Artículo de investigación

La cápsula Yangjing alivia la disfunción espermatogénica en ratones mediante la inhibición de la vía QKI-5/p38 MAPK a través de la regulación al alza del incRNA NONMMUT031883.2

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DOI:

10.3791/73166

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28 de agosto de 2026

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

Este estudio evalúa los efectos protectores de la Cápsula Yangjing sobre la disfunción espermatogénica inducida por ciclofosfamida en ratones y examina la participación de la vía de señalización lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Resumen

La disfunción espermatogénica es una causa importante de infertilidad masculina, y la ciclofosfamida (CP) puede alterar la espermatogénesis al inducir apoptosis anormal de espermatogonias. La Cápsula Yangjing (YC) se ha utilizado para mejorar la función reproductiva, pero su mecanismo molecular subyacente sigue siendo poco claro. Este estudio investigó los efectos protectores de YC en un modelo murino de disfunción espermatogénica inducida por CP y en células espermatogoniales GC-1. Se evaluaron el recuento y la motilidad espermática, la fertilidad masculina, los niveles séricos de hormonas sexuales y los cambios histopatológicos en los testículos y epidídimos. En las células GC-1, se evaluó la viabilidad celular, la liberación de deshidrogenasa láctica, la apoptosis y las proteínas relacionadas con la apoptosis. Se utilizaron reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas de transcripción reversa, ensayos de captura de ARN, inmunofluorescencia y transferencia Western para examinar el lncRNA NONMMUT031883.2, Quaking-5 (QKI-5) y la señalización de la quinasa mitógeno-activada de proteínas p38 (MAPK). YC mejoró de manera dependiente de la dosis la calidad del esperma, los niveles séricos de hormonas sexuales, la morfología de los órganos reproductivos, la histopatología testicular y la fertilidad en ratones tratados con CP. En las células GC-1, YC aumentó la viabilidad celular y redujo el daño celular y la apoptosis. El lncRNA NONMMUT031883.2 interactuó físicamente con QKI-5, y el tratamiento con YC incrementó la expresión del lncRNA NONMMUT031883.2 mientras reducía la expresión de QKI-5 y la fosforilación de p38. El tratamiento con YC inhibió la apoptosis inducida por la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 en células GC-1, mientras que la sobreexpresión de QKI-5 redujo los efectos antiapoptóticos de YC. Estos hallazgos sugieren que YC alivia la disfunción espermatogénica inducida por CP y que sus efectos protectores están mediados por la regulación de la vía lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Introducción

La disfunción espermatogénica se refiere al deterioro reproductivo causado por anomalías en la producción, maduración o función de los espermatozoides en el sistema reproductivo masculino. Se caracteriza por una reducción en el conteo y la motilidad espermática, así como por un aumento en la tasa de deformidades espermáticas.1,2La patogénesis de la disfunción espermatogénica es compleja y se asocia con factores genéticos, trastornos autoinmunes, toxinas ambientales, daño inducido por quimioterapia y lesiones de los órganos reproductivos3-5. Fármacos quimioterapéuticos como la ciclofosfamida (CP) pueden dañar directamente los túbulos seminíferos testiculares e inducir la apoptosis de espermatogonias, contribuyendo así a la disfunción espermatogénica masculina.6,7La terapia de reemplazo hormonal, la suplementación con antioxidantes y las tecnologías de reproducción asistida se utilizan actualmente como intervenciones clínicas. Sin embargo, estos enfoques presentan una eficacia inconsistente y efectos adversos considerables.8,9,10Por lo tanto, identificar intervenciones seguras y eficaces y aclarar sus dianas moleculares es clínicamente importante para mejorar los resultados de fertilidad en pacientes con disfunción espermatogénica.

La medicina herbal china ha mostrado potencial para proteger la función reproductiva masculina y tratar la disfunción espermatogénica debido a sus propiedades multitarget y su toxicidad relativamente baja11,12. La Cápsula Yangjing (YC) es un medicamento patentado chino tradicional compuesto por Rehmannia glutinosa, Epimedium, placenta, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis y otras medicinas herbales chinas. Se utiliza para tonificar el riñón y la esencia, nutrir la sangre y la médula, y regular la función reproductiva13. Estudios previos han demostrado que la YC puede regular los niveles de hormonas sexuales en animales macho, mejorar la calidad del esperma, reparar el daño en el tejido testicular y proteger contra lesiones reproductivas inducidas por agentes químicos14,15. Las células espermatogoniales constituyen la base de la espermatogénesis, y la apoptosis anormal de los espermatogonios es un evento central en el desarrollo de la disfunción espermatogénica16. También se ha informado que la YC mejora la viabilidad de los espermatogonios, aumenta la proporción de células en fase S e inhibe la apoptosis17. Sin embargo, sus efectos protectores y los mecanismos moleculares específicos en la disfunción espermatogénica inducida por CP permanecen poco claros.

Los ARN no codificantes largos (lncARN) son moléculas de ARN con una longitud superior a 200 nucleótidos que carecen de capacidad para codificar proteínas18. Los lncARN pueden regular la expresión génica mediante mecanismos que incluyen el silenciamiento cromosómico, la modificación de la cromatina, la impronta genómica y la activación transcripcional19,20. La proteína de unión al ARN Quaking-5 (QKI-5) participa en procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la proliferación celular y la apoptosis, mediante la regulación del empalme alternativo de genes diana21. La vía de la quinasa mitógeno-activada p38 (MAPK) interviene en la regulación de la apoptosis y también desempeña un papel importante en la fertilidad masculina y en el desarrollo testicular22,23. Un estudio previo mostró que la sobreexpresión de QKI-5 activa la vía p38 MAPK en células de carcinoma hepatocelular24. Además, se ha demostrado que el lncARN NONMMUT074098.2 se une a QKI-5 en espermatogonias, mientras que la inhibición de QKI-5 suprime la vía p38 MAPK y reduce la apoptosis de espermatogonias25. En este estudio se utilizó un modelo murino inducido por CP de disfunción espermatogénica para investigar si YC regula la expresión del lncARN NONMMUT031883.2 y el eje de señalización QKI-5/p38 MAPK, reduciendo así la apoptosis anormal de espermatogonias y aliviando la disfunción espermatogénica inducida por CP (Figura 1). El objetivo fue aclarar el mecanismo molecular subyacente a los efectos protectores de YC sobre la espermatogénesis y ampliar el conocimiento sobre su papel farmacológico en la protección de la función reproductiva masculina.

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Figura 1: Diagrama esquemático del diseño experimental. El panel superior resume los experimentos in vitro en células espermatogoniales GC-1. La reducción del ARNl NOCMMUT031883.2 se utilizó para inducir apoptosis y daño celular, seguida de la reducción de QKI-5 para evaluar sus efectos sobre la apoptosis y la lesión celular. El panel inferior resume los experimentos in vivo en modelos murinos inducidos con ciclofosfamida (CP) de disfunción espermatogénica. Los ratones recibieron tratamiento con la Cápsula Yangjing y/o intervención con el ARNl NOCMMUT031883.2 o QKI-5. Posteriormente se evaluaron la fertilidad, los niveles séricos de hormonas, los tejidos testiculares y epididimarios, la suspensión espermática, las reservas espermáticas, la calidad del esperma y el daño histopatológico testicular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices ARRIVE y con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad del Sudeste (número de aprobación: 20230216022).

1. Preparación del suero que contiene YC
Se abrieron dos cápsulas Yangjing (YC; 0,5 g/cápsula) y se pesaron 0,8 g del contenido. Se añadió suero fisiológico hasta un volumen final de 10 mL, y la mezcla se agitó completamente en vórtex para preparar una suspensión de 80 mg/mL. Se mantuvieron ratones macho BALB/c libres de patógenos específicos, con un peso de 22–25 g y una edad de 8 semanas, a 22 °C y una humedad del 55%–60% bajo un ciclo de 12 h luz/oscuridad, con alimento y agua disponibles ad libitum. Tras una semana de aclimatación, los ratones recibieron YC mediante gavaje oral a una dosis de 800 mg/kg de peso corporal en un volumen de 10 mL/kg, una vez al día durante 5 días consecutivos. Dos horas después de la última administración, los ratones se anestesiaron con pentobarbital sódico al 1% por vía intraperitoneal y se les tomaron muestras de sangre para preparar el suero que contiene YC. El suero se inactivó a 56 °C durante 30 min, se filtró a través de una membrana de 0,22 µm y se almacenó a −80 °C hasta su uso.

