Este protocolo visualiza la deposición de componentes de la pared celular como lignina y pectina en secciones transversales de tallos de alfalfa (Medicago sativa L.). El objetivo es identificar tejidos específicos del tallo que podrían ser objeto de mejora para desarrollar nuevas líneas de alfalfa con características deseables de digestibilidad del tallo.
Artículo de método
Incubación in vitro con Líquido Rumenal y Tinción Histológica de Componentes Seleccionados de la Pared Celular en Tallos de Alfalfa (Medicago sativa L.)
En este artículo
Resumen
Resumen
La acumulación de componentes de la pared celular a medida que las plantas crecen limita la nutrición forrajera para los rumiantes. En particular, la deposición de lignina en los tejidos vegetales dificulta la degradación de los carbohidratos de la pared celular, como la celulosa y la hemicelulosa, reduciendo así la cantidad de energía disponible a partir del forraje. Sin embargo, el componente de la pared celular altamente digerible, la pectina, está fácilmente disponible para la degradación. La información sobre la deposición de lignina y pectina en diferentes tipos celulares del tallo puede proporcionar conocimientos mecanicistas sobre los factores subyacentes a la variación en la digestibilidad del tallo entre líneas de alfalfa. La incubación in vitro de secciones transversales del tallo en líquido ruminal simula los procesos que los tejidos del tallo experimentan en el rumen. Combinado con tinciones histológicas y microscopía, este método permite visualizar los cambios en la degradación de los tejidos a lo largo del tiempo, así como la localización de la lignina y la pectina en el tallo. La tinción de Wiesner reacciona con las unidades aldehído guaiacilo (G) de la lignina, tiñéndolas de fucsia. De manera similar, el rojo de rutenio interactúa con los grupos carboxílicos de la pectina, tiñendo la pectina en el tallo en tonos que van del rosa al naranja y al marrón. Este protocolo describe la digestión de secciones transversales del tallo de alfalfa tras la exposición a microorganismos ruminales, seguida de tinción para visualizar los patrones de lignina y pectina en las paredes celulares. El método puede utilizarse para identificar los tejidos del tallo en los que la lignina y la pectina están presentes o ausentes, facilitando comparaciones entre líneas de alfalfa.
Introducción
Una pared celular rodea cada célula vegetal. La celulosa, hemicelulosa, lignina y pectina son componentes de la pared celular y contribuyen a la fibra vegetal, una parte necesaria en la dieta de los rumiantes. Mientras que las pectinas son polisacáridos altamente digeribles (solubles)1, la lignina es un polímero indigerible que limita la degradación de la fibra2. Por lo tanto, la lignina reduce la digestibilidad de la planta y, en última instancia, disminuye la energía disponible para el rumiante a partir del forraje. Sin embargo, la lignina desempeña funciones fisiológicas vegetales importantes, como la conducción de agua a través de la planta mediante el refuerzo de los elementos traqueidales3. Trabajos previos han demostrado que cambios en la fibra del tallo que reducen la lignina o aumentan la pectina podrían mejorar la digestibilidad del tallo y el valor nutritivo del forraje4. Por tanto, este protocolo se centra en estos dos componentes de la pared celular. Las concentraciones totales de lignina y pectina en la pared celular del tallo no proporcionan información suficiente para explicar los mecanismos subyacentes a la digestibilidad de la fibra del tallo5. La incubación in vitro con líquido ruminal y la tinción histológica pueden ofrecer información a nivel celular al visualizar diferencias en los componentes de la pared celular entre plantas con distinta digestibilidad de la fibra del tallo4,6. En el presente protocolo, la alfalfa (Medicago sativa L.), una leguminosa forrajera perenne común, sirve como especie modelo para ilustrar los patrones de lignina y pectina en los tejidos del tallo, que contienen más lignina pero menos pectina que las hojas.
La incubación in vitro con líquido ruminal simula la digestión del forraje en el estómago de los rumiantes, lo que permite observar los efectos de la anatomía del forraje sobre la digestibilidad. Al crear en un tubo de ensayo condiciones similares a las presentes en el rumen, se pueden extraer secciones transversales de tallo adheridas a portaobjetos en diferentes momentos para evaluar el grado de degradación tisular tras la exposición al líquido ruminal6. Este método proporciona un enfoque relativamente sencillo, rápido y económico para visualizar las estructuras anatómicas de los tallos de alfalfa7 y examinar cómo los tipos celulares que contienen diferentes componentes de la pared celular cambian conforme se digiere el tallo.
La tinción histológica de secciones transversales de tallo permite la visualización de los componentes de la pared celular. El floroglucinol y el ácido clorhídrico (HCl) se combinan para formar el colorante de Wiesner, que resalta los tejidos del tallo que contienen unidades de lignina ricas en guaiacilo8 al reaccionar con monómeros de aldehído G C6C3 (coniferaldehído)9. La lignina está compuesta por múltiples subunidades monoméricas; sin embargo, en todo este artículo, el término «lignina» se refiere únicamente al monómero de la unidad G, ya que es el monómero que reacciona con el colorante de Wiesner10 y, por lo tanto, es el que se visualiza mediante este protocolo. Algunos tejidos, como los vasos del xilema, están siempre lignificados6. De otro modo, la deposición de lignina en los tejidos del tallo de alfalfa comienza cuando inicia el crecimiento secundario (cambial) y coincide con la finalización del alargamiento del entrenudo del tallo6. El rojo de rutenio se une a las sustancias pécticas, que contienen grupos carboxilo que a veces están esterificados y comparten algunas cadenas laterales11. Los grupos carboxílicos de las pectinas presentes en la lámina media y en las paredes celulares primarias interactúan con el rojo de rutenio11. La pectina participa en la elongación celular y, por tanto, está presente en las células durante el crecimiento primario. A lo largo del manuscrito, el término «pectina» se refiere en general al conjunto de pectinas que pueden estar presentes. La combinación de tinción histológica con incubación in vitro ruminal facilita la observación de la ubicación de los componentes de la pared celular en el tallo y resalta cómo cambian los diferentes tipos celulares durante la digestión ruminal. En definitiva, este protocolo puede utilizarse para identificar células del tallo que contienen lignina y pectina y para caracterizar los patrones entre líneas de alfalfa y tiempos de incubación.
Protocolo
Esta investigación se realizó cumpliendo con las directrices institucionales para sujetos animales (IACUC 2301-40689B).
1. Etiquetado de los tubos de muestra
- Preparación y etiquetado de tubos de muestra para incubación, almacenamiento y tinción
- Etiquete previamente cinco conjuntos separados de tubos cónicos desechables de 50 mL con tapón de rosca para cada muestra. Añada el identificador de la muestra y el tiempo de incubación a cada tubo según los usos descritos a continuación.
- Etiquete los tubos de espera previos a la incubación y añada 35 mL de agua ultrapura.
- Etiquete los tubos de incubación para su uso en las Secciones 3 y 4. Organice los tubos en gradillas separadas según el tiempo de incubación (0, 4, 8, 24, 48 u 96 h).
