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Artículo de método

Incubación in vitro con Líquido Rumenal y Tinción Histológica de Componentes Seleccionados de la Pared Celular en Tallos de Alfalfa (Medicago sativa L.)

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DOI:

10.3791/73286

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18 de septiembre de 2026

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1Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota - Twin Cities, 2United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service

En este artículo

Resumen

Este protocolo visualiza la deposición de componentes de la pared celular como lignina y pectina en secciones transversales de tallos de alfalfa (Medicago sativa L.). El objetivo es identificar tejidos específicos del tallo que podrían ser objeto de mejora para desarrollar nuevas líneas de alfalfa con características deseables de digestibilidad del tallo.

Resumen

La acumulación de componentes de la pared celular a medida que las plantas crecen limita la nutrición forrajera para los rumiantes. En particular, la deposición de lignina en los tejidos vegetales dificulta la degradación de los carbohidratos de la pared celular, como la celulosa y la hemicelulosa, reduciendo así la cantidad de energía disponible a partir del forraje. Sin embargo, el componente de la pared celular altamente digerible, la pectina, está fácilmente disponible para la degradación. La información sobre la deposición de lignina y pectina en diferentes tipos celulares del tallo puede proporcionar conocimientos mecanicistas sobre los factores subyacentes a la variación en la digestibilidad del tallo entre líneas de alfalfa. La incubación in vitro de secciones transversales del tallo en líquido ruminal simula los procesos que los tejidos del tallo experimentan en el rumen. Combinado con tinciones histológicas y microscopía, este método permite visualizar los cambios en la degradación de los tejidos a lo largo del tiempo, así como la localización de la lignina y la pectina en el tallo. La tinción de Wiesner reacciona con las unidades aldehído guaiacilo (G) de la lignina, tiñéndolas de fucsia. De manera similar, el rojo de rutenio interactúa con los grupos carboxílicos de la pectina, tiñendo la pectina en el tallo en tonos que van del rosa al naranja y al marrón. Este protocolo describe la digestión de secciones transversales del tallo de alfalfa tras la exposición a microorganismos ruminales, seguida de tinción para visualizar los patrones de lignina y pectina en las paredes celulares. El método puede utilizarse para identificar los tejidos del tallo en los que la lignina y la pectina están presentes o ausentes, facilitando comparaciones entre líneas de alfalfa.

Introducción

Una pared celular rodea cada célula vegetal. La celulosa, hemicelulosa, lignina y pectina son componentes de la pared celular y contribuyen a la fibra vegetal, una parte necesaria en la dieta de los rumiantes. Mientras que las pectinas son polisacáridos altamente digeribles (solubles)1, la lignina es un polímero indigerible que limita la degradación de la fibra2. Por lo tanto, la lignina reduce la digestibilidad de la planta y, en última instancia, disminuye la energía disponible para el rumiante a partir del forraje. Sin embargo, la lignina desempeña funciones fisiológicas vegetales importantes, como la conducción de agua a través de la planta mediante el refuerzo de los elementos traqueidales3. Trabajos previos han demostrado que cambios en la fibra del tallo que reducen la lignina o aumentan la pectina podrían mejorar la digestibilidad del tallo y el valor nutritivo del forraje4. Por tanto, este protocolo se centra en estos dos componentes de la pared celular. Las concentraciones totales de lignina y pectina en la pared celular del tallo no proporcionan información suficiente para explicar los mecanismos subyacentes a la digestibilidad de la fibra del tallo5. La incubación in vitro con líquido ruminal y la tinción histológica pueden ofrecer información a nivel celular al visualizar diferencias en los componentes de la pared celular entre plantas con distinta digestibilidad de la fibra del tallo4,6. En el presente protocolo, la alfalfa (Medicago sativa L.), una leguminosa forrajera perenne común, sirve como especie modelo para ilustrar los patrones de lignina y pectina en los tejidos del tallo, que contienen más lignina pero menos pectina que las hojas.

La incubación in vitro con líquido ruminal simula la digestión del forraje en el estómago de los rumiantes, lo que permite observar los efectos de la anatomía del forraje sobre la digestibilidad. Al crear en un tubo de ensayo condiciones similares a las presentes en el rumen, se pueden extraer secciones transversales de tallo adheridas a portaobjetos en diferentes momentos para evaluar el grado de degradación tisular tras la exposición al líquido ruminal6. Este método proporciona un enfoque relativamente sencillo, rápido y económico para visualizar las estructuras anatómicas de los tallos de alfalfa7 y examinar cómo los tipos celulares que contienen diferentes componentes de la pared celular cambian conforme se digiere el tallo.

