Este protocolo describe un método reproducible para aislar y cultivar células musculares lisas aórticas primarias de origen murino de las regiones torácica y abdominal. El método produce células viables adecuadas para estudios in vitro de remodelación vascular y biología relacionada con aneurismas.
Artículo de método
Aislamiento y cultivo de células primarias de músculo liso aórtico murino para estudios in vitro relacionados con la biología de la remodelación vascular y del aneurisma aórtico
En este artículo
Resumen
Resumen
El aislamiento y cultivo de células musculares lisas aórticas primarias (CML) proporciona un enfoque valioso para investigar los mecanismos celulares subyacentes a enfermedades vasculares, incluidos los aneurismas aórticos. El presente artículo describe un protocolo detallado y optimizado para el aislamiento y cultivo de CML aórticas murinas a partir de segmentos aórticos torácicos y abdominales. El procedimiento actual incluye la disección cuidadosa de la aorta, la eliminación del tejido circundante y una digestión enzimática en dos pasos utilizando colagenasa, elastasa e inhibidor de tripsina de soja, seguida de disociación mecánica y expansión celular bajo condiciones de cultivo definidas. Se hace especial énfasis en los pasos que mejoran el rendimiento, la pureza y la reproducibilidad celular, incluida la eliminación de la adventicia y el control del tiempo de digestión. Mediante este enfoque, las CML primarias pueden aislarse y expandirse con éxito, mostrando una morfología y patrones de crecimiento característicos. Este protocolo ofrece un método reproducible y adaptable para generar CML aórticas primarias y sirve como plataforma para estudios in vitro relacionados con la remodelación vascular y la biología del aneurisma aórtico.
Introducción
Las células musculares lisas aórticas (CML) son componentes esenciales de la pared vascular, que contribuyen tanto a la integridad estructural como a la regulación funcional de la aorta. En vasos sanos, las CML mantienen un fenotipo contráctil caracterizado por la expresión de proteínas contráctiles como la actina α de músculo liso (α-SMA) y la cadena pesada de miosina de músculo liso (MYH11)1,2,3. Este fenotipo sustenta el tono vascular y preserva la organización de la matriz extracelular. Sin embargo, en condiciones patológicas como el aneurisma de aorta abdominal (AAA), las CML experimentan una modulación fenotípica hacia un estado sintético y proinflamatorio1,2,3. Esta transición se asocia con un aumento de la proliferación, la secreción de citoquinas y la producción de enzimas degradadoras de la matriz, lo que finalmente contribuye al debilitamiento de la pared aórtica4,5.
Los modelos animales, incluida la formación de aneurismas aórticos inducida por la angiotensina II (Ang II), han avanzado significativamente en la comprensión de la patogénesis de la AAA1,6,7,8,9,10,11. Sin embargo, estos modelos no permiten la manipulación precisa de las vías celulares ni la observación directa de mecanismos específicos de las CML. Los sistemas in vitro que utilizan CML primarias proporcionan un enfoque complementario, que permite investigar detalladamente las vías de señalización, la regulación génica y las respuestas celulares en condiciones controladas12.
A pesar de su utilidad, el aislamiento de células musculares lisas aórticas primarias de ratón es técnicamente difícil. El pequeño tamaño de la aorta de ratón, la presencia de tejido adiposo y conectivo circundante, y el riesgo de contaminación por fibroblastos adventiciales pueden comprometer todos ellos la pureza celular. Además, la digestión enzimática debe controlarse cuidadosamente para equilibrar la disociación del tejido con la preservación de la viabilidad celular. La variabilidad en estos pasos suele provocar resultados inconsistentes entre experimentos y laboratorios.
Se han publicado varios protocolos que describen el aislamiento y cultivo de células musculares lisas aórticas primarias de ratón, la mayoría de los cuales dependen de la eliminación completa de la adventicia antes de la digestión enzimática y se centran principalmente en aortas completas o segmentos aórticos torácicos13,14. El presente protocolo se basa en estos métodos incorporando varias mejoras técnicas, incluyendo un breve paso de pre-digestión enzimática para facilitar la separación de las capas adventicial y media antes de la disociación completa del tejido, condiciones estandarizadas de digestión con disociación mecánica suave intermitente, y un procedimiento para el aislamiento y cultivo separado de células musculares lisas aórticas torácicas (THX) y abdominales (ABD). En conjunto, estas mejoras tienen como objetivo mejorar la consistencia y la reproducibilidad del procesamiento del tejido, al tiempo que facilitan estudios regionales específicos sobre remodelación vascular y biología de aneurismas. Los cultivos resultantes de CML son adecuados para una amplia gama de aplicaciones posteriores, incluyendo silenciamiento génico, estudios farmacológicos e investigaciones mecanicistas relacionadas con la remodelación vascular y la biología de aneurismas. Aunque las CML primarias aisladas de aortas no enfermas no reproducen inherentemente fenotipos aneurismáticos, proporcionan un sistema controlado in vitro para investigar vías celulares implicadas en el desarrollo de aneurismas tras manipulaciones experimentales dirigidas.
Protocolo
Se utilizaron ratones hembras adultos C57BL/6J de 8 a 10 semanas de edad que pesaban entre 18 y 20 g para el procedimiento descrito a continuación. Se utilizaron dos ratones por aislamiento. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC) de la Universidad de Kentucky y fueron aprobados bajo el protocolo n.º 2022-4153. Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de materiales. Se muestra un esquema general del procedimiento completo de aislamiento y cultivo en Figura 1.
