Flujo de trabajo estandarizado para la recolección de muestras fecales humanas y la extracción automatizada de ácido desoxirribonucleico mediante un procesador de partículas magnéticas

Resumen

El objetivo de este protocolo es estandarizar la recolección de muestras fecales humanas y la extracción automatizada de ácido desoxirribonucleico mediante un procesador de partículas magnéticas.

Resumen

La secuenciación del microbioma intestinal se ha convertido en un enfoque importante para investigar la dinámica de las comunidades microbianas en estados sanos y patológicos. Se ha asociado alteraciones en la composición microbiana con varios trastornos relacionados con el estilo de vida y la edad, incluyendo diabetes, leucemia y enfermedades neurodegenerativas. Dado que diferentes microorganismos presentan características fisiológicas y requisitos ambientales distintos, la recolección, el transporte y el procesamiento estandarizados de muestras fecales son esenciales para preservar la integridad de las muestras y minimizar la variabilidad técnica. Las variaciones introducidas durante el manejo preanalítico y la extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) pueden influir en los análisis posteriores del microbioma y afectar la interpretación de los datos. El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo estandarizado para la recolección de muestras fecales humanas y la extracción automatizada de ADN utilizando el MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (kit de extracción de ácidos nucleicos) y el sistema KingFisher Flex (procesador automatizado de partículas magnéticas). El flujo de trabajo integra un manejo controlado de las muestras con la extracción automatizada de ácidos nucleicos para reducir la variabilidad manual y mejorar la consistencia del procedimiento. El protocolo incluye la recolección, almacenamiento, preparación, extracción automatizada y recuperación de ácidos nucleicos a partir de matrices fecales complejas, todo de forma estandarizada. Los resultados representativos demuestran una recuperación exitosa de ADN adecuado para aplicaciones posteriores, incluyendo la secuenciación del gen del ácido ribonucleico ribosómico 16S (ARNr) y la secuenciación metagenómica de tiro al blanco. El flujo de trabajo estandarizado permite un procesamiento reproducible de muestras, facilita la escalabilidad para estudios del microbioma y promueve una mayor consistencia entre experimentos. La demostración visual ofrece orientación práctica para implementar el procesamiento estandarizado de muestras fecales y la extracción automatizada de ácidos nucleicos en la investigación del microbioma intestinal.

Introducción

El microbioma intestinal es un ecosistema microbiano complejo que influye en el metabolismo del huésped, la inmunidad y la función neurológica, y cuya implicación en diversas enfermedades es cada vez mayor, incluyendo trastornos metabólicos, la enfermedad de Parkinson, el cáncer y la neurodegeneración^1,2. Desempeña un papel importante en el mantenimiento de la fisiología del huésped al influir en el metabolismo, la función inmunitaria, la absorción de nutrientes y la resistencia frente a microorganismos patógenos^3,4. Las mediciones del microbioma robustas y reproducibles son esenciales para traducir estas asociaciones en conocimientos mecanicistas y aplicaciones clínicas. Los avances en las tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS) han revolucionado nuestra comprensión de las complejas comunidades microbianas que residen en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, las variables preanalíticas, como los procedimientos de recolección de muestras fecales, las condiciones de almacenamiento, el manejo, el transporte y los métodos de extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN), pueden alterar selectivamente la estructura de la comunidad microbiana, el rendimiento de ADN y los resultados de la secuenciación^5,6. Tales inconsistencias metodológicas a menudo complican las comparaciones entre estudios.

Entre los pasos preanalíticos críticos, la extracción de ADN representa uno de los determinantes más influyentes en la calidad de los datos del microbioma^7,8. Un protocolo ideal de extracción debe producir de forma constante ADN de alta calidad y alto peso molecular, con contaminación mínima en un gran número de muestras. Las plataformas automatizadas de extracción de ácidos nucleicos pueden mejorar la reproducibilidad, reducir los errores por manipulación manual, disminuir el riesgo de contaminación y aumentar la capacidad de procesamiento. El rendimiento de estas plataformas automatizadas de extracción depende en gran medida de los parámetros del protocolo, incluyendo la homogenización de la muestra, las condiciones de batido con perlas, la química de lisis, las condiciones de incubación y el manejo de perlas magnéticas^9,10. Por lo tanto, establecer un flujo de trabajo estandarizado que integre una recolección uniforme de muestras fecales con la extracción automatizada de ADN es esencial para generar conjuntos de datos del microbioma confiables y reproducibles.

Aquí presentamos un protocolo estandarizado para la recolección, manipulación y extracción automatizada de ADN a partir de muestras fecales humanas, utilizando el kit de extracción de ácidos nucleicos y el procesador automático de partículas magnéticas descritos anteriormente. El protocolo hace hincapié en el manejo controlado de las muestras, la lisis mecánica y química eficaz, la eliminación de inhibidores y las medidas de control de calidad adecuadas para aplicaciones posteriores, incluyendo la secuenciación de amplicones del gen del ácido ribonucleico ribosómico 16S (ARNr), secuenciación del genoma completo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa y secuenciación metagenómica de tipo «shotgun». La demostración visual ofrece orientación práctica para el procesamiento estandarizado de muestras fecales y la extracción automatizada de ácidos nucleicos, con el fin de apoyar investigaciones del microbioma intestinal reproducibles y escalables.

