Un flujo de trabajo rápido para modelar los déficits de la memoria de reconocimiento inducidos por la privación del sueño en ratones mediante el reconocimiento de objetos novedosos y biomarcadores hipocampales

Resumen

Este artículo presenta un protocolo rápido y reproducible para modelar los déficits en la memoria de reconocimiento inducidos por la privación del sueño en ratones, combinando la privación del sueño con manipulación suave, pruebas de reconocimiento de objetos novedosos y análisis de biomarcadores hipocampales en los mismos animales a lo largo de un proceso de 10 días, con registro estructurado de intervenciones y criterios predefinidos de control de calidad.

Resumen

La falta de sueño contribuye al deterioro cognitivo y puede acelerar los procesos neurodegenerativos. Este artículo presenta un protocolo rápido y reproducible para modelar déficits en la memoria de reconocimiento inducidos por la privación de sueño en ratones, vinculando al mismo tiempo los resultados conductuales con alteraciones moleculares en el hipocampo. El protocolo utiliza un paradigma de privación de sueño mediante manipulación suave durante 5 h, administrado inmediatamente después de una sesión estandarizada de familiarización de 10 min con el reconocimiento de objetos novedosos (NOR). La memoria de reconocimiento se evalúa mediante una prueba NOR de 5 min tras un intervalo de retención definido con precisión de 5 h, seguido inmediatamente por la recolección del hipocampo de los mismos animales para cuantificar citocinas proinflamatorias, incluyendo interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α), así como marcadores de estrés oxidativo, incluyendo superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y malondialdehído (MDA). El principal avance metodológico no radica en las técnicas conductuales o bioquímicas individuales, que ya están bien establecidas, sino en su estandarización operativa como un flujo de trabajo integrado. El protocolo requiere un registro estructurado y cuantificable de las intervenciones de manipulación suave, ancla el entrenamiento y la privación a un punto fijo en el tiempo circadiano, mantiene la vinculación a nivel individual entre los registros NOR y las muestras de tejido, y especifica previamente criterios de control de calidad y análisis. El procedimiento está diseñado para minimizar la restricción física y el ejercicio forzado, puede completarse en un breve periodo experimental y se propone como un protocolo de referencia que laboratorios individuales pueden utilizar para evaluar su propia implementación de la privación de sueño mediante manipulación suave, pendiente de replicación independiente.

Introducción

El sueño es un proceso fisiológico fundamental, esencial para la función cerebral, el aprendizaje y la consolidación de la memoria¹. La falta de sueño se asocia con disfunción cognitiva, trastornos del estado de ánimo y la progresión de enfermedades neurodegenerativas². La privación experimental de sueño (PS) en roedores se utiliza ampliamente para investigar las consecuencias neurobiológicas de la pérdida aguda de sueño. El hipocampo, una región cerebral central para la memoria declarativa y espacial, es particularmente vulnerable a la privación de sueño³.

Existen varios procedimientos disponibles para inducir la privación de sueño en roedores. El método modificado de múltiples plataformas puede reducir eficazmente el sueño de movimientos oculares rápidos, pero puede introducir un estrés considerable y agotamiento físico⁴. En contraste, el manejo suave (GH) mantiene la vigilia mediante una estimulación sensorial leve, como golpear la jaula, perturbar el lecho de cama o presentar material novedoso para anidación cuando aparecen signos de sueño. Un breve período de manejo suave aplicado inmediatamente después del aprendizaje puede interferir con la consolidación de la memoria dependiente del hipocampo, evitando al mismo tiempo muchos de los factores de confusión asociados con los paradigmas prolongados de privación⁵. Dado que las intervenciones en este protocolo se activan por señales posturales y de vigilia conductual, y no por la detección confirmada mediante EEG del sueño REM, el manejo suave tal como se implementa aquí constituye un método establecido de privación total de sueño y no una técnica específica para el sueño REM, y ha sido utilizado en esta forma durante varias décadas⁶.

La prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR) es un ensayo ampliamente utilizado para evaluar la memoria de reconocimiento. Se basa en la tendencia natural de los roedores a explorar un objeto novedoso más que un objeto familiar, sin requerir recompensa, castigo ni entrenamiento extenso^7,8. Se ha demostrado que la privación aguda de sueño deteriora la discriminación de objetos novedosos, proporcionando así una lectura conductual eficiente de la consolidación de la memoria alterada⁹. A nivel molecular, la falta de sueño puede inducir neuroinflamación y estrés oxidativo en el hipocampo, incluyendo niveles elevados de citoquinas proinflamatorias y productos de peroxidación lipídica, junto con una capacidad antioxidante reducida^10,11.

El desafío al aplicar este modelo no radica en la disponibilidad de sus elementos individuales, sino en la falta de consistencia operativa entre estudios. El manejo suave a menudo se informa sin un registro estructurado de la intensidad de la intervención; los puntos finales conductuales y moleculares frecuentemente se recopilan en cohortes separadas; y los criterios de control de calidad para el comportamiento exploratorio y la planificación del tamaño de la muestra no siempre son explícitos. El objetivo general del presente artículo es proporcionar un flujo de trabajo estandarizado para modelar los déficits en la memoria de reconocimiento inducidos por la privación del sueño, vinculando al mismo tiempo los resultados conductuales con medidas moleculares del hipocampo en los mismos animales. El método aborda estas brechas de reproducibilidad combinando una ventana de 5 h de manejo suave tras el entrenamiento, un registro de intensidad de intervención, la recopilación conductual y de tejidos en la misma cohorte y criterios analíticos predefinidos en una única secuencia de 10 días (Figura 1). La falta de estandarización en la implementación del manejo suave ya ha sido señalada previamente en la literatura metodológica de investigación del sueño⁶.