La tinción histológica de secciones transversales de tallo permite la visualización de los componentes de la pared celular. El floroglucinol y el ácido clorhídrico (HCl) se combinan para formar el colorante de Wiesner, que resalta los tejidos del tallo que contienen unidades de lignina ricas en guaiacilo8 al reaccionar con monómeros de aldehído G C6C3 (coniferaldehído)9. La lignina está compuesta por múltiples subunidades monoméricas; sin embargo, en todo este artículo, el término «lignina» se refiere únicamente al monómero de la unidad G, ya que es el monómero que reacciona con el colorante de Wiesner10 y, por lo tanto, es el que se visualiza mediante este protocolo. Algunos tejidos, como los vasos del xilema, están siempre lignificados6. De otro modo, la deposición de lignina en los tejidos del tallo de alfalfa comienza cuando inicia el crecimiento secundario (cambial) y coincide con la finalización del alargamiento del entrenudo del tallo6. El rojo de rutenio se une a las sustancias pécticas, que contienen grupos carboxilo que a veces están esterificados y comparten algunas cadenas laterales11. Los grupos carboxílicos de las pectinas presentes en la lámina media y en las paredes celulares primarias interactúan con el rojo de rutenio11. La pectina participa en la elongación celular y, por tanto, está presente en las células durante el crecimiento primario. A lo largo del manuscrito, el término «pectina» se refiere en general al conjunto de pectinas que pueden estar presentes. La combinación de tinción histológica con incubación in vitro ruminal facilita la observación de la ubicación de los componentes de la pared celular en el tallo y resalta cómo cambian los diferentes tipos celulares durante la digestión ruminal. En definitiva, este protocolo puede utilizarse para identificar células del tallo que contienen lignina y pectina y para caracterizar los patrones entre líneas de alfalfa y tiempos de incubación.

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Protocolo

Esta investigación se realizó cumpliendo con las directrices institucionales para sujetos animales (IACUC 2301-40689B).

1. Etiquetado de los tubos de muestra

  1. Preparación y etiquetado de tubos de muestra para incubación, almacenamiento y tinción
    1. Etiquete previamente cinco conjuntos separados de tubos cónicos desechables de 50 mL con tapón de rosca para cada muestra. Añada el identificador de la muestra y el tiempo de incubación a cada tubo según los usos descritos a continuación.
    2. Etiquete los tubos de espera previos a la incubación y añada 35 mL de agua ultrapura.
    3. Etiquete los tubos de incubación para su uso en las Secciones 3 y 4. Organice los tubos en gradillas separadas según el tiempo de incubación (0, 4, 8, 24, 48 u 96 h).
      NOTA: Utilice un rotulador permanente de grado industrial para evitar que las etiquetas se borren en el baño de agua.
    4. Etiquete los tubos de almacenamiento posteriores a la incubación y añada 35 mL de una mezcla 50:50 de glicerol al 100 % y agua ultrapura. Utilice estos tubos para almacenar las secciones transversales digeridas sobre portaobjetos hasta la tinción.
    5. Etiquete los tubos previos a la tinción y añada 35 mL de una mezcla 50:50 de etanol al 200 grados y agua ultrapura. Utilice estos tubos para extraer el glicerol de las secciones transversales antes de la tinción.
    6. Etiquete los tubos de hidratación y añada 35 mL de agua ultrapura.