Protocolo

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Ética Institucional de SKAN Research Trust y fue aprobado por el comité (Número de aprobación: SKAN/IEC/2025/04). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recolección de muestras.

NOTA: Todos los reactivos, consumibles y equipos se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Armar el kit de recolección de muestras fecales

1. Prepare un kit de recolección de muestras fecales que contenga un recolector fecal estéril, un tubo de recolección con tapón de rosca (capacidad de 30–50 mL) con espátula adjunta, un tubo de recolección precargado con tampón de estabilización, guantes desechables, material absorbente, una bolsa de transporte sellable etiquetada como material biopeligroso y una hoja de instrucciones (Figura 1).
2. Etiquete cada tubo de recolección con un identificador único de la muestra, la fecha y la hora de recolección utilizando un marcador permanente o una etiqueta preimpresa.
3. Incluya una hoja de instrucciones que describa el procedimiento de recolección de la muestra, las precauciones de manejo, las condiciones de almacenamiento y los requisitos de transporte.
   ​NOTA: El tampón de estabilización se proporciona precargado en el tubo de recolección fecal como parte del kit de recolección fecal. El fabricante no revela la composición ni el volumen del tampón de estabilización. Recolecte aproximadamente 2–5 g de material fecal directamente en el tubo de recolección precargado según las instrucciones del fabricante.

Figura 1. Componentes del kit de recolección de muestras fecales. 
El kit de recolección de muestras fecales incluye guantes desechables, un recolector fecal estéril, un tubo estéril con tapón de rosca para la recolección de heces provisto de una espátula acoplada, una bolsa de transporte sellable etiquetada como material de bioseguridad y un folleto de instrucciones proporcionado a los participantes para la recolección, manipulación, almacenamiento y transporte de la muestra fecal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparar al participante para la recogida de muestras

1. Instruya al participante a lavarse las manos antes de la recolección de la muestra.
2. Instruya al participante a vaciar la vejiga antes de la defecación para evitar la contaminación de la muestra fecal con orina.

3. Recolecte la muestra fecal utilizando un recolector fecal

1. Coloque un recolector fecal estéril sobre el asiento del inodoro para evitar el contacto entre la muestra fecal y el agua del inodoro.
2. Para los recolectores fecales adhesivos, despliegue cuidadosamente el dispositivo a lo largo de los bordes indicados sin romperlo. Siga las instrucciones del fabricante proporcionadas con el recolector fecal y fije el dispositivo firmemente a la parte trasera del asiento del inodoro para crear una superficie de recolección estable.
3. Para los recolectores fecales no adhesivos, coloque el dispositivo sobre la taza del inodoro según las instrucciones del fabricante, de modo que quede bien sostenido.
4. Asegúrese de que el recolector fecal no entre en contacto con el agua del inodoro durante la recolección de la muestra.
5. Indique al participante que realice la defecación directamente sobre el recolector fecal.
6. Póngase los guantes desechables proporcionados en el kit de recolección antes de manipular la muestra.
7. Abra el tubo estéril de recolección y utilice la espátula adjunta para recolectar material fecal de al menos cuatro a cinco regiones distintas de las heces, incluyendo la superficie externa y el núcleo interno. Este procedimiento generalmente proporciona aproximadamente 2–5 g de material fecal, cantidad suficiente para la extracción de ADN.
8. Evite recolectar material fecal que haya estado en contacto con los bordes del recolector fecal o con cualquier superficie externa.
9. Cierre herméticamente el tubo de recolección inmediatamente después de recolectar la muestra.
10. Mezcle completamente la muestra fecal con el tampón de estabilización agitando vigorosamente a mano el tubo cerrado hasta que la muestra quede uniformemente suspendida y no queden grumos grandes.
11. Coloque el tubo de recolección sellado dentro de la bolsa de transporte resistente a fugas y etiquetada como material biológico peligroso, que contenga material absorbente.
12. Retire cuidadosamente el recolector fecal y déjelo caer en el inodoro junto con las heces, asegurándose de que no se derrame nada. Tire de la cadena para desechar juntos el recolector fecal y las heces.

4. Almacenar y transportar muestras fecales

1. Almacene las muestras de acuerdo con las especificaciones del tampón de estabilización utilizado.
2. Almacene las muestras a temperatura ambiente si el tampón de estabilización permite la conservación en condiciones ambientales. Alternativamente, almacene las muestras a 4 °C para almacenamiento a corto plazo (≤24–48 h) o a −20 °C hasta −80 °C para almacenamiento prolongado.
3. Almacene las muestras según las recomendaciones del fabricante. Las muestras recogidas utilizando el tampón de estabilización empleado en este estudio son estables hasta por 2 años a temperatura ambiente.
4. Transporte las muestras en bolsas herméticas para biohazards que contengan material absorbente para prevenir fugas y contaminación.
5. Mantenga las muestras bajo las condiciones de temperatura recomendadas durante el transporte. Utilice recipientes aislados y elementos refrigerantes cuando sea necesario.
6. Asegúrese de cumplir con las directrices institucionales de bioseguridad y con las regulaciones locales aplicables para el transporte de especímenes biológicos.