NOTA: Utilice un rotulador permanente de grado industrial para evitar que las etiquetas se borren en el baño de agua. - Etiquete los tubos de almacenamiento posteriores a la incubación y añada 35 mL de una mezcla 50:50 de glicerol al 100 % y agua ultrapura. Utilice estos tubos para almacenar las secciones transversales digeridas sobre portaobjetos hasta la tinción.
- Etiquete los tubos previos a la tinción y añada 35 mL de una mezcla 50:50 de etanol al 200 grados y agua ultrapura. Utilice estos tubos para extraer el glicerol de las secciones transversales antes de la tinción.
- Etiquete los tubos de hidratación y añada 35 mL de agua ultrapura.
2. Seccionado transversal del tallo y montaje en portaobjetos
- Con pinzas, seleccione un segmento de tallo a la vez de los tallos de la muestra y excise el centro del segmento.
NOTA: Utilice cuatro tallos por muestra como réplicas técnicas para cada réplica biológica. Seleccione al azar los cuatro tallos de todos los tallos posibles por muestra. Utilice un conjunto adicional de tallos estándar como control en todas las corridas de incubación. - Corte dos rectángulos de espuma rígida de poliestireno extruido, cada uno de aproximadamente 2,5 cm de largo y 0,6 cm de grosor. Corte una pequeña cuña a lo largo de la longitud de cada pieza para que un entrenudo del tallo encaje firmemente entre las dos piezas de espuma.
- Monte el "sándwich" de tallo sobre la platina de un microtomo deslizante capaz de producir secciones de 100 μm de grosor. Con un pincel de punta fina, coloque una gota de agua sobre el tallo y la cuchilla del microtomo para facilitar un corte limpio.
- Corte secciones transversales del tallo con un grosor de 100 μm. Utilice el pincel para transferir cada sección transversal a una placa de Petri previamente etiquetada que contenga agua ultrapura para almacenamiento temporal, y retire cualquier espuma del recipiente.
NOTA: Reemplace la cuchilla del microtomo si la espuma se desgarra, ya que el desgarro puede indicar una cuchilla desafilada. - Etiquete manualmente dos portaobjetos estándar de 25 mm × 75 mm para cada muestra en cada tiempo de incubación (2 coloraciones × 6 puntos temporales = 12 portaobjetos por muestra para cada una de las réplicas biológicas). Incluya el identificador de la muestra, el tiempo de incubación y la coloración en cada etiqueta.
- Corte un trozo de cinta adhesiva doble cara de 2 mm de ancho y 2,5 cm de largo. Coloque el lado corto de la cinta a 0,5 cm del fondo del portaobjetos, con la cara adhesiva hacia abajo, y presione firmemente la cara de papel encerado de la cinta mientras lleva guantes para asegurar la adherencia.
NOTA: Realice este paso sobre una superficie plana para evitar romper los portaobjetos de vidrio. - Utilice un microscopio estereoscópico para orientar todas las secciones transversales en la misma dirección. Retire el papel encerado de la cinta adhesiva doble cara y, manteniendo la orientación de las secciones transversales, transfiéralas a la cinta sobre el portaobjetos previamente etiquetado usando un pincel de punta fina humedecido. Mantenga las secciones transversales ligeramente húmedas.
- Coloque el papel encerado sobre las secciones transversales y pase ligeramente el pincel sobre él para fijar firmemente las secciones transversales a la cinta adhesiva doble cara. Retire el papel encerado y coloque el portaobjetos montado, que contiene cuatro secciones transversales, en el tubo de almacenamiento previamente etiquetado descrito en el paso 1.1.2, asegurándose de que el agua ultrapura cubra las secciones transversales montadas.
- Para la tinción con rojo de rutenio y con la tinción de Wiesner, coloque dos portaobjetos uno frente al otro en cada tubo de almacenamiento, con la cinta adhesiva doble cara orientada hacia afuera.
NOTA: Después de montar todos los portaobjetos y colocarlos en tubos que contengan agua ultrapura, almacene los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente si es necesario.
3. Preparación para la incubación in vitro de secciones transversales de tallo
- Utilice los tubos desechables para centrífuga de 50 mL con tapa roscada preparados para incubación (ver 1.1.3). Agrupe todos los tubos de muestra para cada intervalo de incubación en un solo soporte de plástico.
- Utilice una balanza analítica de cuatro decimales para pesar 0,2 g de un estándar de tallo de maíz molido a 1 mm sobre papel de pesada, y transfiera cuidadosamente el material a cada tubo de incubación, excepto a los tubos de 0 h, que sirven como control sin incubación. Tape los tubos y déjelos aparte hasta su uso.
NOTA: El estándar de tallo de maíz proporciona energía para mantener a los microbios ruminales durante la incubación, ya que la biomasa de las secciones transversales del tallo es insuficiente para mantener la actividad microbiana. - Llene un baño de agua con circulación con suficiente agua y equilibre a 39 °C antes de comenzar la incubación. Ajuste la profundidad del agua para cubrir la marca de 35 mL en los tubos de 50 mL, y utilice un aireador si es necesario para mantener una circulación y temperatura uniformes del agua.
- Preparación del tampón de McDougall para la solución de inoculación
- Prepare el tampón de McDougall no más de 2 días antes de iniciar las incubaciones.
NOTA: Mezcle el tampón de McDougall con líquido ruminal en una proporción de 4:1 para preparar la solución de inoculación. Ajuste el volumen del tampón según el número de muestras y prepare suficiente solución de inoculación para proporcionar 30 mL por tubo. - Mida 1.600 mL de agua ultrapura. Transfiera 1 L a un matraz Erlenmeyer plano de 3 L y reserve 600 mL para la transferencia y el enjuague de reactivos.
- Coloque una barra magnética de agitación en el matraz Erlenmeyer y coloque el matraz sobre una placa agitadora.
- Coloque un embudo de plástico en el matraz Erlenmeyer. Añada 15,7 g de bicarbonato de sodio (NaHCO₃), 5,9 g de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na₂HPO₄), 0,91 g de cloruro de potasio (KCl), 0,75 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,19 g de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO₄·7H₂O) y 0,06 g de cloruro de calcio dihidratado (CaCl₂), añadiendo un reactivo a la vez y permitiendo que cada uno se disuelva antes de añadir el siguiente. Utilice porciones del agua ultrapura reservada (600 mL) para enjuagar el embudo después de cada adición.
- Después de añadir el cloruro de calcio dihidratado, inserte un difusor de CO₂ para facilitar la disolución y burbujee la solución. Una vez que la solución se vuelva clara, continúe burbujeando durante 10–15 min adicionales.
- Tape el matraz firmemente y asegure el tapón con cinta adhesiva, ya que el calentamiento del tampón podría presurizar el recipiente.
- Guarde la solución a 20 °C durante hasta 2 días. Coloque la solución en un baño de agua a 39 °C el día anterior a su uso, o colóquela directamente en el baño de agua a 39 °C si se utilizará al día siguiente.
- Prepare el tampón de McDougall no más de 2 días antes de iniciar las incubaciones.
4. Incubación in vitro de secciones transversales de tallo
- El día de la incubación, coloque 47 mL de agua y 4 mL de NaOH 1 N en un vaso de precipitados de 100 mL dentro de una campana extractora, y agregue 0,625 g de cisteína-HCl. En un segundo vaso de precipitados de 100 mL, añada 0,625 g de sulfuro de sodio a 47 mL de agua, y mantenga las dos soluciones separadas hasta que se prepare la solución de inoculación.
