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Artículo de método

Un protocolo optimizado para la generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas

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DOI:

10.3791/73561

⸱

3 de septiembre de 2026

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un método para generar organoides vasculares utilizando células madre pluripotentes inducidas humanas.

Resumen

Los organoides vasculares derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) han surgido como modelos tridimensionales poderosos para estudiar el desarrollo vascular, los mecanismos de las enfermedades y las respuestas a fármacos. Los protocolos actuales de organoides vasculares permiten la generación de redes endoteliales y pericitarias autororganizadas; sin embargo, la variabilidad entre lotes, la formación inconsistente de organoides y la cobertura inadecuada de pericitos pueden comprometer la reproducibilidad y la escalabilidad. Este estudio presenta un protocolo optimizado para generar organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) con mayor reproducibilidad y consistencia estructural. Las modificaciones clave incluyen condiciones refinadas para la formación de cuerpos embrionoides, concentraciones y momentos optimizados de factores de crecimiento durante la inducción mesodérmica y la especificación vascular, y condiciones de cultivo tridimensional mejoradas que promueven el reclutamiento robusto de pericitos y las interacciones endoteliales–pericitarias. Los organoides optimizados exhiben redes endoteliales positivas para CD31 altamente ramificadas y consistentemente envueltas por pericitos positivos para PDGFR-β, con una variabilidad significativamente reducida entre lotes en comparación con el protocolo original. Se proporcionan procedimientos detallados paso a paso para la generación de organoides, la caracterización mediante inmunofluorescencia en preparaciones enteras y la evaluación del control de calidad. Este método optimizado permite la producción escalable de organoides vasculares de alta calidad, adecuados para estudiar las interacciones entre células vasculares, modelar enfermedades y cribar compuestos, reduciendo así la barrera técnica para los laboratorios que desean adoptar este sistema de modelos.

Introducción

Los organoides tridimensionales (3D) han surgido como herramientas poderosas para modelar el desarrollo y las enfermedades humanas in vitro, ofreciendo una biomimética estructural y una relevancia fisiopatológica superiores en comparación con los modelos convencionales de cultivo celular bidimensional1,2. En los últimos años, se han establecido con éxito organoides derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) para múltiples tipos de tejidos, incluyendo el intestino3, el cerebro4,5, el riñón6, el hígado7,8 y la retina9. Sin embargo, un desafío importante en los estudios basados en organoides es la vascularización insuficiente durante el cultivo a largo plazo, lo que puede provocar hipoxia y necrosis, dificultando así la expansión y diferenciación del organoide10,11. Para abordar esta limitación, se han introducido diversas estrategias de co-cultivo, incluyendo la incorporación de células endoteliales o células madre mesenquimales para promover la formación de redes vasculares12,13. Sin embargo, los cultivos bidimensionales convencionales y los modelos animales no recapitulan completamente la biología vascular humana, mientras que los enfoques de co-cultivo introducen una complejidad experimental adicional14. Por lo tanto, los organoides vasculares capaces de vascularización autónoma ofrecen una alternativa prometedora y relevante para el ser humano15.

La formación de redes vasculares implica tanto vasculogénesis como angiogénesis, procesos coordinados mediante interacciones entre células endoteliales y células murales, como pericitos y células musculares lisas vasculares, y regulados estrictamente por múltiples moléculas señalizadoras, incluyendo VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), TGF-β (factor de crecimiento transformante-β), PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) y angiopoietinas16. En 2019, Wimmer y colaboradores establecieron un método para generar organoides vasculares tridimensionales autoensamblables directamente a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC)17,18. Este sistema genera simultáneamente células endoteliales y pericitos, dando lugar a redes microvasculares con formación de lumen y cobertura de membrana basal. A partir de esta plataforma, los organoides vasculares se han utilizado para modelar la vasculopatía diabética bajo estimulación con glucosa alta y citocinas proinflamatorias (TNF-α e IL-6); estos organoides reproducen el engrosamiento de la membrana basal, una característica distintiva de la patología microvascular diabética17. Además, este modelo se ha empleado para estudiar enfermedades vasculares hereditarias y como plataforma para cribado de toxicidad vascular19. Más recientemente, varios estudios orientados a métodos han buscado optimizar la generación de organoides vasculares. Por ejemplo, avances en la secuenciación de ARN a nivel de célula individual han identificado factores reguladores clave, como MECOM y LEF1, proporcionando así un marco molecular para caracterizar y optimizar la formación de organoides vasculares humanos. Además, Xu et al. introdujeron micropozos para facilitar la formación homogénea de cuerpos embrionoides e incorporaron el cóctel CEPT para mejorar la viabilidad celular, reduciendo así eficazmente la variabilidad entre lotes20.