5. Recibir y registrar muestras

1. Inspeccione cada muestra al recibirla en el laboratorio para verificar la etiquetado adecuado, la integridad del tubo y signos de fuga.
2. Asigne un identificador específico del laboratorio, si es necesario, y registre la fecha y hora de recolección, las condiciones de almacenamiento y la duración del transporte.
3. Excluya las muestras que presenten fugas, etiquetado inadecuado o integridad comprometida.

6. Preparar las placas

NOTA: Prepare todas las placas antes de iniciar el flujo de trabajo de extracción. Realice todos los pasos que involucren reactivos y muestras biológicas en un ambiente limpio y utilizando equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes y protección ocular. Figura 2 muestra el procesador automático de partículas magnéticas (Figura 2A), las posiciones de carga de placas (Figura 2B), el adaptador para placa de pozos profundos (Figura 2C), la centrífuga compatible con placas (Figura 2D), el instrumento de agitación con perlas (Figura 2E), el soporte amortiguador (Figura 2F), el portaplacas (Figura 2G), la placa de 96 pozos con perlas (Figura 2H), la placa de pozos profundos (Figura 2I), y la Placa de Elución (Figura 2J).

Figura 2. Equipos y materiales de consumo utilizados para la extracción automatizada de ácido desoxirribonucleico (ADN) fecal. 
(A) Procesador automático de partículas magnéticas. (B) Posición de carga de placas dentro del procesador automático de partículas magnéticas. (C) Adaptador de placa de pozos profundos para centrifugación. (D) Centrífuga compatible con placas. (E) Homogeneizador por molienda con bolas. (F) Soporte amortiguador utilizado durante la agitación con bolas. (G) Soporte para placa de pozos profundos (adaptador) para agitación con bolas. (H) Placa de 96 pozos con bolas suministrada con el kit de extracción de ácidos nucleicos. (I) Placa de pozos profundos de 96 pozos. (J) Placa de elución de 96 pozos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Retire la placa de peines para puntas de su empaque y téngala lista para la carga en el instrumento.
2. Prepare la Placa de Elución (Figura 2J) añadiendo 200 µL del tampón de elución suministrado con el kit de extracción de ácidos nucleicos a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Selle la placa con una película adhesiva transparente para evitar contaminación. Mantenga la placa sellada hasta cargarla en el procesador automático de partículas magnéticas. Etiquete la placa como Placa de Elución.
3. Prepare la Placa de Lavado 4 añadiendo 1 mL de etanol al 80 % a cada pocillo de una placa de pocillos profundos. Selle la placa con una película adhesiva para evitar la evaporación y la contaminación.
4. Prepare la Placa de Lavado 3 añadiendo 1 mL de etanol al 80 % recién preparado a cada pocillo de una placa de pocillos profundos separada. Selle la placa con una película adhesiva.
5. Prepare la Placa de Lavado 2 añadiendo 1 mL de tampón de lavado a cada pocillo de una placa de pocillos profundos. Selle la placa con una película adhesiva.
6. Prepare la Placa de Lavado 1 añadiendo 1 mL de tampón de lavado a cada pocillo de una placa de pocillos profundos. Selle la placa con una película adhesiva.

7. Configuración del procesador automático de partículas magnéticas

1. Encienda el procesador automático de partículas magnéticas. Verifique que la cabeza magnética de 96 pocillos profundos correcta y el bloque calefactor de placas de 96 pocillos profundos estén instalados.
2. Ejecute el protocolo de verificación del instrumento adecuado (por ejemplo, el protocolo Check_96dw_tip) utilizando un peine de puntas limpio y una placa de pocillos compatible vacía antes de procesar las muestras.
3. Confirme que el programa de extracción requerido esté disponible en el procesador automático de partículas magnéticas.
   NOTA: El uso de una cabeza magnética o un bloque calefactor incorrectos puede reducir el rendimiento de ácidos nucleicos y dañar el instrumento.

8. Realice la lisis de la muestra

1. Prepare un mapa de placas para registrar la posición de cada muestra en la placa de 96 pocillos.
2. Centrifugue la placa de perlas de 96 pocillos (Figura 2H) a 2.750 × g durante 10 s utilizando una centrífuga compatible con placas (Figura 2D) y un adaptador (Figura 2C) para recoger las perlas en el fondo de cada pocillo.
   NOTA: Este paso evita la pérdida de perlas durante la eliminación del sello de la placa.
3. Retire cuidadosamente el sello de la placa sin perturbar las perlas.
4. Agregue 800 µL de tampón de lisis a cada pocillo de la placa de perlas.
5. Evite aspirar las perlas durante la pipetación.
6. Deshiele las muestras fecales congeladas a temperatura ambiente hasta que se descongelen completamente. Mezcle suavemente las muestras para homogeneizarlas y continúe inmediatamente con la extracción de ADN. Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación porque pueden reducir la calidad y el rendimiento del ADN.
   NOTA: Para muestras frescas, vortexe cada tubo de muestra fecal que contenga la solución de estabilización durante 5–10 s para asegurar la homogeneización de la muestra.
7. Transfiera 200 µL de cada muestra homogeneizada al pocillo correspondiente de la placa de perlas.
8. Utilice una pipeta de canal simple equipada con puntas de pipeta estériles de gran apertura (cortadas) para transferir las muestras. Evite pipetear repetidamente para minimizar la pérdida de perlas y la consiguiente reducción en el rendimiento de ADN.
9. Selle la placa firmemente con una película adhesiva, asegurándose de que todos los pocillos y los bordes de la placa queden completamente sellados.