2. Seccionado transversal del tallo y montaje en portaobjetos

  1. Con pinzas, seleccione un segmento de tallo a la vez de los tallos de la muestra y excise el centro del segmento.
    NOTA: Utilice cuatro tallos por muestra como réplicas técnicas para cada réplica biológica. Seleccione al azar los cuatro tallos de todos los tallos posibles por muestra. Utilice un conjunto adicional de tallos estándar como control en todas las corridas de incubación.
  2. Corte dos rectángulos de espuma rígida de poliestireno extruido, cada uno de aproximadamente 2,5 cm de largo y 0,6 cm de grosor. Corte una pequeña cuña a lo largo de la longitud de cada pieza para que un entrenudo del tallo encaje firmemente entre las dos piezas de espuma.
  3. Monte el "sándwich" de tallo sobre la platina de un microtomo deslizante capaz de producir secciones de 100 μm de grosor. Con un pincel de punta fina, coloque una gota de agua sobre el tallo y la cuchilla del microtomo para facilitar un corte limpio.
  4. Corte secciones transversales del tallo con un grosor de 100 μm. Utilice el pincel para transferir cada sección transversal a una placa de Petri previamente etiquetada que contenga agua ultrapura para almacenamiento temporal, y retire cualquier espuma del recipiente.
    NOTA: Reemplace la cuchilla del microtomo si la espuma se desgarra, ya que el desgarro puede indicar una cuchilla desafilada.
  5. Etiquete manualmente dos portaobjetos estándar de 25 mm × 75 mm para cada muestra en cada tiempo de incubación (2 coloraciones × 6 puntos temporales = 12 portaobjetos por muestra para cada una de las réplicas biológicas). Incluya el identificador de la muestra, el tiempo de incubación y la coloración en cada etiqueta.
  6. Corte un trozo de cinta adhesiva doble cara de 2 mm de ancho y 2,5 cm de largo. Coloque el lado corto de la cinta a 0,5 cm del fondo del portaobjetos, con la cara adhesiva hacia abajo, y presione firmemente la cara de papel encerado de la cinta mientras lleva guantes para asegurar la adherencia.
    NOTA: Realice este paso sobre una superficie plana para evitar romper los portaobjetos de vidrio.
  7. Utilice un microscopio estereoscópico para orientar todas las secciones transversales en la misma dirección. Retire el papel encerado de la cinta adhesiva doble cara y, manteniendo la orientación de las secciones transversales, transfiéralas a la cinta sobre el portaobjetos previamente etiquetado usando un pincel de punta fina humedecido. Mantenga las secciones transversales ligeramente húmedas.
  8. Coloque el papel encerado sobre las secciones transversales y pase ligeramente el pincel sobre él para fijar firmemente las secciones transversales a la cinta adhesiva doble cara. Retire el papel encerado y coloque el portaobjetos montado, que contiene cuatro secciones transversales, en el tubo de almacenamiento previamente etiquetado descrito en el paso 1.1.2, asegurándose de que el agua ultrapura cubra las secciones transversales montadas.
  9. Para la tinción con rojo de rutenio y con la tinción de Wiesner, coloque dos portaobjetos uno frente al otro en cada tubo de almacenamiento, con la cinta adhesiva doble cara orientada hacia afuera.
    NOTA: Después de montar todos los portaobjetos y colocarlos en tubos que contengan agua ultrapura, almacene los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente si es necesario.

3. Preparación para la incubación in vitro de secciones transversales de tallo

  1. Utilice los tubos desechables para centrífuga de 50 mL con tapa roscada preparados para incubación (ver 1.1.3). Agrupe todos los tubos de muestra para cada intervalo de incubación en un solo soporte de plástico.
  2. Utilice una balanza analítica de cuatro decimales para pesar 0,2 g de un estándar de tallo de maíz molido a 1 mm sobre papel de pesada, y transfiera cuidadosamente el material a cada tubo de incubación, excepto a los tubos de 0 h, que sirven como control sin incubación. Tape los tubos y déjelos aparte hasta su uso.
    NOTA: El estándar de tallo de maíz proporciona energía para mantener a los microbios ruminales durante la incubación, ya que la biomasa de las secciones transversales del tallo es insuficiente para mantener la actividad microbiana.
  3. Llene un baño de agua con circulación con suficiente agua y equilibre a 39 °C antes de comenzar la incubación. Ajuste la profundidad del agua para cubrir la marca de 35 mL en los tubos de 50 mL, y utilice un aireador si es necesario para mantener una circulación y temperatura uniformes del agua.
  4. Preparación del tampón de McDougall para la solución de inoculación
    1. Prepare el tampón de McDougall no más de 2 días antes de iniciar las incubaciones.
      NOTA: Mezcle el tampón de McDougall con líquido ruminal en una proporción de 4:1 para preparar la solución de inoculación. Ajuste el volumen del tampón según el número de muestras y prepare suficiente solución de inoculación para proporcionar 30 mL por tubo.
    2. Mida 1.600 mL de agua ultrapura. Transfiera 1 L a un matraz Erlenmeyer plano de 3 L y reserve 600 mL para la transferencia y el enjuague de reactivos.
    3. Coloque una barra magnética de agitación en el matraz Erlenmeyer y coloque el matraz sobre una placa agitadora.
    4. Coloque un embudo de plástico en el matraz Erlenmeyer. Añada 15,7 g de bicarbonato de sodio (NaHCO₃), 5,9 g de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na₂HPO₄), 0,91 g de cloruro de potasio (KCl), 0,75 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,19 g de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO₄·7H₂O) y 0,06 g de cloruro de calcio dihidratado (CaCl₂), añadiendo un reactivo a la vez y permitiendo que cada uno se disuelva antes de añadir el siguiente. Utilice porciones del agua ultrapura reservada (600 mL) para enjuagar el embudo después de cada adición.
    5. Después de añadir el cloruro de calcio dihidratado, inserte un difusor de CO₂ para facilitar la disolución y burbujee la solución. Una vez que la solución se vuelva clara, continúe burbujeando durante 10–15 min adicionales.
    6. Tape el matraz firmemente y asegure el tapón con cinta adhesiva, ya que el calentamiento del tampón podría presurizar el recipiente.
    7. Guarde la solución a 20 °C durante hasta 2 días. Coloque la solución en un baño de agua a 39 °C el día anterior a su uso, o colóquela directamente en el baño de agua a 39 °C si se utilizará al día siguiente.