Para mejorar la homogeneidad, reproducibilidad y capacidad de procesamiento en la generación de organoides vasculares, el protocolo original descrito por Wimmer et al.17,18 fue sistemáticamente optimizado para abordar varias limitaciones clave. En primer lugar, el protocolo original emplea la agregación natural en placas con baja adhesión para la formación de cuerpos embrionarios, lo que puede provocar una variabilidad considerable entre lotes en cuanto al tamaño de los agregados y, en consecuencia, una eficiencia de diferenciación heterogénea. En el protocolo optimizado, se combina el alcohol polivinílico (PVA) con agitación orbital durante la formación de agregados para promover una agregación celular uniforme y mejorar la consistencia en el tamaño de los cuerpos embrionarios. En segundo lugar, el protocolo original utiliza el reemplazo completo del medio durante la etapa de formación de la red vascular, lo cual puede causar fluctuaciones considerables en las concentraciones de factores de crecimiento y comprometer la brotación vascular sostenida y el reclutamiento de pericitos. En contraste, el protocolo optimizado conserva un tercio del medio condicionado durante cada cambio de medio para mantener los factores proangiogénicos endógenos y estabilizar el entorno de cultivo. En tercer lugar, el protocolo original requiere múltiples transferencias de placas durante el aislamiento y maduración de los organoides, lo que incrementa los requisitos de manipulación y el riesgo de pérdida de organoides. El protocolo optimizado evita estos pasos transfiriendo individualmente los organoides aislados a pocillos de placas de 96 pocillos con baja adhesión, simplificando así el procedimiento y aumentando la capacidad de procesamiento. En conjunto, este protocolo optimizado proporciona procedimientos detallados paso a paso y puntos críticos de control de calidad para reducir la barrera técnica en la adopción de este sistema modelo y facilitar la aplicación más amplia de los organoides vasculares en estudios sobre el desarrollo vascular, los mecanismos de enfermedades y el cribado de fármacos de alto rendimiento.

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Protocolo

El uso de CEPH en este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Biomédica de la Universidad de Anhui (BECAHU_2026-010).

1. Mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas humanas

NOTA: Mantenga las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) en condiciones libres de alimentadores. Realice todos los procedimientos en una cabina de seguridad biológica de Clase II utilizando técnica aséptica.