9. Realizar la lisis mecánica (golpeteo con perlas)

1. Asegure la placa sellada en el instrumento de lisis por bolas (Figura 2E) utilizando el soporte de placa adecuado (Figura 2G) y el soporte amortiguador (Figura 2F).
2. Equilibre el instrumento colocando una placa de peso igual en la posición opuesta a la placa de muestra.
3. Configure el instrumento a 30 Hz durante 2 min y comience la corrida.
4. Permita que la corrida avance sin interrupciones.
5. Retire cuidadosamente la placa tras la finalización de la corrida sin alterar el sello.
   NOTA: Utilice el soporte amortiguador para evitar daños en la placa durante la lisis por bolas.

10. Realizar el procesamiento posterior a la lisis

1. Centrifugar la placa a 2,750 × g durante 5 min a temperatura ambiente utilizando una configuración balanceada.
2. Transferir cuidadosamente 400 µL del sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de pocillos profundos designada como Placa de Muestras.
3. Evitar transferir cualquier perla durante este paso.
   NOTA: La Placa de Muestras no contiene perlas y no requiere una centrifugación previa.
4. Hermetizar la Placa de Muestras si no se continúa de inmediato.
   NOTA: Almacenar la placa de lisado sellada a 4°C durante la noche, si es necesario. Alternativamente, almacenar la Placa de Muestras sellada a −20°C durante hasta 3 meses. Descongelar las muestras a temperatura ambiente antes de cualquier procesamiento adicional.

11. Preparar la mezcla de perlas de unión

1. Prepare la mezcla de perlas de unión inmediatamente antes de usar combinando 500 µL de tampón de unión de ácidos nucleicos con 20 µL de perlas magnéticas por muestra. Mezcle bien para obtener una suspensión homogénea.
2. Calcule el volumen total de mezcla de perlas de unión necesario según el número de muestras.
3. Para una placa de 96 pocillos completa, prepare la mezcla de perlas de unión añadiendo 48,00 mL de tampón de unión de ácidos nucleicos y 1,92 mL de perlas magnéticas a un tubo cónico estéril. Mezcle bien para obtener un volumen final de 49,92 mL (520 µL por pocillo).
   NOTA: Prepare un volumen suficiente para uno o dos pocillos adicionales para compensar la variabilidad en la pipetación.
4. Mezcle suavemente la suspensión de perlas de unión mediante inversión hasta que quede homogénea.
5. Transfiera la mezcla de perlas de unión a un depósito de reactivo limpio.
6. Inmediatamente antes de dispensar, resuspenda las perlas magnéticas pipeteando la suspensión de arriba abajo tres a cuatro veces para evitar la sedimentación de las perlas.
7. Dispense 520 µL de la mezcla de perlas de unión en cada pocillo de la placa de muestras preparada utilizando una pipeta multicanal.
8. Pipete lentamente debido a la viscosidad de la solución y evite la formación de burbujas. Resuspenda suavemente la mezcla de perlas de unión en el depósito de reactivo antes de cada paso de dispensación para mantener una distribución uniforme de perlas en todos los pocillos.

12. Modifique el programa del instrumento MagMAX_Microbiome_Stool_Flex (programa de extracción modificado)

1. Descargue e instale el software BindIt (software para la edición de protocolos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Descargue el programa del instrumento desde el sitio web del fabricante.
3. Inicie el software para la edición de protocolos y permita que se inicialice.
4. Haga clic en Abrir y seleccione el programa del instrumento descargado.
5. Modifique los parámetros del protocolo según se describe en Tabla 1.
6. Guarde el protocolo modificado y cierre el software.
7. Conecte la computadora al procesador automático de partículas magnéticas utilizando un cable serial USB o RS-232C.
   NOTA: Asegúrese de que el procesador automático de partículas magnéticas esté apagado antes de conectar la computadora.
8. Encienda el procesador automático de partículas magnéticas y permita que complete la inicialización.
9. Inicie el software para la edición de protocolos y confirme que detecta el procesador automático de partículas magnéticas.
10. Transfiera el programa de extracción modificado al procesador automático de partículas magnéticas.
11. Confirme la transferencia exitosa del programa de extracción modificado, luego apague el procesador automático de partículas magnéticas.