Figura 1. Representación esquemática del flujo experimental. El protocolo abarca 10 días, incluyendo manipulación y habituación, seguidos por un día crítico de pruebas que integra una fase de familiarización de 10 min en la NOR, 5 h de privación del sueño GH, una prueba de NOR de 5 min y la recolección inmediata de tejido hipocampal de los mismos animales para el análisis de biomarcadores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Bienestar y Ética Animal del Laboratorio de AILIMO (Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.) bajo solicitud del Hospital Nanjing Drum Tower (Investigador Principal: Yuan Liu), número de aprobación AP CODE: ALM202605070, aprobado el 7 de mayo de 2026 (válido por 4 años), de acuerdo con las regulaciones institucionales y nacionales aplicables. Utilice ratones macho adultos C57BL/6J (de 8 a 12 semanas de edad) para el protocolo descrito a continuación.

1. Preparación y habituación del animal

1. Mantenga a los ratones en condiciones estándar de laboratorio a 22°C ± 1°C y 50%–60% de humedad, con un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad (la luz encendida a las 07:00, definido como ZT0). Proporcione acceso ad libitum a alimento estándar para roedores y agua.
2. Manipule a cada ratón durante 3–5 min diariamente durante al menos 7 días consecutivos antes de la prueba.
   NOTA: Este procedimiento minimiza el estrés inducido por la manipulación, que podría alterar el comportamiento exploratorio.
3. Prepare una arena opaca cuadrada para el NOR que mida 40 cm × 40 cm × 40 cm, con paredes no reflectantes. Utilice un color de arena que contraste con el color del pelaje de los animales.
4. Seleccione objetos para el NOR lo suficientemente pesados para evitar su desplazamiento y que estén hechos de material no poroso. Use objetos que sean distinguibles en forma y textura, pero que sean comparables en tamaño general.
   NOTA: Figura 2 muestra la configuración de entrenamiento y prueba.
5. Los días 8 y 9, traslade a los ratones a la sala de pruebas 1 h antes de la habituación. Coloque a cada ratón en la arena vacía durante 10 min y luego devuélvalo a su jaula de origen.
6. Limpie la arena y los objetos con etanol al 70% entre cada animal. Deje que el etanol se seque al aire durante aproximadamente 3–5 min bajo ventilación normal de laboratorio antes de introducir el siguiente animal.
   ADVERTENCIA: El etanol es altamente inflamable. Asegúrese de una ventilación adecuada y manténgalo alejado de fuentes de ignición.

Figura 2. Esquema del aparato de reconocimiento de objetos novedosos y del diseño experimental. Durante la fase de familiarización, coloque dos objetos idénticos (A y A′) en esquinas opuestas del recinto. Durante la fase de prueba, tras el intervalo de retención de 5 h, reemplace uno de los objetos familiares con un objeto novedoso (B). Equilibre la posición del objeto novedoso entre las posiciones izquierda y derecha entre los animales, de modo que aproximadamente la mitad de los animales en cada grupo reciban el objeto novedoso en cada posición, para minimizar el sesgo espacial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Entrenamiento en NOR (Familiarización)

1. El día 10, comience el entrenamiento en la NOR a ZT1 (08:00 según el horario de luz indicado). Mantenga este horario de inicio en todos los grupos para minimizar la variación circadiana.
2. Transfiera los ratones a la sala de pruebas 1 h antes del inicio de la sesión de entrenamiento. Coloque dos objetos idénticos (A y A′) en esquinas opuestas del recinto, aproximadamente a 10 cm de las paredes.
3. Asegure los objetos al suelo cuando sea necesario.
4. Coloque al ratón en el centro del recinto, orientado en dirección opuesta a los objetos. Permita que el ratón explore libremente durante 10 min.
5. Registre el comportamiento mediante un sistema de videoseguimiento superior. Defina la exploración activa como dirigir la nariz hacia un objeto a una distancia ≤2 cm, oler el objeto o tocarlo con la nariz.
   NOTA: No considere como exploración del objeto el hecho de que el animal se siente sobre él o trepe por él sin oler activamente.
6. Registre y puntúe el comportamiento en la NOR utilizando EthoVision XT versión 17.5 con una cámara Basler acA1300-60gm colocada por encima. Configure el software de seguimiento con una zona de detección del punto de la nariz de ≤2 cm desde cada objeto para puntuar la exploración activa, de acuerdo con los criterios definidos en el paso 2.5.
7. Al finalizar la sesión de familiarización de 10 min, retire inmediatamente al ratón del recinto.
8. Limpie cuidadosamente el recinto y los objetos con etanol al 70 % antes de introducir el siguiente animal.