2. Cultivo celular y transfección
Las células espermatogoniales GC-1 de ratón se mantuvieron en DMEM que contenía 1% de penicilina-estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. Todos los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera que contenía 5% de CO₂ (v/v).

Se sintetizaron y construyeron ARN de horquilla corta específicos para lncRNA (sh-lncRNA), un plásmido de sobreexpresión de QKI-5 (OE-QKI-5), ARN interferente pequeño de QKI-5 (si-QKI-5) y sus controles negativos correspondientes (sh-NC, OE-NC y si-NC). Las células GC-1 se transfectaron con sh-lncRNA o sh-NC, si-QKI-5 o si-NC, u OE-QKI-5 u OE-NC según las instrucciones del reactivo de transfección. Tras una incubación de 48 h, la eficiencia de transfección se evaluó midiendo la expresión de lncRNA NONMMUT031883.2 o de QKI-5.

Para el grupo sh-lncRNA + si-QKI-5 + etopósido, las células GC-1 se transfectaron con sh-lncRNA y si-QKI-5 y posteriormente se trataron con 100 µM de etopósido durante 12 h26. Para los ensayos posteriores de viabilidad celular, las células GC-1 se cultivaron en medio suplementado con suero que contenía 5%, 10% o 20% de YC y se designaron como los grupos de dosis baja de YC (L-YC), dosis media de YC (M-YC) y dosis alta de YC (H-YC), respectivamente. Las concentraciones de suero que contenía YC (5%, 10% y 20% de YC) se determinaron en función de los resultados de experimentos preliminares de gradiente de concentración. Para los grupos sh-lncRNA + H-YC + OE-NC y sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5, las células GC-1 se transfectaron con sh-lncRNA más OE-NC o con sh-lncRNA más OE-QKI-5 durante 48 h y luego se expusieron a suero que contenía 20% de YC durante 24 h.

3. Ensayo con el kit Cell Counting Kit-8
Las células GC-1 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células/pocillo y se cultivaron durante 24 h. Tras la adhesión celular, el medio original se sustituyó por 100 µL de medio completo suplementado con suero que contenía YC, y las células se incubaron durante 6, 12 o 24 h. Después de la incubación, se añadieron 10 µL del reactivo del kit Cell Counting Kit-8 a cada pocillo, y las células se incubaron a 37 °C en la oscuridad durante 2 h. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas.

4. Ensayo de lactato deshidrogenasa
Después de la transfección con sh-NC o sh-lncRNA durante 48 h, se recogió el medio de cultivo de las células GC-1 y se obtuvo el sobrenadante mediante centrifugación. De acuerdo con las instrucciones del kit de ensayo de lactato deshidrogenasa, el sobrenadante se mezcló suavemente con la solución de detección preparada y se transfirió a una placa de 96 pocillos. La placa se incubó a 25 °C en la oscuridad durante 30 min. Se midió la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas, y se calculó la liberación de lactato deshidrogenasa para evaluar el daño celular.

5. Tinción con Calceína AM/yoduro de propidio
Después de la transfección con sh-NC o sh-lncRNA durante 48 h, la supervivencia de las células GC-1 se evaluó mediante tinción con calceína AM/yoduro de propidio (PI). Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 5 × 104 células/pocillo y se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 60%–70%. Las células se enjuagaron suavemente con solución salina tamponada con fosfato y se añadieron 500 µL de solución de tinción con calceína AM/PI a cada pocillo. Las células se incubaron a 37 °C en oscuridad durante 30 min y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. Se contaron las células vivas y muertas utilizando un software de análisis de imágenes y se calculó la proporción de células sobrevivientes.

6. Citometría de flujo
Las células GC-1 se recolectaron por centrifugación y se lavaron suavemente con solución salina tamponada con fosfato. El sedimento celular se resuspendió en 500 µL de tampón de enlace a una densidad de 5 × 105 células/mL. Luego se añadieron 5 µL de anexina V-APC y 5 µL de yoduro de propidio (PI), y la suspensión se mezcló completamente y se incubó a 25 °C en la oscuridad durante 10 min. La apoptosis se analizó mediante citometría de flujo utilizando longitudes de onda de excitación/emisión de 633/660 nm para APC y 488/630 nm para PI. La tasa de apoptosis se evaluó utilizando software de análisis de citometría de flujo.

7. Ensayo de actividad de caspasa-3
Después de los tratamientos indicados, se recolectaron aproximadamente 1 × 106 células GC-1, se lavaron y resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato. Las células se mezclaron con 100 µL del reactivo II del kit de ensayo de actividad de caspasa-3 y se lisaron en hielo durante 15 min. Tras la centrifugación, se recolectaron 50 µL del sobrenadante del lisado y se mezclaron con 40 µL del reactivo I y 10 µL del reactivo III. La mezcla se incubó a 37 °C durante 2 h. Se midió la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplacas, y la actividad de la caspasa-3 se evaluó según las instrucciones del kit.

8. Ensayo de retención de ARN
Las cadenas sentido y antisentido del ARNl NONMMUT031883.2 se sintetizaron según la secuencia correspondiente y se marcaron con biotina. Las células se lisaron en tampón de lisis celular para inmunoprecipitación durante 30 min en hielo, y el sobrenadante que contenía proteínas se recolectó mediante centrifugación. Las perlas magnéticas de estreptavidina se lavaron tres veces con tampón de unión para ARN y se incubaron en tampón de unión que contenía 1% de albúmina sérica bovina durante 30 min.

Las perlas pretratadas se combinaron con las sondas marcadas con biotina e incubaron a 25 °C durante 30 min. Las sondas no unidas se eliminaron mediante separación magnética. Luego se añadió el sobrenadante del lisado celular, y la mezcla se incubó a 4 °C durante 4 h para formar complejos de perlas magnéticas-RNA-proteína. Las perlas magnéticas se lavaron tres veces con tampón de lavado para eliminar las proteínas unidas de forma no específica. El tampón de lavado se eliminó mediante separación magnética, y se añadió tampón de carga 2× SDS. Las muestras se calentaron a 95 °C durante 10 min, y el sobrenadante se recolectó mediante separación magnética para el análisis posterior por inmunotransferencia Western.

9. Construcción de un modelo murino de disfunción espermatogénica
Tras 5 días de aclimatación, ratones macho BALB/c libres de patógenos específicos, que pesaban entre 22 y 25 g y tenían 8 semanas de edad, recibieron ciclofosfamida (CP) por vía intraperitoneal a una dosis de 50 mg/kg una vez al día durante 7 días para establecer un modelo de disfunción espermatogénica14,27. Los ratones que fueron modelados con éxito se asignaron aleatoriamente, mediante una tabla de números aleatorios, a los grupos CP, YC 200 mg/kg, YC 400 mg/kg, YC 800 mg/kg, YC 800 mg/kg + sh-NC y YC 800 mg/kg + sh-lncRNA, con seis ratones en cada grupo.