4. Incubación in vitro de secciones transversales de tallo

  1. El día de la incubación, coloque 47 mL de agua y 4 mL de NaOH 1 N en un vaso de precipitados de 100 mL dentro de una campana extractora, y agregue 0,625 g de cisteína-HCl. En un segundo vaso de precipitados de 100 mL, añada 0,625 g de sulfuro de sodio a 47 mL de agua, y mantenga las dos soluciones separadas hasta que se prepare la solución de inoculación.
  2. Llene una botella térmica aislada con agua caliente para establecer un ambiente cálido durante el transporte de los microorganismos ruminales desde la vaca hasta el laboratorio. Lleve un cubo de cinco galones para transferir el agua caliente desde la botella térmica.
  3. Vaya al establo para recolectar líquido ruminal de la vaca cánulada asignada al experimento por la administración del establo.
    NOTA: Recolecte el líquido ruminal aproximadamente a la misma hora del día y de la misma vaca durante todo el experimento para minimizar las variaciones. Coordine con la administración del establo para notificar con anticipación cuándo estará en el establo para recolectar el líquido ruminal.
  4. Identifique la vaca experimental y use equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio, protección ocular, fundas para botas y guantes de longitud hasta los hombros.
    NOTA: Restrinja los procedimientos de los pasos 4.4–4.8 al personal autorizado bajo el protocolo IACUC aplicable.
  5. Transfiera el agua caliente de la botella térmica al cubo de cinco galones. Prepare dos capas de gasa grado 50 (muselina) para filtrar el material ruminal.
  6. Recolección del líquido ruminal de la vaca cánulada
    1. Abra cuidadosamente la cánula y coloque el tapón en el cubo de cinco galones con agua caliente para evitar contaminar el tapón. Con una mano enguantada, retire suficiente material del rumen para acceder a la interfase sólido-líquido del rumen.
    2. Una vez alcanzada la interfase sólido-líquido, recoja varias puñados de material y exprímalos a través de dos capas de gasa grado 50, cada una de aproximadamente 45 cm cuadrados, hacia una botella térmica con tapa de rosca previamente calentada. Descarte el material usado después de exprimir el líquido ruminal a través de la gasa.
    3. Repita el paso 4.6.2 hasta obtener 1 L de líquido ruminal en la botella térmica por cada conjunto de 60 tubos de inoculación, ajustando el volumen según sea necesario en función del número de muestras a incubarse.
      NOTA: Las vacas cánuladas tienen límites específicos sobre la cantidad de líquido ruminal que puede extraerse en una semana determinada. Comuníquese con el encargado del establo para asegurarse de que la cantidad de líquido ruminal extraída no supere el límite establecido para la vaca.
  7. Tras recolectar suficiente líquido ruminal, cierre firmemente la botella térmica para mantener su temperatura. Vuelva a colocar la cánula y utilice el agua caliente del cubo de cinco galones para la limpieza.
  8. Descarte las fundas para botas, guantes y gasa usados en el recipiente adecuado para desechos al salir del establo. Regrese al laboratorio lo antes posible para mantener la temperatura del líquido ruminal y las condiciones anóxicas.
  9. Al regresar al laboratorio, combine las dos soluciones de agente reductor (véase 4.1) en la campana extractora y mézclelas para preparar la solución de reducción.
  10. Coloque un vaso de precipitados de vidrio de al menos 2 L de capacidad que contenga una barra magnética de agitación sobre una placa agitadora calentada ajustada a <30 °C, y coloque un difusor de CO₂ por encima del líquido. Añada 1.600 mL de tampón de McDougall y agite lentamente sin permitir que el difusor de CO₂ entre en contacto con el líquido.
    NOTA: Si lo desea, puede usar un vaso de precipitados de polipropileno a esta baja temperatura. Use CO₂ para desplazar el O₂ y ayudar a mantener condiciones anóxicas.
  11. Forre un embudo grande con dos capas de muselina grado 50 y colóquelo sobre un cilindro graduado de 2 L. Filtre 400 mL de líquido ruminal y añádalos al tampón de McDougall (véase 3.4.7) para preparar la solución de inoculación.
  12. Agregue 80 mL de la solución de reducción (véase 4.9) a la solución de inoculación y mezcle lentamente. Evite que el difusor de CO₂ entre en contacto con el líquido.
  13. En la campana extractora, retire las tapas de los tubos de incubación y organícelos en rejillas separadas según el tiempo de incubación. Retire las tapas de los tubos de espera previos a la incubación en preparación para transferir las láminas (véase 1.1.2).
  14. Seleccione al azar un tubo de espera previo a la incubación a la vez y use pinzas para transferir las láminas montadas al tubo de incubación correspondiente (véase 1.1.3). Coloque cada tubo de incubación que contenga las láminas montadas en una rejilla pequeña de muestra y aparte el tubo de espera previo a la incubación.
    NOTA: Utilice dos personas para realizar los pasos 4.14–4.15. Siempre que sea posible, minimice el enfriamiento de la mezcla de líquido ruminal y tampón.
  15. Succione 30 mL de solución de inoculación en una jeringa de 60 mL equipada con una aguja roma de gran calibre. Dispense lentamente la solución por la pared interna del tubo de incubación, purgue el tubo con CO₂ durante aproximadamente 20 s, tápelo y devuélvalo a la rejilla.
  16. Coloque las rejillas que contienen los tubos inoculados en un baño de agua a 39 °C. Agite suavemente los tubos al menos una vez al día y cambie diariamente la posición de las rejillas para minimizar el calentamiento desigual.
    NOTA: La formación de burbujas de gas en los tubos indica fermentación activa.
  17. Al final de cada período de incubación, retire la rejilla correspondiente del baño de agua. Abra un tubo a la vez, retire cada lámina y enjuáguela suavemente con agua ultrapura para eliminar los sólidos y la solución de inoculación residual.
  18. Coloque las láminas enjuagadas en los tubos de almacenamiento posteriores a la incubación que contienen la mezcla de glicerol-agua descrita en el paso 1.1.4.

