Fabricación y uso de una microplaca de 32 pocillos con LED integrados para el control dinámico optogenético

Resumen

Este protocolo describe cómo fabricar, programar y operar una microplaca de 32 pocillos con un diodo emisor de luz (LED) integrado para estudios optogenéticos (LEMOS 2.0) dentro de un lector de microplacas, a fin de permitir la estimulación optogenética de alto rendimiento y mediciones cuantitativas de la expresión génica en cultivos microbianos.

Resumen

El control optogenético permite la regulación activada por luz de la expresión génica y proporciona una interfaz programable entre células vivas y sistemas electrónicos. Sin embargo, la prototipificación rutinaria de constructos optogenéticos sigue limitada por la infraestructura. Las plataformas cerradas existentes a menudo requieren quimiostatos, microfluidica, manipulación robótica o sensores ópticos personalizados, lo que puede aumentar los costos, reducir la accesibilidad o restringir el rendimiento de las mediciones.

Aquí se presenta LEMOS 2.0, una placa microtituladora actualizada con diodos emisores de luz (LED) integrados para estudios optogenéticos, un dispositivo de bajo costo para la estimulación optogenética y la caracterización de circuitos genéticos dentro de lectores de placas estándar. LEMOS 2.0 mejora la plataforma LEMOS original al aumentar el rendimiento de 16 a 32 micropocillos y reducir la fuga de luz entre micropocillos adyacentes, lo que permite condiciones de oscuridad como un estado adicional de iluminación. El dispositivo consta de un marco impreso en tres dimensiones (3D), LEDs individualmente direccionables colocados junto a cada micropocillo, una batería recargable y un microcontrolador integrado para comunicación inalámbrica mediante Bluetooth. Los micropocillos de polidimetilsiloxano (PDMS) biocompatibles se moldean directamente en el dispositivo mediante replicación por moldeo, lo que permite la estimulación de cultivos bacterianos a través del molde transparente. El dispositivo se adapta a lectores de placas estándar, permitiendo la medición de densidad óptica y fluorescencia.

Este protocolo describe el flujo de trabajo completo de LEMOS 2.0, incluyendo la fabricación del dispositivo, el ensamblaje del circuito, la programación de Arduino, la elaboración de micropocillos de PDMS, la configuración del lector de placas, la preparación de cepas y cultivos, la ejecución automatizada del experimento, la limpieza del dispositivo y el análisis de datos de fluorescencia y OD₆₀₀. Como demostración, el protocolo utiliza el sistema optogenético CcaSR, en el cual la expresión de sfGFP es activada por luz verde y reprimida por luz roja. LEMOS 2.0 tiene como objetivo hacer que las perturbaciones optogenéticas y la caracterización de la expresión génica sean más accesibles para los usuarios de laboratorio, permitiendo ciclos más rápidos de diseño-construcción-prueba-aprendizaje sin necesidad de infraestructura especializada de biorreactores o microfluidos.

Introducción

La optogenética proporciona una interfaz programable entre células vivas y sistemas electrónicos de control. Al utilizar la luz para regular la expresión génica, el comportamiento celular puede activarse con precisión temporal, reversibilidad y mínima perturbación del medio de cultivo¹. Cuando se combina con reporteros fluorescentes o luminiscentes, los sistemas optogenéticos permiten medir electrónicamente los estados biológicos y regularlos mediante retroalimentación¹. Esta interfaz óptica bidireccional ha posibilitado el control ciber-genético de procesos celulares, incluyendo la expresión génica, el crecimiento celular y la composición de la población^2,3,4. Sin embargo, muchos sistemas optogenéticos exitosos en bucle cerrado requieren quimioestatos especializados⁵, dispositivos microfluídicos^4,6,7 o muestreo robótico^2,3,8, lo que puede limitar su accesibilidad y dificultar los ciclos rutinarios de diseño-construcción-prueba-aprendizaje.

Los lectores de microplacas están entre los instrumentos más utilizados para medir el crecimiento microbiano y la dinámica de expresión génica. Proporcionan mediciones fiables de densidad óptica y fluorescencia en múltiples muestras, permiten el control ambiental y ya están integrados en los flujos de trabajo estándar de biología sintética⁹. Sin embargo, los trayectos de iluminación en los lectores de placas comerciales estándar están diseñados para mediciones ópticas, no para la actuación optogenética programable y específica por pocillo durante el crecimiento del cultivo. Como resultado, los experimentos optogenéticos a menudo requieren dispositivos de iluminación independientes^{10,11,12,13,14}, transferencia robótica entre plataformas de estimulación y medición^8,15, o hardware personalizado para la adquisición de datos^5,16,17. Estos pasos adicionales reducen la resolución temporal, introducen variabilidad en el manejo y complican el control en bucle cerrado.

La placa microtituladora con LED integrados para estudios optogenéticos, o LEMOS, fue desarrollada previamente para abordar esta carencia¹⁸. LEMOS es un dispositivo compatible con lectores de microplacas que contiene LED individualmente direccionables posicionados alrededor de micropocillos de cultivo. El dispositivo permanece dentro de un lector de microplacas comercial durante todo el experimento, lo que permite que la estimulación óptica y la medición de fluorescencia o densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) se realicen en la misma plataforma. En la implementación original, LEMOS soportaba 16 micropocillos de cultivo y se utilizó para demostrar la estimulación optogenética en lazo abierto y el control de retroalimentación en lazo cerrado de la expresión génica en cultivo por lotes¹⁸. El dispositivo se sincronizó con una computadora externa para que la iluminación de los LED pudiera desactivarse durante las ventanas de medición, minimizando así la interferencia directa con las lecturas de fluorescencia y densidad óptica.

Este protocolo describe una versión actualizada del dispositivo, LEMOS 2.0, y su uso en experimentos optogenéticos con cultivos microbianos. LEMOS 2.0 fue rediseñado para aumentar el número de micropocillos de cultivo independientemente direccionables de 16 a 32, mejorando el rendimiento experimental y permitiendo probar más condiciones, réplicas o diseños de controladores en un solo ensayo. El diseño del dispositivo también se modificó para reducir la fuga de luz entre los micropocillos iluminados y los micropocillos oscuros adyacentes, mejorando la fiabilidad de los controles oscuros y de los experimentos de estimulación con patrones espaciales. Estas modificaciones hacen que la plataforma sea más adecuada para la caracterización optogenética comparativa, la evaluación de controladores en múltiples condiciones y la adopción rutinaria del protocolo por laboratorios que ya utilizan lectores de microplacas.