Paso	Acción	Parámetros
1	Unión	Mezclar; 5 ciclos de recogida; 37°C
2	Recoger perlas	5 ciclos magnéticos de recogida
3	Lavado 1	Mezclar durante 20 s × 3 ciclos; 37°C
4	Lavado 2	Mezclar durante 20 s × 3 ciclos; 37°C
5	Lavado 3	Mezclar durante 20 s × 2 ciclos; 37°C
6	Lavado 4	Mezclar; 1 ciclo; 37°C
7	Secado	Secar al aire durante 2 min
8	Elución	75°C; 6 ciclos de mezcla; precalentamiento activado
9	Recoger perlas	3 ciclos magnéticos de recogida
10	Transferir el eluato	Transferir el ácido nucleico purificado a la placa de elución

Tabla 1: Programa automatizado de extracción para el procesador de partículas magnéticas.
Resumen del programa automatizado ejecutado por el procesador automatizado de partículas magnéticas durante la extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN). El programa incluye la unión de ácidos nucleicos, recolección de perlas magnéticas, pasos de lavado secuenciales, secado al aire, elución y transferencia del ADN purificado a la Placa de Elución. Se enumeran los parámetros operativos para cada paso automatizado.

13. Realizar la extracción automatizada de ácidos nucleicos

1. Encienda el procesador automático de partículas magnéticas (Figura 2A) activando primero el suministro principal de energía eléctrica y luego pulsando el botón de encendido del instrumento. Permita que el sistema complete la inicialización.
2. Utilizando el panel de control del instrumento, seleccione el programa de extracción modificado e inicie la corrida.
3. Cuando el sistema lo indique, coloque la placa de peines para puntas en la posición 7 y pulse Iniciar para continuar. Consulte la Tabla 2 para conocer las posiciones de carga de las placas (Figura 2B).
4. Retire la película sellante de la Placa de Elución y coloque la placa en la posición 6, asegurándose de la orientación correcta (el pocillo A1 alineado con la posición designada). Pulse Iniciar para continuar.
5. Retire la película sellante de la Placa de Lavado 4 que contiene etanol al 80%, coloque la placa en la posición 5 con la orientación correcta y pulse Iniciar.
6. Retire la película sellante de la Placa de Lavado 3 que contiene etanol al 80%, coloque la placa en la posición 4 y pulse Iniciar.
7. Retire la película sellante de la Placa de Lavado 2, coloque la placa en la posición 3 y pulse Iniciar.
8. Retire la película sellante de la Placa de Lavado 1, coloque la placa en la posición 2 y pulse Iniciar.
9. Cuando el sistema lo indique, coloque la Placa de Muestras en la posición 1, asegurando la orientación correcta.
10. Cierre la tapa del instrumento y pulse Iniciar para comenzar la corrida automática de extracción.
11. Permita que el programa se ejecute sin interrupciones hasta su finalización (aproximadamente 35–40 min).
    NOTA: La Tabla 1 resume el programa de extracción automática ejecutado por el instrumento.

Placa	Posición	Tipo de placa	Reactivo	Volumen por pocillo
Placa de muestra	1	Placa de 96 pocillos profundos	Mezcla de lisado de muestra y perlas de unión	920 µL
Placa de lavado 1	2	Placa de 96 pocillos profundos	Tampón de lavado	1,000 µL
Placa de lavado 2	3	Placa de 96 pocillos profundos	Tampón de lavado	1,000 µL
Placa de lavado 3	4	Placa de 96 pocillos profundos	Etileno al 80%	1,000 µL
Placa de lavado 4	5	Placa de 96 pocillos profundos	Etileno al 80%	1,000 µL
Placa de elución	6	Placa de 96 pocillos	Tampón de elución	200 µL
Placa de peine de puntas	7	Placa profunda estándar	Peine de puntas de 96 pocillos profundos	N/A

Tabla 2: Configuración de carga de placas para la extracción automatizada de ácidos nucleicos.
Posiciones de carga de placas, tipos de placas, reactivos y volúmenes de reactivos utilizados para la extracción automatizada de ADN con el procesador de partículas magnéticas. La Placa de Muestra contiene la mezcla de lisado de la muestra y perlas de unión. N/D indica que no se agregó ningún reactivo líquido a la Placa de Peine de Puntas.

​14. Eluir y almacenar los ácidos nucleicos

1. Abra el instrumento tras la finalización del proceso y retire la placa de elución con cuidado para evitar derramar los eluidos.
   NOTA: Si hay arrastre visible de perlas magnéticas en la placa de elución, transfiera los eluidos a una placa estándar de 96 pocillos y coloque la placa sobre un soporte magnético durante 5–10 min. Transfiera el sobrenadante clarificado a una placa nueva de 96 pocillos o a tubos adecuadamente etiquetados utilizando una pipeta multicanal.
2. Transfiera el ADN eluido a tubos o placas de almacenamiento adecuadamente etiquetados.
3. Almacene el ADN eluido a 4°C para uso a corto plazo, a −20°C para almacenamiento de hasta 6 meses, o a −80°C para almacenamiento a largo plazo.

15. Realice la limpieza posterior al análisis

1. Retire todas las placas y peines de puntas usados del procesador automático de partículas magnéticas.
2. Deseche todos los materiales desechables de acuerdo con las directrices institucionales de seguridad biológica y eliminación de residuos químicos.
3. Limpie cualquier derrame utilizando un desinfectante de laboratorio adecuado.
4. Apague el procesador automático de partículas magnéticas y luego la fuente de alimentación principal.