3. Privación de sueño mediante manipulación suave

1. Antes de la sesión de entrenamiento del día 10, asigne a cada animal un código de identificación único. Mantenga el código de identificación durante todo el registro del comportamiento y la recolección de tejidos.
2. Asigne los animales a los grupos SD y NSD en una proporción de 1:1 utilizando números aleatorios generados por computadora con la función ALEATORIO de Excel.
3. Inmediatamente después del entrenamiento en NOR, devuelva los ratones NSD a sus jaulas de origen y déjelos sin interrupciones durante 5 h. Mantenga los animales SD y NSD en condiciones ambientales equivalentes y dentro de la misma ventana de tiempo circadiano.
4. Inmediatamente después del entrenamiento en NOR, inicie la privación de sueño GH en los ratones SD. Mantenga la vigilia durante 5 horas consecutivas en la jaula de origen.
5. Supervise continuamente a los animales. Intervenga cuando un ratón adopte posturas relacionadas con el sueño, como encogerse, cerrar los ojos o permanecer inmóvil durante un tiempo prolongado.
6. Aplique la estimulación progresivamente, comenzando con golpes suaves sobre la jaula. De ser necesario, perturbe ligeramente el lecho de cama, introduzca un objeto novedoso limpio como un tubo de papel o toque suavemente al animal con un pincel suave.
7. Evite la restricción física, la locomoción forzada y la estimulación aversiva o dolorosa.
8. Complete el registro de intervenciones en Tabla 1 para cada jaula durante todo el período de 5 h de GH. Registre el número aproximado de intervenciones por hora, el tipo de intervención predominante y cualquier desviación del protocolo o preocupación relacionada con el bienestar.
9. Utilice la misma plantilla de registro de intervenciones en todos los grupos.
   ADVERTENCIA: No utilice restricción física, ejercicio forzado ni estímulos dolorosos, ya que estos pueden influir independientemente en la memoria, el estrés y los resultados inflamatorios.

Identificación de jaula/cohorte	H1	H2	H3	H4	H5	Tipo(s) dominante(s) de intervención	Desviación u observación de bienestar
Identificación del registro	Recuento del registro H1	Recuento del registro H2	Recuento del registro H3	Recuento del registro H4	Recuento del registro H5	Palmetazo / cama / objeto novedoso / cepillo suave	Registrar si está presente

Tabla 1: Plantilla de registro de la intervención de manipulación suave. Registre el ID de la jaula o cohorte, el número de intervenciones de manipulación suave durante cada hora del período de privación de sueño de 5 h (H1–H5), el (los) tipo(s) de intervención dominante(s) y cualquier desviación del protocolo o observaciones de bienestar.

4. Fase de prueba de NOR

1. Exactamente 5 h después de finalizar el entrenamiento NOR, comience la fase de prueba NOR para mantener un intervalo de retención fijo de 5 h.
2. Coloque un objeto familiar (A) y un objeto novedoso (B) en la arena.
3. Equilibre la posición del objeto novedoso entre los animales alternando su ubicación entre la izquierda y la derecha, de modo que aproximadamente la mitad de los animales en cada grupo reciban el objeto novedoso a la izquierda y la otra mitad a la derecha.
4. Coloque al ratón en el centro de la arena. Permita que explore libremente durante 5 min.
5. Grabe la sesión utilizando el mismo sistema de videoseguimiento superior empleado durante la familiarización. Aplique la definición de exploración especificada en el paso 2.5.
6. Limpie la arena y los objetos con etanol al 70 % entre cada animal.

5. Recolección de tejido y disección del hipocampo en el mismo cohorte

1. Inmediatamente después de la prueba NOR, identifique el mismo animal sometido a pruebas conductuales para la recolección de tejido.
2. Sacrifique al animal mediante decapitación sin anestesia, de acuerdo con el protocolo para animales aprobado, para evitar posibles efectos confusos de los agentes anestésicos sobre los biomarcadores inflamatorios y dependientes de la fosforilación. Recolecte el tejido cerebral inmediatamente después de la eutanasia.
3. Mantenga el código único de registro conductual del animal en todos los tubos de muestra y registros para asegurar que cada muestra molecular permanezca directamente vinculada al resultado NOR de ese animal.
4. Extraiga rápidamente el cerebro y colóquelo sobre una superficie de disección estéril y fría con hielo.
5. Seccione los hemisferios mediante un corte medio sagital. Diseque el hipocampo de cada hemisferio utilizando espátulas microscópicas enfriadas.
6. Congele rápidamente los hipocampos diseccionados en nitrógeno líquido. Almacene las muestras a −80°C hasta su análisis.
   ADVERTENCIA: El nitrógeno líquido puede causar lesiones graves por frío. Use equipo de protección personal criogénico adecuado.