- Llene una botella térmica aislada con agua caliente para establecer un ambiente cálido durante el transporte de los microorganismos ruminales desde la vaca hasta el laboratorio. Lleve un cubo de cinco galones para transferir el agua caliente desde la botella térmica.
- Vaya al establo para recolectar líquido ruminal de la vaca cánulada asignada al experimento por la administración del establo.
NOTA: Recolecte el líquido ruminal aproximadamente a la misma hora del día y de la misma vaca durante todo el experimento para minimizar las variaciones. Coordine con la administración del establo para notificar con anticipación cuándo estará en el establo para recolectar el líquido ruminal. - Identifique la vaca experimental y use equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio, protección ocular, fundas para botas y guantes de longitud hasta los hombros.
NOTA: Restrinja los procedimientos de los pasos 4.4–4.8 al personal autorizado bajo el protocolo IACUC aplicable. - Transfiera el agua caliente de la botella térmica al cubo de cinco galones. Prepare dos capas de gasa grado 50 (muselina) para filtrar el material ruminal.
- Recolección del líquido ruminal de la vaca cánulada
- Abra cuidadosamente la cánula y coloque el tapón en el cubo de cinco galones con agua caliente para evitar contaminar el tapón. Con una mano enguantada, retire suficiente material del rumen para acceder a la interfase sólido-líquido del rumen.
- Una vez alcanzada la interfase sólido-líquido, recoja varias puñados de material y exprímalos a través de dos capas de gasa grado 50, cada una de aproximadamente 45 cm cuadrados, hacia una botella térmica con tapa de rosca previamente calentada. Descarte el material usado después de exprimir el líquido ruminal a través de la gasa.
- Repita el paso 4.6.2 hasta obtener 1 L de líquido ruminal en la botella térmica por cada conjunto de 60 tubos de inoculación, ajustando el volumen según sea necesario en función del número de muestras a incubarse.
NOTA: Las vacas cánuladas tienen límites específicos sobre la cantidad de líquido ruminal que puede extraerse en una semana determinada. Comuníquese con el encargado del establo para asegurarse de que la cantidad de líquido ruminal extraída no supere el límite establecido para la vaca.
- Tras recolectar suficiente líquido ruminal, cierre firmemente la botella térmica para mantener su temperatura. Vuelva a colocar la cánula y utilice el agua caliente del cubo de cinco galones para la limpieza.
- Descarte las fundas para botas, guantes y gasa usados en el recipiente adecuado para desechos al salir del establo. Regrese al laboratorio lo antes posible para mantener la temperatura del líquido ruminal y las condiciones anóxicas.
- Al regresar al laboratorio, combine las dos soluciones de agente reductor (véase 4.1) en la campana extractora y mézclelas para preparar la solución de reducción.
- Coloque un vaso de precipitados de vidrio de al menos 2 L de capacidad que contenga una barra magnética de agitación sobre una placa agitadora calentada ajustada a <30 °C, y coloque un difusor de CO₂ por encima del líquido. Añada 1.600 mL de tampón de McDougall y agite lentamente sin permitir que el difusor de CO₂ entre en contacto con el líquido.
NOTA: Si lo desea, puede usar un vaso de precipitados de polipropileno a esta baja temperatura. Use CO₂ para desplazar el O₂ y ayudar a mantener condiciones anóxicas. - Forre un embudo grande con dos capas de muselina grado 50 y colóquelo sobre un cilindro graduado de 2 L. Filtre 400 mL de líquido ruminal y añádalos al tampón de McDougall (véase 3.4.7) para preparar la solución de inoculación.
- Agregue 80 mL de la solución de reducción (véase 4.9) a la solución de inoculación y mezcle lentamente. Evite que el difusor de CO₂ entre en contacto con el líquido.
- En la campana extractora, retire las tapas de los tubos de incubación y organícelos en rejillas separadas según el tiempo de incubación. Retire las tapas de los tubos de espera previos a la incubación en preparación para transferir las láminas (véase 1.1.2).
- Seleccione al azar un tubo de espera previo a la incubación a la vez y use pinzas para transferir las láminas montadas al tubo de incubación correspondiente (véase 1.1.3). Coloque cada tubo de incubación que contenga las láminas montadas en una rejilla pequeña de muestra y aparte el tubo de espera previo a la incubación.
NOTA: Utilice dos personas para realizar los pasos 4.14–4.15. Siempre que sea posible, minimice el enfriamiento de la mezcla de líquido ruminal y tampón. - Succione 30 mL de solución de inoculación en una jeringa de 60 mL equipada con una aguja roma de gran calibre. Dispense lentamente la solución por la pared interna del tubo de incubación, purgue el tubo con CO₂ durante aproximadamente 20 s, tápelo y devuélvalo a la rejilla.
- Coloque las rejillas que contienen los tubos inoculados en un baño de agua a 39 °C. Agite suavemente los tubos al menos una vez al día y cambie diariamente la posición de las rejillas para minimizar el calentamiento desigual.
NOTA: La formación de burbujas de gas en los tubos indica fermentación activa. - Al final de cada período de incubación, retire la rejilla correspondiente del baño de agua. Abra un tubo a la vez, retire cada lámina y enjuáguela suavemente con agua ultrapura para eliminar los sólidos y la solución de inoculación residual.
- Coloque las láminas enjuagadas en los tubos de almacenamiento posteriores a la incubación que contienen la mezcla de glicerol-agua descrita en el paso 1.1.4.
5. Tinción de secciones transversales para lignina
- Si las láminas se han almacenado en una mezcla de glicerol-agua al 50:50, transfiera ambas láminas que contienen las secciones transversales montadas a tubos de lavado previo a la tinción que contienen la solución de etanol-agua ultrapura (ver 1.1.5). Almacene los tubos durante la noche en un refrigerador para eliminar el glicerol antes de la tinción.
- Prepare una solución al 3% de floroglucinol (PG) disolviendo 0,3 g de PG en 10 mL de etanol absoluto en un matraz Erlenmeyer de 25 mL envuelto en papel de aluminio para proteger el reactivo fotosensible de la luz. Tape y etiquete el matraz con el nombre de la solución, la fecha de preparación y el nombre del preparador, y almacénelo a 20 °C.
- Retire las láminas de los tubos refrigerados y transfiéralas temporalmente a los tubos de hidratación descritos en el paso 1.1.6, que contienen agua ultrapura al 100%.
NOTA: Mantenga las secciones transversales hidratadas durante el manejo para minimizar la oxidación, que puede dañar las secciones y afectar el posterior análisis de imágenes. - Prepare la tinción de Wiesner en la campana extractora usando una pipeta, mezclando 50 μL de PG al 3% en etanol (ver 5.2) con 25 μL de ácido clorhídrico (HCl) en un vaso de precipitados de 50 mL.
NOTA: Ajuste las cantidades según el número de láminas, manteniendo una proporción de PG a HCl de 2:1.