Resultados

Se recolectaron con éxito muestras fecales de siete participantes utilizando el procedimiento de recolección descrito, obteniendo especímenes con masa suficiente y consistencia adecuada para el procesamiento posterior. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente tras su recolección. La mayoría de las muestras presentó una textura y coloración uniformes, compatibles con condiciones adecuadas de recolección y almacenamiento, mientras que un pequeño subconjunto mostró una variabilidad menor en la consistencia, lo que podría reflejar la variación biológica entre los participantes. No se observó contaminación ni fugas visibles durante el transporte, y todas las muestras se procesaron dentro del período de estabilidad validado del kit de recolección (hasta 2 años a temperatura ambiente), lo que respalda la solidez y fiabilidad del procedimiento de recolección (Figura 1).

El flujo de trabajo automatizado de extracción de ADN se realizó utilizando el procesador automatizado de partículas magnéticas (Figura 2A), la configuración de carga de placas (Figura 2B), el adaptador para placas de pocillos profundos (Figura 2C), la centrífuga compatible con placas (Figura 2D), el instrumento de impacto con perlas (Figura 2E), el soporte amortiguador (Figura 2F), el portaplacas (Figura 2G), la placa de perlas (Figura 2H), la placa de pocillos profundos (Figura 2I) y la placa de elución (Figura 2J), siguiendo el programa de extracción automatizada resumido en la Tabla 1 y la configuración de carga de placas presentada en la Tabla 2. Se evaluó la concentración y pureza del ADN en muestras fecales representativas, y los resultados se resumen en la Tabla 3. La concentración de ADN se midió mediante el ensayo Qubit de ADN de doble cadena de alta sensibilidad (ensayo fluorométrico de cuantificación de ADN) en un fluorómetro Qubit (instrumento fluorométrico de cuantificación de ADN), según las instrucciones del fabricante. Las muestras se mezclaron con la solución de trabajo, se incubaron durante 2 min a temperatura ambiente y se midieron junto con los dos estándares del ensayo. Las relaciones de absorbancia A₂₆₀/A₂₈₀ y A₂₆₀/A₂₃₀ se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (espectrofotómetro de microvolumen). Las concentraciones de ADN oscilaron entre 36 y 87 ng/µL, con todas las muestras eluidas en un volumen constante de 200 µL, lo que permitió la comparación directa del rendimiento total de ADN entre las preparaciones (Tabla 3).

Muestra	Concentración de ADN (ng/µL)	A260/A280	A260/A230	Volumen de elución (µL)	Rendimiento total de ADN (ng)
Muestra A	62	1.83	1.71	200	12,400
Muestra B	36	1.89	1.51	200	7,200
Muestra C	87	1.92	1.85	200	17,400
Muestra D	50	2.03	1.87	200	10,000
Muestra E	55	1.97	1.81	200	11,000
Muestra F	85	1.99	1.88	200	17,000
Muestra G	44	2.01	1.51	200	8,800
Blanco de extracción	0	—	—	200	0

Tabla 3: Recuperación y pureza representativas del ADN tras la extracción automatizada de muestras fecales humanas.
Concentración representativa de ADN, pureza (relaciones de absorbancia A₂₆₀/A₂₈₀ y A₂₆₀/A₂₃₀), volumen de elución y rendimiento total de ADN medidos tras la extracción automatizada de ADN a partir de muestras fecales humanas. La concentración de ADN se determinó mediante un ensayo fluorométrico. El blanco de extracción sirvió como control negativo y no produjo ADN detectable.

Los resultados representativos demostraron variabilidad en la recuperación de ADN entre las muestras. Se obtuvieron concentraciones más altas de ADN para la Muestra A (62 ng/µL), la Muestra F (85 ng/µL) y la Muestra C (87 ng/µL), mientras que se observaron concentraciones intermedias para la Muestra D (50 ng/µL) y la Muestra E (55 ng/µL). La Muestra B y la Muestra G produjeron las concentraciones más bajas de ADN (36 ng/µL y 44 ng/µL, respectivamente). Las relaciones de absorbancia A₂₆₀/A₂₈₀ oscilaron entre 1,83 y 2,03, mientras que las relaciones de absorbancia A₂₆₀/A₂₃₀ variaron entre 1,51 y 1,88 (Tabla 3). Esta variación es esperada en especímenes fecales y puede reflejar diferencias en la composición de la muestra y la variabilidad biológica, además de la variación técnica asociada al procesamiento de los especímenes. El blanco de extracción no produjo ADN detectable, lo que indica la ausencia de contaminación detectable durante el procedimiento de extracción. La amplificación representativa del gen bacteriano 16S rRNA casi completo generó el amplicón de PCR esperado de aproximadamente 1,5 kb en las muestras de ADN fecal, mientras que el control sin plantilla no mostró amplificación (Figura 3).