  1. Preparación de placas de cultivo recubiertas con matriz de membrana basal
    1. Saque un vial de matriz de membrana basal de −20 °C y deshiélelo a 4 °C durante la noche, aproximadamente 12–16 h. Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación.
    2. Mezcle completamente la matriz de membrana basal descongelada en condiciones estériles y divídala en alícuotas de un solo uso (por ejemplo, 1 mL por tubo). Almacene las alícuotas a −20 °C durante hasta 2 años.
      NOTA: Mantenga la matriz de membrana basal, pipetas, puntas y tubos fríos durante el manejo para evitar la solidificación prematura. Evite introducir burbujas de aire.
    3. Deshiele la alícuota necesaria de matriz de membrana basal sobre hielo. Diluya la matriz de membrana basal 1:200 en DMEM previamente enfriado (5 µL de matriz de membrana basal por 1 mL de DMEM; concentración final, aproximadamente 5 µg/mL).
    4. Mezcle suavemente la solución mediante pipeteo hasta que no queden partículas visibles.
    5. Añada 0,5 mL de matriz de membrana basal diluida a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Incline y gire suavemente la placa para recubrir toda la superficie inferior.
    6. Incube la placa recubierta a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ durante al menos 2 h o a 4 °C durante la noche.
      NOTA: Almacene las placas recubiertas y selladas a 4 °C durante 1–2 semanas. Equilibre la placa a temperatura ambiente y aspire la solución de recubrimiento inmediatamente antes de su uso.
  2. Deshielo de las hiPSCs
    1. Saque un vial criogénico de hiPSCs congeladas del nitrógeno líquido y colóquelo inmediatamente en un baño de agua a 37 °C. Agite suavemente el vial y retírelo en menos de 1 min, cuando solo queden unos pocos cristales de hielo pequeños.
      NOTA: Evite la exposición prolongada a dimetilsulfóxido (DMSO) a 37 °C y un deshielo incompleto, ya que ambos pueden reducir la viabilidad celular.
    2. Desinfecte el exterior del vial criogénico con etanol al 70% y ábralo dentro de la cabina de seguridad biológica.
    3. Transfiera lentamente la suspensión celular gota a gota a un tubo cónico de 15 mL que contenga 3 mL de medio de mantenimiento químicamente definido para hPSC previamente calentado, o un medio de mantenimiento químicamente definido equivalente. Mezcle suavemente durante la transferencia para diluir gradualmente el DMSO y minimizar el estrés osmótico.
    4. Centrifugue las células a 300 × g durante 3 min a temperatura ambiente (22–24 °C) utilizando un rotor de cubeta oscilante.
    5. Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular. Resuspenda suavemente el sedimento en 1 mL de medio de mantenimiento químicamente definido para hPSC previamente calentado.
      NOTA: Utilice una pipeta P1000 y pipetee suavemente 2–3 veces para minimizar el cizallamiento mecánico y la formación de burbujas.
  3. Siembra y cultivo de hiPSCs
    1. Saque la placa de 12 pocillos previamente recubierta de la incubadora y aspire la solución de recubrimiento. No lave los pocillos.
    2. Siembre aproximadamente 1 × 105–2 × 105 células viables por pocillo para la recuperación rutinaria tras el deshielo. Ajuste la densidad según la línea de hiPSC y los requisitos experimentales.
    3. Dispense la suspensión celular lentamente a lo largo de la pared de cada pocillo sin tocar la superficie recubierta con la punta de la pipeta.
    4. Añada Y-27632 hasta una concentración final de 5 µM para promover la supervivencia y la adhesión celular tras el deshielo.
      NOTA: Utilice Y-27632 únicamente en el medio inicial de siembra. Reemplácelo al día siguiente por medio de mantenimiento químicamente definido para hPSC sin Y-27632.
    5. Incube las células a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad saturada.
    6. Examine la adhesión y la morfología celular después de aproximadamente 16–24 h. Aspire el medio y reemplácelo por medio fresco de mantenimiento químicamente definido para hPSC, previamente calentado y sin Y-27632.
    7. Renueve el medio diariamente o cada dos días hasta que las células alcancen una confluencia aproximada del 70%–80% para su posterior pase o diferenciación.
      NOTA: Examine los cultivos diariamente. Utilice colonias con bordes compactos y bien definidos, una alta relación núcleo-citoplasma y mínima diferenciación espontánea.

2. Generación y diferenciación de agregados de hiPSC

NOTA: Mantenga las hiPSC en condiciones libres de alimentadores en medio de mantenimiento de hPSC químicamente definido sobre placas recubiertas con matriz de membrana basal. Pase las células cada 4–5 días utilizando EDTA al 0,02 %. Utilice cultivos con densidad de siembra y tamaño de colonias adecuados, y diferenciación espontánea mínima, para maximizar la eficiencia de diferenciación vascular.