LEMOS 2.0 está diseñado para experimentos microbianos de cultivo por lotes que requieren mediciones repetidas de OD₆₀₀ y fluorescencia con iluminación programable en estados rojo, verde, azul o oscuro. El lector de placas debe admitir mediciones cinéticas de OD₆₀₀ y fluorescencia, control de temperatura, agitación, definición personalizada del diseño de la placa para los 32 micropozos de LEMOS y exportación automatizada de archivos de medición a una carpeta supervisada por el script de control en Python. La implementación actual se validó utilizando un lector de microplacas BioTek Synergy H1 con BioTek Gen5 v3.14; la implementación con otro software de lectores de placas requiere modificaciones adecuadas en el formato de exportación, el analizador de archivos y los pasos de automatización de pantalla. Dado que el dispositivo utiliza LED con picos de emisión en 620–630 nm, 515–525 nm y 465–475 nm, los usuarios deben seleccionar actuadores optogenéticos y reporteros fluorescentes cuyos espectros de activación y lectura sean compatibles con estos canales^19,20. Nuevas cepas hospederas, reporteros, sistemas optogenéticos, medios, temperaturas de crecimiento, intervalos de muestreo o diseños de controladores probablemente requerirán una recalibración de la intensidad del LED, el rango del ciclo de trabajo, la corrección del blanco, la normalización de la fluorescencia y los parámetros del controlador.

El protocolo abarca todo el flujo de trabajo de LEMOS 2.0: fabricación del dispositivo, ensamblaje del circuito, programación de Arduino, moldeo de micropocillos de polidimetilsiloxano (PDMS), configuración del lector de placas, preparación de cepas y cultivos, ejecución automatizada del experimento, limpieza del dispositivo y análisis de datos de fluorescencia y OD₆₀₀. Aunque el flujo de trabajo de ejemplo se centra en el control optogenético de la expresión génica bacteriana, el mismo marco puede adaptarse a otras cepas microbianas, reporteros fluorescentes, sistemas actuadores optogenéticos y algoritmos de control. Al combinar la iluminación programable con mediciones estándar mediante lectores de placas, la plataforma actualizada de LEMOS 2.0 ofrece un enfoque accesible para experimentos de perturbación optogenética y control por retroalimentación de alto rendimiento en cultivos por lotes.

Protocolo

All experimental procedures involving Escherichia coli strain MG1655  were performed in designated Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratories at Texas A&M University. Bacterial cultures and manipulations were carried out in certified Class II Biosafety Cabinets in accordance with standard containment guidelines. Procedures were performed under designated containment conditions reviewed and approved by the Texas A&M Institutional Biosafety Committee (IBC) under permit number IBC2023-044.

1. Fabrication of the LEMOS 2.0 Frame and LED Array

NOTE: Begin fabricating LEMOS 2.0 by 3D-printing the LEMOS 2.0 frame and placing the LED strips into the device body. The goal is to generate a mechanically stable frame in which each LED is positioned next to the corresponding microwell. Correct LED placement at this stage is important because misalignment can reduce stimulation uniformity and increase optical crosstalk between microwells.

1. 3D-print the LEMOS 2.0 inner frame and the casting mold for the PDMS microwells using the provided STL files in the GitHub repository (github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0). Remove all support material after printing.
   NOTE: It is recommended to use polylactic acid (PLA) filament and a fused deposition modelling (FDM) printer with the following printing parameters: 0.2 mm layer height, 20% infill for the LEMOS 2.0 frame, and 40% infill for the casting mold.
2. Cut the LED strips across the center of the soldering pads into 2 sets of 16 LEDs. Ensure each strip end has three soldering pads available for soldering, as discussed further in Section 2.
3. Fold each LED strip in half, with the LEDs facing outward (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1).
4. Manually conform the LED strip to the device geometry and insert it between the microwells, with the +5 V soldering pads oriented downward, noting the arrow on the LED strip (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1). Adjust the strip position iteratively until each LED is correctly seated in its slot before continuing.

2. Assembly and Validation of the Electrical Circuit

NOTE: Assemble the power, charging, microcontroller, switch, and LED connections required for wireless device operation. After assembly, the LEMOS 2.0 device should operate from the onboard battery, recharge through the charging module, and receive LED commands from the peripheral Arduino board. Verify each power connection before connecting the LED strips, as incorrect voltage routing can damage the microcontroller or LEDs.

CAUTION: The protocol requires prior proficiency in soldering, including appropriate safety practices (e.g., use of a smoke absorber, protective eyewear, and burn-prevention methods), soldering iron maintenance, and basic through-hole/wire-soldering techniques. Users without this experience should obtain training before attempting the steps in this section.

1. Gather all electronic components listed in the Table of Materials and inspect for visible physical damage. Review the wiring diagram (Supplementary File 1).
2. Configure the step-up voltage converter to output 5 V, instead of the default 12 V. Following the configuration key on the back of the board, disconnect pads A and B by applying heat from a soldering iron to remove the connection.
3. Solder the Arduino Nano BLE Rev2 (referred to hereafter as BLE Nano) VIN pin to the step-up converter OUT+ pin and the BLE Nano GND pin to the step-up converter OUT- pin (Supplementary Figure 1B).
4. Solder the step-up converter IN– pin to the battery charging module negative (-) pin.
5. Separate the two wires of the 'JST PH 2-Pin Cable – Female Connector, 100 mm' by pulling the battery-connection ends from the white housing. Trim each to ~70 mm to better fit in the device by trimming from the non-battery-connection ends (Supplementary Figure 1C).
6. Modify the switch. First, remove the mounting pins in each corner. Second, trim all pins to 30% of their length. Then, remove completely T1, T3, and B3 (Notation: T = top, B = bottom, numbered left to right from 1 to 4 when looking directly at the pins with the switch on top) (Supplementary Figure 1D).
7. Solder the red JST cable to B2, leaving the battery-connection end exposed for connecting to the battery’s male connector later (Supplementary Figure 1D).
8. Solder a connecting wire between B1 and B4.
9. Solder the battery charging module B+ pin to B1, being careful to leave the connecting wire from the previous step also soldered to B1 (Supplementary Figure 1E).
10. Solder the step-up converter IN+ pin to T4.
11. Solder the battery charging module positive (+) pin to T2.
12. Solder the black JST cable to the battery charging module B– pin. Leave the battery-connection end loose for later connection to the battery’s male connector.
13. Verify connections under normal device operation mode. Connect the Li-ion battery to the circuit via battery connecting wires left loose in soldering steps, with the switch in the center/off position (Supplementary Figure 1E).
14. Flip the switch to the left/on position (the side with only 2 occupied pins).
15. Verify power to the BLE Nano via the onboard power LED (labeled ‘ON’, next to the USB port), which should turn green (Supplementary Figure 1E, Supplementary Video 1).
16. Verify power to the step-up converter via its on-board LED, which should turn blue.
    NOTE: If LED indicators do not illuminate, verify all connections with a multimeter before proceeding.
17. Remove the first LED strip (inserted in step 1.4) and solder wires to both sets of VIN, DIN, and GND pads. Reinsert the LED strip, feeding the wires through the port on the side of the frame (Supplementary Figure 1F, Supplementary Video 1).
18. Repeat with the second LED strip, according to Supplementary Video 1.
19. Solder the first LED strip to the BLE Nano GND pin, BLE Nano D13 pin, and BLE Nano VIN pin.
    NOTE: Soldering to the VIN pin requires soldering two wires to the same Arduino pin. Solder one wire inside the pin hole, and the other to the outside of the pin hole, at the indentation in the Nano board.
20. Solder the two LED strips together.
21. Verify connections with a multimeter in continuity mode by touching the VIN pin on the BLE Nano and the +5 V pad on the last unsoldered LED pad. Repeat for GND.
22. Secure the LED strips in place using a hot glue gun (Supplementary Figure 1F, Supplementary Video 1). Move slowly, gluing only one or two LED pairs at a time, allowing the glue to cool between applications. Use tweezers as needed to hold the LEDs in place.