ADVERTENCIA: Manipule el ácido clorhídrico en la campana extractora porque es corrosivo para los metales, causa quemaduras graves en la piel y daño ocular, y puede provocar irritación respiratoria. Evite inhalar vapores o aerosoles, use guantes protectores adecuados, ropa, protección ocular y facial, y lávese bien la piel expuesta después de manipularlo. - Retire una lámina del tubo y seque suavemente el vidrio alrededor de la cinta de doble cara con un tejido de bajo desprendimiento de pelusas para evitar que el colorante se salga de la cinta. Coloque la lámina sobre una bandeja de plástico pequeña y use una pipeta para aplicar varias gotas de la tinción de Wiesner sobre las secciones transversales.
- Ajuste un temporizador a 12 min y cubra las láminas con papel de aluminio para protegerlas de la luz. Revise las secciones transversales durante la tinción y vuelva a aplicar el colorante según sea necesario para evitar que se sequen.
NOTA: Evite que las secciones transversales se sequen porque la oxidación puede dañar el tejido y afectar el posterior análisis de imágenes. - Tras 12 min, retire suavemente el exceso de tinción de Wiesner con un tejido de bajo desprendimiento de pelusas. Lave el tejido antes de montarlo para minimizar la exposición del objetivo del microscopio a los vapores corrosivos de HCl.
- Aplique 1–2 gotas de mezcla de glicerol-agua ultrapura al 50% sobre cada sección transversal y cúbrala con una cubreobjetos de 24 mm × 30 mm (grosor No. 1.5). Proceda inmediatamente al análisis microscópico y a la obtención de imágenes.
NOTA: Adquiera las imágenes dentro de las 6–8 h porque la tinción de Wiesner es sensible al tiempo y puede volverse amarilla y difuminarse desde la sección transversal con el paso del tiempo.
6. Tinción de secciones transversales para pectina
- Siga el paso 5.1 para eliminar la mezcla de glicerol y agua ultrapura de los portaobjetos almacenados antes de la tinción.
- Prepare una solución de rojo de rutenio al 0,02 % disolviendo 0,02 g de rojo de rutenio en 100 mL de agua ultrapura en un matraz Erlenmeyer de 125 mL envuelto en papel de aluminio para proteger el reactivo fotosensible de la luz. Tape el matraz y etiquételo con el nombre de la solución, la fecha de preparación y el nombre del preparador, y guárdelo a 20 °C.
- Retire los portaobjetos de los tubos de etanol-agua ultrapura refrigerados y transfiera los portaobjetos correctamente etiquetados que contengan secciones montadas a tubos que contengan agua ultrapura al 100 % (véase 1.1.6) para su almacenamiento temporal.
NOTA: Siga las precauciones de hidratación descritas en el paso 5.3. - Retire un portaobjetos del agua ultrapura usando pinzas y seque el agua alrededor de la cinta con un tejido de bajo desprendimiento de pelusas para evitar que el colorante se extienda sobre el vidrio. Coloque el portaobjetos sobre una bandeja de plástico pequeña.
- Aplique varias gotas de la solución de rojo de rutenio (véase 6.2) para cubrir uniformemente las secciones transversales. Cubra los portaobjetos con papel de aluminio durante 10 min para protegerlos de la luz, luego enjuague suavemente el colorante del portaobjetos con agua ultrapura durante 2 min.
- Seque el exceso de agua del portaobjetos y aplique 1–2 gotas de glicerol al 50 % en agua ultrapura sobre cada sección transversal. Cubra las secciones transversales con una cubreobjetos de 24 mm × 30 mm (grosor No. 1.5) y proceda al análisis microscópico y a la obtención de imágenes.
NOTA: Realice el análisis microscópico el mismo día para obtener resultados óptimos.
7. Imagen en campo claro
- Observe las secciones transversales en iluminación de campo claro utilizando un microscopio con aumentos de 10×, 20× y 40×. Consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros y configuraciones de adquisición de imágenes.
Resultados
El uso de tubos de centrífuga para simular condiciones del rumen permitió una digestión in vitro relativamente rápida y económica de secciones transversales del tallo de Medicago sativa. Mediante un microtomo deslizante, se prepararon secciones transversales de 100 μm de grosor de tallos de M. sativa (Figura 1A). Las secciones transversales de los tallos se adhirieron a portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva de doble cara (Figura 1B) y se sumergieron en una solución de inóculo de líquido ruminal durante períodos de incubación que variaron desde 4 h hasta 96 h (Figura 1C). Para la incubación in vitro, se utilizaron tubos de centrífuga desechables de 50 mL con tapa como recipientes de incubación, a los que se añadieron 0,2 g de sustrato de tallo de maíz molido a 1 mm para mantener a los microorganismos ruminales durante todo el período de incubación. Los tubos se incubaron en un baño de agua mantenido a 39 °C (Figura 1D). La fermentación activa por parte de los microorganismos ruminales se confirmó visualmente mediante la formación de burbujas de gas en la solución de inóculo. Los materiales necesarios para este protocolo están comúnmente disponibles en laboratorios de química húmeda. La cinta adhesiva de doble cara no evitó la degradación del tejido durante la exposición al líquido ruminal, pero retuvo las porciones del tallo que permanecieron tras la digestión, permitiendo tinciones posteriores y la visualización microscópica.
Las secciones transversales de tallo que no fueron sometidas a incubación in vitro (0 h) permitieron la visualización de los componentes iniciales de la pared celular en diferentes tejidos del tallo. Las secciones transversales teñidas con el reactivo de Wiesner identificaron tejidos que mostraban tinción asociada a lignina (Figura 2A–E), mientras que las secciones teñidas con rojo de rutenio resaltaron tejidos que exhibían tinción asociada a pectinas (Figura 3A–E). En las secciones teñidas con Wiesner, las fibras del floema primario maduras mostraron tinción fucsia (Figura 2B–E). Los vasos xilemáticos y el xilema interfascicular también mostraron tinción fucsia (Figura 2B–D). La tinción con rojo de rutenio se observó en la epidermis, el colénquima, el clorénquima, el floema secundario (Figura 3B–E) y la médula (Figura 3B–D). Algunas regiones del xilema interfascicular y de las fibras del floema primario también se tiñeron con rojo de rutenio (Figura 3B–E). Las secciones transversales completas del tallo se visualizaron mediante la unión de una cuadrícula de 5 × 5 imágenes adquiridas con aumento de 10× (Figura 2A y Figura 3A). Se obtuvieron imágenes adicionales de una región de la sección transversal del tallo con aumentos de 10× (Figura 2B y Figura 3B), 20× (Figura 2C y Figura 3C) y 40× por encima (Figura 2D y Figura 3D) y por debajo (Figura 2E y Figura 3E) del cambium vascular.