6. Cuantificación de biomarcadores del hipocampo

1. Suplemente el tampón de lisis RIPA frío con hielo con una mezcla combinada de inhibidores de proteasas y fosfatasas a una concentración de trabajo 1× (10 µL por mL de tampón de lisis a partir de un stock 100×).
2. Homogenice el tejido hipocampal en una proporción tejido-tampón de 1:10 (p/v) en el tampón de lisis RIPA frío con hielo suplementado (10 µL de tampón de lisis por mg de tejido). Para una masa típica de tejido hipocampal de aproximadamente 25–30 mg por hemisferio, utilice aproximadamente 250–300 µL de tampón de lisis por hemisferio, o aproximadamente 500–600 µL para unos 50–60 mg de tejido hipocampal bilateral.
3. Centrifugue el homogenado RIPA a 14.000 × g durante 15 min a 4°C y recoja el sobrenadante. Utilice el sobrenadante para la cuantificación de proteína total y para los tres ELISA de citoquinas.
   NOTA: Utilice los tampones de homogenización específicos del kit para los ensayos de SOD, GPx y MDA según las recomendaciones de los fabricantes para preservar la actividad enzimática.
4. Prepare un homogenado hipocampal separado al 10% (p/v) para las mediciones de SOD, GPx y MDA en una proporción tejido-tampón de 1:9, utilizando el tampón de homogenización específico del kit correspondiente en lugar del tampón de lisis RIPA.
5. Determine la concentración total de proteína mediante un ensayo de proteína BCA.
6. Cuantifique IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD, GPx y MDA utilizando los kits de ELISA o ensayos bioquímicos específicos para cada diana enumerados en la Tabla de Materiales. Siga las instrucciones del fabricante para cada ensayo.
7. Prepare los estándares en el tampón de ensayo correspondiente. Diluya las muestras de modo que los valores de densidad óptica caigan dentro de la porción lineal de la curva estándar.
8. Diluya las muestras hipocampales para los ELISA de citoquinas aproximadamente 1:5 con el diluyente de ensayo correspondiente. Ajuste la dilución dentro de un rango de 1:2 a 1:10 según sea necesario para obtener valores de densidad óptica dentro de la porción lineal de la curva estándar.
9. Utilice directamente los sobrenadantes de los homogenados hipocampales al 10% (p/v) descritos en el paso 6.4 para los ensayos de SOD, GPx y MDA. No aplique el esquema de dilución para ELISA de citoquinas descrito en el paso 6.8 a estos tres ensayos.
10. Para los ELISA de IL-1β, IL-6 y TNF-α, agregue 100 µL de estándar o muestra hipocampal adecuadamente diluida por pocillo en duplicado e incube a 37°C durante 90 min. Añada 100 µL de anticuerpo de detección biotinilado e incube a 37°C durante 60 min.
11. Agregue 100 µL de conjugado de HRP a cada pocillo del ELISA de citoquinas e incube a 37°C durante 30 min. Revele con sustrato TMB a 37°C en la oscuridad durante aproximadamente 15 min.
12. Para el ensayo de SOD, mezcle 20 µL del sobrenadante del homogenado hipocampal con 20 µL de solución enzimática de trabajo y 200 µL de solución de sustrato. Incube a 37°C durante 20 min y mida la absorbancia a 450 nm.
13. Para el ensayo de GPx, combine 200 µL del sobrenadante del homogenado hipocampal con la mezcla de reacción que contiene GSH e incube a 37°C durante 5 min. Detenga la reacción y centrifugue la mezcla a 3500 × g durante 10 min a 4°C. Somete el sobrenadante al desarrollo del color durante aproximadamente 15 min y mida la absorbancia a 412 nm utilizando 200 µL del sobrenadante de la reacción.
14. Para el ensayo de MDA, mezcle 100 µL del sobrenadante del homogenado hipocampal con 1,0 mL del reactivo de trabajo MDA e incube en un baño de agua a 95°C durante 40 min. Enfríe y centrifugue la mezcla. Transfiera aproximadamente 250 µL del sobrenadante a una microplaca y mida la absorbancia a 532 nm.
15. Para los ELISA de citoquinas, lea la absorbancia a la longitud de onda especificada por el kit, típicamente 450 nm, utilizando corrección por longitud de onda de referencia cuando esté disponible.
16. Genere una curva estándar utilizando un modelo adecuado, como la regresión logística de cuatro parámetros. Normalice cada medición de biomarcador al contenido total de proteína.
17. Informe las concentraciones de citoquinas como pg/mg de proteína, las actividades de enzimas antioxidantes como U/mg de proteína y el MDA como nmol/mg de proteína, cuando sea compatible con el kit seleccionado.