3. Programming the Central and Peripheral Arduino Boards

NOTE: Program the two Arduino boards used for wireless communication and LED control. The central Arduino (Arduino Nano IOT 33) is connected to the computer during an experiment, and it relays commands from the Python script. The peripheral Arduino (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) is stationed in the LEMOS 2.0 device and controls the LED array. Both boards must be loaded with the appropriate sketches before starting an experiment. Visual indicators of successful connection to the other device are available by uncommenting the listed lines in the Arduino scripts: Central – Lines 34–37, Yellow LED flashes; Peripheral – Lines 99–106, Green LED flashes. Re-comment these lines after observing successful connections between devices. Otherwise, flashing LEDs may turn on while the device is inside the plate reader, potentially compromising the measurements.

1. Download the Arduino files from the GitHub repository: LEMOS_Central.ino, LEMOS_Peripheral.ino. Download and install the latest version of the Arduino integrated development environment (IDE) from http://www.arduino.cc/en/software.
2. Install the latest version of the board package from the Boards Manager (Tools > Board > Boards Manager) (Supplementary Figure 2A).
   Central: Arduino SAMD Boards
   Peripheral: Arduino Mbed OS Nano Boards
3. Install the following Arduino libraries in the Library Manager (Tools > Manage Libraries) (Supplementary Figure 2B): 'ArduinoBLE’ for Bluetooth Low Energy communication between both peripheral and central devices, and ‘Adafruit_NeoPixel’ for LED programming.
4. Open the LEMOS_Central.ino Arduino file in the Arduino IDE.
5. Connect the corresponding device to the computer via universal serial bus (USB) data cable.
6. Select the correct COM port for the connected device (Tools > Port). If the COM port is unclear, observe which port appears and disappears when connecting and disconnecting the device.
7. Select the Arduino Nano 33 IoT board from the board menu (Tools > Board).
8. Upload the script to the device.
9. Repeat for the LEMOS_Peripheral.ino file and peripheral device (Arduino Nano 33 BLE Rev 2).

4. Casting PDMS Microwells by Replica Molding

NOTE: Cast optically clear PDMS microwells directly inside the LEMOS 2.0 frame using replica molding²¹. The PDMS microwells hold the bacterial cultures during plate-reader experiments and must have clear, bubble-free bottoms for reliable OD₆₀₀ and fluorescence measurements. Dust, bubbles, or incomplete curing can introduce well-to-well variation and should be avoided during casting. Ensure the fume hood surface is clean before casting, as any dust or debris in the PDMS will compromise its optical transparency and result in inconsistent OD₆₀₀ readings across microwells.

CAUTION: Work in a fume hood when handling uncured PDMS. Avoid skin contact with the curing agent.

1. Sanitize the interior of the LEMOS 2.0 frame where the microwells are cast by spraying 70% ethanol, avoiding direct contact with any electrical components other than the LEDs. Allow the LEMOS 2.0 frame to dry completely before casting PDMS microwells.
   NOTE: Ethanol exposure to the LEDs is safe, but will damage all other electrical components.
2. Spray the casting mold for the PDMS microwells with a release agent, and wait 10 min for the spray to settle on the plastic surface. A second application after an additional 10 min can improve mold release, but it is optional.
   NOTE: The release agent (e.g., Ease Release 200) will make the casting mold hydrophobic, allowing for easy removal of the casting mold from the cured PDMS microwells.
3. Weigh and mix the curing agent and base of 184 silicone elastomer to a 10:1 mass ratio of base to curing agent in a disposable plastic cup.
   NOTE: It is recommended to use 2.5 g of curing agent + 25 g of base for a total of 27.5 g mixture for one LEMOS 2.0 device; scale up proportionally if casting multiple devices simultaneously.
4. Mix vigorously for at least 5 min using a disposable spatula or wooden stick, scraping the sides and bottom of the cup to ensure complete mixing.
   NOTE: Thorough mixing is critical. Undermixed PDMS will not cure uniformly and will yield inconsistent baseline OD₆₀₀ readings across microwells.
5. Place the cup containing the PDMS mixture in a vacuum desiccator. Apply vacuum (at least 65 cmHg /25 inHg) for 45–60 min, until all visible air bubbles have been removed from the mixture. The PDMS will expand as air bubbles rise to the surface and may overflow its cup. Use a container with at least 3× the volume of the mixture.
   NOTE: Residual air bubbles in the cured PDMS will alter the optical transmission of the microwell bottoms, leading to inconsistent baseline OD₆₀₀ measurements.
6. Secure the LEMOS 2.0 frame to the outer shell using binder clips of appropriate sizes on all four sides.
   NOTE: The binder clips minimize the amount of PDMS that seeps into the gap between the outer shell and the LEMOS 2.0 frame. Excess PDMS in this gap can increase the overall device height and prevent the LEMOS 2.0 frame from sitting level within the outer shell. Placing Kapton tape along the bottom perimeter of the LEMOS 2.0 frame, adjacent to the microwells, can further reduce seepage.
7. Pour the degassed PDMS carefully into the LEMOS 2.0 frame. Use a syringe to add PDMS into each microwell in the frame to ensure they are filled with minimal bubbles.
   NOTE: Formation of small bubbles is unavoidable; they will eventually rise to the surface and disappear. Pour the degassed PDMS immediately after degassing to minimize the reintroduction of bubbles during handling.
8. Insert the 3D-printed casting mold into the PDMS-filled frame. Press the mold gently and evenly, ensuring the circular protrusions in the casting mold sit in the holes of the LEMOS 2.0 frame. The mold defines square microwells aligned next to the LEDs. Wipe away excess PDMS that overflows from the edges with a clean lint-free wipe.
9. Allow the PDMS to cure at room temperature (25 °C) on a level surface for a minimum of 30 h. If needed, accelerate curing by placing the device at 37 °C for 4 h, but only once all visible air bubbles have been removed from the PDMS.
   CAUTION: Do not expose the LEMOS device to temperatures above 37 °C, as this may cause the onboard Li-ion battery to overheat and rupture.
10. Remove the casting mold after the PDMS microwells are cured by gripping it at the edges and pulling it up with a steady force. Ensure the PDMS microwells remain in the frame.
11. Inspect each microwell to ensure that the walls are optically clear and the bottom is free of bubbles. The LEMOS 2.0 device with fresh PDMS microwells is now ready for use.

5. Configuring the Microplate Reader and Data Export Workflow

NOTE: Configure the microplate reader to obtain LEMOS 2.0-compatible kinetic measurements and automation of data export. The reader must recognize the custom LEMOS 2.0 microwell layout, acquire OD₆₀₀ and fluorescence measurements at defined intervals, and export data files to the folder monitored by the Python control script. Perform a baseline measurement with sterile medium before biological experiments to confirm that the PDMS microwells and plate-reader settings produce consistent readings. This protocol uses a BioTek Synergy H1 microplate reader operated via BioTek Gen5 software v3.14.