PRECAUCIÓN: La ketamina y la xilacina son sustancias controladas y deben manipularse, almacenarse y desecharse de acuerdo con las políticas institucionales y las regulaciones aplicables. La colagenasa tipo II y la elastasa son enzimas proteolíticas que pueden causar irritación cutánea, ocular y respiratoria. El azul de tripan es un colorante peligroso y debe manipularse con el equipo de protección personal adecuado, evitando el contacto con la piel y los ojos. Todos los reactivos peligrosos deben manipularse y desecharse de acuerdo con las directrices institucionales de seguridad y las instrucciones de los fabricantes.
1. Preparación de reactivos y medios de cultivo
- Prepare 10 mL de solución de digestión enzimática fresca el día del aislamiento en un tubo cónico estéril de 15 mL:
- Añada 10 mg de colagenasa tipo II (concentración final de 1 mg/mL) (véase la Tabla de Materiales).
- Añada 10 mg de inhibidor de tripsina de soja (concentración final de 1 mg/mL) (véase la Tabla de Materiales).
- Añada 71 µL de suspensión de elastasa (concentración final de 0,744 U/mL) (véase la Tabla de Materiales).
- Prepare la solución en HBSS que contenga calcio y magnesio sin rojo de fenol (véase la Tabla de Materiales).
- Añada 100 µL de penicilina/estreptomicina (1% del volumen final) (véase la Tabla de Materiales).
- Mezcle bien la solución y filtre estéril mediante un filtro de jeringa de nailon de 0,2 µm (véase la Tabla de Materiales).
- Prepare el medio de cultivo completo para CML (500 mL)
- Añada 385 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco/mezcla nutriente F-12 (DMEM/F12) sin rojo de fenol (véase la Tabla de Materiales) como medio base.
- Suplemente con 100 mL de suero bovino fetal tratado con carbón activado/dextrano (20% del volumen final) (véase la Tabla de Materiales).
- Añada 10 mL de penicilina/estreptomicina (2% del volumen final) (véase la Tabla de Materiales).
- Añada 5 mL de anfotericina B (1% del volumen final) (véase la Tabla de Materiales)
- Filtre estéril el medio y almacénelo a 4 °C.
- Caliente previamente todos los reactivos a 37 °C antes de su uso.
2. Preparación para el procesamiento de tejidos
- Aliquotar previamente la solución de digestión enzimática en 4 pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos (2,5 mL cada uno) y precalentar en el incubador a 37 °C con 5% de CO₂ antes del procesamiento del tejido. Dos pocillos deben designarse como 'THX' y dos como 'ABD' para los segmentos aórticos. Se pueden procesar múltiples segmentos de la misma región anatómica en un solo pocillo.
- Preparar 2 placas de cultivo separadas (ver Tabla de Materiales) que contengan medio de cultivo completo para células musculares lisas y etiquetarlas como THX y ABD.
- Precalentar las placas de cultivo que contienen el medio en un incubador humedecido.
- Preparar con anticipación 20 mL de HBSS estéril para la perfusión vascular y el manejo del tejido.
- Preparar 2 placas de cultivo adicionales, cada una con 3 mL de HBSS, para la limpieza secuencial de las aortas aisladas.
- Preparar tubos cónicos de 15 mL etiquetados (ver Tabla de Materiales) que contengan 5 mL de HBSS cada uno, para el almacenamiento temporal y la separación de los segmentos aórticos THX y ABD.
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos entre animales aplicando detergente, enjuagando con agua destilada, desinfectando con etanol al 70% y esterilizando mediante un esterilizador de perlas (ver Tabla de Materiales).
3. Preparación del animal y disección aórtica
- Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal (IP) de ketamina (300 mg/kg) y xilacina (30 mg/kg) (ver Tabla de Materiales), según lo aprobado bajo el protocolo IACUC de la Universidad de Kentucky 2022-4153 para procedimientos terminales.
- Confirmar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la ausencia de respuesta refleja al pellizco del dedo del pie.
- Esterilizar el campo quirúrgico utilizando etanol al 70 %.
- Mientras los ratones estén bajo anestesia quirúrgica profunda, sacrificarlos mediante exsanguinación por punción cardíaca seguida de perfusión transcardíaca con HBSS, de acuerdo con las directrices institucionales y de la AVMA.
- Abrir la cavidad torácica y realizar una punción cardíaca para recolectar sangre.
- Perfundir la vasculatura a través del ventrículo izquierdo utilizando una jeringa de 10 mL equipada con una aguja de 25 gauge para inyectar lentamente 10 mL de HBSS estéril. Se recomienda una velocidad de perfusión de aproximadamente 0,5 mL/s para garantizar la eliminación eficiente de la sangre residual.
- Retirar cuidadosamente los órganos circundantes (hígado, pulmones, bazo, tracto gastrointestinal, riñones). Dejar un fragmento del diafragma conectado a la aorta.
- Aislar la aorta desde la raíz aórtica hasta la bifurcación ilíaca con el diafragma intacto. El diafragma sirve como límite anatómico entre las regiones THX y ABD (Figura 2B).
- Transferir inmediatamente la aorta a HBSS estéril (Figura 2A).
4. Limpieza y segmentación de la aorta
- Coloque la placa de cultivo estéril que contiene la aorta bajo un microscopio estereoscópico (consulte la Tabla de Materiales).