Los ratones en los grupos tratados con YC recibieron la dosis correspondiente de YC mediante gavaje oral una vez al día durante 30 días13. Para los grupos de 800 mg/kg de YC + sh-NC y 800 mg/kg de YC + sh-lncRNA, tras el establecimiento exitoso del modelo, los ratones fueron anestesiados mediante inhalación de isoflurano al 2 %. Tras confirmar la ausencia del reflejo de retirada del pie en cada ratón y que la frecuencia respiratoria era estable, se afeitó y desinfectó la zona quirúrgica con povidona-yodo. En condiciones asépticas, se realizó una incisión media ventral a través de la piel y la pared corporal anterior a las genitales. Se expuso el testículo manipulando cuidadosamente la almohadilla de grasa epididimaria, teniendo cuidado de evitar daños vasculares. Utilizando un micromanipulador, se visualizaron los túbulos seminíferos y se inyectó lentamente 1 µL de la suspensión de adenovirus (1 × 1010 TU/mL) mediante una aguja de microinyección28. La aguja se mantuvo en su lugar durante 5 minutos tras la inyección antes de retirarla lentamente, y se logró la hemostasia con un hisopo estéril. Posteriormente, se realizó el mismo procedimiento en el testículo contralateral. A continuación, se suturó la incisión y los ratones se dejaron recuperar sobre una almohadilla térmica en el postoperatorio. Los ratones del grupo control recibieron diariamente un volumen igual de solución salina mediante gavaje e inyección.

10. Evaluación de la fertilidad
Tras finalizar la administración del fármaco, los ratones macho de cada grupo se aparearon libremente con ratonas BALB/c en una proporción de 1:2 durante 7 días. Se monitoreó y registró diariamente la formación del tapón vaginal en las ratonas. Una vez confirmado el apareamiento exitoso, se retiraron los ratones macho y las ratonas se mantuvieron individualmente hasta el parto natural. Se obtuvieron nueve ratonas preñadas por grupo, que fueron incluidas en el análisis. Se registró el tamaño promedio de la camada para evaluar la fertilidad masculina en cada grupo.

Al final del período experimental, los ratones fueron sacrificados mediante la administración intraperitoneal de pentobarbital sódico a 100 mg/kg. Este método de eutanasia fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad del Sudeste (número de aprobación: 20230216022). Los testículos y las epídidas fueron cuidadosamente separados, fotografiados y pesados. Los índices de testículo y epídídimo se calcularon como peso del órgano/peso corporal. Se recolectó una epídídimo de cada ratón, se cortó en trozos, se colocó en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato precalentada (37 °C) y se incubó durante 20 min para permitir que los espermatozoides salieran nadando29. La suspensión espermática se mezcló suavemente y se colocaron 10 µL de la suspensión espermática sobre una cámara de recuento de células sanguíneas precalentada. Los espermatozoides se contaron manualmente bajo un microscopio óptico a un aumento de 200×, y los resultados se expresaron como 106/L. Además, el porcentaje de espermatozoides con movimiento progresivo respecto al número total de espermatozoides se calculó como la motilidad espermática13.

11. Determinación de los niveles de hormonas sexuales
Se recogió sangre de la vena orbital de los ratones de cada grupo y se dejó reposar a 25 °C durante 30 min. El suero se recogió mediante centrifugación a 3.000 × g durante 10 min30. Los niveles séricos de testosterona, hormona luteinizante (LH) y hormona foliculoestimulante (FSH) se midieron utilizando los correspondientes kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA).

12. Ensayo de estabilidad del ARN
Las células GC-1 se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos, se transfectaron con si-QKI-5 o si-NC y se cultivaron durante 48 h. Luego se añadió actinomicina D a 5 µg/mL, y las células se recolectaron a las 0, 3, 6 y 9 h. Se aisló el ARN total y el nivel de expresión relativo del lncARN NONMMUT031883.2 se determinó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa tras la transcripción inversa. El nivel relativo de ARN en cada punto de tiempo se calculó utilizando el nivel de expresión a las 0 h como 100%.

13. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa
Las células GC-1 y los tejidos testiculares de ratón se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato y se lisaron para el aislamiento de ARN total. Se generó ADN complementario mediante transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa de AMV. Se realizó la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa utilizando un sistema de PCR en tiempo real y un kit de PCR cuantitativa, empleando ADN complementario como molde de amplificación. Se utilizó U6 como referencia interna para el lncARN NONMMUT031883.2, y GAPDH se utilizó como la referencia interna para QKI-5. La expresión relativa del gen diana se calculó utilizando el 2−ΔΔCt método25. El ARN también se aisló por separado de las fracciones citoplasmática y nuclear para determinar la localización subcelular del ARN largo no codificante NONMMUT031883.2. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en Tabla 1.

GenPrimer directo (5' a 3')Primer inverso (5' a 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tabla 1: Secuencias de cebadores utilizadas para la reacción en cadena de la polimerasa por transcripción reversa cuantitativa. Se indican las secuencias de los cebadores directos e inversos en dirección 5′–3′ para el ARnl NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 y GAPDH.

14. Tinción con hematoxilina y eosina
Los tejidos testiculares y epididimarios de ratón se sumergieron en paraformaldehído al 4% y se fijaron a 4 °C durante 24 h. Después de lavarlos con solución salina tamponada con fosfato, los tejidos se deshidrataron mediante una serie graduada de etanol, se incluyeron en parafina y se seccionaron a 5 µm. Las secciones se calentaron a 60 °C durante 60 min y se desparafinaron en xileno durante 30 min.

Después de la hidratación mediante una serie de etanol graduado, los cortes se tiñeron con hematoxilina durante 5 min, se trataron con solución diferenciadora de ácido clorhídrico-etanol durante 10 s, se lavaron con agua del grifo para la reacción de enrojecimiento, y se tiñeron con eosina al 1% durante 2 min. Luego, los cortes se deshidrataron en etanol al 95% y etanol absoluto, y se aclararon en xileno durante 30 min. Después del secado al aire, los cortes se montaron con goma neutra. Los cambios morfológicos en los testículos y los epidídimos se observaron bajo un microscopio.

15. Inmunofluorescencia
Las secciones parafinadas de testículo de ratón se desparafinaron e hidrataron mediante una serie de etanol gradual, seguido de recuperación de antígenos mediada por microondas en tampón citrato a pH 6,0. Después de enfriar a temperatura ambiente de forma natural, las secciones se incubaron con Triton X-100 al 0,3 % durante 10 min. Las secciones se bloquearon con albúmina sérica bovina al 5 % a 25 °C durante 60 min, se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato y se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo primario contra Ki67. Al día siguiente, se aplicó un anticuerpo secundario de inmunoglobulina G marcado con fluorocromo, y las secciones se incubaron a 37 °C en oscuridad durante 60 min. Tras el enjuague con solución salina tamponada con fosfato, las secciones se contratinjeron con DAPI durante 10 min y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia se analizó mediante software de análisis de imágenes.

Para la tinción por inmunofluorescencia de células GC-1, las células se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 1 × 105 células/pocillo y se incubaron durante 24 h. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 30 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,3 % durante 10 min, se bloquearon con albúmina sérica bovina al 5 % y se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo primario contra QKI-5. El resto del procedimiento se realizó como se describió para las secciones de tejido testicular.

16. Tinción TUNEL
Se desparafinizaron secciones de testículo de ratón en parafina y se hidrataron mediante una serie de etanol graduado, luego se incubaron con Triton X-100 al 0,1 % durante 5 min para aumentar la permeabilidad de la membrana celular. Se aplicó uniformemente una solución de trabajo de proteinasa K a 20 µg/mL sin DNasa, seguida de incubación a 37 °C durante 15 min. Se añadió la solución de detección TUNEL y las secciones se incubaron a 37 °C en oscuridad durante 90 min. Tras la incubación con DAPI durante 10 min, se aplicó un medio de montaje antifade y se observó el tejido testicular mediante microscopía de fluorescencia.

Las células GC-1 se sembraron en placas de 12 pocillos y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 30 min. Después de la permeabilización con Triton X-100 al 0,1 % durante 5 min, se aplicó a las células la solución de detección TUNEL, seguida de una incubación en oscuridad durante 60 min. Luego, las células se tiñeron con DAPI durante 10 min y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia.