1. Launch Gen5.
2. Go to Plate Types and import LEMOS 2.0.xml from GitHub, or alternatively set up the custom plate layout for LEMOS 2.0 in Gen5 by referring to Supplementary File 2 (Section 1)  and Supplementary File 3.
3. Perform a baseline measurement with the LEMOS 2.0 device (microwells filled with 200 µL of sterile M9CA media, covered with a medical-grade sealing film [e.g., Breathe-Easy film]). Record the OD₆₀₀ and fluorescence baseline values for all 32 microwells and compare these values to those obtained from a standard 96-well microplate. If a large discrepancy is observed, re-cast the PDMS microwells, as bubbles or debris in the cured PDMS are the most likely cause.
   NOTE: Breathe-Easy film is gas-permeable, maintaining aerobic conditions for cell growth, while remaining optically transparent to avoid interference with fluorescence and OD₆₀₀ measurements.
4. Open the experiment protocol closed_loop_protocol.prt from the GitHub repository in Gen5.
   NOTE: A pre-configured experiment file template.xpt is available in the GitHub repository for convenience. However, the settings are described in detail in Supplementary File 2 (Section 2) and Supplementary File 3 to provide a reference for troubleshooting for users with different versions of Gen5.

6. Preparation of Bacterial Cultures for LEMOS 2.0 Experiments

NOTE: Prepare bacterial cultures for a LEMOS 2.0 optogenetic time-course experiment. A cautious approach to culture preparation is important because starting density and pre-experiment light exposure can affect the measured gene-expression dynamics. The demonstration strain is Escherichia coli (E. coli) MG1655 carrying pSR58.6 and pNO286-3²². pSR58.6 contains superfolder green fluorescent protein (sfgfp) under P_cpcG2 and constitutive CcaR, chloramphenicol resistance, and a pColE1 origin. pNO286-3 contains constitutive CcaS, spectinomycin resistance, and a p15A origin. Together, these plasmids reconstitute a green-light-inducible, red-light-repressible gene expression system. pSR58.6 and pNO286-3 were transformed into chemically competent E. coli MG1655 using standard heat-shock transformation²³. Plates were kept in a box to protect cells from ambient light to avoid premature activation of the optogenetic circuit.

1. Inoculate a single colony of the CcaSR optogenetic strain and a fluorescence-negative control strain into separate 14 mL round-bottom culture tubes, each containing 2 mL of M9CA broth supplemented with 50 µg/mL spectinomycin and 25 µg/mL chloramphenicol. Use this media formulation for all subsequent culture steps throughout the experiment.
2. Cover each tube with aluminum foil and incubate overnight (14–16 h) at 37 °C with shaking at 220 rpm.
   NOTE: Foil wrapping maintains dark conditions and prevents unintended activation of the CcaSR system. Alternatively, cultures can be incubated under constant red light by housing the tubes in an LED enclosure wired with the same electrical setup described in section 2, which more closely mimics the repressed state of the system prior to the experiment.
3. Transfer 100 µL of each overnight culture into 2 mL of fresh media in a new foil-wrapped culture tube. Incubate for 4 h at 37 °C with shaking at 220 rpm.
4. Measure the OD₆₀₀ of each sub-culture after 4 h using the microplate reader.
   NOTE: Cultures should have reached an OD₆₀₀ of 0.4–0.6.
5. Dilute each culture to OD₆₀₀ = 0.1 in fresh media, pipette 200 µL into each microwell of the LEMOS 2.0 device, taking care while pipetting to avoid the formation of air bubbles, and seal the device with a medical-grade sealing film.

7. Initiation of a LEMOS 2.0 Optogenetic Time-Course Experiment

NOTE: Start the automated LEMOS 2.0 experiment by coordinating the microplate reader, the central Arduino, and the Python control script. During the run, the computer coordinates plate-reader measurements, data export, Bluetooth communication, and LED actuation. It is critical that the Gen5 window remains visible, as the Python script uses screen-based automation to interact with the plate-reader software. A successful start is indicated by exported data files appearing in the expected folder, terminal output confirming Bluetooth communication, and LED commands updating at each control interval.

1. Slide the switch to the left to power on the LEMOS 2.0 device. The first LED on the LED strip in LEMOS 2.0 will illuminate green.
2. Connect the central Arduino to the computer via USB and select it in the Arduino IDE from the drop-down menu (Tools > Board).
3. Open the Serial Monitor and connect the peripheral Arduino staged in LEMOS 2.0 to the central Arduino.
4. Turn off the indicator LED on the LED strip by entering the letter 'o' into the serial monitor.
5. Open the experiment file LEMOS-start-data.xpt in Gen5 and take a baseline reading of the cultures in the device, ensuring that the OD₆₀₀ and fluorescence values are consistent with expectations. Close the experiment file.
6. Open the protocol file saved in step 5.4 in Gen5 and save it as an experiment by referring to the Supplementary File 2 (Section 3) and Supplementary File 3.
7. Ensure that Python 3.10 or newer is installed on the system, and install the required packages using the provided requirements.txt file.
8. Open control_duty_cyle.py (for duty cycle experiments) or control_pid.py (for PID experiments) in any suitable IDE, such as Visual Studio Code or Spyder.
   NOTE: Ensure the working directory is set to the folder containing all the Python scripts so they can be imported during script execution. The choice of IDE is not critical.
9. In the Main section of the python script, modify the file variable to match the filename chosen for the Gen5 experiment file in step 7.6.
10. Set up the experiment file and Python script side by side (Figure 1).
11. Click Run on the Gen5 experiment, then abort it once the kinetic step begins.
    NOTE: The Python script looks for a Continue button after clicking Run. However, in a fresh experiment file, this button is not displayed until the second reading is taken or the kinetic run is aborted.
12. Run the Python script. Do not minimize or cover the Gen5 window during the run.
    NOTE: The Python script uses screen-based automation and must be able to locate the Gen5 window approximately every 20 min to handle data export after each kinetic cycle. Obscuring or minimizing the window during this time may disrupt the experiment.

8. Device Cleaning, PDMS Removal, and Battery Recharging

NOTE: Clean and reset the LEMOS 2.0 device after the experiment. Remove the bacterial cultures and the used PDMS microwells, sanitize the reusable frame and shell, and recharge the battery for the next run. Avoid exposing the non-LED electronic components to ethanol or excessive mechanical force during cleaning.

1. Gently peel the medical-grade sealing film from the top of the LEMOS 2.0 device and discard.
2. Aspirate and discard all cell suspension fluid from each microwell using a pipette according to biological waste disposal procedures.
3. Separate the outer shell from the LEMOS 2.0 frame by applying a steady, even force. Avoid excessive bending or twisting of the PLA frame, as this may cause cracking or permanent deformation.
4. Peel away the bulk PDMS layer from the exterior of the frame and use tweezers to carefully remove PDMS microwells from the LEMOS 2.0 frame.
5. Sanitize the LEMOS 2.0 frame and outer shell with 70% ethanol, avoiding direct contact with any electrical components other than the LEDs, as described in step 4.1.
6. Recharge the Li-ion battery for the next experiment:
   1. Slide switch to the right/charging position.
   2. Connect USB to charging module.
   3. Confirm charging via the onboard LED, which will flash while charging (Supplementary Figure 1E).