5. Tinción de secciones transversales para lignina

  1. Si las láminas se han almacenado en una mezcla de glicerol-agua al 50:50, transfiera ambas láminas que contienen las secciones transversales montadas a tubos de lavado previo a la tinción que contienen la solución de etanol-agua ultrapura (ver 1.1.5). Almacene los tubos durante la noche en un refrigerador para eliminar el glicerol antes de la tinción.
  2. Prepare una solución al 3% de floroglucinol (PG) disolviendo 0,3 g de PG en 10 mL de etanol absoluto en un matraz Erlenmeyer de 25 mL envuelto en papel de aluminio para proteger el reactivo fotosensible de la luz. Tape y etiquete el matraz con el nombre de la solución, la fecha de preparación y el nombre del preparador, y almacénelo a 20 °C.
  3. Retire las láminas de los tubos refrigerados y transfiéralas temporalmente a los tubos de hidratación descritos en el paso 1.1.6, que contienen agua ultrapura al 100%.
    NOTA: Mantenga las secciones transversales hidratadas durante el manejo para minimizar la oxidación, que puede dañar las secciones y afectar el posterior análisis de imágenes.
  4. Prepare la tinción de Wiesner en la campana extractora usando una pipeta, mezclando 50 μL de PG al 3% en etanol (ver 5.2) con 25 μL de ácido clorhídrico (HCl) en un vaso de precipitados de 50 mL.
    NOTA: Ajuste las cantidades según el número de láminas, manteniendo una proporción de PG a HCl de 2:1.
    ADVERTENCIA: Manipule el ácido clorhídrico en la campana extractora porque es corrosivo para los metales, causa quemaduras graves en la piel y daño ocular, y puede provocar irritación respiratoria. Evite inhalar vapores o aerosoles, use guantes protectores adecuados, ropa, protección ocular y facial, y lávese bien la piel expuesta después de manipularlo.
  5. Retire una lámina del tubo y seque suavemente el vidrio alrededor de la cinta de doble cara con un tejido de bajo desprendimiento de pelusas para evitar que el colorante se salga de la cinta. Coloque la lámina sobre una bandeja de plástico pequeña y use una pipeta para aplicar varias gotas de la tinción de Wiesner sobre las secciones transversales. 
  6. Ajuste un temporizador a 12 min y cubra las láminas con papel de aluminio para protegerlas de la luz. Revise las secciones transversales durante la tinción y vuelva a aplicar el colorante según sea necesario para evitar que se sequen.
    NOTA: Evite que las secciones transversales se sequen porque la oxidación puede dañar el tejido y afectar el posterior análisis de imágenes.
  7. Tras 12 min, retire suavemente el exceso de tinción de Wiesner con un tejido de bajo desprendimiento de pelusas. Lave el tejido antes de montarlo para minimizar la exposición del objetivo del microscopio a los vapores corrosivos de HCl.
  8. Aplique 1–2 gotas de mezcla de glicerol-agua ultrapura al 50% sobre cada sección transversal y cúbrala con una cubreobjetos de 24 mm × 30 mm (grosor No. 1.5). Proceda inmediatamente al análisis microscópico y a la obtención de imágenes.
    NOTA: Adquiera las imágenes dentro de las 6–8 h porque la tinción de Wiesner es sensible al tiempo y puede volverse amarilla y difuminarse desde la sección transversal con el paso del tiempo.