Los tejidos teñidos con Wiesner de secciones transversales del tallo de M. sativa fueron evidentes en todas las incubaciones in vitro desde 0 h hasta 96 h (Figura 4A–F). A las 0 h, todas las células presentaban bordes definidos (Figura 4A). Después de 8 h, se observó evidencia de degradación del tejido por el desenfoque de los bordes de las células con paredes celulares delgadas y no lignificadas (es decir, sin tinción) (por ejemplo, colénquima) y la desaparición de células (por ejemplo, floema secundario). Después de 24 h, la estructura tridimensional en espiral de los vasos xilemáticos se hizo más evidente a medida que los tejidos circundantes se degradaron (Figura 4D). Más allá de las 24 h, las células sin tinción se degradaron progresivamente y desaparecieron (Figura 4D–F). A medida que estos tejidos se degradaron, la pérdida de soporte anatómico provocó el colapso lateral de la epidermis sin tinción, produciendo la apariencia de una cinta de células delgadas y transparentes a las 24, 48 y 96 h (Figura 4D–F).
La incubación in vitro de secciones transversales del tallo de M. sativa, seguida de tinción con rojo de rutenio, permitió visualizar la tinción asociada a pectinas en los tejidos del tallo tras 0–96 h de exposición al líquido ruminal (Figura 5A–F). Entre las 0 y 4 h, los bordes nítidos alrededor de todas las células indican que estas se encontraban intactas (Figura 5A,B). A medida que el tiempo de incubación avanzó hasta las 8 h, los tejidos con paredes celulares delgadas y no lignificadas en el cortex, incluyendo el colénquima, clorénquima y floema secundario, perdieron progresivamente su integridad estructural, lo que provocó el desdibujamiento de los bordes celulares (Figura 5C). A las 24, 48 y 96 h, gran parte del tejido cortical circundante había desaparecido, mientras que partes de la epidermis, xilema interfascicular, médula y tejidos vasculares permanecieron visibles (Figura 5D–F). La pérdida de la estructura anatómica circundante fue acompañada por un colapso lateral de la región epidérmica. A las 96 h, quedó sustancialmente menos tejido teñido con rojo de rutenio en comparación con los tiempos tempranos de incubación (Figura 5F). En general, la pérdida progresiva del tejido del tallo durante la incubación estuvo acompañada por una reducción en las células que mostraron tinción positiva para rojo de rutenio. Se esperaba la degradación y desaparición de células delgadas, no lignificadas y asociadas a pectinas, ya que las pectinas se degradan fácilmente con el tiempo.
Figura 1: in vitro incubación de secciones transversales de tallo de alfalfa (ASegmentos de tallo de alfalfa se insertaron entre dos piezas de espuma rígida de poliestireno expandido y se montaron en la platina de un microtomo deslizante para obtener secciones transversales.B) Cuatro secciones transversales, cada una 100 μm gruesas, se fijaron a una lámina de vidrio con cinta adhesiva de doble cara para in vitro incubación y tinción histológica. (C) Se colocaron dos portaobjetos de vidrio uno frente al otro, con la cinta de doble cara orientada hacia afuera, en un tubo de 50 mL que contenía 30 mL de solución tampón con inóculo de líquido ruminal y 0,2 g de tallo de maíz molido de 1 mm. El tubo se purgó con CO₂ y se tapó para la incubación. La presencia de burbujas de gas a lo largo del costado del tubo indicó fermentación activa por microorganismos ruminales durante la incubación. (D) Se mantuvieron las gradillas que contenían los tubos de 50 mL en un 39 °C baño de agua durante toda la incubación. El nivel de agua cubrió la solución de inóculo pero permaneció por debajo de las aberturas de los tubos, evitando que el agua entrara en ellos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La tinción de Wiesner en tejidos del tallo de alfalfa indica la distribución de los componentes de la pared celular lignificada. (A–E) Secciones transversales del tallo de alfalfa sin digerir (tiempo de incubación = 0 h) sirvieron como referencia inicial para identificar los tejidos del tallo que presentan tinción de Wiesner. Los vasos xilemáticos (XV), el xilema interfascicular (ifX) y las fibras del floema primario maduras (PP) se tiñeron de fucsia. Aumentos y barras de escala: (A) cuadrícula de 5 × 5 de imágenes unidas adquiridas con aumento de 10×, barra de escala = 500 μm; (B) 10×, barra de escala = 500 μm; (C) 20×, barra de escala = 250 μm; (D, E) 40×, barras de escala = 150 μm. Abreviaturas: Xy = xilema; Ct = córtex; Pi = médula; Ep = epidermis; Co = colénquima; Ch = clorénquima; SP = floema secundario; XV = vasos xilemáticos; ifX = xilema interfascicular; PP = fibras del floema primario maduras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La tinción con rojo de rutenio en tejidos de tallo de alfalfa indica la distribución de polisacáridos pécticos en las paredes celulares. (A–E) Secciones transversales de tallo de alfalfa sin digerir (tiempo de incubación = 0 h) sirvieron como referencia inicial para identificar los tejidos del tallo que presentan tinción con rojo de rutenio. La epidermis (Ep), el colénquima (Co), el clorénquima (Ch), el floema secundario (SP) y la médula (Pi) mostraron tinción roja. El xilema secundario (SX) y el floema primario maduro (PP) también mostraron tinción, mientras que los vasos de xilema (XV) permanecieron relativamente sin teñir. Aumentos y barras de escala: (A) cuadrícula de 5 × 5 de imágenes combinadas adquiridas con aumento de 10×, barra de escala = 500 μm; (B) 10×, barra de escala = 500 μm; (C) 20×, barra de escala = 250 μm; (D, E) 40×, barras de escala = 150 μm. Abreviaturas: Xy = xilema; Ct = córtex; Pi = médula; Ep = epidermis; Co = colénquima; Ch = clorénquima; SP = floema secundario; XV = vasos de xilema; SX = xilema secundario; PP = floema primario maduro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cambios en los tejidos del tallo de alfalfa tras la incubación in vitro y la tinción de Wiesner. Secciones transversales del tallo de alfalfa procedentes de los mismos entrenudos se sometieron a incubación in vitro con líquido ruminal durante (A) 0 h, (B) 4 h, (C) 8 h, (D) 24 h, (E) 48 h y (F) 96 h. Los vasos de xilema (XV), el xilema interfascicular (ifX) y las fibras del floema primario maduras (PP) conservaron la tinción de Wiesner a lo largo de los períodos de incubación. Se observó una tinción débil del ifX en el tejido del tallo inmaduro. A medida que aumentaba el tiempo de incubación, los tejidos circundantes perdieron progresivamente su integridad estructural, haciendo que las estructuras vasculares teñidas restantes se hicieran cada vez más evidentes. Barras de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cambios en los tejidos del tallo de alfalfa tras la incubación in vitro y tinción con rojo de rutenio. Secciones transversales del tallo de alfalfa procedentes de los mismos entrenudos se sometieron a incubación in vitro con líquido ruminal durante (A) 0 h, (B) 4 h, (C) 8 h, (D) 24 h, (E) 48 h y (F) 96 h. Se observó tinción con rojo de rutenio en múltiples tejidos del tallo, mientras que los vasos xilemáticos (XV) permanecieron relativamente sin teñir. A medida que aumentaba el tiempo de incubación, se observó una pérdida progresiva de la estructura del tejido y de la tinción con rojo de rutenio. Partes de los vasos xilemáticos, el xilema interfascicular (ifX) y la región epidérmica (Ep) permanecieron visibles en los tiempos posteriores de incubación. Barras de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
| Parámetro | Configuración |
| Rápido (Enfoque) | 2000 × 1328 |
| Calidad (Captura) | 2000 × 1328 |
| Modo de color | Color RGB |
| Profundidad de bits | 8 bits por canal |
| Profundidad de color efectiva | RGB de 24 bits (8 bits R + 8 bits G + 8 bits B) |
| Ganancia | 2 |
| Tiempo de exposición con aumento de 10x (ms) | 30 |
| Tiempo de exposición con aumento de 20x (ms) | 50 |
| Tiempo de exposición con aumento de 150x (ms) | 150 |
Tabla 1: Configuraciones del microscopio y la cámara para la adquisición de imágenes. Configuraciones del microscopio, la cámara y la adquisición de imágenes utilizadas para la obtención de imágenes en campo claro con un microscopio invertido equipado con una cámara digital de color y software de imagen.
