión génica y proteica en embriones completos de E8.5 y E9.5. Estos métodos presentan una mejor resolución espacial y capacidad de multiplexación en comparación con los métodos tradicionales de hibridación in situ de ARN e inmunofluorescencia de cortes. Este protocolo se basa en protocolos recientes existentes para examinar vías del desarrollo en embriones de ratón. Un protocolo reciente utilizó RNAscope y tinción de inmunofluorescencia para analizar la señalización Wnt en embriones, pero empleó cortes en lugar de embriones completos26. Otro estudio reciente realizó tinciones de RNAscope e inmunofluorescencia en preparaciones completas de embriones de ratón de E8.5 a E10.527, pero los autores no combinaron ambas técnicas de tinción, ni emplearon un cuarto canal de RNAscope utilizando sondas C4 y fluoróforos Opal 780. La combinación de inmunofluorescencia y RNAscope ya ha sido descrita previamente en embriones completos de E3.5, donde se realiza RNAscope tras completar el protocolo de inmunofluorescencia28. Aunque no hemos probado este protocolo exacto en embriones posteriores, obtuvimos una tinción deficiente de anticuerpos cuando intercalamos la tinción de RNAscope entre las incubaciones del anticuerpo primario y secundario de nuestro protocolo de inmunofluorescencia en embriones de E8.5. Esto probablemente se deba a la necesidad de usar una incubación con proteasa al realizar RNAscope en embriones más grandes, lo cual no fue necesario en el estudio que utilizó embriones de ratón de E3.5. La incubación con proteasa podría afectar la integridad de los anticuerpos unidos, por lo que cambiar el orden de RNAscope e inmunofluorescencia es poco probable que funcione en este sistema. Un estudio reciente adicional en miofibras combinó ambos protocolos realizando RNAscope antes de la tinción de inmunofluorescencia29. De forma similar a este protocolo, dicho estudio realizó RNAscope antes de la inmunofluorescencia; sin embargo, no validaron su método en embriones completos de ratón, ni realizaron RNAscope incorporando un canal adicional mediante la tinción con sondas C4 y un fluoróforo Opal 780.

La capacidad de teñir embriones en montaje completo utilizando la multiplexación tiene aplicaciones amplias en biología del desarrollo, ya que permite mapear transcritos y proteínas clave, así como etiquetar tipos celulares progenitores o vías de señalización del desarrollo en embriones en diferentes etapas. Hemos podido utilizar estas técnicas para mapear la distribución de células progenitoras cardíacas (Figura 2B), células de la cresta neural en distintas etapas de migración y diferenciación (Figura 3), la señalización Wnt (Figura 3) y la fase del ciclo celular (Figura 2, Figura 4, Figura 5). Al modificar las sondas y los anticuerpos utilizados, es posible emplear estas técnicas para examinar cualquier tipo celular o molécula de señalización de interés, siempre que estén presentes en los embriones en esta etapa. Aunque en este protocolo nos hemos centrado en embriones E8.5 y E9.5, es posible que embriones más jóvenes o más viejos también puedan teñirse mediante la modificación de la permeabilización del tejido, los tiempos de incubación y la clarificación del tejido.