9. Analyzing Fluorescence and Growth Dynamics

NOTE: Process the fluorescence and OD₆₀₀ data generated during the LEMOS 2.0 experiment. The analysis notebook imports the exported plate-reader data, applies blank and negative-control corrections, calculates normalized fluorescence, and generates time-course plots. Before running the notebook, confirm that the microwell assignments and condition labels match the experimental layout.

1. Open either FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb or FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
   NOTE: This uses fluorescence (FL) and optical density (OD) data, which are stored in these files, generated during the run: Datafile/fl.csv and Datafile/od.csv. The PID analysis sheet also uses the errors of expression from the set point that are stored in Datafile/errors.csv.
2. Set the conditions variable with condition names and wells.
3. Set neg_wells equal to a bracketed list of negative control microwell names.
4. Set od_blank and fl_blank to averages across blank wells, or to known values if no blank was run.
5. Set colors_4_figures to desired colors (full list of named colors available at https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
6. Set figsize to the desired width and height of resultant figures in inches.
7. Confirm filenames listed under Constants.
8. Run the notebook, figures will be generated as .png files.

10. Troubleshooting

1. During LED wiring, if the LED soldering pads break off, consider the following:
   1. Bend the corner of the LED strip to more easily fit the wires through the wiring port.
   2. If a stiffer (solid) wire was used, switch to a more flexible (stranded) wire.
2. If the switch is turned on and the BLE Nano's power LED does not illuminate, consider the following:
   1. First, confirm whether the battery is charged. Set the switch to charging mode and connect the charging module to power. If charged, the indicator LED should stop flashing and turn solid green after a few minutes. If the battery was drained, allow it to charge fully before retrying.
   2. If the battery is charged and the LED still does not illuminate, use a multimeter to measure the voltage across the BLE Nano's VIN and GND pins.
      1. 0 V: A wiring connection is broken. Inspect each solder joint along the battery > switch > step-up converter > Nano path and re-flow any joint that looks cold or incomplete.
      2. 5 V: Power is reaching the Nano correctly, so the board itself may be damaged. Attempt to power the Nano via cable to confirm this. If the power LED still does not illuminate, solder a new Nano to replace the faulty Nano.
      3. Greater than 5 V: The step-up converter has not been configured to output 5 V. Confirm pads A and B have been disconnected on the step-up converter, as described in the device assembly section.
3. If the Python script fails to run, consider the following:
   1. Confirm whether the Python script is opened from within its full project folder rather than as a standalone file; both control_duty_cycle.py and control_pid.py depend on other local modules and will fail if opened independently.
   2. Confirm that Arduino IDE is closed, since the Arduino can only have one active connection at a time. The operating system grants access to whichever program opens the port first.
   3. Confirm that the Gen5 protocol is set up correctly, especially if using different software. Refer to Supplementary File 2 (Section 2).
   4. Ensure the required packages are installed. Create a virtual environment and install the packages as listed in the requirements.txt file.
4. If the experiment stops unexpectedly, consider the following:
   1. Stops after the first cycle: The Gen5 data export path is likely misconfigured. Confirm the export destination matches the folder the Python script expects to read from the file variable.
   2. Stops after several cycles: PyAutoGUI occasionally fails to recognize on-screen elements, often after a change in screen resolution, display scaling, or window size. Re-capture the reference screenshots used by the script and keep the Gen5 window active and in the foreground throughout the run; the Python IDE window can be minimized.
   3. In the event that Gen5 reports that the chamber temperature is outside the target range, allow the reader to equilibrate before continuing. Do not override the temperature warning, because doing so can trigger an audit report window that must be closed manually and may interrupt automation.
5. If unusually high or inconsistent OD₆₀₀/fluorescence baseline values across microwells are observed, consider the following:
   1. Inspect the PDMS microwells for trapped dust or debris, which scatters light and inflates readings.
   2. Avoid leaving PDMS uncovered and exposed to ambient air for extended periods before casting or use.
6. If cells show no detectable response to light despite running the experiment, consider the following:
   1. Confirm LED "on" commands are being issued by checking both the IDE terminal output and the BLE communication log.
   2. If commands are being sent but no light is visible, check the LED soldering connections with a multimeter.

Resultados

LEMOS 2.0 es una plataforma compatible con lectores de microplacas de 32 pocillos²⁴ para estimulación optogenética programable y medición cuantitativa de la expresión génica (Figura 2A,B). Cada micropocillo está asociado a un diodo emisor de luz (LED) WS2812B individualmente direccionable, controlado por un Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2 mediante la biblioteca Adafruit_NeoPixel. El dispositivo se comunica con un ordenador externo a través de Bluetooth, lo que permite actualizar los comandos de iluminación durante el experimento. Antes de su uso, se moldean nuevos micropocillos de PDMS en el dispositivo mediante moldeo por réplica (Figura 2C,D). Cultivos de E. coli crecidos en LEMOS 2.0 a 30 °C bajo iluminación constante del LED mostraron un crecimiento reproducible entre los micropocillos, lo que indica que el dispositivo permite el cultivo bacteriano y la medición mediante lector de placas durante todo el curso del experimento¹⁸ (Figura 2E). Además, las curvas de crecimiento fueron similares entre las diferentes condiciones de iluminación, lo que indica que la exposición al LED no afectó de forma medible el crecimiento celular en estas condiciones.

Para demostrar el control de la expresión génica mediante optogenética, se adoptó el sistema CcaSR v3.0²², un sistema de dos componentes activado por luz verde y reprimido por luz roja que controla la expresión de sfGFP (Figura 3A). Bajo luz verde, CcaS se autofosforila y transfiere el fosfato al regulador de respuesta CcaR, el cual se dimeriza para activar la expresión de sfGFP dependiente del promotor P_cpcG2. Bajo luz roja, CcaS se desfosforila, reduciendo así la actividad de P_cpcG2 y reprimiendo la expresión de sfGFP. Los plásmidos CcaSR se transformaron en E. coli MG1655 y se utilizaron para los experimentos descritos en este protocolo (Figura 3B). Durante el experimento, el lector de microplacas midió la DO₆₀₀ y la fluorescencia cada 10 min. Para evitar que la iluminación de los LED interfiriera con las mediciones ópticas, se programó que los LED se apagaran durante las ventanas de medición al principio y al final de cada intervalo de 10 min (Figura 3C).

Primero se evaluó la interferencia entre pozos colocando pozos micrométricos en condición oscura vertical u horizontalmente adyacentes a pozos micrométricos bajo iluminación verde constante (Figura 3D). Los pozos oscuros adyacentes a pozos con luz verde constante no mostraron un aumento significativo en la expresión en comparación con los pozos oscuros sin pozos vecinos iluminados, lo que indica una fuga mínima de luz entre los pozos. En base a estos resultados, se utilizó un valor de modulación por ancho de pulso (PWM) de 1 sobre 255 en experimentos posteriores para proporcionar una estimulación óptica suficiente mientras se minimizaba la interferencia entre pozos.