- Retire cuidadosamente el tejido adiposo y el tejido conectivo utilizando pinzas finas (consulte la Tabla de Materiales).
- Divida la aorta en los segmentos THX y ABD.
NOTA: El segmento THX se extiende desde la región de la aorta justo por encima del diafragma hasta la raíz aórtica, mientras que el segmento ABD se extiende desde la región de la aorta justo por debajo del diafragma hasta la bifurcación ilíaca (Figura 2B). - Transfiera los segmentos limpios a tubos cónicos separados de 15 mL con HBSS fresco para su posterior procesamiento.
5. Digestión enzimática y aislamiento celular
- Incubar segmentos aórticos en solución enzimática a 37 °C durante 8–10 min.
- Retirar los segmentos aórticos de la solución enzimática.
- Transferir los segmentos a placas de cultivo separadas que contengan medio completo para CML designado para muestras THX y ABD.
- Eliminar la capa adventicial de la aorta utilizando pinzas gruesas y finas. La eliminación completa de la adventicia se confirma cuando la superficie externa de la aorta aparece lisa y translúcida, sin tejido conectivo ni tejido adiposo residual visible (Figura 2C).
- Transferir los segmentos aórticos a una solución enzimática fresca y picar la capa media en fragmentos pequeños directamente dentro de la solución (Figura 3A).
- Incubar los fragmentos de tejido a 37 °C en un incubador humedecido con 5% CO₂ durante 1 h.
- Realizar una disociación mecánica suave pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10–15 veces para facilitar la liberación de células (Figura 3B).
- Repetir el paso de disociación mecánica a intervalos de 30–60 min durante la incubación continua, durante un tiempo total de digestión de 2–3 h o hasta obtener una suspensión celular homogénea.
6. Recolección, lavado, siembra y cultivo inicial de células
- Transferir la solución de digestión enzimática que contiene las células disociadas a tubos cónicos separados de 15 mL (ver Tabla de Materiales), designados para muestras de THX y ABD.
- Lavar cada pocillo de digestión con 5 mL de medio de cultivo y combinar con los tubos correspondientes.
- Centrifugar la suspensión celular a 400 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Repetir la centrifugación si la formación del botón celular es insuficiente.
- Eliminar el sobrenadante sin perturbar el botón celular (Figura 3C).
- Resuspender las células con 5 mL de medio de cultivo fresco y realizar un paso adicional de lavado seguido de centrifugación en las mismas condiciones.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular final en un volumen adecuado (típicamente 6 mL) de medio de cultivo completo para células musculares lisas (SMC).
- Inocular toda la suspensión celular obtenida del segmento aórtico torácico o abdominal en dos pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos (3 mL de medio suspendido por pocillo) e incubar a 37 °C con 5,0 % de CO₂. Las células se siembran inmediatamente después del aislamiento, sin recuento previo de células; por lo tanto, en esta etapa no se utiliza una densidad de siembra objetivo.
- Mantener los cultivos sin perturbar durante 5–7 días para permitir la adhesión celular y la expansión inicial.
PUNTO DE PAUSA: Después de la siembra, los cultivos pueden mantenerse en la incubadora durante 5–7 días antes de pasar a los pasos de mantenimiento y expansión celular descritos en la Sección 7.
7. Mantenimiento y expansión celular
- Cambie el medio de cultivo cada 3–4 días.
- Supervise regularmente la morfología celular y la confluencia.
- Pase las células cuando alcancen aproximadamente una confluencia del 80–90 %.
- Aspire el medio de cultivo y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada (véase la tabla de materiales).
- Añada tripsina-EDTA al 0,05 % e incube a 37 °C durante 5–10 min.
- Continúe cuando se haya desprendido el 80–90 % de las células.
- Toque suavemente la placa de cultivo para facilitar el desprendimiento.
- Añada un volumen igual de medio de cultivo completo para neutralizar la tripsina.
- Aspire y expulse suavemente con una pipeta para desprender las células restantes.
- Transfiera la suspensión celular a tubos cónicos y centrifugue a 400 × g durante 5 min.
- Elimine el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en medio de cultivo fresco.
- Siembre las células a una relación de repique de 1:2 (o a la densidad experimental deseada) e incube a 37 °C con 5 % de CO₂. Deje que las células se adhieran sin perturbar durante 24–48 h.
NOTA: Para experimentos posteriores, utilice células entre los pasajes 3 y 7 (P3–P7) para minimizar la deriva fenotípica inducida por el cultivo. Las células posteriores al pasaje 7 son más propensas a la deriva fenotípica y pueden presentar morfología y función alteradas.
8. Validación mediante tinción de inmunofluorescencia para α-SMA
- Cultivar células en un material adecuado para microscopía de fluorescencia.
- Siembre las células en una placa de fondo óptico de 96 pocillos a una densidad de 15.000 células por pocillo. Permita que las células crezcan hasta alcanzar la confluencia deseada.
- Preparar las células para la fijación
- Aspire el medio de cultivo de las células adherentes. Lave tres veces con 200 µL por pocillo de solución salina tamponada con Tris que contenga 0,1 % de Tween 20 (TBS-T) durante 5 min por lavado, luego aspire con vacío en cabina biológica.
- Fijar las células
- Añada 200 µL por pocillo de paraformaldehído al 4 % (PFA) en PBS 1x. Incube durante 10–20 min a temperatura ambiente, luego aspire.
- Permeabilización
- Añada 200 µL por pocillo de Triton X-100 al 0,1 % en PBS 1x. Incube durante 10–15 min a temperatura ambiente, luego aspire.