Discusión
El material de alfalfa utilizado en el presente estudio consistió en clones de cinco líneas de alfalfa. Se seleccionaron dos líneas experimentales tras dos ciclos de selección divergente para la digestibilidad in vitro de la fibra detergente neutro (IVNDFD) a partir de plantas madre con IVNDFD baja a las 16 h y IVNDFD baja a las 96 h, o IVNDFD alta a las 16 h y IVNDFD alta a las 96 h12. También se incluyeron en el estudio tres líneas comerciales con antecedentes genéticos desconocidos, y se seleccionaron plantas madre basándose en análisis de espectroscopía de infrarrojo cercano para identificar individuos con (a) lignina más alta, (b) lignina más baja y (c) fibra detergente neutro y fibra detergente ácido más bajas. Las cinco líneas de alfalfa se trasplantaron desde un invernadero en mayo de 2021 a ensayos de campo replicados en dos ubicaciones en Minnesota, EE. UU. Para las cosechas de primer y segundo corte de cada temporada de crecimiento, se cosecharon 10 tallos de cada línea de alfalfa en las etapas de madurez vegetativa, brotación temprana, floración temprana, floración y vaina verde. Se resecó el séptimo entrenudo desde la base de cada tallo y se colocó en un tubo de 50 mL que contenía una mezcla 50:50 de etanol al 200 grados y agua ultrapura para su almacenamiento hasta la incubación de las secciones transversales. Este método se desarrolló basándose en trabajos previamente realizados por el grupo de laboratorio en la década de 1990, en los que se seleccionó el séptimo entrenudo como unidad de estudio4,6.
In vitro se utilizó la incubación con líquido ruminal y la tinción histológica de tallos de alfalfa para obtener información sobre los patrones de deposición de componentes de la pared celular en los tejidos del tallo degradados. Las incubaciones in vitro simularon el grado de degradación que un tallo de alfalfa experimenta en el rumen, y la tinción histológica posterior resaltó la lignina y la pectina en las células donde estos componentes de la pared celular permanecieron detectables tras la digestión microbiana controlada en el tiempo. El uso de un microtomo deslizante aseguró un grosor estandarizado de las secciones transversales para minimizar los artefactos de corte que podrían interferir con los resultados13. Aunque en el presente protocolo solo se examinaron la lignina y la pectina, otras tinciones como azul de toluidina, azul de Astra y Direct Red 23 también pueden utilizarse para la tinción histológica de estos y otros componentes de la pared celular14,15,16. Además, puede emplearse luz polarizada para detectar la celulosa en las paredes celulares, y reactivos fluorescentes como la safranina O pueden visualizar la lignina17 y los polisacáridos de la pared celular. Asimismo, pueden utilizarse anticuerpos para marcar pectinas específicas18. Más allá de la alfalfa, este protocolo podría aplicarse a otras especies. Sin embargo, las respuestas a la tinción pueden variar entre especies, genotipos, estadios de desarrollo y condiciones ambientales19.
Anteriormente se ha descrito el uso de cinta adhesiva de doble cara de bajo costo para adherir secciones transversales de tallo a portaobjetos de vidrio6,20. Antes de iniciar este protocolo de incubación in vitro, fue necesario identificar una cinta de doble cara que pudiera resistir la inmersión en líquido durante varios días y que estuviera fácilmente disponible. Se evaluaron varios tipos de cinta que diferían en su uso industrial previsto y en grosor. En resumen, se fijaron trozos de cinta de doble cara de 2,5 cm de largo y secciones transversales de tallo a portaobjetos de vidrio, y se sumergieron en agua durante diferentes períodos a lo largo de una semana para determinar si permanecían adheridos a los portaobjetos. Algunas cintas de doble cara se desprendieron de los portaobjetos de vidrio, mientras que otras se volvieron opacas tras una exposición prolongada al líquido. La pérdida de transparencia de la cinta interfirió con la microscopía y evitó la obtención de imágenes de alta calidad de las secciones transversales del tallo. Una cinta de doble cara de vinilo tuvo el mejor desempeño entre los adhesivos evaluados. La cinta utilizada en los experimentos originales se había adquirido en la década de 1990 y seguía siendo efectiva; sin embargo, no fue posible obtener el mismo producto para experimentos posteriores. Por lo tanto, se debe probar la cinta seleccionada antes de su uso para asegurar que tanto la cinta como las secciones transversales permanezcan adheridas durante todo el período de incubación. La cinta también debe mantenerse transparente para permitir la adquisición de imágenes de alta calidad.
La parte de incubación in vitro del protocolo incluyó múltiples pasos dependientes del tiempo que requirieron una planificación y coordinación cuidadosas. El tiempo total necesario para el procedimiento de incubación in vitro puede variar según el tamaño del experimento. Por ejemplo, para generar un conjunto de datos robusto de secciones transversales de tallos, se montaron cuatro tallos únicos de alfalfa en cada portaobjetos por cada muestra × intervalo de incubación in vitro × combinación de colorantes. Con 16 muestras, seis intervalos de incubación y dos colorantes, se requirieron un total de 768 secciones transversales de tallos para cada corrida de incubación in vitro. Se necesitaron aproximadamente 8 h para preparar las 768 secciones transversales, las cuales luego pudieron almacenarse durante la noche en placas de Petri que contenían agua ultrapura y montarse al día siguiente. Antes del montaje, se requirió etiquetar 192 portaobjetos y 96 tubos cónicos (50 mL). El montaje de las secciones requirió 8 h adicionales porque las secciones se orientaron de manera consistente entre los intervalos de incubación y los colorantes para facilitar las comparaciones entre los tejidos de los tallos. Este enfoque requirió más tiempo que el montaje aleatorio de las secciones transversales. Las preparaciones montadas se almacenaron durante la noche en agua ultrapura antes de iniciar la incubación in vitro al día siguiente. Mientras se preparaban y montaban las secciones transversales de tallos de alfalfa, también se debió preparar el tampón de McDougall. El tampón podía prepararse con no más de 2 días de anticipación a la iniciación de la incubación in vitro y debía calentarse a 39 °C antes de la inoculación de las secciones montadas. Por lo tanto, fue necesaria una planificación y preparación cuidadosas para completar con éxito el protocolo.