17. Inmunotransferencia (Western blotting)
Los tejidos testiculares de ratón y las células GC-1 se lisaron en tampón de lisis celular para inmunoprecipitación en hielo durante 30 min y se rompieron mediante ultrasonido. Tras la centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía proteínas y se determinó la concentración proteica utilizando un kit de ensayo con ácido bicinconínico. El sobrenadante proteico se mezcló con tampón de carga SDS y se calentó en agua hirviendo durante 10 min. Tras la separación mediante electroforesis en gel, las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno y se bloquearon con albúmina sérica bovina al 5 % durante 2 h31.

Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra caspasa-3 escindida (1:500), Bcl-2 (1:1000), caspasa-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), p38 fosforilada (1:1000) o p38 (1:500). Al día siguiente, las membranas se lavaron con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 e incubadas con inmunoglobulina G de cabra anti-conejo a 1:10000 durante 2 h a 25 °C. Se aplicó la solución de trabajo de quimioluminiscencia mejorada sobre la superficie de la membrana y las bandas proteicas se visualizaron mediante un sistema de imagen de geles. La intensidad de las bandas se analizó utilizando software de análisis de imágenes, y la expresión proteica relativa se normalizó respecto a GAPDH (1:3000).

Se utilizó cicloheximida a 50 µg/mL para inhibir la síntesis de proteínas. Para determinar la vida media de QKI-5, las células se recolectaron a las 0, 3, 6 y 9 h, y los niveles de proteína QKI-5 se determinaron posteriormente mediante inmunotransferencia25.

18. Análisis estadístico
Todos los datos se analizaron estadísticamente y se representaron mediante software estadístico, de gráficos y de análisis de imágenes. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para evaluar la normalidad de los datos. Los datos experimentales se presentan como media ± desviación estándar. Se utilizó el análisis de varianza de un solo factor para evaluar las diferencias entre grupos. La prueba t de LSD se utilizó para comparaciones por pares posteriores al análisis cuando las varianzas eran homogéneas, mientras que la prueba T3 de Dunnett se utilizó cuando las varianzas eran heterogéneas. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

La inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 induce apoptosis en espermatogonias
Las células GC-1 fueron transfectadas con sh-lncRNA para reducir la expresión del lncRNA NONMMUT031883.2. En comparación con las células transfectadas con sh-NC, el nivel transcripcional del lncRNA NONMMUT031883.2 se redujo notablemente tras la transfección con sh-lncRNA, lo que confirma una inhibición exitosa (Figura 2A). Tras la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2, la viabilidad de las células GC-1 disminuyó significativamente (Figura 2B), mientras que la liberación de LDH aumentó significativamente, lo que indica un mayor daño celular (Figura 2C). La tinción con Calceína-AM/PI mostró un mayor número de células GC-1 positivas para PI y una proporción reducida de células viables en el grupo sh-lncRNA (Figura 2D, E). La tasa de apoptosis en las células GC-1 aumentó notablemente tras la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 (Figura 2F, G). La proporción de células positivas en el ensayo TUNEL también aumentó significativamente en el grupo sh-lncRNA, lo que indica un mayor nivel de apoptosis (Figura 2H, I). Además, la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 aumentó significativamente la actividad de la caspasa-3 en las células GC-1 (Figura 2J). En el grupo sh-lncRNA, la expresión de Bax aumentó notablemente, la expresión de Bcl-2 disminuyó y la relación caspasa-3 escindida/caspasa-3 total aumentó significativamente (Figura 2K, L). Estos resultados indican que la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 induce apoptosis en las células GC-1. Todos los datos cuantificados se obtuvieron con n = 6.

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Figura 2: La inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 induce apoptosis en espermatogonias. (A) Análisis mediante reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción cuantitativa (qRT-PCR) de la expresión del lncRNA NONMMUT031883.2 en células GC-1. (B) Ensayo con el kit de recuento celular Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para evaluar la viabilidad de células GC-1 tras la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2. (C) Libertación de lactato deshidrogenasa (LDH) desde células GC-1 tras la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2. (D, E) Tinción con calceína-AM/yoduro de propidio (PI) para evaluar la supervivencia de células GC-1 (20×; barra de escala, 100 µm). (F, G) Análisis por citometría de flujo de la apoptosis tras la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2. (H, I) Análisis mediante etiquetado de extremos de rotura con transferasa de desoxinucleotidil dUTP (TUNEL) en células GC-1 (40×; barra de escala, 50 µm). (J) Actividad de la caspasa-3 tras la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2. (K, L) Análisis por inmunotransferencia (Western blot) de la expresión de Bcl-2, Bax, caspasa-3 y caspasa-3 escindida tras la transfección con sh-lncRNA. Los datos se presentan como media ± desviación estándar; n = 6. ***p < 0,001 frente a sh-NC. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

El lncRNA NONMMUT031883.2 interactúa con QKI-5
Se examinó la interacción entre el lncRNA NONMMUT031883.2 y QKI-5 para elucidar el mecanismo molecular subyacente a la apoptosis de espermatogonias. Tras la separación de las fracciones nucleares y citoplasmáticas, el análisis de qRT-PCR mostró que el lncRNA NONMMUT031883.2 se localizaba principalmente en los núcleos de las células GC-1 (Figura 3A). El análisis de inmunofluorescencia mostró que QKI-5 también se concentraba en el núcleo, lo que proporciona una base espacial para la interacción entre el lncRNA NONMMUT031883.2 y QKI-5 (Figura 3B). Se midió la semivida del lncRNA NONMMUT031883.2 tras el tratamiento con actinomicina D para evaluar si QKI-5 regulaba la estabilidad del lncRNA. La reducción de QKI-5 no tuvo un efecto notable sobre la semivida del transcrito del lncRNA (Figura 3C). Tras la inhibición de la síntesis de proteínas mediante cicloheximida, la reducción del lncRNA NONMMUT031883.2 no alteró la expresión proteica de QKI-5 (Figura 3D, E). Luego se evaluó la eficiencia de captura de la sonda antisentido marcada con biotina dirigida al lncRNA NONMMUT031883.2 mediante qRT-PCR. La sonda antisentido enriqueció eficazmente el lncRNA diana y, por lo tanto, se utilizó en el ensayo posterior de precipitación de ARN (Figura 3F). La precipitación de ARN seguida de inmunotransferencia mostró una interacción física específica entre el lncRNA NONMMUT031883.2 y QKI-5 (Figura 3G, H). Estos resultados indican que el lncRNA NONMMUT031883.2 y QKI-5 colocalizan en los núcleos de las células GC-1 y que interactúan de manera específica. Los datos cuantitativos de la Figura 3C y de la Figura 3D, F se obtuvieron con n = 3, y el resto de los datos cuantitativos se obtuvieron con n = 6.

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Figura 3: El lncRNA NONMMUT031883.2 interactúa con QKI-5. (A) Análisis por qRT-PCR de la distribución nuclear y citoplasmática del lncRNA NONMMUT031883.2 en células GC-1. (B) Análisis por inmunofluorescencia de la localización subcelular de QKI-5 en células GC-1 (40×; barra de escala, 50 µm). (C) Análisis por qRT-PCR de la semivida del lncRNA NONMMUT031883.2 tras el tratamiento con actinomicina D y la inhibición de QKI-5 (n = 3). (D, E) Análisis por inmunotransferencia de la expresión proteica de QKI-5 tras el tratamiento con cicloheximida y la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) Validación por qRT-PCR de la eficiencia de enriquecimiento de la sonda antisentido marcada con biotina dirigida contra el lncRNA NONMMUT031883.2. (G, H) Análisis de retención de ARN e inmunotransferencia de la interacción entre el lncRNA NONMMUT031883.2 y QKI-5. Los datos se presentan como media ± desviación estándar; n = 6. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La inhibición de QKI-5 impide la apoptosis de espermatogonias mediante la supresión de la vía de señalización p38 MAPK
Se examinó el papel de QKI-5 y la vía p38 MAPK en la apoptosis de espermatogonias. Tras la transfección con si-QKI-5, los niveles de la proteína QKI-5 se redujeron significativamente en las células GC-1, lo que confirmó una inhibición eficaz (Figura 4A, B). La inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 aumentó significativamente la relación p-p38/p38, mientras que la inhibición simultánea de QKI-5 disminuyó esta relación, lo que indica una supresión de la activación de la vía p38 MAPK (Figura 4C, D). La inhibición de QKI-5 alivió el daño en las células GC-1 provocado por la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2, mientras que el tratamiento con el inductor de apoptosis etopósido redujo significativamente la viabilidad celular (Figura 4E). La inhibición de QKI-5 redujo significativamente la tasa de apoptosis en las células GC-1, mientras que el tratamiento con etopósido aumentó marcadamente la apoptosis (Figura 4F, G). La transfección con si-QKI-5 también redujo significativamente la actividad de la caspasa-3, mientras que el tratamiento con etopósido incrementó dicha actividad (Figura 4H). La inhibición de QKI-5 redujo la expresión de Bax, aumentó la expresión de Bcl-2 y disminuyó significativamente la relación caspasa-3 escindida/caspasa-3, mientras que el tratamiento con etopósido invirtió estos patrones de expresión (Figura 4I, J). Estos resultados indican que la inhibición de QKI-5 suprime la apoptosis en las espermatogonias GC-1 mediante la inhibición de la vía p38 MAPK. Todos los datos cuantificados se obtuvieron con n = 6.