- Bloqueo de uniones no específicas
- Lave las células tres veces con 200 µL por pocillo de TBS-T durante 5 min por lavado. Añada 200 µL por pocillo de albúmina sérica bovina (BSA) al 5 % en TBS-T.
- Coloque la placa en un agitador orbital a aproximadamente 200 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
- Tinción con anticuerpo primario
- Prepare el anticuerpo primario α-SMA a una dilución de 1:1.000 en BSA al 5 % en TBS-T.
- Retire la placa del agitador orbital y aspire la solución de bloqueo de los pocillos destinados a la tinción con α-SMA. Para el control solo con anticuerpo secundario, omita el anticuerpo primario y mantenga el pocillo de control en BSA al 5 % en TBS-T.
- Añada 200 µL por pocillo del anticuerpo primario α-SMA diluido a los pocillos experimentales. Incube los pocillos experimentales y el control solo con anticuerpo secundario durante la noche a 4 °C en un agitador orbital suave.
- Tinción con anticuerpo secundario
- Prepare el anticuerpo secundario fluorescente a una dilución de 1:2.500 en TBS-T que contenga 0,1 % de Tween 20.
- Retire la placa del agitador orbital y aspire todos los pocillos.
- Lave todos los pocillos tres veces con 200 µL por pocillo de TBS-T durante 5 min por lavado, luego aspire.
- Añada 200 µL por pocillo del anticuerpo secundario fluorescente diluido a todos los pocillos, incluido el control solo con anticuerpo secundario.
- Proteja la placa de la luz e incube en un agitador orbital a aproximadamente 200 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
- Tinción nuclear e imagen de fluorescencia
- Prepare una solución de Hoechst 33342 a 2 µg/mL.
- Lave las células tres veces con 200 µL por pocillo de TBS-T durante 5 min por lavado. Añada suficiente solución de tinción con Hoechst 33342 para cubrir las células e incube durante 10 min a temperatura ambiente protegido de la luz.
- Adquiera imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio invertido de fluorescencia con un aumento de 20x para los cultivos de THX y ABD teñidos con α-SMA y con un aumento de 10x para los controles solo con anticuerpo secundario, empleando una excitación a 385 nm para Hoechst 33342 y a 475 nm para el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo. Los controles solo con anticuerpo secundario se imaginaran a 10x para incluir un número suficiente de núcleos dentro del campo de visión.
- Cuantificación de células positivas para α-SMA.
- Evalue la positividad para α-SMA contando los núcleos positivos para Hoechst asociados con células que presenten una tinción citoplasmática clara en forma de huso positiva para α-SMA. Clasifique conservadoramente como negativas para α-SMA las células con señal fluorescente ambigua o no definida.
- Calcule la positividad para α-SMA como el número de células positivas para α-SMA dividido por el número total de núcleos positivos para Hoechst contados en los campos microscópicos evaluados, multiplicado por 100.
Resultados
Dentro de las 24–48 h posteriores al aislamiento, un subconjunto de células comienza a adherirse a la superficie del cultivo y a extenderse, mostrando inicialmente una morfología redondeada. La adhesión celular puede ser variable en los primeros momentos, y los cultivos pueden parecer escasos debido al número limitado de células viables recuperadas durante el aislamiento inicial. Entre los días 3 y 5, las células adherentes adoptan progresivamente una morfología alargada y en forma de huso, característica de las células musculares lisas vasculares (SMCs), y comienzan a proliferar, formando pequeños grupos. En Figura 1 se ilustra una visión esquemática del flujo experimental, que incluye el aislamiento aórtico, la segmentación, la digestión enzimática, la disociación mecánica y el siembra de células.
Se muestran imágenes representativas del aislamiento aórtico, la segmentación anatómica en regiones TOR y ABD y la eliminación de la capa adventicia en la Figura 2. Las regiones aórticas TOR y ABD se distinguieron según la ubicación anatómica con respecto al diafragma, como se indica en la Figura 2B. Se muestran imágenes representativas de la digestión enzimática, la disociación mecánica y la formación de un pellet celular visible tras la centrifugación en la Figura 3.
El recuento celular y la viabilidad se evaluaron en el pase 3 mediante exclusión de azul de tripano (1:1) y un contador automático de células Countess. Los datos se obtuvieron a partir de 3 aislamientos independientes utilizando un total de 6 ratones (2 ratones por aislamiento). Las culturas de THX presentaron un recuento celular medio de 5,10 × 105 ± 7,81 × 104 células (rango, 4,20 × 105–5,60 × 105) y una viabilidad del 66,33 ± 18,18% (rango, 46–81%). Las culturas de ABD presentaron un recuento celular medio de 4,63 × 105 ± 2,31 × 104 células (rango, 4,50 × 105–4,90 × 105) y una viabilidad del 61,66 ± 12,01% (rango, 50–74%) (Tabla 1).
Entre los días 5 y 7, los cultivos suelen alcanzar aproximadamente entre el 70 % y el 90 % de confluencia, formando una monocapa densa y relativamente uniforme. Las células comúnmente se alinean en orientaciones paralelas, reflejando su linaje contráctil. Pueden observarse diferencias en la tasa de proliferación y la densidad celular entre las CML procedentes de la región torácica (THX) y abdominal (ABD), lo cual es consistente con la heterogeneidad regional conocida de la aorta. En Figura 4 se muestran imágenes representativas de contraste de fase de la morfología de CML primarias procedentes de segmentos aórticos THX y ABD, a aumentos bajos (10x) y más altos (20x).