A continuación, se utilizó una estimulación de circuito abierto para definir el parámetro de actuación para el control optogenético basado en LEMOS. El parámetro de actuación fue el ciclo de trabajo de la luz verde, definido como la fracción de cada ventana de iluminación activa asignada a la luz verde, con el tiempo restante de iluminación asignado a la luz roja. Cada intervalo de control duró 10 min, con los LED activos durante 8 min y apagados durante los 2 min restantes para evitar interferencias con las mediciones del lector de placas. Los ciclos de trabajo de la luz verde entre 5% y 80% produjeron una expresión escalonada de sfGFP, lo que demuestra que el ciclo de trabajo puede utilizarse como una entrada ajustable para la regulación optogenética (Figura 3E). La tasa de expresión aumentó cuando el ciclo de trabajo se elevó de 5% a 40%, sin un aumento significativo adicional a ciclos de trabajo más altos (Figura 3F), lo que sugiere que el sistema se aproxima a la saturación bajo una estimulación prolongada con luz verde.

Finalmente, se implementó un control de retroalimentación en bucle cerrado para probar si LEMOS 2.0 podía regular dinámicamente la expresión génica hacia un punto de ajuste definido²⁵ (Figura 4A). Los componentes del sistema de control se asignaron de la siguiente manera: actuador — LEDs, controlador — computadora externa ejecutando el script PID, y salida medida — fluorescencia de sfGFP normalizada por OD₆₀₀. El controlador comparó el valor medido de FL/OD₆₀₀ con el punto de ajuste asignado y actualizó el ciclo de trabajo de la luz verde para el próximo intervalo de 10 minutos. Se implementó un control proporcional-integral-derivativo (PID), en el cual la duración de la exposición a la luz verde en cada ciclo, t_green, se calculó como:

Aquí, e(t) es el error entre la señal medida de FL/OD₆₀₀ y el punto de consigna en el tiempo t. K es la ganancia proporcional, τ_I  es la constante de tiempo integral y τ_D es la constante de tiempo derivativa. Los parámetros de control en lazo cerrado se seleccionaron utilizando el modelo de expresión génica a través de las etapas de crecimiento (GEAGS, por sus siglas en inglés), que fue reportado previamente²⁶. Con estos parámetros, la señal medida se aproximó y siguió el punto de consigna objetivo de FL/OD₆₀₀ (Figura 4B).

Los comandos correspondientes del ciclo de trabajo se muestran en la Figura 4C. La altura de las barras representa la fracción de luz verde entregada durante cada ventana de iluminación de 8 minutos. El comando del ciclo de trabajo cambió en pasos discretos porque el controlador actualizaba la entrada una vez cada 10 minutos. A medida que la expresión de sfGFP se acercaba al punto de consigna, la exposición a la luz verde disminuía y la exposición a la luz roja aumentaba. Después de que la señal medida alcanzó el punto de consigna, aún se observó un nivel bajo de entrada de luz verde. Esta entrada de control residual probablemente refleja el término derivativo respondiendo al cambio brusco en la tasa de expresión cerca del punto de consigna. Estos resultados demuestran que LEMOS 2.0 puede implementar un control retroalimentado PID guiado por modelo sobre la expresión génica optogenética en cultivo por lotes.

Figura 1: Configuración del software LEMOS 2.0 durante un experimento. Captura de pantalla de ejemplo que muestra el script de control de Python ejecutándose en VS Code (izquierda), con los comandos de LED apareciendo en la terminal a medida que se envían al microcontrolador Arduino. En el panel del explorador de archivos se observa el directorio del proyecto que contiene el script principal y los módulos de funciones asociados. A la derecha, el software del lector de placas muestra un ciclo de medición cinética en curso; al final de cada ciclo, el script de Python activa automáticamente la siguiente ejecución a través de la interfaz Gen5 y actualiza los comandos del ciclo de trabajo de los LED en consecuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Construcción del dispositivo LEMOS y caracterización del crecimiento celular. (A) Esquema despiezado del dispositivo LEMOS que muestra micropozos de PDMS, LED de estimulación, batería, interruptor, microcontrolador, módulo de carga, armazón del dispositivo y carcasa exterior. (B) Dispositivo ensamblado con micropozos de PDMS llenos con agua desionizada. (C) Molde de micropozo de PDMS en el dispositivo LEMOS. Reproducido de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, con licencia CC BY 4.0. (D) Molde impreso en 3D para la fabricación de micropozos. (E) Curvas de crecimiento de E. coli en LEMOS a 30 °C (N = 3 réplicas técnicas para pozos iluminados continuamente con luz verde o roja, así como mantenidos en la oscuridad). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Caracterización del sistema optogenético en LEMOS y dinámicas de control en lazo abierto. (A) Mapa del plásmido del sistema optogenético de dos componentes CcaSR: la luz verde (522 nm) activa CcaS/CcaR para regular positivamente la expresión de sfGFP, y la luz roja (620 nm) regula negativamente la expresión. (B) Protocolo para realizar experimentos optogenéticos con el sistema optogenético CcaSR. (C) Esquema de funcionamiento de LEMOS. Durante el curso temporal de 12 h, el dispositivo permanece en el lector de microplacas. El lector mide la fluorescencia de sfGFP y la DO₆₀₀, luego transmite los datos a una computadora, que gestiona el control de tiempo y ejecuta los programas de Arduino. Los programas de Arduino ordenan al microcontrolador integrado que desactive temporalmente la iluminación LED durante cada medición. Adaptado de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, bajo licencia CC BY 4.0. (D) Efecto de la interferencia de la luz verde en células no estimuladas en condiciones de oscuridad. En el diseño de la placa, los recuadros verdes indican micropocillos con luz verde (N = 9), los recuadros grises indican micropocillos en condiciones de oscuridad sin interferencia lumínica de los micropocillos circundantes (N = 6), los recuadros morados indican micropocillos oscuros (N = 3) adyacentes verticalmente a micropocillos con luz verde, los recuadros amarillos indican micropocillos oscuros (N = 3) adyacentes horizontalmente a micropocillos con luz verde, y los recuadros azules indican micropocillos con luz verde (N = 2) con una cepa control para medir la autofluorescencia. (E) Respuestas en lazo abierto en LEMOS frente a ciclos de trabajo de luz verde variables (5–80%, N = 3) como parámetro de actuación. Las líneas continuas indican las medias; las bandas sombreadas indican las desviaciones estándar. (F) Tasa promedio de expresión durante la fase exponencial de crecimiento con ciclos de trabajo variables. N denota el número de réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Control de retroalimentación en bucle cerrado en LEMOS 2.0. (A) Esquema del funcionamiento en bucle cerrado: el lector de microplacas actúa como sensor que mide FL/OD₆₀₀, el ordenador actúa como controlador y el dispositivo LEMOS 2.0 acciona los LED para regular la expresión génica. El proceso es la expresión génica en células bacterianas vivas. Adaptado de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, con licencia CC BY 4.0. (B) Control proporcional integral derivativo (PID) siguiendo el punto de ajuste de FL/OD₆₀₀ (SP = 18,5 × 10⁵ u.a.). Las referencias con luz constante son verde y roja (N = 3). Las corridas de seguimiento del punto de ajuste se representan con líneas naranjas (N = 3). Las líneas continuas indican la media de FL/OD₆₀₀; las bandas sombreadas indican las desviaciones estándar. La línea punteada marca el punto de ajuste. (C) Comandos representativos del ciclo de trabajo generados por el controlador PID durante el seguimiento del punto de ajuste en bucle cerrado. La altura de las barras indica la fracción de luz verde entregada durante cada intervalo de iluminación. N denota el número de réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Plataforma	Formato de cultivo	Lectura	Control de retroalimentación demostrado	Formato de crecimiento	Limitación abordada por LEMOS 2.0
LEMOS 2.0	32 micropocillos de PDMS en lector de placas	Lector de placas comercial	Seguimiento del punto de consigna mediante PID guiado por modelo	Cultivo por lotes agitado	Este estudio	Este estudio
LEMOS 1.0	16 micropocillos de PDMS en lector de placas	Lector de placas comercial	Seguimiento del punto de consigna mediante PI y PID guiado por modelo	Cultivo por lotes agitado	Menor rendimiento; compatibilidad limitada con condiciones oscuras	18
Turbidostato automatizado + muestreo robótico	Turbidostato	Citometría de flujo + sensor de OD	Seguimiento del punto de consigna mediante PI, PID y MPC	Cultivo continuo	Requiere muestreo robótico; retardo entre medición y actuación	2, 3
Microscopía Mother-machine	Microfluídica de célula individual	Microscopía de células vivas	Retroalimentación a nivel de célula individual / MPC	Perfusión continua	Requiere microfluídica y microscopía especializadas	4, 6, 7
Chi.Bio	Turbidostato miniaturizado	Sensores integrados de OD/FL	Seguimiento del punto de consigna mediante PI	Cultivo continuo	El rango dinámico limitado del sensor integrado restringe el desempeño de retroalimentación de fluorescencia	5
Light Tube Array	Tubos de cultivo	OD/citometría de flujo externos	Solo en modo abierto	Cultivo por lotes agitado	Muestreo manual; lectura de crecimiento en línea limitada	10
LAVA / LITOS / RainbowCap / Diya	Dispositivos de iluminación de pocillos múltiples	Lector de placas comercial	Solo en modo abierto	Cultivo por lotes	Estimulación y lectura separadas; automatización limitada	12, 13, 14, 15
Lustro	Iluminación de placas de 96 pocillos	Lector de placas comercial	Solo en modo abierto	Cultivo por lotes	Requiere transferencia robótica entre estimulación y lectura	8
RT-OGENE	Plataforma compatible con múltiples pocillos/microfluídica	OD/FL basado en cámara	Se intentó en modo cerrado; limitado por la lectura	Cultivo por lotes estático	La lectura basada en cámara y el cultivo estático restringen el desempeño del control	16
optoPlateReader	Lector/estimulador personalizado de 96 pocillos	Fotodiodos integrados	Seguimiento del punto de consigna tipo bang-bang	Cultivo por lotes agitado	La dependencia del reportero/filtro y la menor sensibilidad de fluorescencia restringen la flexibilidad de lectura	11,17