Sin embargo, esta capacidad mejorada para multiplexar la expresión de proteínas y transcritos en embriones enteros ha generado nuevos desafíos. En primer lugar, realizar análisis en muestras enteras es un proceso que consume mucho tiempo en comparación con la inmunofluorescencia y el RNAscope en cortes histológicos, que normalmente pueden realizarse en 1–2 días en lugar de varios días. Además, el uso de muestras enteras requiere una consideración cuidadosa de los parámetros de microscopía para garantizar una profundidad y resolución adecuadas de la muestra. Se necesita un microscopio capaz de obtener imágenes a través de hasta 700 µm tejido grueso, y es necesario utilizar técnicas de clarificación de tejidos en embriones más grandes, de lo contrario podrían pasarse por alto estructuras profundas en la muestra. Además, debido al grosor de las muestras, la obtención de imágenes con un microscopio de campo amplio generaría una gran cantidad de luz proveniente de fuera del plano focal; se prefiere un microscopio confocal debido a su capacidad para eliminar señales provenientes de fuera del plano focal, lo que permite obtener imágenes a través de toda la muestra excluyendo cualquier señal fuera del plano. Asimismo, un microscopio confocal de disco giratorio suele permitir tiempos más rápidos de adquisición de imágenes, aunque con un menor control fino en la detección de fluorescencia en comparación con un microscopio confocal de barrido puntual. El tamaño de los embriones también puede representar un desafío, ya que muchos microscopios no cuentan con un campo de visión suficientemente amplio para imaginar el embrión completo sin recurrir al escaneo por mosaico. Esto puede generar artefactos de empalme dentro de la imagen (por ejemplo, Figura 2B). La multiplexación de muestras también podría provocar fugas de señal entre canales (por ejemplo, Figura 4B), lo que puede mitigarse seleccionando un microscopio confocal de barrido puntual en el que las ventanas de detección puedan estrecharse, especialmente cuando los fluoróforos presentan ligeras superposiciones en sus espectros de emisión. El uso del fluoróforo Opal 780 es útil para multiplexar aún más objetivos en una misma muestra; se requiere un microscopio con capacidad para imagen en el infrarrojo cercano para detectar este sistema. Dicha capacidad no está disponible en la mayoría de los microscopios ópticos.

El montaje de las muestras para la obtención de imágenes también requiere una consideración cuidadosa. Al permitir que las muestras floten libremente, como cuando se realizan imágenes en una placa de cámara de múltiples pocillos, las muestras no siempre se encuentran exactamente al mismo ángulo para la obtención de imágenes. Esto puede provocar diferencias en la intensidad de la tinción dependiendo de qué partes del embrión estén más cercanas a la cámara/detector, y puede generar dificultades al realizar análisis posteriores de intensidad. Un problema adicional al usar placas de cámara de múltiples pocillos es que el borde del pocillo podría quedar dentro del campo que se está capturando, lo cual puede provocar artefactos en la imagen. Fijar el embrión, como en una placa con cavidad, puede ayudar a mantener la orientación, pero puede facilitar el daño y/o la compresión del embrión, lo que dificulta el análisis volumétrico de las estructuras.

Se deben tener varias consideraciones al seguir este protocolo. Para inmunofluorescencia, es necesario tener cuidado durante la recuperación del antígeno para no disociar el embrión, especialmente al analizar embriones más jóvenes. Para evitar esto, podría ser posible utilizar otros métodos de recuperación del antígeno, como emplear un tampón alternativo como Tris/EDTA o usar un método de recuperación proteolítica. Embriones más pequeños o más grandes podrían beneficiarse de la optimización de los tiempos de incubación de los anticuerpos. Es necesario considerar cuidadosamente los anticuerpos primarios, ya que varios de ellos se producen en ratones, pero el uso de anticuerpos anti-ratón puede unirse al saco vitelino residual y fluorescer intensamente. Esto puede observarse usando anticuerpos secundarios anti-ratón conjugados con AlexaFluor 488 (Figura 2) y AlexaFluor 647 (Figura 4). Otros fluoróforos no han sido probados en nuestro laboratorio, pero podrían tener intensidades de fluorescencia diferentes, lo que requeriría una mayor optimización. Este efecto no se observa en los canales donde se han utilizado anticuerpos anti-conejo (Figura 2, Figura 4, Figura 5) o anticuerpos anti-rata (Figura 2B); por lo tanto, se recomienda, siempre que sea posible, el uso de anticuerpos primarios producidos en otras especies.

Para RNAscope, es fundamental optimizar los pasos de incubación con proteasa, ya que un tiempo demasiado corto puede provocar una penetración insuficiente de las sondas, mientras que uno demasiado largo puede provocar la disociación completa de la muestra. Al optimizar los tiempos de incubación con proteasa, recomendamos modificar la duración en incrementos de un solo minuto. Es una buena práctica utilizar también controles adecuados para determinar si una sonda o un anticuerpo han funcionado. Un control negativo sería un embrión de etapa equivalente teñido simultáneamente sin sonda ni anticuerpo primario, o el uso de un control de isotipo IgG o una sonda de control negativo para inmunofluorescencia o RNAscope, respectivamente, con el fin de confirmar que la tinción observada es real. También pueden ser útiles controles positivos de un tejido de tamaño equivalente que se sabe que expresa el gen o transcripción de interés, para determinar si la tinción ha sido exitosa.