7. Análisis de datos y control de calidad

1. Extraiga el tiempo de exploración dirigido hacia el objeto familiar (T_familiar) y el objeto novedoso (T_nuevo) durante la fase de la prueba NOR.
2. Calcule el índice de discriminación (ID) de la siguiente manera:
   .
   NOTA: Un ID superior a 0,5 indica preferencia por el objeto novedoso.
3. Excluya a un animal del análisis NOR cuando el tiempo total de exploración de objetos (T_nuevo + T_familiar) sea inferior a 10 s. Aplique este criterio antes del análisis a nivel de grupo y reporte todas las exclusiones.
4. Evalue la normalidad para cada grupo mediante la prueba de Shapiro–Wilk y la homogeneidad de la varianza mediante la prueba de Levene. Para cada grupo, evalúe el ID frente al valor de azar 0,5 utilizando una prueba t de una muestra bilateral; si no se cumple el supuesto de normalidad, utilice en su lugar la prueba de rangos con signo de Wilcoxon de una muestra frente a 0,5.
5. Establezca el valor alfa en 0,05 para todas las pruebas estadísticas, salvo que se indique lo contrario.
6. Compare el ID entre los grupos independientes NSD y SD mediante una prueba t no pareada bilateral cuando se cumplan los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza. Utilice la prueba U de Mann–Whitney en caso contrario.
7. Analice el tiempo de exploración del objeto familiar frente al novedoso mediante un análisis de varianza de medidas repetidas de dos vías, con Grupo y Tipo de Objeto como factores. Realice comparaciones post hoc por pares corregidas con el método de Sidak y reporte los intervalos de confianza del 95 % junto con todas las estimaciones de comparación entre grupos.
8. Compare cada biomarcador hipocampal entre los grupos independientes NSD y SD mediante una prueba t no pareada bilateral cuando se cumplan los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza. Utilice la prueba U de Mann–Whitney en caso contrario.
9. Al evaluar múltiples biomarcadores de la misma cohorte, controle la tasa de descubrimientos falsos en todo el panel de biomarcadores mediante el procedimiento de Benjamini–Hochberg. Reporte tanto los valores p nominales como los ajustados por FDR.
10. Realice el análisis de potencia a priori utilizando G*Power versión 3.1 para una comparación bilateral de muestras independientes, con el índice de discriminación NOR como resultado principal. Basar el efecto esperado en estudios previamente publicados que demuestran un deterioro robusto de la preferencia por el objeto novedoso tras la privación de sueño posterior al aprendizaje.
11. Realice el análisis de potencia a priori utilizando un tamaño del efecto estandarizado de Cohen’s d = 1,35, un alfa bilateral de 0,05, una potencia del 80 % y una razón de asignación 1:1. Estos parámetros arrojan un tamaño mínimo de muestra calculado de 10 animales por grupo.
    NOTA: El tamaño del efecto se estimó a partir de datos publicados previamente sobre reconocimiento de objetos⁹. Palchykova et al. informaron un efecto significativo del grupo sobre la duración de la exploración del objeto novedoso durante la fase de prueba (F(1,16) = 8,26, p < 0,007) en ratones privados de sueño inmediatamente después del entrenamiento frente a controles emparejados en el tiempo (n = 9 por grupo), lo que corresponde a un Cohen’s d ≈ 1,36. Por tanto, se adoptó un tamaño del efecto estandarizado de d = 1,35 para el análisis de potencia a priori.
12. Incremente el tamaño de muestra planeado en un 20 %, hasta 12 animales por grupo (24 animales en total), para permitir exclusiones prespecificadas por motivos conductuales o técnicos. Prespecifique como criterios de exclusión: exploración total de objetos <10 s durante la prueba NOR, exclusiones relacionadas con el bienestar, grabaciones de video no utilizables y fallos técnicos en los ensayos de tejidos o muestras.
13. No excluya animales en función de la dirección o magnitud del efecto del tratamiento observado.
14. Realice los análisis estadísticos utilizando Python versión 3.12, SciPy versión 1.17 para pruebas de hipótesis y cálculos del tamaño del efecto, y statsmodels versión 0.14 para la corrección de la tasa de descubrimientos falsos de Benjamini–Hochberg.
15. Cuando utilice este protocolo para generar un conjunto de datos formal, reporte los tamaños del efecto (por ejemplo, Cohen's d para comparaciones entre grupos) junto con los valores p para todas las pruebas estadísticas especificadas en los pasos 7.4–7.9.

Resultados

Una implementación exitosa de este protocolo debería producir un patrón coherente de resultados conductuales y moleculares sin requerir la interpretación de ninguna lectura individual de forma aislada. La secuencia experimental completa se ilustra en Figura 1, y se muestran el aparato y el diseño experimental de NOR en Figura 2. En el grupo NSD, los ratones deben mostrar una preferencia clara por el objeto novedoso, reflejada en un ID por encima del nivel de azar de 0,5. Los ratones expuestos al protocolo de GH de 5 h posterrenamiento deben mostrar una preferencia atenuada por el objeto novedoso y un ID más bajo que los controles NSD. La exploración total de los objetos debe mantenerse comparable entre los grupos; una reducción global en la exploración sugeriría factores de confusión motores, de ansiedad o procedimentales, más que un déficit selectivo en la memoria de reconocimiento. En la cohorte presente (NSD, n = 12; SD, n = 12, de los cuales un animal fue excluido según el umbral preespecificado de exploración total en el paso 7.3, quedando n = 11 para el análisis NOR; esta exclusión se aplicó de forma consistente tanto al análisis del índice de discriminación como al del tiempo total de exploración reportados a continuación), los ratones NSD mostraron un ID medio de 0,70 ± 0,05 (media ± SD), significativamente por encima del nivel de azar de 0,5 (prueba t de una muestra, t(11) = 15.21, p < 0.0001), mientras que los ratones SD mostraron un DI medio de 0.51 ± 0,05, no significativamente diferente al azar (t(10) = 0.49, p = 0,638). La DI difirió significativamente entre los grupos (prueba t no pareada, t(21) = 9.28, p < 0.0001; de Cohen d = 3,87; diferencia media = 0,19, IC 95 % [0,15, 0,23]) (Figura 3A). El tiempo total de exploración no difirió significativamente entre los grupos (NSD: 33,5 ± 8,7 s; DE: 29,9 ± 6.2 s; t(21) = 1.13, p = 0.272) (Figura 3B), lo que es consistente con un efecto selectivo sobre la memoria de reconocimiento en lugar de una reducción generalizada del comportamiento exploratorio.

Figura 3Rendimiento en el reconocimiento de objetos novedosos. (A) Índice de discriminación (ID) para NSD (n = 12) y DE (n = 11; se excluyó un animal según el umbral preespecificado de tiempo total de exploración) grupos. La línea punteada indica el nivel de probabilidad de 0,5. (B) Tiempo total de exploración del objeto durante la fase de prueba para NSD (n = 12) y DE (n = 11; la misma exclusión que en los grupos del panel A). Las barras muestran la media ± SEM; los círculos abiertos muestran animales individuales. ****p < 0,0001; ns, no significativo (prueba t no apareada de dos colas) t-prueba). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El registro de intervenciones (Tabla 1) debe mostrar que la marcha horizontal (GH) se mantuvo mediante intervenciones sensoriales suaves y progresivas, en lugar de restricción o locomoción forzada. Las grandes diferencias en el número de intervenciones por hora entre cohortes deben llevar a revisar las condiciones de las jaulas, la consistencia de los observadores y las prácticas de manipulación antes de interpretar las diferencias conductuales. En las 12 cohortes registradas en este estudio, el número de intervenciones por hora durante la ventana de 5 h de GH osciló entre 1 y 6 por hora, compuestas principalmente por golpes suaves en la jaula y alteración del aserrín, mientras que las intervenciones con cepillo suave u objetos novedosos se utilizaron con menos frecuencia; ninguna jaula requirió restricción física ni locomoción forzada, y no se observaron desviaciones en el bienestar animal.