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Figura 4: La inhibición de QKI-5 suprime la apoptosis de espermatogonias al bloquear la vía p38 MAPK. (A, B) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de QKI-5 en células GC-1 tras la transfección con si-NC o si-QKI-5. (C, D) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de p38 fosforilada (p-p38) y p38 total. (E) Análisis CCK-8 de la viabilidad celular de las células GC-1 en los diferentes grupos de tratamiento. (F, G) Análisis citométrico de flujo de la apoptosis tras el tratamiento con etopósido. (H) Actividad de la caspasa-3 en los diferentes grupos de tratamiento. (I, J) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de Bax, Bcl-2, caspasa-3 y caspasa-3 escindida en células GC-1. Los datos se presentan como media ± desviación estándar; n = 6. ***p < 0,001 frente a si-NC o sh-NC; ###p < 0,001 frente a sh-lncRNA; &&&p < 0,001 frente a sh-lncRNA + si-QKI-5. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

YC inhibe la apoptosis de los espermatogonios mediante la vía de señalización del ARNlnc NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
Tras el tratamiento de las células GC-1 con suero que contenía YC durante 6, 12 y 24 h, la viabilidad celular aumentó gradualmente con concentraciones crecientes de YC y tiempos prolongados de exposición. Por lo tanto, se seleccionaron estas concentraciones para experimentos posteriores, con una duración del tratamiento de 24 h (Figura 5A). El tratamiento con YC durante 24 h aumentó notablemente el nivel transcripcional del ARN largo no codificante NONMMUT031883.2 en células GC-1 (Figura 5B) y mejoró su capacidad de unión a QKI-5 (Figura 5C, D). Tras el tratamiento con YC, la expresión de QKI-5 y la relación p-p38/p38 se redujeron notablemente en las células GC-1, lo que sugiere la inhibición de la vía de señalización p38 MAPK (Figura 5E, F). El tratamiento con YC también redujo notablemente la tasa de apoptosis (Figura 5G, H), actividad reducida de la caspasa-3 (Figura 5I), aumento de la expresión de Bcl-2, y disminución de la expresión de Bax y de la relación caspasa-3 escindida/caspasa-3 (Figura 5J, K).

Para evaluar aún más la especificidad de la vía, las células GC-1 fueron transfectadas con OE-NC u OE-QKI-5. La expresión de la proteína QKI-5 aumentó significativamente en las células transfectadas con OE-QKI-5, lo que confirma una sobreexpresión exitosa (Figura 5L, M). La inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 redujo significativamente la viabilidad celular, mientras que el tratamiento con YC revirtió este efecto. La sobreexpresión de QKI-5 atenuó el efecto citoprotector de YC (Figura 5N). El tratamiento con YC también redujo la apoptosis inducida por la inhibición del lncRNA NONMMUT031883.2 (Figura 5O, P), disminuyó la actividad de la caspasa-3 (Figura 5Q), redujo la expresión de Bax, aumentó la expresión de Bcl-2 y disminuyó la relación caspasa-3 escindida/caspasa-3 (Figura 5R, S). En contraste, la sobreexpresión de QKI-5 atenuó los efectos antiapoptóticos de YC. Estos resultados indican que YC regula positivamente el lncRNA NONMMUT031883.2 y promueve su unión a QKI-5, inhibiendo así la vía p38 MAPK y suprimiendo la apoptosis en las células GC-1. Todos los datos cuantificados se obtuvieron con n = 6.

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Figura 5: YC inhibe la apoptosis de espermatogonias vía la vía del ARNlnc NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Análisis con CCK-8 de la viabilidad de células GC-1 tras la exposición a suero conteniendo la cápsula Yangjing (YC) durante 6, 12 y 24 h. (B) Análisis de qRT-PCR de la expresión del lncRNA NONMMUT031883.2 en células GC-1 tras 24 h de tratamiento con YC. (C, D) Análisis de captura de ARN para evaluar la unión del lncARN NONMMUT031883.2 a QKI-5 tras el tratamiento con YC. (E, F) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de QKI-5, p-p38 y p38 tras el tratamiento con YC. (G, H) Análisis por citometría de flujo de la apoptosis en células GC-1 tras el tratamiento con YC. (I) Actividad de la caspasa-3 tras el tratamiento con YC. (J, K) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de Bcl-2, Bax, caspasa-3 y caspasa-3 escindida tras el tratamiento con YC. (L, M) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de QKI-5 tras la transfección con OE-NC u OE-QKI-5. (N) Análisis de viabilidad de células GC-1 mediante CCK-8 (O, P) Análisis citométrico de flujo de la apoptosis en células GC-1 tras la sobreexpresión de QKI-5. (Q) Actividad de la caspasa-3 tras la sobreexpresión de QKI-5. (R, S) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de Bax, Bcl-2, caspasa-3 y caspasa-3 escindida tras la sobreexpresión de QKI-5. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar; n = 6. ***p < 0,001 frente al control; ###p < 0,001 frente a sh-lncRNA; &&&p < 0,001 frente a sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

YC mejora la disfunción espermatogénica inducida por CP en ratones
Se evaluaron los efectos protectores de YC en ratones con disfunción espermatogénica. Los testículos y las epídidas de los ratones en el grupo CP mostraron atrofia marcada, volumen reducido y aspecto opaco. Tras el tratamiento con diferentes dosis de YC, la morfología, la plenitud y el color de los órganos reproductivos mejoraron progresivamente (Figura 6A). Los pesos relativos de los testículos y las epídidas aumentaron significativamente, observándose el mayor efecto en el grupo tratado con YC de 800 mg/kg (Figura 6B, C).

La tasa de deformidad espermática aumentó significativamente en el grupo CP, con anomalías frecuentes que incluían distorsión de la cabeza, enroscamiento de la cola y daño estructural. El número y la motilidad espermática también se redujeron marcadamente. Tras el tratamiento con YC, la morfología espermática mejoró (Figura 6D), el número de espermatozoides aumentó (Figura 6E) y la motilidad espermática se incrementó significativamente (Figura 6F). Los experimentos de apareamiento mostraron que la fertilidad y el tamaño de la camada se redujeron marcadamente en el grupo CP, mientras que el tratamiento con YC mejoró la fertilidad (Figura 6G). Los niveles séricos de testosterona, hormona foliculoestimulante y hormona luteinizante también se redujeron marcadamente en el grupo CP y aumentaron tras el tratamiento con YC (Figura 6H-J). Estos hallazgos indican que YC mejora la atrofia de los órganos reproductivos, la calidad espermática, la fertilidad y la secreción de hormonas sexuales en ratones con disfunción espermatogénica. Los datos cuantitativos de la Figura 6G se obtuvieron con n = 9, y el resto de los datos cuantitativos se obtuvieron con n = 6.