En general, este protocolo es un método robusto y optimizado para visualizar la expresión de proteínas y transcritos en embriones completos de ratón en E8.5 y E9.5, con un gran potencial para investigar los mecanismos celulares y moleculares en el desarrollo embrionario normal y en enfermedades.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero competitivo.

Agradecimientos

Los autores agradecen al equipo de la instalación Core de Imagen Celular, Centro de Genética Humana, Universidad de Oxford, por brindar apoyo técnico con la microscopía y el análisis de imágenes incluidos en este manuscrito. Los autores agradecen al personal de Servicios Biomédicos, Universidad de Oxford, por su apoyo en el mantenimiento de animales y apareamientos programados para generar embriones.

Este estudio recibió financiamiento de la British Heart Foundation Senior Fellowship FS/SBSRF/22/31022 (DBS), el Additional Ventures Single Ventricle Fund (DBS), el John Fell Fund, Universidad de Oxford 0016065 (VSR) y el Medical Sciences Internal Fund, Universidad de Oxford 0016707 (VSR).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material plástico/vidrio
Pipetas Pasteur de 3 ml de polietileno de baja densidad (LDPE) graduadasWheaton711116
Tubos Eppendorf Safe-lock, microtubo de 1,5 mlEppendorf0030 120.086
Ibidi µ-slide de 18 pocillos Ibidi81817Cubrebarras de vidrio #1.5H, sin tratar
Cubrebarras Menzel X1000 de 22x50 mm #1.5 (0,16-0,19 mm)Thermo Scientific17284904
Portaobjetos para microscopio con cavidadesMarienfeld Superior1320000
Microtubo sellable de 2 mlSarstedt72.695.500Tubo de 2 ml tipo 'Eppendorf', fondo redondeado
Soluciones/tampones
Disolvente/bloqueo de anticuerpos 1xAkoya BiosciencesARD1001EA
Solución descontaminante Ambion™ RnaseZap™Ambion9780.9782
Tampón desenmascarante de citratoVector labs H-3300Etiquetado como solución desenmascarante de antígenos,
a base de ácido cítrico
Dimetilsulfóxido (DMSO)Merck (Sigma-Aldrich)D8418
Solución salina equilibrada de Hanks 10xMerck (Sigma-Aldrich)H4641
Solución de peróxido de hidrógenoMerck (Sigma-Aldrich)H100930% (p/p) en H2O
MetanolMerck (Sigma-Aldrich)32213-2.5L-M
Suero normal de asno AbcamAb7475Concentración stock al 100%,
concentración final al 10%
Polvo de paraformaldehído (PFA)Merck (Sigma-Aldrich)158127-500gDiluir hasta 4% en agua. Preparar en cabina de gases. Agitar en bloque calefactor y añadir una pequeña cantidad de NaOH para facilitar la disolución. pH 7,2-7,6
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Merck (Sigma-Aldrich)P44171 tableta por 200 ml de agua destilada
Kit auxiliar RNAscope 4-Plex para kit de reactivo fluorescente múltiple v2ACD (Bio-Techne)323120Contiene HRP-C4 y bloqueador HRP
Kit de detección fluorescente múltiple RNAscope™ v2 ACD (Bio-Techne)323110Contiene Proteasa Plus, Proteasa III,
Proteasa IV, peróxido de hidrógeno, tampón TSA,
Amp1/2/3, Hrp-C1/2/3, bloqueador HRP y DAPI