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa de amplicones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen bacteriano del ácido ribonucleico ribosómico 16S (ARNr). 
Gel de agarosa representativo que muestra la amplificación del gen bacteriano del ARNr 16S de casi toda la longitud (~1,5 kb) utilizando los cebadores universales 27F y 1525R tras la extracción de ADN a partir de muestras fecales humanas. Carril M: escalera de ADN de 100 pares de bases (pb); Carril 1: control sin molde (en blanco); Carriles 2–8: muestras representativas de ADN fecal que muestran el amplicón de PCR esperado de ~1,5 kb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La implementación exitosa de este protocolo se demuestra mediante la recuperación de ADN medible adecuado para aplicaciones moleculares posteriores, incluidos ensayos basados en PCR, secuenciación del gen del ARNr 16S, secuenciación metagenómica de tiro al blanco y preparación de bibliotecas. En conjunto, estos resultados representativos demuestran que el protocolo recupera de manera consistente ADN a partir de muestras fecales humanas, al tiempo que ilustra el rango de variación que puede encontrarse entre especímenes biológicos.

Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona un flujo de trabajo estandarizado para la recolección de muestras fecales humanas y la extracción automatizada de ADN para estudios del microbioma. Los pasos críticos incluyen el muestreo representativo de las heces a partir de múltiples regiones del bol fecal, la homogeneización completa con el tampón de estabilización, el almacenamiento y transporte adecuados bajo las condiciones recomendadas, la lisis mecánica eficiente y el manejo cuidadoso durante la extracción automatizada. El cumplimiento constante de estos pasos minimiza la variabilidad técnica y favorece una recuperación reproducible del ADN. Estudios previos han identificado de manera similar la recolección de muestras, las condiciones de almacenamiento, la homogeneización y la extracción de ADN como fuentes importantes de variabilidad en los análisis del microbioma, y han destacado la importancia de flujos de trabajo estandarizados para obtener resultados reproducibles^5,6,7,8. Los resultados representativos demuestran una recolección exitosa de muestras sin contaminación ni fugas visibles, así como una recuperación medible de ADN en todas las muestras analizadas.

Varios factores procedimentales pueden influir en la recuperación del ADN y deben considerarse durante la implementación. Una lisis mecánica o química inadecuada, una homogenización incompleta, una unión ineficiente de los ácidos nucleicos o la pérdida de muestra durante las etapas de transferencia y lavado pueden reducir el rendimiento de ADN. Las variaciones en la composición de las heces, en la biomasa microbiana y en la consistencia de la muestra también pueden contribuir a diferencias en la recuperación de ADN entre los especímenes. Por lo tanto, es importante ejecutar cuidadosamente el protocolo, especialmente durante la homogenización de la muestra, la agitación con perlas y la extracción automatizada, para obtener resultados consistentes. La resolución de problemas debe centrarse en verificar la preparación de los reactivos, la configuración del instrumento, la carga de las placas y la ejecución del programa de extracción automatizada antes de procesar las muestras. Recomendaciones similares han sido reportadas en estudios que evalúan flujos de trabajo analíticos del microbioma y metodologías de extracción de ADN^5,6,7,8,11.

La principal limitación de este método es la variabilidad observada en el rendimiento de ADN entre especímenes biológicos. Como se demostró en los resultados representativos, las diferencias en la concentración de ADN pueden reflejar tanto variación biológica inherente entre muestras fecales como variación técnica introducida durante el procesamiento de los especímenes. Por consiguiente, la concentración de ADN por sí sola no debería considerarse el único indicador del rendimiento de la extracción. Pueden requerirse medidas adicionales de calidad y adecuación del ADN dependiendo de la aplicación molecular posterior prevista. Para evaluar más a fondo la calidad y adecuación del ADN para análisis moleculares posteriores, se amplificó el gen bacteriano de ARNr 16S mediante PCR utilizando los cebadores universales 27F y 1525R. Se confirmó la amplificación exitosa del fragmento esperado del gen de ARNr 16S de aproximadamente 1,5 kb mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 3), lo que demuestra que el ADN extraído era de calidad suficiente para aplicaciones posteriores, incluyendo secuenciación y otros ensayos moleculares. Estudios previos de referencia han mostrado asimismo que el rendimiento de ADN no necesariamente se correlaciona con el desempeño en secuenciación posterior o con la precisión en el perfilado del microbioma^8,11.