La tinción de Wiesner se utiliza comúnmente para visualizar estructuras asociadas a la lignina en tejidos vegetales. Aunque este método de tinción es relativamente sencillo21 y razonablemente específico22, tiñe los grupos terminales de cinnamaldehído asociados con unidades de lignina guaiaxil (G)13. En angiospermas dicotiledóneas como la alfalfa, las unidades G y siringil (S) son los componentes principales del polímero de lignina, aunque también están presentes subunidades con anillos H. Por lo tanto, la tinción de Wiesner podría subestimar la lignina total en el tallo, ya que no reacciona con la lignina S. Tanto las unidades G como las S pueden estar presentes en el xilema interfascicular y en las fibras del floema primario (es decir, tejidos esclerenquimatosos); por consiguiente, aunque las unidades S no reaccionen con la tinción de Wiesner, la coloración de las unidades G puede indicar la presencia de estructuras asociadas a la lignina en estos tejidos. La tinción de Mäule podría utilizarse para visualizar las unidades S y proporcionar una representación más completa de las unidades de lignina en el tallo13. Asimismo, puede haber variaciones en la intensidad de la tinción del rojo de rutenio sobre la pectina dependiendo del estado de esterificación o desesterificación del ácido péctico23. La tinción puede variar desde un tono amarillo-anaranjado hasta un matiz rojo brillante. Dado que el rojo de rutenio puede interactuar con varios carbohidratos, el uso de este colorante podría provocar una sobrestimación de la pectina en los tejidos11. Como la proporción de lignina aumenta a medida que el tallo de alfalfa madura, la lignina también podría interferir con la tinción de pectina en tallos más viejos. Las diferencias entre matices de una misma tinción pueden ser difíciles de distinguir visualmente; sin embargo, las tecnologías de análisis de imágenes podrían ayudar a superar esta limitación.
Después de la incubación in vitro con líquido ruminal y la tinción histológica, se pueden visualizar secciones transversales de tallo bajo el microscopio y adquirir imágenes para su análisis posterior. Dado que la tinción de Wiesner se desvanece dentro de las 24 h9, el análisis microscópico en campo claro de tallos teñidos para lignina debe completarse el mismo día de la tinción, idealmente dentro de las 6–8 h, para garantizar una coloración consistente entre las imágenes. La tinción con rojo de rutenio mantiene su intensidad con el tiempo; por lo tanto, la adquisición de imágenes el mismo día es menos crítica. No obstante, las imágenes teñidas con rojo de rutenio también se adquirieron dentro de las 6–8 h para mantener la consistencia. Las imágenes se obtuvieron mediante una cámara digital de microscopio en color de alta definición y alta resolución, equipada con un sensor de imagen CMOS de formato grande. Se utilizaron los mismos ajustes de exposición, ganancia analógica, profundidad de bits, calidad de imagen y enfoque para asegurar la comparabilidad entre las imágenes y minimizar la variación introducida por diferencias en los ajustes de adquisición. El tiempo de exposición se ajustó según el aumento (10×, 20× y 40×) para evitar sobreexposición o subexposición y producir imágenes de alta calidad. Por lo tanto, las comparaciones deben realizarse entre imágenes adquiridas con el mismo aumento para minimizar la variación asociada a diferentes ajustes de exposición. Es posible que los ajustes de imagen deban modificarse según el microscopio y la cámara utilizados (Tabla 1). Otras técnicas de microscopía, incluyendo la microscopía electrónica de barrido 6,20 y la microscopía de fluorescencia14,15,17, también se han utilizado para visualizar componentes de la pared celular, aunque en el presente protocolo se empleó microscopía en campo claro.
Este protocolo generó un gran conjunto de datos de imágenes de secciones transversales de tallos (>15.000), que podría aprovecharse para ampliar la información cualitativa obtenida en este protocolo mediante tinciones histológicas hacia un análisis cuantitativo utilizando tecnologías de aprendizaje automático. Las canalizaciones eficientes de análisis de imágenes pueden automatizar y acelerar la extracción de datos cuantitativos a partir de imágenes. La colaboración con científicos informáticos puede facilitar el desarrollo de herramientas para preprocesar imágenes, eliminar ruido innecesario y extraer características de interés para abordar múltiples hipótesis. Los enfoques de aprendizaje automático requieren conjuntos de datos de entrenamiento y prueba adecuados y de tamaño suficiente para garantizar un rendimiento robusto del modelo. Los conjuntos de datos más pequeños pueden analizarse utilizando enfoques de análisis de imágenes más simples, como la medición manual de rasgos de interés con software de análisis de imágenes como ImageJ24 o con el software de análisis de imágenes asociado al microscopio25. Por lo tanto, considerar el uso posterior previsto de las imágenes puede mejorar la eficiencia al determinar el tipo y número de imágenes que deben adquirirse, así como el enfoque analítico subsiguiente.
Divulgaciones
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo sin relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses. La mención de nombres comerciales o productos en esta publicación tiene únicamente el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. El USDA es un proveedor y empleador que brinda igualdad de oportunidades. Todos los experimentos cumplieron con las leyes vigentes de los Estados Unidos, el país en donde se realizaron.
Agradecimientos
Los autores agradecen a R. Ted Jeo sus aportes sobre trabajos previos relacionados. Agradecemos al Centro de Imagenología de la Universidad de Minnesota - Twin Cities por proporcionar acceso al software de adquisición y análisis de imágenes microscópicas para preparar las imágenes con fines de publicación. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos – Servicio de Investigación Agrícola [062-21500-001-000D] y por el acuerdo cooperativo de no asistencia (N.º 58-5062-2-016).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Foil de aluminio | Boardwalk | 7106BW | 18 in × 1.000 ft; utilizado para proteger las soluciones de tinción sensibles a la luz |
| Cloruro de calcio dihidrato, mínimo 99 % | Sigma Life Science | C7902-500G | N.º CAS 10035-04-8; reactivo para el tampón de McDougall’s |
| Software de cámara | Nikon | NIS-Elements AR 5.42.04 | Software de imagen de 64 bits utilizado para la adquisición y análisis de imágenes |
| Gas de dióxido de carbono | Matheson | UN1013 | Grado técnico; utilizado para mantener condiciones anóxicas durante la preparación y la incubación |
| Baño de agua circulante | Precision | — | Baño de agua circulante controlado por temperatura, utilizado para mantener las muestras a 39 °C |
| Patrón de tallo de maíz | University of Minnesota | NA | Recolectado en otoño de 2023 en St. Paul, Minnesota, EE. UU.; molido a 1 mm y utilizado como sustrato microbiano |