Las CML exhibieron la morfología alargada y en forma de huso característica, alineación organizada en paralelo en estado de confluencia y patrón de crecimiento uniforme, mientras que las células similares a fibroblastos suelen presentar una morfología más aplanada e irregular, con orientación menos organizada y dispersión heterogénea. Estas características morfológicas y de crecimiento proporcionan un enfoque práctico y reproducible para identificar poblaciones de CML en cultivo primario en ausencia de validación molecular. El aislamiento exitoso se indica por la adhesión celular temprana dentro de las 24–48 h, la adquisición progresiva de morfología en forma de huso y la formación de una monocapa confluyente entre los días 5 y 7. Las células suelen alinearse en arreglos paralelos a mayor confluencia, lo cual es consistente con el fenotipo de músculo liso. Los resultados subóptimos pueden incluir pobre adhesión celular, bajo rendimiento celular o la presencia de células aplanadas y de forma irregular, lo que podría indicar digestión incompleta, exposición excesiva a enzimas o contaminación con poblaciones celulares no pertenecientes a células de músculo liso.
La viabilidad celular constante y la mínima contaminación con células similares a fibroblastos respaldan aún más un aislamiento exitoso. Para validar adicionalmente la identidad de las CML, se realizaron tinciones inmunológicas en cultivos primarios representativos para la α-actina muscular lisa (α-SMA) (Figura 5) siguiendo el procedimiento descrito en la Sección 8. Tanto los cultivos de THX como de ABD mostraron el patrón de tinción filamentoso característico de la α-SMA esperado en las CML vasculares. La cuantificación realizada en cuatro campos microscópicos identificó 69 células positivas para α-SMA entre 72 células positivas para Hoechst evaluadas, lo que corresponde a una positividad global para α-SMA del 95,8 % (IC del 95 %, 88,5 %–98,9 %). Específicamente, 20 de 20 células de THX y 49 de 52 células de ABD fueron positivas para α-SMA. Figura 5 muestra campos representativos de los evaluados.
Durante los primeros pasajes, las células mantienen una morfología y capacidad proliferativa estables. Sin embargo, con cultivos prolongados, las células pueden exhibir gradualmente características de modulación fenotípica, incluyendo un aumento en la expansión, una reducción en la alineación y patrones de crecimiento alterados.
Bajo estas condiciones, los cultivos primarios de CML son adecuados para aplicaciones posteriores, incluyendo la inhibición génica, tratamientos farmacológicos y estudios mecanicistas de las vías implicadas en la remodelación vascular y el desarrollo de aneurismas aórticos.
Figura 1: Vista general del flujo de trabajo esquemático. Una representación esquemática del procedimiento principal para el aislamiento de células musculares lisas aórticas murinas primarias. Panel 1 muestra la eutanasia y el aislamiento de la aorta. Panel 2 muestra la separación de los segmentos aórticos torácicos (THX) y abdominales (ABD) en solución de digestión enzimática. Panel 3 muestra la eliminación de la adventicia y el aislamiento de la capa media. Panel 4 muestra el regreso de los segmentos de tejido a una solución enzimática fresca y su picado. Panel 5 muestra la disociación mecánica mediante pipeteo cada 30 minutos durante 2–3 h. Panel 6 muestra la recuperación y siembra de las células, incluyendo 6a centrifugación, 6b eliminación del sobrenadante y 6c resuspensión del sedimento y siembra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aislamiento y preparación de segmentos de aorta de ratón. (A) Aorta completa aislada y colocada en una placa de cultivo. (B) Aorta limpia con referencias anatómicas que indican las regiones TOR (THX) y ABD, incluyendo el diafragma y la bifurcación ilíaca. (C) Imágenes representativas de la eliminación de la adventicia de segmentos TOR (superior) y ABD (inferior) utilizando pinzas finas y gruesas, revelando la capa media subyacente, fundamental para el aislamiento de células musculares lisas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Digestión enzimática y disociación mecánica del tejido aórtico. (A) Tras la eliminación de la capa adventicia, la capa media se transfiere a una solución enzimática fresca y se pica con tijeras pequeñas. (B) Ejemplo de disociación mecánica de fragmentos aórticos mediante pipeteo suave. (C) Tras la digestión enzimática y la centrifugación, se observa un pellet celular visible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Morfología representativa de células musculares lisas aórticas murinas primarias (SMCs). Las SMCs primarias aisladas de segmentos aórticos torácicos y abdominales se cultivaron en condiciones estándar y se capturaron imágenes en el pase 4. Se muestran imágenes representativas de contraste de fase a baja (10x) y mayor (20x) magnificación. Las células exhiben una morfología alargada y en forma de huso característica, así como alineación consistente con un fenotipo de SMC contráctil. Pueden observarse diferencias en la densidad celular y la organización entre las SMCs derivadas de THX y ABD, lo que refleja la heterogeneidad regional. Barras de escala = 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Validación por inmunofluorescencia de células musculares lisas aórticas murinas primarias. (A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia de células musculares lisas primarias aisladas de la aorta torácica (izquierda) y abdominal (derecha) y marcadas para α-actina de músculo liso (α-SMA, verde). Los núcleos se contramarcharon con Hoechst 33342 (azul). Las imágenes se obtuvieron con un aumento de 20x. (B) Imágenes representativas de controles con solo anticuerpo secundario de células musculares lisas primarias de la aorta torácica (izquierda) y abdominal (derecha), procesadas sin el anticuerpo primario anti-α-SMA y contramarchadas con Hoechst 33342 (azul). Las imágenes se obtuvieron con un aumento de 10x. La cuantificación en cuatro campos microscópicos identificó 69 de 72 células como positivas para α-SMA (95,8 %). Barras de escala = 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