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Figura 6: YC mejora la disfunción espermatogénica inducida por CP en ratones. (A-C) Morfología de los órganos reproductivos en los grupos control, ciclofosfamida (CP) y tratamiento con YC (A), índice testicular (B) y índice del epidídimo (C). (D-F) Morfología espermática (D) (40×; barra de escala, 50 µm), densidad espermática (E) y motilidad espermática (F). (G) Fertilidad masculina evaluada mediante experimentos de apareamiento (n = 9). (H-J) Niveles séricos de hormona folículoestimulante (FSH), testosterona y hormona luteinizante (LH) medidos mediante kits de ensayo inmunoenzimático. Los datos se presentan como media ± desviación estándar; n = 6. ***p < 0,001 frente al control; #p < 0,05, ##p < 0,01 y ###p < 0,001 frente a CP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

YC mejora el daño histopatológico testicular en ratones con disfunción espermatogénica
El efecto reparador de YC sobre el daño en el tejido testicular se evaluó mediante tinción histológica. La tinción con hematoxilina y eosina mostró una estructura tisular intacta, capas celulares bien definidas y un número adecuado de células en el grupo control. En contraste, el grupo CP mostró una marcada atrofia de los túbulos seminíferos y desorganización estructural, reducción en el número de células y colapso de la luz del epidídimo. Tras el tratamiento con YC, el daño testicular y epididimal se redujo, la estructura de los túbulos seminíferos se restauró progresivamente y las células se volvieron más ordenadas y aumentaron en número (Figura 7A, B).

La proporción de células positivas para TUNEL en el tejido testicular aumentó significativamente en el grupo CP y se redujo significativamente tras el tratamiento con YC (Figura 7C, D). La expresión de Bax y la relación caspasa-3 escindida/caspasa-3 aumentaron notablemente en el grupo CP, mientras que la expresión de Bcl-2 disminuyó. El tratamiento con YC revirtió estos patrones de expresión (Figura 7E, F). El análisis de inmunofluorescencia mostró que la intensidad de fluorescencia de Ki67 se redujo marcadamente en el grupo CP y aumentó significativamente tras el tratamiento con YC, lo que sugiere la restauración de la proliferación de las células espermatogénicas (Figura 7G, H). Estos hallazgos indican que YC reduce el daño histopatológico inducido por CP en los testículos y epídidos, inhibe la apoptosis excesiva y promueve la proliferación de las células espermatogénicas. Todos los datos cuantificados se obtuvieron con n = 6.

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Figura 7: YC mejora el daño histopatológico inducido por CP en el tejido testicular de ratón. (A, B) Tinción con hematoxilina y eosina (HE) de los testículos (A) y epídidos (B) tras el tratamiento con YC (20×; barra de escala, 100 µm). (C, D) Análisis TUNEL de apoptosis en el tejido testicular de ratón (40×; barra de escala, 50 µm). (E, F) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de Bax, Bcl-2, caspasa-3 y caspasa-3 escindida en el tejido testicular tras el tratamiento con YC. (G, H) Análisis de inmunofluorescencia de la expresión de Ki67 en el tejido testicular de ratón (40×; barra de escala, 50 µm). Los datos se presentan como media ± desviación estándar; n = 6. ***p < 0,001 frente al control; p < 0,001 frente a CP. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

YC mejora la disfunción espermatogénica y el daño patológico testicular en ratones mediante la vía de la lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
Se evaluó más a fondo la participación de la vía de la lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK en los efectos de YC. La expresión de la lncRNA NONMMUT031883.2 se redujo significativamente en el tejido testicular de ratones del grupo CP, mientras que la expresión de QKI-5 y la relación p-p38/p38 aumentaron marcadamente (Figura 8A-D). Tras el tratamiento con YC, la expresión de la lncRNA NONMMUT031883.2 aumentó, mientras que la expresión de QKI-5 y la relación p-p38/p38 disminuyeron.

Para evaluar aún más la especificidad de la vía, se realizó un silenciamiento del lncRNA NONMMUT031883.2 en ratones mediante sh-lncRNA. El nivel de expresión del lncRNA NONMMUT031883.2 se redujo significativamente, lo que confirma un silenciamiento exitoso (Figura 8E). Tras el silenciamiento del lncRNA NONMMUT031883.2, el nivel de QKI-5 en el tejido testicular no cambió significativamente, pero el nivel de p-p38/p38 aumentó significativamente (Figura 8F, G). El tratamiento con sh-lncRNA atenuó los efectos de YC a 800 mg/kg, lo que resultó en una expresión reducida del lncRNA NONMMUT031883.2 en el tejido testicular (Figura 8H) y en un aumento de los niveles de p-p38/p38 (Figura 8I, J). El tratamiento con YC aumentó significativamente el recuento y la motilidad espermática tras la inducción con CP, mientras que el silenciamiento del lncRNA NONMMUT031883.2 atenuó estos efectos (Figura 8K, L). El tratamiento con YC también incrementó los niveles de testosterona, hormona folículoestimulante y hormona luteinizante en el grupo CP, mientras que el silenciamiento del lncRNA atenuó estos efectos (Figura 8M-O).

La tinción con hematoxilina y eosina mostró que YC mejoró el daño testicular inducido por CP, incluyendo la atrofia de los túbulos seminíferos y la disposición desorganizada de las células espermatogénicas. La inhibición de la lncRNA NONMMUT031883.2 atenuó estos efectos protectores (Figura 8P). Tras el tratamiento con YC, se redujo la expresión de Bax y la relación caspasa-3 escindida/caspasa-3, mientras que aumentó la expresión de Bcl-2. La inhibición de la lncRNA NONMMUT031883.2 revirtió estos efectos sobre las proteínas relacionadas con la apoptosis (Figura 8Q, R). Estos hallazgos indican que YC mejora la calidad del esperma y reduce el daño en el tejido testicular tras la inducción con CP mediante la sobreexpresión de la lncRNA NONMMUT031883.2, la subexpresión de QKI-5 y la inhibición de la vía p38 MAPK. Todos los datos cuantificados se obtuvieron con n = 6.

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Figura 8: YC mejora la espermatogénesis y reduce el daño histopatológico testicular vía la vía del ARNlnc NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Análisis de qRT-PCR de la expresión del lncRNA NONMMUT031883.2 en tejido testicular de ratón. (B-D) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de QKI-5, p-p38 y p38 en tejido testicular de ratón tras el tratamiento con YC. (E) Validación mediante qRT-PCR del silenciamiento del lncRNA NONMMUT031883.2 en tejido testicular de ratón tras la administración de sh-lncRNA. (F, G) Análisis por inmunotransferencia de los niveles de QKI-5 y p-p38/p38 en el tejido testicular de ratones tras la inhibición del ARNlnc NONMMUT031883.2. (H) Análisis de qRT-PCR de la expresión de la lncRNA NONMMUT031883.2 en tejido testicular de ratón tras el tratamiento con YC y la administración de sh-lncRNA. (I, J) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de p-p38 y p38 en tejido testicular de ratón. (K, L) Recuento de espermatozoides (K) y movilidad espermática (L) en los diferentes grupos de tratamiento. (M-O) Los niveles séricos de FSH, testosterona y LH se midieron utilizando kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA). (P) Tinción HE de tejido testicular en ratones tratados con CP (20×barra de escala, 100 µm). (Q, R) Análisis por inmunotransferencia de la expresión de Bcl-2, Bax, caspasa-3 escindida y caspasa-3 en tejido testicular de ratón. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar; n = 6. ***p < 0,001 frente al control; p < 0,001 frente a CP; p < 0,001 frente a 800 mg/kg de YC + sh-NC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Disponibilidad de datos:
Los datos brutos que respaldan los hallazgos de este estudio se proporcionan como un Archivo Suplementario 1.