Tabla 1: Comparación de LEMOS 2.0 con plataformas optogenéticas existentes^{2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18}.

Figura suplementaria 1: Imágenes del ensamblaje. (A) Tira LED doblada y tira moldeada dentro del dispositivo. (B) Nano BLE Sense Rev 2 soldada al convertidor elevador, que a su vez está soldado al módulo de carga de la batería. (C) Versiones original y modificada del cable ‘JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 100mm’. (D) Interruptor original, interruptor modificado, cable JST PH rojo soldado y puente corto soldado entre dos pines en ambos lados de la fila inferior. (E) Incorporación del interruptor al ensamblaje del circuito y alimentación del circuito. (F) Vista lateral de los LED y tiras LED colocadas con pegamento caliente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Capturas de pantalla de la configuración del IDE de Arduino. (A) Captura de pantalla del Administrador de placas, que muestra una búsqueda de una de las placas requeridas. (B) Captura de pantalla del Administrador de bibliotecas, que muestra dos de las bibliotecas requeridas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1. Diagrama de cableado de LEMOS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario 2: Protocolo para configurar un diseño personalizado de placa para LEMOS 2.0 en Gen5. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario 3: Capturas de pantalla de los pasos del software descritos en el Archivo Suplementario 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Vídeo suplementario 1: Vídeo de montaje con los siguientes pasos. Manipulación de la tira LED dentro del marco, fijación de la tira LED con pegamento caliente, disposición de los cables tanto hacia como entre las tiras LED, y montaje final con la circuitería electrónica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo describe la fabricación y el funcionamiento de LEMOS 2.0, una microplaca de 32 pocillos con LED integrado para experimentos de estimulación optogenética y control con retroalimentación dentro de un lector de microplacas estándar. Experimentos representativos demuestran que LEMOS 2.0 permite el crecimiento microbiano (Figura 2E) sin observarse fototoxicidad significativa bajo iluminación. Además, LEMOS 2.0 reduce la fuga de luz hacia los micropocillos adyacentes en condiciones oscuras (Figura 3D), mejorando así la fiabilidad de los controles oscuros y los experimentos de estimulación con patrones espaciales. Asimismo, LEMOS 2.0 permite la actuación optogenética basada en ciclos de trabajo (Figura 3E) e implementa un control PID en bucle cerrado de la expresión génica en cultivos por lotes (Figura 4B).

El fotoblanqueo es un aspecto importante a considerar en experimentos optogenéticos porque se utiliza el mismo flujo óptico tanto para la actuación como para la lectura de fluorescencia²⁷. LEMOS 2.0 utiliza LEDs RGB comerciales que contienen tres diodos con picos de emisión en 620–630 nm (rojo), 515–525 nm (verde) y 465–475 nm (azul)¹⁹. Por lo tanto, la selección del reportero y la intensidad de operación del LED deben elegirse para minimizar la superposición espectral entre las longitudes de onda de actuación y el espectro de excitación del reportero fluorescente, manteniendo al mismo tiempo una entrada de luz suficiente para la regulación optogenética. En este protocolo, se utilizó el sistema CcaSR, cuyas respuestas a luz verde y roja se encuentran dentro de las bandas amplias de activación e inactivación reportadas para este sistema²², y se midió la fluorescencia de sfGFP utilizando una excitación a 485 nm. Dado que las longitudes de onda de actuación verde y roja utilizadas para el control de CcaSR están separadas de la longitud de onda de excitación de sfGFP, y porque la salida del LED se minimizó hasta una intensidad PWM de 1 sobre 255 mientras aún se producía una regulación optogenética robusta, se espera que el fotoblanqueo derivado de la actuación con LED sea limitado. Aun así, puede ocurrir algo de fotoblanqueo durante experimentos prolongados de curso temporal; sin embargo, bajo las condiciones utilizadas aquí, no fue lo suficientemente grande como para oscurecer la inducción optogenética medida, la respuesta al ciclo de trabajo o la dinámica de seguimiento en bucle cerrado²⁰.