| Recuento de células y viabilidad de cultivos primarios de células musculares lisas aórticas murinas | |||
| Segmento aórtico | Aislamientos independientes, n | Recuento de células (Media ± DE)* | Viabilidad celular (Media ± DE)† |
| THX | 3 | 5.10 x 105 ± 7.81 x 104 cells | 66.33 ± 18.18 % |
| ABD | 3 | 4.63 x 105 ± 2.31 x 104 cells | 61.66 ± 12.01 % |
| *Los recuentos de células se obtuvieron en el pase 3 a partir de 3 aislamientos independientes. | |||
| †El recuento y la viabilidad celular se determinaron mediante exclusión de azul de tripano 1:1 utilizando un contador automático de células Countess. | |||
Tabla 1: Recuento de células y viabilidad de cultivos primarios de células musculares lisas aórticas de ratón
| Paso | Problema | Causa posible | Solución recomendada |
| Diseción aórtica | Bajo rendimiento celular | Recuperación incompleta de la aorta o daño tisular durante la disección | Asegurar el aislamiento completo desde la raíz aórtica hasta la bifurcación ilíaca; manipular el tejido con cuidado para evitar daños |
| Limpieza aórtica | Contaminación por fibroblastos | Eliminación incompleta del tejido adventicial | Eliminar cuidadosamente la adventicia tras la digestión inicial; este paso es crítico para la pureza de los miocitos lisos (SMC) |
| Digestión inicial | Dificultad para eliminar la adventicia | Soltura enzimática insuficiente | Asegurar una incubación adecuada (8-10 min) antes de intentar la eliminación mecánica |
| Digestión enzimática | Bajo rendimiento celular | Digestión insuficiente del tejido | Alargar ligeramente el tiempo de digestión o aumentar la frecuencia de la disociación mecánica |
| Digestión enzimática | Baja viabilidad celular | Digestión excesiva o exposición prolongada a enzimas | Reducir el tiempo de digestión y evitar incubaciones prolongadas |
| Disociación mecánica | Pobre liberación celular | Pipeteo inadecuado | Realizar pipeteo suave pero repetido cada 30-60 min |
| Adherencia celular | Pobre adherencia a la placa | Daño celular o medio frío | Utilizar medio precalentado y minimizar el estrés por manipulación |
| Cultivo temprano | Ausencia de crecimiento celular | Baja viabilidad o contaminación | Confirmar las condiciones de digestión y la esterilidad; repetir el aislamiento si es necesario |
| Morfología celular | Forma no fusiforme (persistencia de células redondeadas o planas) | Contaminación o deriva fenotípica | Verificar la eliminación de la adventicia; evitar el sobrecrecimiento y cultivos prolongados |
| Crecimiento celular | Proliferación lenta | Concentración subóptima de suero | Utilizar 20% de suero bovino fetal (FBS) durante la fase inicial de expansión |
| Confluencia | Dificultad para el paso de células sobreconfluentes | Retraso en la división | Pasar las células al 80-90% de confluencia |
| Pasaje | Pobre desprendimiento | Las células están demasiado confluentes o la tripsinización es insuficiente | Aumentar ligeramente la exposición a tripsina y ayudar mecánicamente al desprendimiento |
| Cultivo a largo plazo | Pérdida del fenotipo de miocito liso (SMC) | Número elevado de pasajes o cultivo prolongado | Utilizar células entre los pasajes 3 y 7 |
| Reproducibilidad | Variabilidad entre aislamientos | Diferencias en la técnica o variabilidad biológica | Normalizar la preparación de enzimas, los tiempos y la manipulación entre experimentos |
Tabla 2: Guía de solución de problemas para el aislamiento y cultivo de células musculares lisas aórticas murinas primarias. Resumen de los problemas técnicos comunes que se presentan durante el aislamiento, la digestión y el cultivo de células musculares lisas aórticas murinas primarias, incluyendo causas potenciales y soluciones recomendadas para mejorar la reproducibilidad.
Discusión
Este protocolo proporciona un método robusto y reproducible para aislar y cultivar células musculares lisas aórticas primarias de ratón (SMCs) para estudios in vitro. Además de su utilidad técnica, este enfoque es altamente relevante para investigar los mecanismos subyacentes al remodelado vascular y al desarrollo de aneurismas aórticos. Dado el papel establecido del sistema renina-angiotensina (RAS) y de la Ang II en la inflamación vascular y la formación de aneurismas15,16, el aislamiento de SMCs aórticas primarias ofrece un enfoque valioso para analizar estas vías a nivel celular.
Un factor determinante del éxito es la eliminación exhaustiva del tejido adventicial. La adventicia contiene fibroblastos y otras poblaciones no musculares lisas (SMCs) que pueden sobrecrecerse frente a los SMCs en cultivo si no se eliminan adecuadamente. El breve paso inicial de digestión enzimática facilita la separación mecánica de la adventicia desde la capa media, permitiendo una disección más precisa. La falta de realizar este paso de manera efectiva es una de las causas más comunes de contaminación y variabilidad en los protocolos de aislamiento de SMCs.