6. Tinción de secciones transversales para pectina

  1. Siga el paso 5.1 para eliminar la mezcla de glicerol y agua ultrapura de los portaobjetos almacenados antes de la tinción.
  2. Prepare una solución de rojo de rutenio al 0,02 % disolviendo 0,02 g de rojo de rutenio en 100 mL de agua ultrapura en un matraz Erlenmeyer de 125 mL envuelto en papel de aluminio para proteger el reactivo fotosensible de la luz. Tape el matraz y etiquételo con el nombre de la solución, la fecha de preparación y el nombre del preparador, y guárdelo a 20 °C.
  3. Retire los portaobjetos de los tubos de etanol-agua ultrapura refrigerados y transfiera los portaobjetos correctamente etiquetados que contengan secciones montadas a tubos que contengan agua ultrapura al 100 % (véase 1.1.6) para su almacenamiento temporal.
    NOTA: Siga las precauciones de hidratación descritas en el paso 5.3.
  4. Retire un portaobjetos del agua ultrapura usando pinzas y seque el agua alrededor de la cinta con un tejido de bajo desprendimiento de pelusas para evitar que el colorante se extienda sobre el vidrio. Coloque el portaobjetos sobre una bandeja de plástico pequeña.
  5. Aplique varias gotas de la solución de rojo de rutenio (véase 6.2) para cubrir uniformemente las secciones transversales. Cubra los portaobjetos con papel de aluminio durante 10 min para protegerlos de la luz, luego enjuague suavemente el colorante del portaobjetos con agua ultrapura durante 2 min.
  6. Seque el exceso de agua del portaobjetos y aplique 1–2 gotas de glicerol al 50 % en agua ultrapura sobre cada sección transversal. Cubra las secciones transversales con una cubreobjetos de 24 mm × 30 mm (grosor No. 1.5) y proceda al análisis microscópico y a la obtención de imágenes.
    NOTA: Realice el análisis microscópico el mismo día para obtener resultados óptimos.

7. Imagen en campo claro

  1. Observe las secciones transversales en iluminación de campo claro utilizando un microscopio con aumentos de 10×, 20× y 40×. Consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros y configuraciones de adquisición de imágenes.

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Resultados

El uso de tubos de centrífuga para simular condiciones del rumen permitió una digestión in vitro relativamente rápida y económica de secciones transversales del tallo de Medicago sativa. Mediante un microtomo deslizante, se prepararon secciones transversales de 100 μm de grosor de tallos de M. sativa (Figura 1A). Las secciones transversales de los tallos se adhirieron a portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva de doble cara (Figura 1B...

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Discusión

El material de alfalfa utilizado en el presente estudio consistió en clones de cinco líneas de alfalfa. Se seleccionaron dos líneas experimentales tras dos ciclos de selección divergente para la digestibilidad in vitro de la fibra detergente neutro (IVNDFD) a partir de plantas madre con IVNDFD baja a las 16 h y IVNDFD baja a las 96 h, o IVNDFD alta a las 16 h y IVNDFD alta a las 96 h12. También se incluyeron en el estudio tres líneas comerciales con antecedentes genéticos desconocido...