En comparación con los protocolos de extracción manual, los procesadores automáticos de partículas magnéticas reducen el trabajo manual, estandarizan las condiciones de extracción y permiten el procesamiento de alta capacidad, al tiempo que minimizan la variabilidad dependiente del operador^9,10. Sin embargo, las variaciones en la consistencia de las heces y en la biomasa microbiana pueden influir en la eficiencia de la lisis y en el rendimiento de ADN. Además, los microorganismos con paredes celulares resistentes podrían no lisarse completamente, lo que afectaría potencialmente la representación de ciertos taxa. A pesar de estas limitaciones, la extracción automatizada proporciona un enfoque robusto y eficiente para estudios a gran escala del microbioma intestinal^5,6,7,8,9,10. El presente protocolo combina la recolección estandarizada de muestras fecales con un protocolo automatizado de extracción de ADN, ofreciendo un enfoque práctico y reproducible para estudios del microbioma que requieren un procesamiento consistente de un gran número de muestras. Metodologías estandarizadas como esta facilitan la reproducibilidad entre estudios y son adecuadas para aplicaciones moleculares posteriores, incluyendo el perfilado del microbioma, la secuenciación metagenómica y otros análisis basados en secuenciación^5,6,7,8,9,10.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Etanol al 80 % (preparado a partir de etanol absoluto)	Merck	ET00161000	Preparar fresco a partir de etanol absoluto según se describe en el protocolo.
Material absorbente	Kimtech	34256	Incluido en la bolsa de transporte.
Película adhesiva para sellado de placas	Applied Biosystems	4306311	Película adhesiva transparente MicroAmp.
Procesador automático de partículas magnéticas (Sistema de Purificación KingFisher Flex con cabezal de 96 pocillos profundos)	Thermo Fisher Scientific	5400630	Sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos.
Bolsa de transporte hermética con etiqueta de bioseguridad	Zymo Research	R1180	Bolsa de transporte impermeable para el transporte de muestras.
Software BindIt	Thermo Fisher Scientific	5189009	Software utilizado para modificar y transferir el protocolo de extracción automatizado.
Tubo de recolección con espátula adjunta (30–50 mL)	Zymo Research	R1180	Tubo de recolección estéril con tapón roscado.
Soporte amortiguador	QIAGEN	69984	Juego de adaptadores TissueLyser (utilizado como soporte amortiguador durante la agitación con perlas).
Placa de pocillos profundos (96 pocillos)	Thermo Fisher Scientific	95040460	Placa KingFisher Deepwell de 96 pocillos.
Guantes desechables	Zymo Research	R1180	Se recomiendan sin polvo.
Tampón de elución	Applied Biosystems	A42357	Suministrado con el Kit de Aislamiento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.
Recolector fecal	Zymo Research	R1180	Dispositivo estéril de recolección.
Bloque calefactor (96 pocillos profundos)	Thermo Fisher Scientific	Suministrado con el instrumento	Componente del Sistema de Purificación KingFisher Flex.
Bata de laboratorio	Proveedor local	N/A	Equipo de protección personal.
Tampón de lisis	Applied Biosystems	A42357	Suministrado con el Kit de Aislamiento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.
Perlas magnéticas	Applied Biosystems	A42357	Suministradas con el Kit de Aislamiento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.
Cabezal magnético (96 pocillos profundos)	Thermo Fisher Scientific	Incluido con 5400630	Cabezal magnético de 96 pocillos profundos suministrado con el sistema KingFisher Flex.
Soporte magnético (96 pocillos)	Thermo Fisher Scientific	12332D	Requerido únicamente si se observa arrastre de perlas magnéticas.
Pipeta multicanal	Eppendorf	3125000052	Compatible con placas de 96 pocillos.
Espectrofotómetro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Utilizado para determinar las relaciones A260/280 y A260/230.
Tampón de unión de ácidos nucleicos	Applied Biosystems	A42357	Suministrado con el Kit de Aislamiento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.
Marcador permanente	Sharpie	3002	Alternativamente, usar etiquetas preimpresas.
Puntas de pipeta, filtradas estérilmente (10 µL)	Tarsons	528100	Puntas filtradas estériles graduadas.
Puntas de pipeta, filtradas estérilmente (200 µL)	Tarsons	528104	Puntas filtradas estériles graduadas.
Puntas de pipeta, filtradas estérilmente (1.000 µL)	Tarsons	529106	Puntas filtradas estériles; cortar para preparar puntas de gran orificio según se indica en el protocolo.
Adaptador de placa para centrífuga	Eppendorf	5820710004	Adaptador de placa de pocillos profundos Rotor A-2-DWP-AT.
Centrífuga compatible con placas	Eppendorf	5810	Compatible con el adaptador Rotor A-2-DWP-AT.
Soporte de placa para agitación con perlas	QIAGEN	69984	Juego de adaptadores TissueLyser 2 × 96.
Etiquetas preimpresas (opcional)	Brady	BBP12	Alternativa al marcador permanente.
Ensayo Qubit dsDNA HS	Thermo Fisher Scientific	Q33231	Ensayo fluorométrico utilizado para la cuantificación de ADN.
Fluorímetro Qubit	Thermo Fisher Scientific	Q33327	Instrumento utilizado para la cuantificación fluorométrica de ADN.
Reservorio de reactivo	Thermo Fisher Scientific	8093	Reservorio de reactivo Matrix.
Tampón de estabilización de muestras	Zymo Research	R1180	Kit de recolección fecal DNA/RNA Shield.
Tubo cónico estéril	HiMedia	TCP106H	Utilizado para la preparación de la mezcla de perlas de unión.
Homogeneizador mecánico de molienda con perlas TissueLyser III	QIAGEN	9003240	Instrumento de lisis mecánica.
Placa de peine de puntas	Thermo Fisher Scientific	97002534	Peine de puntas KingFisher 96 para imanes de pocillos profundos.
Tampón de lavado	Applied Biosystems	A42357	Suministrado con el Kit de Aislamiento de Ácidos Nucleicos MagMAX Microbiome Ultra.