Solución 20X de tampón de citrato-sodio-salino (SSC)Fisher BioreagentsBP-1325-1Diluir hasta 0,2x en agua destilada
Reactivo de aclarado de tejidos Cubic-R+(M) [para animales]Tokyo Chemical IndustryT3741
Triton™ X 100Merck (Sigma-Aldrich)X100
Tween® 20Merck (Sigma-Aldrich)P7949
EDTA Ultrapuro™ 0,5 M, pH 8Invitrogen15575020
Anticuerpos primarios
Anticuerpo contra endomucina (V.7C7) Santa CruzSC-65495Usar dilución 1:50. 
Anticuerpo contra Islet 1 e Islet 2Developmental Studies Hybridioma Bank34.4DS-5Diluir al 50% en glicerol. Usar dilución 1:50.
Anticuerpo monoclonal de ratón contra PCNA (PC10)Cell Signaling Technology2586SUsar dilución 1:500
Anticuerpo monoclonal de ratón contra P-histona H3 (Ser10) (6G3)Cell Signaling Technology9706SUsar dilución 1:500
Anticuerpo monoclonal de conejo contra P-histona H3 (Ser10) (D7N8E) XP®Cell Signaling Technology53348SUsar dilución 1:500
Anticuerpo monoclonal de conejo Sox10 (E6B6I) XP® Cell Signaling Technology69661SUsar dilución 1:500
Anticuerpos secundarios/tinciones nucleares
AlexaFluor® 488 conjugado con Affinipure® IgG de burro anti-ratón (H+L)Jackson Immunoresearch715-545-151Usar dilución 1:500
AlexaFluor® 647 conjugado con Affinipure®  IgG de burro anti-rata (H+L)Jackson Immunoresearch712-605-153Usar dilución 1:500
AlexaFluor® 647 conjugado con fragmento F(ab')2 de Affinipure® de burro anti-ratón (H+L)Jackson Immunoresearch715-606-150Usar dilución 1:500
Cy™3 Affinipure® IgG de burro anti-conejo (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-152Usar dilución 1:500
DAPIMerck (Sigma-Aldrich)D9542Usar a 1 µg/ml
Probetas RNAscope
Probeta RNAscope® - Mm Sp5-C4ACD (Bio-Techne)405681-C4Probeta C4
Probeta RNAscope® - Mm-Dlx2-C3ACD (Bio-Techne)555951-C3Probeta C3
Probeta RNAscope® - Mm-Msx1ACD (Bio-Techne)421841Probeta C1
Probeta RNAscope® - Mm-Sox10-C2ACD (Bio-Techne)435931-C2Probeta C2
Fluoróforos RNAscope
Paquete de reactivo Opal 780Akoya BiosciencesFP1501001KT Contiene reactivo Opal 780, Opal TSA-DIG,
DMSO
Fluoróforo TSA-vivid™ 520ACD (Bio-Techne)323271ahora fluoróforo ClariTSA™ 520
Fluoróforo TSA-vivid™ 570ACD (Bio-Techne)323272ahora fluoróforo ClariTSA™ 570
Fluoróforo TSA-vivid™ 650ACD (Bio-Techne)323273ahora fluoróforo ClariTSA™ 650
Equipos/software
Microscopio de barrido láser Fluoview FV4000 Evidentfv4000Láseres de excitación: 405/488/561/640/730 nm.
Longitud de onda detectada (Fig. 3): 430-470, 500-540, 570-620,
650-710, 750-850 nm. Longitud de onda detectada (Fig. 4): 430-470,
500-531, 570-620 nm.
Graphpad Prism 10Graphpadv10.6.1
Bloque calefactorGrantQBT1
Horno de hibridación HybrigeneTechne (Bibby Scientific)FHB4DD
Sistema de microscopio de superresolución Ixplore IX83 SpinSROlympusixplore-ix83-spinsrLáseres de excitación: 405/488/561/640 nm.
Filtros de emisión: 447/60, 525/50, 617/73, 685/40. 
Zeiss Arivis Pro Carl Zeiss Microscopy GmbHv. 4.5 (anteriormente Arivis Vision 4D)
Convertidor Zeiss Arivis SISCarl Zeiss Microscopy GmbHv. 4.3.0

Referencias

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