Varios pasos son fundamentales para un rendimiento confiable. Durante la fabricación, cada LED debe alinearse con el micropozo correspondiente para mantener la uniformidad de la estimulación y reducir la interferencia óptica. Durante el ensamblaje del circuito, el convertidor elevador debe configurarse a 5 V antes de conectar el microcontrolador y las tiras de LED. La colada de PDMS también requiere especial cuidado, ya que las burbujas, el polvo, los residuos o la curación incompleta pueden alterar la transmisión óptica a través de los fondos de los micropozos y producir líneas base inconsistentes de OD₆₀₀ o de fluorescencia²⁸. Por lo tanto, debe realizarse una medición de línea base con medio estéril antes de los experimentos biológicos. Si se observan grandes discrepancias en las lecturas de OD₆₀₀ entre pozos en comparación con el resto de la placa, deben inspeccionarse los pozos afectados en busca de los problemas de fabricación mencionados anteriormente. Dependiendo de la gravedad, esos micropozos deben excluirse del análisis o deben recolarse por completo.

La configuración del software es otra causa común de experimentos fallidos. El flujo de trabajo actual depende del funcionamiento coordinado del método del lector de placas, la exportación de datos de Gen5, el script de control en Python y la comunicación Bluetooth entre las placas Arduino central y periférica. La ruta de exportación y el formato de archivo deben coincidir con la estructura esperada por el script de Python, y la ventana de Gen5 debe permanecer visible durante la ejecución, ya que la automatización utiliza interacciones basadas en la pantalla. Antes de iniciar un experimento, el dispositivo LEMOS debe conectarse a la placa Arduino central, y se debe ejecutar una rutina de prueba para verificar que todos los LED se iluminen correctamente; cualquier LED que no responda debe identificarse y corregirse antes de cargar las culturas bacterianas, ya que fallos no detectados provocarían condiciones de iluminación no controladas durante el experimento. Los usuarios que adapten el flujo de trabajo a otro modelo de lector de placas o paquete de software deben mantener la misma lógica de temporización, medición, exportación y análisis, modificando la capa de automatización según sea necesario.

LEMOS cierra el bucle al permitir una actuación automatizada sincronizada con los intervalos de medición¹⁸. Aquí, el dispositivo LEMOS inicial se actualiza duplicando la cantidad de pocillos para aumentar el rendimiento. Además, una geometría revisada de los micropocillos minimiza la fuga de luz entre pocillos, lo que permite probar circuitos optogenéticos en condiciones oscuras junto con condiciones iluminadas en el mismo experimento. Actualmente, LEMOS 2.0 soporta experimentos de cultivo por lotes. Dado que la velocidad de crecimiento, la disponibilidad de recursos y la dinámica de expresión génica cambian durante el cultivo por lotes, puede ser necesario recalcular parámetros como la intensidad del LED, el rango del ciclo de trabajo, el intervalo de muestreo y los parámetros del controlador para otras cepas, sistemas de reporteros, sistemas optogenéticos o condiciones de crecimiento²⁰. En el Tabla 1 se proporciona una comparación detallada de LEMOS 2.0 con plataformas previamente desarrolladas para realizar estudios optogenéticos. Las versiones futuras podrían incorporar canales o reservorios dentro de la placa para un intercambio y dilución controlados del medio, permitiendo experimentos más prolongados mientras se mantienen condiciones de crecimiento más constantes. Otros diseños adicionales también podrían soportar longitudes de onda alternativas de LED o reducir la dependencia de la automatización mediante software basado en pantallas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hilo conductor trenzado 22 AWG	Amazon	ASIN: B089CQ2N69	Alambre económico para conectar el circuito eléctrico. Es aceptable alambre sólido o trenzado.
Interruptor deslizante de 8 pines, 3 posiciones, 2P3T DP3T con perilla lateral	Amazon	ASIN: B007Q9Y8YC	El interruptor y los pines deben estar en lados adyacentes, no opuestos, como es más común.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2	Arduino	ABX00071	Microcontrolador – Perfil plano y capacidad BLE adecuados para las necesidades del dispositivo periférico.
Arduino Nano 33 IoT	Arduino	ABX00027	Microcontrolador – Utilizado como dispositivo central.
Lector de microplacas BioTek Synergy H1	Agilent (BioTek)	—	O lector de placas compatible con modo cinético
Película sellante Breathe-Easy	USA Scientific	9123-6100	Película sellante de grado médico; sello de microplaca permeable a gases
Cloranfenicol (solución stock de 25 mg/mL en etanol)	Varios	—	Conc. de trabajo: 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200	Mann Release Technologies		Agente liberador
Cinta Kapton	Amazon	ASIN: B07F8TZZ4N
Placas de agar LB y antibióticos adecuados	En laboratorio	—	Se asume que ya están disponibles.
Batería de iones de litio de 3,7 V, 3000 mAh (11,1 Wh), tamaño 104060	Ufine	UFX0391-03	Debe incluir cable JST PH de 2 pines macho. Fabricado por Liter Energy, vendido por varios minoristas.
Módulo de carga y descarga para batería de iones de litio con USB tipo C (5 V 1 A)	Amazon	ASIN: B0CTMJMRKZ	Buscar "Reemplaza TP4056" en Amazon. Pase por alto los módulos TP4056 estándar. Deténgase en cualquier listado que muestre los módulos más pequeños y negros con "Reemplaza TP4056" en el título.
Cable JST PH de 2 pines para batería de iones de litio – Conector hembra de 100 mm	Varios	ASIN: B07NWNPB77	Debe ser compatible con el conector JST de la batería’s.
Módulo mini elevador de 3,7 V a 5 V/8 V/9 V/12 V con indicador LED	Amazon (Teyleten Robot)	ASIN: B0B4TB9QNY	[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
Placa Nunc OmniTray de un solo pozo	Thermo Scientific	242811	Carcasa exterior
pNO286-3	Addgene	Plásmido n.º 107746	Codifica la expresión constitutiva de CcaS
pSR58.6	Addgene	Plásmido n.º 63176	Codifica la expresión constitutiva de CcaR y sfGFP bajo el promotor PcpcG2
Plancha de soldar y estaño	Varios	—	Recomendaciones: punta fina, estaño con núcleo de flux o resina.
Espectinomicina (solución stock de 50 mg/mL)	Varios	—	Conc. de trabajo: 50 µg/mL
Tubos de cultivo estériles (14 mL, fondo redondo)	Varios	—
Elastómero de silicona SYLGARD 184 (base + agente de curado)		SYLGARD 184	Relación de curado:base 1:10 en masa
Cable USB-A a Micro USB	Varios	—	Para conectar las placas Arduino a la PC. Debe ser un cable de transferencia de datos, no solo un cable de carga.
Cable de carga USB-A a USB-C	Varios	—	Se conecta al módulo de carga de la batería
Desecador al vacío y bomba	Varios	—	Para desgasificar PDMS
Tira de LED RGB controlable por IC SPI WS2812B, 100 LED/m, CC5V, IP30, color negro	Amazon (BTF-LIGHTING)	ASIN: B088B8G8LD ; N.º de pieza BTF-LIGHTING: WS2812B1M100LB30	Tira de LED con acceso individual. 100 LED/m. Voltaje: 5 V. IP30 se refiere a resistencia al agua. Se prefiere el color negro sobre el blanco para reflejar menos luz.