Las medidas bioquímicas obtenidas de los mismos animales deben proporcionar un contexto molecular para el fenotipo conductual. Se espera que un modelo exitoso de SD muestre un patrón coordinado de mayor carga de citocinas proinflamatorias en el hipocampo, disminución de la actividad de enzimas antioxidantes y aumento de marcadores de peroxidación lipídica en comparación con los controles emparejados de NSD. Vincular cada muestra tisular con el registro correspondiente de NOR permite evaluar por animal la concordancia entre lo conductual y lo molecular, evitando al mismo tiempo la variación por lotes introducida por cohortes conductuales y bioquímicas separadas. En la cohorte actual (NSD, n = 12; SD, n = 12), los seis biomarcadores hipocampales difirieron significativamente entre grupos en la dirección esperada, y todos permanecieron significativos tras la corrección de FDR de Benjamini–Hochberg en el panel de seis marcadores: IL-1β (NSD 43,4 ± 7,5 frente a DE 58,6 ± 5,3 pg/mg de proteína; t(22) = −5,73, nominal p < 0,0001, ajustado por FDR p < 0.0001, d = −2,34), IL-6 (57,8 ± 8,1 frente a 71,8 ± 7,4 pg/mg; t(22) = −4,42, nominal p = 0,0002, ajustado por FDR p = 0.0002, d = −1,81), TNF-α (40.5 ± 7.8 frente a 55.1 ± 7,8 pg/mg; t(22) = −4,60, nominal p = 0,0001, ajustado por FDR p = 0.0002, d = −1,88), SOD (18,0 ± 2.0 frente a 14.0 ± 1.8 U/mg; t(22) = 5,16, nominal p < 0,0001, ajustado por FDR p < 0.0001, d = 2,11), GPx (13,2 ± 0,9 frente a 10,8 ± 1,4 U/mg; t(22) = 4,92, nominal p < 0,0001, ajustado por FDR p < 0.0001, d = 2,01) y MDA (3,5 ± 0,3 frente a 4,9 ± 0.8 nmol/mg t(22) = −5,59, nominal p < 0,0001, ajustado por FDR p < 0.0001, d = −2,28). Estos datos se muestran en Figura 4. Los puntos de datos individuales mostrados en Figura 3 y Figura 4 son las mediciones experimentales reales obtenidas en esta cohorte, y todas las medias, tamaños del efecto, valores p e intervalos de confianza informados se calcularon directamente a partir de estos mismos datos subyacentes.

Figura 4. Biomarcadores del hipocampo en ratones NSD frente a SD. Niveles en el hipocampo de IL-1β, IL-6 y TNF-α (citoquinas proinflamatorias), SOD y GPx (enzimas antioxidantes) y MDA (marcador de peroxidación lipídica) en ratones NSD (n = 12) y SD (n = 12). Las barras muestran la media ± EE; los círculos abiertos representan animales individuales. Los símbolos de significancia reflejan valores p ajustados por FDR de Benjamini-Hochberg en el panel de seis marcadores. ***p < 0,001 y ****p < 0,0001 tras el ajuste por FDR (pruebas t no pareadas de dos colas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Si los ratones NSD no muestran preferencia por el objeto novedoso, si la exploración total cae por debajo del umbral predeterminado, o si la varianza del biomarcador es inesperadamente grande, debe investigarse la habituación, la selección de objetos, la consistencia de la intervención, la identificación de las muestras y el momento del procesamiento de los tejidos antes de repetir la cohorte, como se resume en Tabla 2. Estos resultados representan datos experimentales subóptimos que requieren solución de problemas antes de su interpretación. En la cohorte actual, un animal SD (M19) fue excluido del análisis NOR según el umbral preespecificado de exploración total (8,7 s; Paso 7,3), lo que ilustra el tipo de resultado subóptimo abordado por este criterio; ningún animal NSD dejó de mostrar preferencia por el objeto novedoso, y ninguna cohorte mostró varianza inesperadamente alta del biomarcador que requiriera repetir la cohorte en este conjunto de datos.

Problema	Causa posible	Solución
Baja exploración general en NOR	Habituación insuficiente, ansiedad elevada o perturbación ambiental excesiva	Amplíe el manejo diario; confirme que la sala de pruebas esté tranquila y con poca luz; verifique la habituación al recinto antes del entrenamiento.
Ausencia de preferencia por objetos novedosos en los controles NSD	Los objetos difieren en preferencia innata o no son suficientemente distintos	Evalúe previamente los objetos en animales ingenuos; utilice objetos con texturas/formas claramente diferentes pero con tamaño y accesibilidad equivalentes.
Gran variación en los conteos de intervención GH	Umbral del observador inconsistente o condiciones de jaula variables	Capacite a los observadores utilizando los mismos criterios de vigilia; use el mismo registro de intervenciones; estandarice el lecho, el enriquecimiento de la jaula y las condiciones ambientales.
Alta variabilidad en las mediciones de biomarcadores	Retraso en la disección, identidad inconsistente de las muestras o degradación de las muestras	Mantenga la identificación desde el comportamiento hasta la muestra; estandarice el momento de la disección; congele rápidamente; mantenga las muestras en hielo durante la homogenización.
Los ratones SD muestran angustia marcada	Manejo excesivamente intenso	Utilice únicamente intervenciones sensoriales leves; deténgase y siga los procedimientos de bienestar aprobados si se observa angustia.