Archivo suplementario 1: Datos originales. Este archivo de Excel contiene los datos numéricos brutos que sustentan los análisis cuantitativos presentados en las Figuras 2–8. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La disfunción espermatogénica adquirida inducida por quimioterapia es una causa importante de infertilidad masculina32,33,34. Sin embargo, los mecanismos moleculares específicos aún no se comprenden completamente. Los hallazgos de este estudio demuestran que la Cápsula Yangjing (YC) mejora de manera dependiente de la dosis las alteraciones hormonales sexuales, el daño histopatológico testicular y el deterioro de la fertilidad inducidos por ciclofosfamida (CP) en ratones macho. Estas mejoras se asociaron con la sobreexpresión del ARN largo no codificante NONMMUT031883.2 y la inhibición de la vía QKI-5/p38 MAPK, lo que sugiere que YC podría actuar a través de este eje para reducir la apoptosis anormal de espermatogonias.

Se ha documentado ampliamente la toxicidad reproductiva del CP. Su metabolito, el acroleína, puede acumularse en el tejido testicular e inducir la apoptosis de células germinales mediante estrés oxidativo, daño del ADN y otras vías. Las espermatogonias, como células iniciales de la espermatogénesis, son particularmente sensibles a los efectos citotóxicos del CP35,36. Cao et al. descubrieron que la señalización del punto de control del daño del ADN estaba significativamente enriquecida en el tejido testicular de pacientes con azoospermia tras la quimioterapia con CP, mientras que los genes asociados con el desarrollo espermático estaban significativamente regulados a la baja y se interrumpía la integridad estructural de los túbulos seminíferos37. Bcl-2 es una proteína antiapoptótica que actúa manteniendo la integridad de la membrana mitocondrial38. Bax es una proteína proapoptótica, y su sobreexpresión puede promover la liberación de citocromo c desde las mitocondrias hacia el citoplasma, activar la cascada de caspasas e inducir la apoptosis39,40. Saleh et al. demostraron que la exposición al CP causó atrofia de los túbulos seminíferos y edema intersticial en ratones, acompañado de una regulación a la baja de Bcl-2 y una sobreexpresión de Bax, lo que finalmente resultó en una reducción del recuento y la motilidad espermática41. Por lo tanto, la inhibición de la apoptosis excesiva de las espermatogonias inducida por el CP podría representar un objetivo importante para proteger la función reproductiva tras la quimioterapia. En el presente estudio, la intervención con YC redujo de manera dependiente de la dosis las alteraciones inducidas por el CP en la secreción de hormonas sexuales séricas, reparó el daño de los túbulos seminíferos y mejoró la motilidad espermática y la fertilidad masculina. YC también aumentó la expresión de Bcl-2 y redujo la expresión de Bax, la relación caspasa-3 escindida/caspasa-3 y el número de células positivas para TUNEL en el tejido testicular. In vitro, el suero que contenía YC redujo notablemente la apoptosis de las células GC-1 y aumentó la viabilidad celular, lo que respalda aún más un efecto inhibitorio sobre la apoptosis de las espermatogonias.

Los ARN largos no codificantes (lncARN) desempeñan funciones reguladoras importantes en procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la espermatogénesis y la apoptosis de células germinales42,43. La expresión anormal de lncARN puede alterar la función espermatogénica testicular mediante la regulación del estrés oxidativo y de las vías apoptóticas, lo que representa un mecanismo molecular importante de la infertilidad masculina44. Wang et al. descubrieron que el lncARN DNM3OS regula el eje miR-214-5p/E2F2, lo que resulta en una menor actividad de las células espermatogoniales y un aumento de la apoptosis y senescencia, contribuyendo finalmente a la azoospermia no obstructiva45. Investigaciones previas también mostraron que la inhibición del lncARN NONMMUT074098.2 en espermatogonias induce apoptosis25. Estos estudios indican que los lncARN son reguladores importantes de la apoptosis espermatogonial y de la espermatogénesis. En el presente estudio, la inhibición del lncARN NONMMUT031883.2 indujo apoptosis espermatogonial. Su expresión se redujo significativamente en el tejido testicular de ratón tras la inducción con CP, mientras que la intervención con YC restauró parcialmente su expresión. Además, la intervención con YC atenuó la apoptosis espermatogonial anormal inducida por la inhibición del lncARN NONMMUT031883.2, lo que sugiere que el efecto protector de YC podría estar asociado con la regulación de este lncARN.

QKI-5 es una proteína que se une al ARN perteneciente a la familia STAR y participa en varios procesos fisiológicos y patológicos mediante la regulación del empalme, la estabilidad y la eficiencia traduccional del ARNm diana46,47. Investigaciones previas han establecido que QKI-5 es un regulador importante en el sistema reproductivo y que su expresión anormal puede promover la apoptosis de las células germinales y afectar la función espermática mediante la activación de la vía p38 MAPK downstream25. Li et al. descubrieron que la inhibición de la activación de la vía p38 MAPK redujo el daño testicular inducido por CP y restauró la función de la barrera hematotesticular en ratas48. Estos hallazgos sugieren que el eje QKI-5/p38 MAPK podría ser una vía importante en la regulación de la apoptosis de espermatogonias y un posible objetivo terapéutico para la disfunción espermatogénica. En el presente estudio, la expresión de QKI-5 y la fosforilación de p38 aumentaron significativamente en el tejido testicular de ratón tras la inducción con CP, mientras que la intervención con YC redujo la expresión de QKI-5 y la activación de la vía p38 MAPK. El lncARN NONMMUT031883.2 se unió directamente a QKI-5, mientras que la expresión de QKI-5 no afectó la estabilidad del lncARN, lo que sugiere que el lncARN NONMMUT031883.2 podría regular la función de QKI-5 mediante interacción directa. La reducción de QKI-5 atenuó el daño en las células GC-1 causado por la inhibición del lncARN NONMMUT031883.2, mientras que la sobreexpresión de QKI-5 redujo los efectos protectores de YC en las células GC-1. Li et al. informaron que el lncARN NONMMUT074098.2 regula la apoptosis de células germinales mediante unión a QKI-525. Los hallazgos actuales muestran que el lncARN NONMMUT031883.2 también se une a QKI-5 y está implicado en la regulación de la apoptosis de espermatogonias. En conjunto, estos datos sugieren que YC podría aumentar la expresión del lncARN NONMMUT031883.2, inhibir la vía QKI-5/p38 MAPK, reducir la apoptosis anormal de espermatogonias y aliviar la disfunción espermatogénica inducida por CP. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que YC es una formulación herbácea multicomponente que probablemente actúa sobre múltiples dianas. No pueden descartarse otros mecanismos, como los efectos antioxidantes directos de los componentes de YC, la modulación de otras vías de señalización o la regulación epigenética independiente del eje lncARN-QKI-5, y podrían contribuir a los efectos protectores observados.

Se deben reconocer varias limitaciones. El estudio se realizó únicamente en un modelo murino y en la línea celular GC-1, y careció de validación mediante muestras clínicas de pacientes con infertilidad. La espermatogénesis es un proceso complejo, y el ciclo completo de espermatogénesis en ratones dura aproximadamente 35 días49,50. El régimen de YC de 30 días utilizado en este estudio no abarcó un ciclo espermatogénico completo. Por lo tanto, se justifican estudios futuros que empleen protocolos de intervención de ≥35 días para evaluar sistemáticamente los efectos terapéuticos de YC durante todo un ciclo espermatogénico. Además, aún deben explorarse los eventos moleculares precisos posteriores a la unión del lncRNA NONMMUT031883.2 a QKI-5, tales como alteraciones en la actividad de empalme de QKI-5 y su localización subcelular, así como el reconocimiento y regulación de sus dianas de empalme downstream. Asimismo, aunque el tratamiento con YC aumentó la expresión del lncRNA NONMMUT031883.2, los factores de transcripción upstream y los mecanismos epigenéticos aún deben esclarecerse. Se necesitan estudios futuros que incluyan análisis de promotor y ensayos de inmunoprecipitación de cromatina para aclarar la base molecular de la expresión inducida por YC del lncRNA NONMMUT031883.2. Además, estudios futuros deberían evaluar los efectos de YC en pacientes con infertilidad masculina asociada a quimioterapia y analizar la expresión del lncRNA NONMMUT031883.2 en tejido testicular o semen para determinar su posible valor clínico como marcador diagnóstico o terapéutico.