Las condiciones de digestión enzimática también deben optimizarse cuidadosamente. La combinación de colagenasa tipo II, elastasa e inhibidor de tripsina de soja permite una degradación eficiente de los componentes de la matriz extracelular mientras se preserva la viabilidad celular. Sin embargo, la digestión debe vigilarse de cerca. Una digestión insuficiente provoca una disociación incompleta del tejido y una menor recuperación celular, mientras que una digestión excesiva puede dañar las células, afectar su adhesión y reducir la viabilidad. Por ello, la disociación mecánica mediante pipeteo suave y repetido constituye un paso complementario esencial, que favorece la liberación celular mientras se minimiza la exposición excesiva a enzimas. Conjuntamente, estos pasos destacan la importancia de equilibrar el procesamiento enzimático y mecánico para optimizar tanto el rendimiento celular como la viabilidad. Mantener tiempos de digestión, manipulación del tejido y disociación mecánica consistentes durante todo el procedimiento es igualmente importante para mejorar la reproducibilidad entre aislamientos.
Las condiciones de cultivo desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento del fenotipo y la función de las células musculares lisas (SMC). Los medios con alto contenido de suero (20% de suero bovino fetal) favorecen la adhesión inicial y la expansión de células primarias tras su aislamiento. Se utilizó suero tratado con carbón/dextrano para reducir la variabilidad provocada por hormonas y componentes lipídicos presentes en las preparaciones estándar de suero. Sin embargo, la exposición prolongada a suero rico o a un tiempo de cultivo extendido puede favorecer una deriva fenotípica hacia un estado sintético o similar al de los fibroblastos. Para minimizar estos efectos, se recomienda utilizar células en pasajes tempranos a intermedios (P3–P7) y evitar condiciones de sobreconfluencia, que pueden alterar la morfología y reducir la capacidad proliferativa.
La morfología de las células aisladas proporciona un indicador inicial importante de la calidad del cultivo. Las CML sanas presentan una morfología característica alargada en forma de huso y se alinean en arreglos paralelos a mayor confluencia. Las desviaciones respecto a esta morfología, incluidas células aplanadas o con formas irregulares, pueden indicar contaminación, condiciones de cultivo subóptimas o deriva fenotípica. Las características morfológicas sugestivas de un cambio fenotípico desde un estado contráctil hacia un estado sintético incluyen un aumento en la expansión celular, una reducción de la morfología en forma de huso, la pérdida del alineamiento paralelo y patrones de crecimiento más heterogéneos.
Aunque la evaluación morfológica es informativa, no es suficiente para determinar de manera definitiva el fenotipo de las células musculares lisas (SMC) y debe complementarse con validación molecular mediante marcadores como α-SMA y MYH11, según la aplicación. En el presente estudio, α-Inmunofluorescencia para SMA confirmó la identidad de las células aisladas y demostró una alta proporción de α-Células positivas para SMA en cultivos de THX y ABDFigura 5). Una ventaja clave de este protocolo es la capacidad de aislar células musculares lisas (SMCs) de distintas regiones aórticas, incluyendo los segmentos torácico (THX) y abdominal (ABD). Estas regiones presentan diferencias biológicas intrínsecas, incluyendo variaciones en la composición de la matriz extracelular, el origen embriológico y la susceptibilidad a enfermedades. El aislamiento de SMCs específicas de cada región permite investigar la heterogeneidad espacial en la biología vascular y podría proporcionar información sobre la vulnerabilidad regional específica frente a la formación de aneurismas.16,17,18. Los métodos existentes de aislamiento de células musculares lisas vasculares aórticas en ratón utilizan ya sea digestión con colagenasa durante la noche13 o 4–6 h de digestión enzimática, con informes que indican que 5–6 h proporcionan una mejor recuperación14, en comparación con la digestión de 2–3 h tras una predigestión de 8–10 min utilizada en el presente protocolo, con un tiempo total de procesamiento de aproximadamente 4 h desde la eutanasia hasta la siembra celular. Adhikari et al. informaron entre 25 y 35 × 103 células viables/mL después de 5 días de cultivo y positividad del 97 %–99 % para sm22α y Acta2, mientras que el presente protocolo produjo recuentos de células en el pase 3 de 5,10 × 105 ± 7.81 × 104 células para THX y 4,63 × 105 ± 2.31 × 104 células para ABD, con un conjunto general α- Positividad para SMA del 95,8 %. Hubert et al. utilizaron digestión nocturna, pero no informaron un rendimiento celular cuantitativo ni un porcentaje de pureza13,14. En contraste, el método basado en explantes de McMurray et al. requirió un período de latencia medio de aproximadamente 7,6 días antes del crecimiento celular a partir de explantes aórticos normales, con >90% de los explantes mostrando crecimiento externo para el día 10 y >95% el día 12, mientras que el presente método enzimático permite la siembra directa de las células aisladas el mismo día del aislamiento18. El presente protocolo combina un breve paso de pre-digestión que facilita la eliminación de la adventicia con condiciones estandarizadas de digestión y disociación mecánica para promover un procesamiento de tejido y recuperación celular consistentes. Junto con el aislamiento específico por región de las CML de THX y ABD, el tiempo reducido de procesamiento y la caracterización cuantitativa de la recuperación celular y α-La positividad para SMA proporciona ventajas prácticas para la reproducibilidad in vitro estudios.