Tabla 2: Solución de problemas. Problemas comunes encontrados durante el procedimiento de NOR, la privación de sueño con manipulación suave y el flujo de trabajo de biomarcadores del hipocampo, junto con posibles causas y acciones correctivas recomendadas.

Discusión

Este artículo proporciona un marco rápido y reproducible para estudiar los déficits en la memoria de reconocimiento inducidos por la privación aguda del sueño y los cambios moleculares en el hipocampo. Al aplicar 5 h de manejo suave inmediatamente después de una fase de aprendizaje estandarizada de 10 min, el procedimiento se enfoca en una ventana de consolidación postaprendizaje definida y está diseñado para reducir la carga física asociada con modelos de privación prolongada o procedimientos basados en movimiento forzado^4,5. Sin embargo, este trabajo no incluye mediciones directas de hormonas del estrés para confirmar una respuesta fisiológica de estrés más baja, como se discute más adelante bajo las limitaciones del método.

Los factores técnicos más críticos son la habituación, la selección consistente de objetos, el intervalo de retención fijo de 5 h y la monitorización continua pero no aversiva durante la GH. Dado que la NOR depende de la exploración espontánea, la ansiedad residual o una habituación deficiente al recinto pueden suprimir la exploración de objetos y ocultar efectos relacionados con la memoria⁸. El criterio de exclusión preespecificado respecto al tiempo de exploración y el registro de intervenciones proporcionan controles prácticos de calidad que ayudan a distinguir un ensayo conductual fallido de un fenotipo de memoria genuino. Cuando la exploración general es baja, la preferencia por el objeto novedoso está ausente en los controles NSD, las cuentas de intervención de la GH varían considerablemente, las mediciones de biomarcadores muestran alta variabilidad o los ratones SD presentan evidente malestar, los investigadores deben revisar los procedimientos correspondientes de solución de problemas en Tabla 2 antes de repetir o interpretar el experimento.

Más que representar una simple concatenación de técnicas previamente establecidas, la contribución incremental de este protocolo radica en cuatro elementos operativos específicos destinados a abordar la reproducibilidad, más que la disponibilidad de técnicas. Primero, el registro obligatorio de intervenciones (Protocolo Paso 3 y Tabla 1) introduce un registro cuantificable y comparable para estandarizar la intensidad de la privación total de sueño (GH) entre cohortes y estudios. La técnica en sí tiene una historia ya establecida, mientras que el presente protocolo enfatiza la estandarización operativa de su implementación. Esto concuerda con la historia previa de la GH como técnica de privación total de sueño y con la falta previamente señalada de estandarización en su aplicación entre estudios⁶. Segundo, el protocolo exige un diseño dentro de la misma cohorte, en el que los puntos finales conductuales y moleculares se obtengan de animales idénticos y rastreados individualmente dentro de una única secuencia de 10 días; este diseño pretende reducir la variación asociada con la recopilación de puntos finales conductuales y bioquímicos en cohortes separadas. Tercero, el protocolo fija la ventana de entrenamiento y privación a un punto de referencia circadiano definido (ZT1, Protocolo Paso 2) y exige que las cohortes de privación sin sueño (NSD) y privación de sueño (SD) se mantengan bajo condiciones de fase luminosa equivalentes (Protocolo Paso 3), controlando así el momento circadiano dentro del flujo de trabajo. Cuarto, el protocolo especifica criterios a priori de control de calidad y análisis, incluyendo un umbral mínimo de tiempo de exploración (Protocolo Paso 7), reporte transparente de exclusiones, planificación prospectiva del poder estadístico, pruebas del índice de discriminación (DI) frente al nivel de azar 0,5, verificación de supuestos, corrección por comparaciones múltiples de biomarcadores y reporte del tamaño del efecto. En conjunto, estos elementos transforman métodos individualmente establecidos en un flujo de trabajo explícito y transferible, propuesto como un marco de referencia candidato frente al cual los laboratorios individuales pueden comparar su propia implementación, pendiente de adopción independiente y replicación, más que como un informe de un hallazgo biológico específico.

El procedimiento tiene varias limitaciones. La técnica GH es intensiva en mano de obra y requiere atención continua del experimentador, lo que limita el rendimiento. Además, GH mantiene la vigilia pero por sí sola no cuantifica la arquitectura del sueño. Las aplicaciones futuras podrían incorporar una validación piloto de EEG/EMG para documentar los estados de vigilia y verificar el grado de privación de sueño producido por el procedimiento GH antes de aplicar el protocolimiento a una cohorte experimental completa. Las aplicaciones futuras también podrían incluir mediciones de corticosterona para evaluar los efectos relacionados con el estrés de la intervención. Estas mediciones no forman parte del presente protocolo y, por lo tanto, no deben interpretarse como una validación realizada en este estudio. La prueba NOR es sensible a la memoria de reconocimiento, pero no evalúa de forma exhaustiva la navegación espacial ni la memoria de trabajo; se pueden añadir ensayos complementarios, como el laberinto en Y, el laberinto de Barnes u otras tareas de un solo ensayo, cuando se requiera un perfil cognitivo más amplio. El método modificado de múltiples plataformas representa un enfoque alternativo para inducir experimentalmente la pérdida de sueño y se ha utilizado para cuantificar la privación y recuperación del sueño⁴; en contraste, el presente procedimiento GH enfatiza una intervención sensorial leve sin locomoción forzada. Sin embargo, dado que los marcadores fisiológicos de estrés no se midieron directamente en este protocolo, no puede concluirse aquí que GH produzca una respuesta de estrés fisiológico menor.