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Divulgaciones

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo sin relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses. La mención de nombres comerciales o productos en esta publicación tiene únicamente el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. El USDA es un proveedor y empleador que brinda igualdad de oportunidades. Todos los experimentos cumplieron con las leyes vigentes de los Estados Unidos, el país en donde se realizaron.

Agradecimientos

Los autores agradecen a R. Ted Jeo sus aportes sobre trabajos previos relacionados. Agradecemos al Centro de Imagenología de la Universidad de Minnesota - Twin Cities por proporcionar acceso al software de adquisición y análisis de imágenes microscópicas para preparar las imágenes con fines de publicación. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos – Servicio de Investigación Agrícola [062-21500-001-000D] y por el acuerdo cooperativo de no asistencia (N.º 58-5062-2-016).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Foil de aluminioBoardwalk7106BW18 in × 1.000 ft; utilizado para proteger las soluciones de tinción sensibles a la luz
Cloruro de calcio dihidrato, mínimo 99 %Sigma Life ScienceC7902-500GN.º CAS 10035-04-8; reactivo para el tampón de McDougall’s
Software de cámaraNikonNIS-Elements AR 5.42.04Software de imagen de 64 bits utilizado para la adquisición y análisis de imágenes
Gas de dióxido de carbonoMathesonUN1013Grado técnico; utilizado para mantener condiciones anóxicas durante la preparación y la incubación
Baño de agua circulantePrecision—Baño de agua circulante controlado por temperatura, utilizado para mantener las muestras a 39 °C
Patrón de tallo de maízUniversity of MinnesotaNARecolectado en otoño de 2023 en St. Paul, Minnesota, EE. UU.; molido a 1 mm y utilizado como sustrato microbiano
CubreobjetosThermo Scientific341924 mm × 30 mm, grosor No. 1,5, 1 oz
Cámara microscópica digital de color DS-10 con sensor de imagen CMOS de gran formato FXNikonMQA20000Cámara digital de color utilizada para adquirir imágenes microscópicas de campo claro
Microscopio estereoscópicoNikonSMZ18Microscopio estereoscópico utilizado para orientar y posicionar secciones transversales de tallo
Cinta adhesiva doble caraSelloTape Office Vinyl Double Sided Tape42702 mm × 53 m; utilizada para fijar secciones transversales de tallo a portaobjetos
Balanza eléctricaANDGH-202Balance analítico con lectura de cuatro decimales
Matraz Erlenmeyer (125 mL)Kimax25600Matraz de 125 mL; compatible con tapón No. 5
Matraz Erlenmeyer (25 mL)Pyrex4980Matraz de 25 mL; compatible con tapón No. 0
Etileno (200 pruebas)Fisher Scientific04-355-720Etileno absoluto utilizado para la preparación de soluciones de tinción y enjuagues previos a la tinción
Aislamiento rígido de espuma de poliestireno extruidoOwens Corning14077881 in × 2 ft × 2 ft, R-5, espuma de 15 PSI; utilizada para soportar los entrenudos del tallo durante el corte
PinzasFisher Scientific10-316APinzas de laboratorio utilizadas para manipular segmentos de tallo, portaobjetos y secciones montadas
Portaobjetos de vidrioFisherBrand12550325 mm × 75 mm × 1 mm; utilizados para montar secciones transversales de tallo
Matraz globo (6 L)PyrexCLS43205L-4EAMatraz de vidrio de 6 L utilizado para la preparación o manipulación de volúmenes mayores de solución
Glicerina, líquido grado laboratorioFisher Science Education525342CN.º CAS 56-81-5; glicerol utilizado en soluciones de montaje y almacenamiento
Gasa doble capa grado 50JINIOHEE ShopB0FL27KXRN100 % algodón, blanqueada; utilizada para filtrar material ruminal y fluido ruminal
Probeta graduada (10 mL)Pyrex700024Probeta graduada de 10 mL utilizada para medir volúmenes líquidos
Ácido clorhídricoFisherA1445-500N.º CAS 7647-01-0; utilizado con floroglucinol para preparar la tinción de Wiesner
Rotulador industrial superpermanenteSharpie13601Punta fina; utilizado para etiquetar tubos de incubación con marcas resistentes al agua