| Cubreobjetos | Thermo Scientific | 3419 | 24 mm × 30 mm, grosor No. 1,5, 1 oz |
| Cámara microscópica digital de color DS-10 con sensor de imagen CMOS de gran formato FX | Nikon | MQA20000 | Cámara digital de color utilizada para adquirir imágenes microscópicas de campo claro |
| Microscopio estereoscópico | Nikon | SMZ18 | Microscopio estereoscópico utilizado para orientar y posicionar secciones transversales de tallo |
| Cinta adhesiva doble cara | SelloTape Office Vinyl Double Sided Tape | 4270 | 2 mm × 53 m; utilizada para fijar secciones transversales de tallo a portaobjetos |
| Balanza eléctrica | AND | GH-202 | Balance analítico con lectura de cuatro decimales |
| Matraz Erlenmeyer (125 mL) | Kimax | 25600 | Matraz de 125 mL; compatible con tapón No. 5 |
| Matraz Erlenmeyer (25 mL) | Pyrex | 4980 | Matraz de 25 mL; compatible con tapón No. 0 |
| Etileno (200 pruebas) | Fisher Scientific | 04-355-720 | Etileno absoluto utilizado para la preparación de soluciones de tinción y enjuagues previos a la tinción |
| Aislamiento rígido de espuma de poliestireno extruido | Owens Corning | 1407788 | 1 in × 2 ft × 2 ft, R-5, espuma de 15 PSI; utilizada para soportar los entrenudos del tallo durante el corte |
| Pinzas | Fisher Scientific | 10-316A | Pinzas de laboratorio utilizadas para manipular segmentos de tallo, portaobjetos y secciones montadas |
| Portaobjetos de vidrio | FisherBrand | 125503 | 25 mm × 75 mm × 1 mm; utilizados para montar secciones transversales de tallo |
| Matraz globo (6 L) | Pyrex | CLS43205L-4EA | Matraz de vidrio de 6 L utilizado para la preparación o manipulación de volúmenes mayores de solución |
| Glicerina, líquido grado laboratorio | Fisher Science Education | 525342C | N.º CAS 56-81-5; glicerol utilizado en soluciones de montaje y almacenamiento |
| Gasa doble capa grado 50 | JINIOHEE Shop | B0FL27KXRN | 100 % algodón, blanqueada; utilizada para filtrar material ruminal y fluido ruminal |
| Probeta graduada (10 mL) | Pyrex | 700024 | Probeta graduada de 10 mL utilizada para medir volúmenes líquidos |
| Ácido clorhídrico | Fisher | A1445-500 | N.º CAS 7647-01-0; utilizado con floroglucinol para preparar la tinción de Wiesner |
| Rotulador industrial superpermanente | Sharpie | 13601 | Punta fina; utilizado para etiquetar tubos de incubación con marcas resistentes al agua |
| Clorhidrato de L-cisteína hidratado | Sigma-Aldrich | C121800-10G | N.º CAS 345909-32-2; agente reductor utilizado en la preparación de la solución de incubación |
| Tejido sin pelusa | Kimberly-Clark | 34155 | 4,5 in × 8,5 in; utilizado para absorber el exceso de líquido de los portaobjetos sin dejar fibras |
| Cuchilla de microtomo de perfil bajo | Leica 819 | 63065-LP | Cuchilla de repuesto de perfil bajo utilizada para la preparación de secciones transversales uniformes de tallo |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Fisher Chemical | M80-500 | N.º CAS 10034-99-8; reactivo para el tampón de McDougall’s |
| Barra de agitación magnética | Fisher Scientific | 03-411-783 | 76 mm × 12 mm; utilizada para mezclar soluciones tampón e inóculo |
| Etiquetas para direcciones postales | Avery | 5167 | 1/2 in × 1 3/4 in; utilizadas para la identificación de muestras y portaobjetos |
| Pincel | Loew-Cornell | — | Serie 7000, redondo No. 3; pincel fino utilizado para transferir y manipular secciones transversales de tallo |
| Placas de Petri con tapa | Becton Dickinson Labware | 81731119 | 60 mm × 15 mm; utilizadas para almacenamiento temporal de secciones transversales de tallo en agua ultrapura |
| Floroglucinol, 1,3,5-trihidroxibenceno | Sigma-Aldrich | P3502-25G | N.º CAS 108-73-6; reactivo utilizado para preparar la tinción de Wiesner |
| Pipeta (100 μL) | Gilson | P 1000; 767547M | Pipeta de volumen ajustable utilizada para dispensar soluciones de tinción |
| Embudo plástico de uso general | Nalgene | 10-437-23E | 150 mm; utilizado para la transferencia y filtración de reactivos |
| Vaso de precipitados de polipropileno (4 L) | Nalgene | 1201-4000 | Vaso de precipitados químicamente resistente de 4 L utilizado para la preparación y mezcla de soluciones de inóculo |
| Cloruro de potasio | Fisher Chemical | P217-500 | N.º CAS 7447-40-7; reactivo para el tampón de McDougall’s |
| Cuchillas de afeitar | Personna | 66-0089 | 0,009 in de grosor; utilizadas para el recorte manual del material de tallo |
| Ruutenio rojo, oxocloruro de rutenio amoniacal | Sigma | R-2751 | N.º CAS 11103-72-3; tinción histológica utilizada para visualizar sustancias pécticas |
| Tijeras | Fiskars | 1063071 | Tijeras de uso general utilizadas para cortar cinta, espuma y otros consumibles |
| Tubos cónicos de centrífuga con tapa roscada (50 mL) | Corning | 430828 | Polipropileno, no pirógeno; utilizados para contener muestras, incubación, enjuagues y almacenamiento |
| Microtomo de deslizamiento | Leica | 2000R | Microtomo de deslizamiento utilizado para preparar secciones transversales de tallo de 100 μm de grosor |
| Bicarbonato de sodio, grado ACS | Fisher Chemical | S233-3 | N.º CAS 144-55-8; reactivo para el tampón de McDougall’s |
| Cloruro de sodio | Fisher Chemical | — | N.º CAS 7647-14-5; reactivo para el tampón de McDougall’s |
| Hidróxido de sodio | Fisher Chemical | S318-500 | N.º CAS 1310-73-2; utilizado en la preparación de la solución reductora |
| fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S-9763 | N.º CAS 7558-79-4 |
| Sulfuro de sodio anhidro, ACS, mínimo 98,0 % | Oakwood Chemicals | 245960 | N.º CAS 1313-84-4; agente reductor utilizado en la preparación de la solución de incubación |
| Cucharilla de laboratorio | Fisher Scientific | 14-375-10 | Esátula de laboratorio utilizada para transferir reactivos en polvo |
| Placa de agitación | Thermolyne by Sybron | 7200 | Placa de agitación magnética utilizada para mezclar soluciones tampón e inóculo |
| Jeringa (60 mL) con aguja ancha | Monoject | 935401028 | Jeringa de 60 mL con aguja de gran calibre utilizada para dispensar la solución de inóculo |
| Porta-tubos de ensayo | Thermo Scientific | 14-809-44 | Porta-tubos utilizados para organizar y sostener tubos de incubación de 50 mL |
| Termómetro | FisherBrand | 13201663 | Termómetro de laboratorio utilizado para verificar la temperatura de las soluciones y del baño de agua |
| Microscopio vertical | Nikon | Eclipse Ni | Microscopio vertical de campo claro utilizado para la visualización e imagen de secciones transversales de tallo teñidas |
| Bomba de uso general | Little Giant Pump Co. | 502203 | Modelo 2E-38N; 115 VAC, 60 Hz, 1,7 A; utilizada para circular agua y mantener una temperatura uniforme en el baño |
| Papel para pesar | VWR Scientific Products | 12578-165 | Papel para pesar desechable utilizado para pesar y transferir reactivos sólidos y sustrato de tallo de maíz |
Referencias
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