En conclusión, YC aumenta la expresión del ARN largo no codificante NONMMUT031883.2 e inhibe la activación de la vía QKI-5/p38 MAPK, reduciendo así la apoptosis de espermatogonias y el daño testicular, y aliviando la disfunción espermatogénica en ratones. Estos hallazgos aclaran el mecanismo molecular subyacente a los efectos protectores de YC contra la disfunción espermatogénica y amplían el conocimiento actual sobre los roles del ARN largo no codificante NONMMUT031883.2 y la vía QKI-5/p38 MAPK en la regulación de la espermatogénesis. El ARN largo no codificante NONMMUT031883.2 y QKI-5 podrían representar dianas terapéuticas potenciales para la disfunción espermatogénica masculina.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses financieros ni no financieros.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º de beca 82374257), el Cuarto Lote del Programa de Formación de Talento Académico de Excelencia del Hospital Provincial de Medicina China de Jiangsu (n.º de beca k2026yrc74) y los Proyectos de Investigación Científica de Medicina Tradicional China y Medicina Integrada China-Ocidental de la Provincia de Jiangsu (n.º de beca CYTF2026019).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Actinomicina DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559Inhibidor de la transcripción utilizado en ensayos de estabilidad del ARN
Transcriptasa inversa de AMVTakara, Tokio, Japón2621Enzima para la síntesis de ADN complementario
Kit de detección de anexina V-APC/PIBioLab Technology, Pekín, ChinaKFS191Kit para análisis por citometría de flujo de la apoptosis
Medio de montaje antifadeMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Medio de montaje para la preservación de la fluorescencia
Anticuerpo primario BaxAffinity Biosciences, OH, EE. UU.AF0120Anticuerpo primario para la detección de Bax
Kit BCAMacklin, Shanghái, ChinaB917925Kit para la determinación de la concentración de proteínas
Anticuerpo primario Bcl-2Affinity Biosciences, OH, EE. UU.AF0769Anticuerpo primario para la detección de Bcl-2
Albúmina sérica bovinaBioLab Technology, Pekín, ChinaBTN131070Reactivo bloqueante
Kit de detección de calceína/PIBeyotime, Shanghái, ChinaC2015MKit para tinción de células vivas/muertas
Kit de ensayo de actividad de caspasa-3BioLab Technology, Pekín, ChinaQN2866Kit para medir la actividad de la caspasa-3
Anticuerpo primario caspasa-3Abcam, MA, EE. UU.ab184787Anticuerpo primario para la detección de caspasa-3
Reactivo CCK-8MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Reactivo para evaluación de viabilidad celular
Anticuerpo primario caspasa-3 escindidaAbcam, MA, EE. UU.ab32042Anticuerpo primario para la detección de caspasa-3 escindida
CicloheximidaMacklin, Shanghái, ChinaH823111Inhibidor de la síntesis de proteínas utilizado en ensayos de estabilidad proteica
CiclofosfamidaMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Utilizada para inducir disfunción espermatogénica
Reactivo DAPIBeyotime, Shanghái, ChinaC1006Contratinción nuclear
Medio DMEMWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302Medio de cultivo celular para células GC-1
Solución de trabajo ECLSolarbio, Pekín, ChinaSW2030Sustrato quimioluminiscente para la detección de bandas proteicas
EtopósidoMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Agente inductor de apoptosis
Citómetro de flujoBD Biosciences, CA, EE. UU.BD FACSCaliburInstrumento para análisis de apoptosis
Software FlowJoBD Biosciences, CA, EE. UU.v10.8Software para análisis de datos de citometría de flujo
Microscopio de fluorescenciaLeica, Heidelberg, AlemaniaDM3000Instrumento para imágenes de fluorescencia
Anticuerpo secundario IgG marcado con fluorescenciaServicebio, Wuhan, ChinaGB22303Anticuerpo secundario para detección por inmunofluorescencia
Kit ELISA de hormona foliculoestimulanteHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871mKit para medir la hormona foliculoestimulante sérica
Anticuerpo primario GAPDHAffinity Biosciences, OH, EE. UU.T0004Anticuerpo de control de carga para inmunotransferencia Western
Células GC-1Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302Línea celular de espermatogonias de ratón
Sistema de imagen de gelesJinpeng Analysis Instrument, Shanghái, ChinaJP-2880Sistema de imagen para visualización de geles y transferencias
Sistema de imagen de gelesInvitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.iBright CL1500Sistema de imagen quimioluminiscente para inmunotransferencias Western
Anticuerpo secundario de cabra anti-conejo IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB23303Anticuerpo secundario para inmunotransferencia Western
Solución de hematoxilinaBioLab Technology, Pekín, ChinaYT165Tinción nuclear para análisis histológico
Solución de diferenciación de etanol con ácido clorhídricoBeyotime, Shanghái, ChinaC0163SReactivo de diferenciación para tinción con hematoxilina
Software ImageJNational Institutes of Health, EE. UU.1.54hSoftware para cuantificación de imágenes
Tampón de lisis celular para IPBeyotime, Shanghái, ChinaP0013Tampón de lisis para inmunoprecipitación y extracción de proteínas
Anticuerpo primario Ki67Affinity Biosciences, OH, EE. UU.AF0198Anticuerpo primario para la detección de Ki67
Kit de ensayo de citotoxicidad por LDHBeyotime, Shanghái, ChinaC0016Kit para medir la liberación de lactato deshidrogenasa y daño celular
Microscopio ópticoOlympus, Tokio, JapónCKX53Utilizado para conteo de espermatozoides y observación morfológica
Lipofectamina 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.L3000001Reactivo de transfección
Lector de microplacasMolecular Devices, CA, EE. UU.SpectraMax MiniInstrumento para mediciones de absorbancia
Kit ELISA de hormona luteinizante de ratónHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770mKit para medir la hormona luteinizante sérica
Kit ELISA de testosterona de ratónHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101mKit para medir la testosterona sérica
Goma neutraBioLab Technology, Pekín, ChinaQN1253Medio de montaje para secciones histológicas
Anticuerpo primario p38Affinity Biosciences, OH, EE. UU.AF6456Anticuerpo primario para la detección de p38 total
ParaformaldehídoMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Fijador para células y tejidos
Kit PARISInvitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.AM1921Kit para fraccionamiento de ARN nuclear y citoplasmático
Sistema de PCRABI, CA, EE. UU.ABI PRISM 7300Instrumento de PCR en tiempo real
Anticuerpo primario p-p38Affinity Biosciences, OH, EE. UU.AF3455Anticuerpo primario para la detección de p38 fosforilada
Solución de proteinasa KBeyotime, Shanghái, ChinaST532Reactivo para permeabilización del tejido antes de la tinción TUNEL
Membranas de PVDFMillipore, MA, EE. UU.ISEQ00010Membranas para transferencia de proteínas en inmunotransferencia Western
Anticuerpo primario QKI-5Abcam, MA, EE. UU.ab126742Anticuerpo primario para la detección de QKI-5
Tampón de unión de ARNInvitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.65040DTampón para reacciones de unión ARN-proteína
Tampón de carga SDSBeyotime, Shanghái, ChinaP0286Tampón de carga de muestras para SDS-PAGE
Perlas magnéticas de estreptavidinaMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Perlas magnéticas para captura de sondas de ARN marcadas con biotina
Kit TB Green FAST qPCRTakara, Tokio, JapónCN830SKit de reactivos para PCR cuantitativa
Tritón X-100Macklin, Shanghái, ChinaT824275Reactivo de permeabilización
Reactivo TRIzolInvitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.15596018CNReactivo para extracción de ARN total
Solución de detección TUNELBeyotime, Shanghái, ChinaC1086Reactivo para detección de fragmentación del ADN
XilenoMacklin, Shanghái, ChinaX821391Reactivo para eliminación de parafina y aclarado de tejidos

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