Este método es muy adecuado para estudios mecanicistas que implican manipulación genética y farmacológica. Las culturas primarias de CML pueden utilizarse para enfoques de silenciamiento génico, incluyendo la inhibición mediada por ARNip, así como para estudios de sobreexpresión y tratamientos con fármacos. Estos enfoques permiten la interrogación directa de las vías de señalización implicadas en el cambio fenotípico de los CML, la inflamación y la remodelación de la matriz extracelular, procesos centrales en el desarrollo y progresión del aneurisma aórtico1,5.
Es importante considerar las limitaciones de este protocolo en el contexto de la modelización de enfermedades. Las células musculares lisas en este protocolo se aíslan de aortas murinas no enfermas y, por lo tanto, no presentan intrínsecamente fenotipos asociados con aneurismas. Por consiguiente, se requieren enfoques experimentales adicionales, incluyendo estimulación farmacológica, manipulación genética o integración con modelos in vivo, para reproducir procesos relevantes para la enfermedad, como la activación inflamatoria, la remodelación de la matriz extracelular y el cambio fenotípico. Además de las consideraciones descritas anteriormente, este protocolo presenta varias limitaciones. Puede haber variabilidad en el rendimiento celular y en la cinética de crecimiento entre aislamientos debido a diferencias biológicas entre animales o variaciones menores en la técnica. Asimismo, el aislamiento basado en digestión enzimática puede influir en la expresión de receptores de superficie celular o en las vías de señalización, lo cual debe tenerse en cuenta al interpretar estudios funcionales posteriores. Las CML primarias también pierden gradualmente su fenotipo contráctil conforme aumenta el número de pases, lo que puede afectar los resultados experimentales. Una estandarización cuidadosa de los procedimientos y el uso de células en pasajes tempranos pueden ayudar a mitigar estas limitaciones. Los desafíos técnicos comunes y las soluciones recomendadas para este protocolo se resumen en Tabla 2.
En resumen, este protocolo proporciona un marco confiable y adaptable para el aislamiento y cultivo de células musculares lisas aórticas primarias de ratón. Cuando se combina con modelos in vivo, este enfoque permite la investigación exhaustiva de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen al remodelado vascular y a la patogénesis del aneurisma aórtico.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto. Grammarly se utilizó para la corrección lingüística y gramatical; todo el contenido científico y su interpretación fueron elaborados por los autores.
Agradecimientos
El apoyo financiero fue proporcionado, en parte, por la Facultad de Medicina de la Universidad de Kentucky. El resumen gráfico (Figura 1) fue creado utilizando BioRender.com bajo una licencia de publicación académica, con el número de acuerdo de publicación GI2A3W9TY8.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm Filtros de jeringa de nailon | VWR | 76439-080 | Filtración estéril |
| Tubos cónicos de 15 mL | VWR | — | Para transferencia de aorta después de la limpieza y para recolección de células |
| Placas de cultivo de 6 pocillos / 12 pocillos (sin tratar) | Corning | — | Cultivo celular |
| Tubos cónicos de 50 mL | VWR | — | Recolección de células |
| Microplaca de fondo óptico de 96 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 165305 | Para validación de CML |
| Anticuerpo α-actina de músculo liso (monoclonal) | Cell Signaling Technology | 19245S | Para validación de CML; dilución de trabajo 1:1000 |
| Anticuerpo secundario IgG Alexa Fluor 488 (policlonal) | Invitrogen | A-11008 | Para validación de CML; dilución de trabajo 1:2500 |
| Amfotericina B | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Antifúngico |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | Para validación de CML |
| Incubadora de CO2 (37 °C) | Varios | — | Condiciones de cultivo celular |
| Colagenasa tipo II | Worthington Biochemical | LS004174 | Para digestión enzimática; se usa 260 U/mg |
| Contador automático de células Countess | Invitrogen | C10281 | Para contar células |
| Microscopio de disección | Varios | — | Limpieza de tejido |
| Medio DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Medio de cultivo base |
| Elastasa | Worthington Biochemical | LS002279 | Para degradación de la matriz; se usa 4,17 U/mg de proteína |
| Suero bovino fetal (tratado con carbón/dextrano) | Cytiva (Hyclone) | SH30068.03 | Se utiliza al 20 % para el cultivo |
| HBSS con Ca2+ y Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | Se utiliza como tampón de digestión |
| Solución Hoechst 33342 | BD Pharmingen | 561908 | Para validación de CML |
| Esterilizador por perlas calientes | Fine Science Tools | 18000-45 | Para extracción de aorta |
| Ketamina | Dechra | — | Para anestesia de ratón |
| Penicilina/estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiótico |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | Tampón de lavado |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | BDH9286 | Para validación de CML; concentración de trabajo 150 mM (8,8 g por 1 L) |
| Inhibidor de tripsina de soja | Worthington Biochemical | LS003570 | Evita la sobredigestión |
| Base de Tris | Fisher Scientific | BP152 | Para validación de CML; concentración de trabajo 20 mM (2,4 g por 1 L) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | Para validación de CML; concentración de trabajo 0,1 % |
| Tinción con azul de tripano | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Para conteo celular |
| Tripsina-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Para pasaje |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | Para validación de CML; concentración de trabajo 0,1 % |
| Xilacina | Covetrus | 61035 | Para anestesia de ratón |
| Materiales opcionales (si se utilizan) | |||
| Frascos de cultivo (T25/T75) | Corning | — | Ampliación celular |
Referencias
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