Clorhidrato de L-cisteína hidratadoSigma-AldrichC121800-10GN.º CAS 345909-32-2; agente reductor utilizado en la preparación de la solución de incubación
Tejido sin pelusaKimberly-Clark341554,5 in × 8,5 in; utilizado para absorber el exceso de líquido de los portaobjetos sin dejar fibras
Cuchilla de microtomo de perfil bajoLeica 81963065-LPCuchilla de repuesto de perfil bajo utilizada para la preparación de secciones transversales uniformes de tallo
Sulfato de magnesio heptahidratadoFisher ChemicalM80-500N.º CAS 10034-99-8; reactivo para el tampón de McDougall’s
Barra de agitación magnéticaFisher Scientific03-411-78376 mm × 12 mm; utilizada para mezclar soluciones tampón e inóculo
Etiquetas para direcciones postalesAvery51671/2 in × 1 3/4 in; utilizadas para la identificación de muestras y portaobjetos
PincelLoew-Cornell—Serie 7000, redondo No. 3; pincel fino utilizado para transferir y manipular secciones transversales de tallo
Placas de Petri con tapaBecton Dickinson Labware8173111960 mm × 15 mm; utilizadas para almacenamiento temporal de secciones transversales de tallo en agua ultrapura
Floroglucinol, 1,3,5-trihidroxibencenoSigma-AldrichP3502-25GN.º CAS 108-73-6; reactivo utilizado para preparar la tinción de Wiesner
Pipeta (100 μL)GilsonP 1000; 767547MPipeta de volumen ajustable utilizada para dispensar soluciones de tinción
Embudo plástico de uso generalNalgene10-437-23E150 mm; utilizado para la transferencia y filtración de reactivos
Vaso de precipitados de polipropileno (4 L)Nalgene1201-4000Vaso de precipitados químicamente resistente de 4 L utilizado para la preparación y mezcla de soluciones de inóculo
Cloruro de potasioFisher ChemicalP217-500N.º CAS 7447-40-7; reactivo para el tampón de McDougall’s
Cuchillas de afeitarPersonna66-00890,009 in de grosor; utilizadas para el recorte manual del material de tallo
Ruutenio rojo, oxocloruro de rutenio amoniacalSigmaR-2751N.º CAS 11103-72-3; tinción histológica utilizada para visualizar sustancias pécticas
TijerasFiskars1063071Tijeras de uso general utilizadas para cortar cinta, espuma y otros consumibles
Tubos cónicos de centrífuga con tapa roscada (50 mL)Corning430828Polipropileno, no pirógeno; utilizados para contener muestras, incubación, enjuagues y almacenamiento
Microtomo de deslizamientoLeica2000RMicrotomo de deslizamiento utilizado para preparar secciones transversales de tallo de 100 μm de grosor
Bicarbonato de sodio, grado ACSFisher ChemicalS233-3N.º CAS 144-55-8; reactivo para el tampón de McDougall’s
Cloruro de sodioFisher Chemical—N.º CAS 7647-14-5; reactivo para el tampón de McDougall’s
Hidróxido de sodioFisher ChemicalS318-500N.º CAS 1310-73-2; utilizado en la preparación de la solución reductora
fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4)Sigma AldrichS-9763N.º CAS 7558-79-4
Sulfuro de sodio anhidro, ACS, mínimo 98,0 %Oakwood Chemicals245960N.º CAS 1313-84-4; agente reductor utilizado en la preparación de la solución de incubación
Cucharilla de laboratorioFisher Scientific14-375-10Esátula de laboratorio utilizada para transferir reactivos en polvo
Placa de agitaciónThermolyne by Sybron7200Placa de agitación magnética utilizada para mezclar soluciones tampón e inóculo
Jeringa (60 mL) con aguja anchaMonoject935401028Jeringa de 60 mL con aguja de gran calibre utilizada para dispensar la solución de inóculo
Porta-tubos de ensayoThermo Scientific14-809-44Porta-tubos utilizados para organizar y sostener tubos de incubación de 50 mL
TermómetroFisherBrand13201663Termómetro de laboratorio utilizado para verificar la temperatura de las soluciones y del baño de agua
Microscopio verticalNikonEclipse NiMicroscopio vertical de campo claro utilizado para la visualización e imagen de secciones transversales de tallo teñidas
Bomba de uso generalLittle Giant Pump Co.502203Modelo 2E-38N; 115 VAC, 60 Hz, 1,7 A; utilizada para circular agua y mantener una temperatura uniforme en el baño
Papel para pesarVWR Scientific Products12578-165Papel para pesar desechable utilizado para pesar y transferir reactivos sólidos y sustrato de tallo de maíz

Referencias

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