Por lo tanto, el método debe considerarse mejor como una plataforma estandarizada de entrada más que como un modelo completo de todas las consecuencias cognitivas de la privación del sueño. Su valor radica en la conexión explícita entre una intervención controlada con GH tras el aprendizaje, una lectura conductual diseñada para minimizar el manejo físico en comparación con los paradigmas de locomoción forzada, la recolección del hipocampo en el mismo animal y controles de calidad transparentes. La NOR proporciona un enfoque bien establecido de una sola prueba para evaluar la memoria de reconocimiento^7,8, y se ha asociado previamente la privación del sueño con alteraciones en el reconocimiento de objetos⁹, cambios neuroinflamatorios en el hipocampo¹⁰ y estrés oxidativo en el hipocampo junto con déficits de memoria¹¹. En consecuencia, este marco puede facilitar comparaciones entre cohortes y proporcionar una base práctica para estudios mecanicistas y para la evaluación de intervenciones destinadas a mitigar el deterioro cognitivo asociado a la privación del sueño; trabajos previos también han investigado intervenciones dirigidas al deterioro cognitivo y la neuroinflamación asociados a la privación del sueño¹². En consonancia con este alcance, la presente contribución se centra en establecer y estandarizar un flujo de trabajo reproducible, a la vez que proporciona datos representativos que demuestran el desempeño del protocolo; un conjunto de datos más amplio y una interpretación biológica más extensa podrían reportarse por separado en trabajos futuros.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Etanol al 70%	Cualquier proveedor	N/D	Limpieza del área de NOR y objetos
Ratones macho adultos C57BL/6J (8–12 semanas)	Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.	N/D	Animales experimentales
Kit de ensayo de proteína BCA	Thermo Fisher Scientific (Pierce)	23225	Determinación y normalización de proteína total
Software de análisis de comportamiento	Noldus Information Technology B.V.	EthoVision XT versión 17.5	Puntuación y análisis de la exploración en NOR
Centrífuga capaz de 14,000 × g a 4 °C	Eppendorf	Centrifuge 5424 R; Cat. 5404000610	Clarificación de homogeneizados de hipocampo
Tubos de papel limpios	Cualquier proveedor	N/D	Intervención de manipulación suave
Equipo de protección personal criogénico	Cualquier proveedor	N/D	Manejo seguro de nitrógeno líquido
Kit de ensayo de glutatión peroxidasa	Abcam	ab102530	Cuantificación de GPx
Homogeneizador de tejido de hipocampo	IKA-Werke GmbH & Co. KG	T 10 basic ULTRA-TURRAX; Cat. 0003737000	Homogeneización del tejido de hipocampo en tampón de lisis
Nitrógeno líquido	Cualquier proveedor	N/D	Congelación rápida de hipocampos diseccionados
Kit de ensayo de MDA	Sigma-Aldrich	MAK085	Cuantificación de MDA
Lector de microplacas	Agilent Technologies / BioTek	BioTek Epoch 2 Microplate Spectrophotometer	Medición de absorbancia a longitudes de onda especificadas por el kit
Microespátulas	Cualquier proveedor	N/D	Disección de hipocampo; se usan frías
Kit ELISA de IL-1β de ratón	R&D Systems	MLB00C	Cuantificación de IL-1β
Kit ELISA de IL-6 de ratón	R&D Systems	M6000B	Cuantificación de IL-6
Kit ELISA de TNF-α de ratón	R&D Systems	MTA00B	Cuantificación de TNF-α
Juegos de objetos A/A′ y B	Cualquier proveedor	N/D	Fases de familiarización y prueba de NOR
Área opaca de NOR (40 cm × 40 cm × 40 cm)	Cualquier proveedor	N/D	Pruebas conductuales
Sistema de grabación de video desde arriba	Basler AG	acA1300-60gm	Grabación de video de las sesiones de familiarización y prueba de NOR
Cóctel de inhibidores de proteasa/fosfatasa	Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)	78440	Se añade al tampón de lisis a una concentración de trabajo de 1× (10 µL/mL desde un stock de 100×)
Tampón de lisis RIPA	Thermo Fisher Scientific	89900	Homogeneización del tejido de hipocampo
Tubos de muestra adecuados para almacenamiento criogénico	Thermo Fisher Scientific (Nunc)	Nunc CryoTube, 1.8 mL; Cat. 375418	Mantenimiento de identificadores específicos por animal y almacenamiento del tejido de hipocampo diseccionado
Cepillo suave	Cualquier proveedor	N/D	Intervención de manipulación suave
Kit de ensayo de SOD	Sigma-Aldrich	19160	Cuantificación de SOD
Software estadístico y de análisis de potencia	G*Power; Python Software Foundation	G*Power versión 3.1; Python versión 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)	Análisis de potencia a priori y análisis estadísticos descritos en la Sección 7 del Protocolo
Alimento estándar para roedores	Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.	Dieta de mantenimiento irradiada para ratas/ ratones; XTI01WC-010	Alimentación ad libitum de animales
Congelador a −80 °C	Haier Biomedical	DW-86L626	Almacenamiento a largo plazo del tejido de hipocampo congelado rápidamente