  1. Preparación de una suspensión de células individuales
    1. Aspire el medio de mantenimiento químicamente definido para hPSC y lave las hiPSC con 0,5 mL de DMEM por pocillo de una placa de 6 pocillos.
    2. Aspire el DMEM y añada 0,5 mL de EDTA al 0,02% por pocillo. Incube a temperatura ambiente durante 2–4 min y supervise las células hasta que comiencen a redondearse.
    3. Desprenda las células utilizando una pipeta P1000. Pipete suavemente 2–3 veces para disociar los agregados en una suspensión de células individuales.
    4. Resuspenda las células en 5 mL de medio de mantenimiento químicamente definido para hPSC y transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mL.
    5. Mezcle 10 µL de la suspensión celular con 10 µL de solución de azul de tripano al 0,1%. Cargue 10 µL de la mezcla en una cámara de recuento y determine el número de células viables.
    6. Calcule el volumen de suspensión celular necesario para obtener 5 × 105 células viables por pocillo.
    7. Centrifugue las células a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente (22–23 °C). Aspire el sobrenadante.
    8. Resuspenda las células en medio de mantenimiento químicamente definido para hPSC fresco que contenga 50 µM de Y-27632, en un volumen de 3 mL por pocillo.
  2. Formación de agregados
    1. Añada 3 mL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 6 pocillos de baja adhesión. Añada PVA hasta una concentración final de 0,25%.
    2. Coloque la placa en un agitador orbital a 50 rpm e incube a 37 °C durante 1 día.
    3. Confirme la formación de agregados con bordes lisos y un diámetro de aproximadamente 50–100 µm o mayor antes de continuar.
    4. NOTA: Optimice el período de agregación para cada línea individual de hiPSC. Extienda la incubación a 2–3 días cuando sea necesario para obtener agregados del tamaño deseado.
  3. Inducción de mesodermo
    1. En el día 0, transfiera los agregados a un tubo cónico de 15 mL utilizando una pipeta desechable estéril de 10 mL. Guarde la placa original de baja adhesión para el replanteo.
    2. Permita que los agregados sedimenten por gravedad durante aproximadamente 15–20 min.
    3. NOTA: Manipule los agregados con cuidado y utilice la sedimentación por gravedad en lugar de la centrifugación para minimizar el daño mecánico.
    4. Aspire cuidadosamente el sobrenadante después de que los agregados hayan sedimentado.
    5. Resuspenda los agregados en 3 mL por pocillo de medio N2B27 suplementado con 12 µM de CHIR99021 y 30 ng/mL de BMP-4.
    6. Transfiera los agregados de vuelta a la placa de baja adhesión e incube a 37 °C.
    7. Pipetee los agregados suavemente una vez al día con una pipeta P1000 para minimizar la fusión excesiva de agregados. Continúe la inducción de mesodermo durante 3 días.
  4. Inducción de la línea vascular
    1. En el día 3, transfiera los agregados a un tubo cónico de 15 mL y permita que sedimenten por gravedad. Guarde la placa de 6 pocillos original.
    2. Aspire cuidadosamente el sobrenadante después de que los agregados hayan sedimentado.
    3. Resuspenda los agregados en 3 mL por pocillo de medio N2B27 suplementado con 100 ng/mL de VEGF-A y 2 µM de forskolina.
    4. Transfiera los agregados de vuelta a la placa de 6 pocillos de baja adhesión e incube durante 2 días adicionales.

3. Generación de redes vasculares y organoides

  1. Preparación de la matriz de colágeno I–membrana basal
    1. Recoger los agregados generados en una placa de 6 pocillos para su inclusión en una placa de 12 pocillos. Utilizar aproximadamente 40–60 agregados por pocillo.
    2. Preparar una cantidad suficiente de mezcla de matriz de colágeno I–membrana basal para añadir dos capas de 0,5 mL a cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
    3. Preparar 12 mL de matriz para una placa de 12 pocillos. Mantener todos los componentes en hielo, preparar la mezcla inmediatamente antes de su uso y evitar introducir burbujas de aire.
    4. Añadir 0,5 mL de matriz a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. Agitar suavemente la placa para distribuir la matriz de forma uniforme.
    5. Incubar la placa a 37 °C durante 2 h para permitir que la primera capa de matriz solidifique.
  2. Inclusión de los agregados
    1. Transferir los agregados a un tubo cónico de 15 mL utilizando una pipeta desechable estéril de 10 mL y dejar que sedimenten por gravedad.
    2. Aspirar el sobrenadante y lavar los agregados dos veces con 1 mL de medio N2B27. Eliminar el mayor volumen posible de medio residual tras el último lavado.
    3. Preparar una mezcla fresca de matriz de colágeno I–membrana basal y mantenerla en hielo.
    4. Re-suspender suavemente los agregados lavados en la matriz recién preparada.
    5. Retirar la placa de 12 pocillos que contiene la primera capa solidificada del incubador.
    6. Añadir 0,5 mL de la matriz que contiene los agregados a cada pocillo.
    7. Agitar suavemente la placa durante no más de 1 minuto para distribuir los agregados de forma uniforme.
    8. Incubar inmediatamente la placa a 37 °C durante 2 h para permitir que la segunda capa solidifique.
  3. Inducción de la brotación vascular
    1. Calentar previamente el medio N2B27 suplementado con 15% de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A y 100 ng/mL de FGF-2 a 37 °C.
    2. Añadir el medio suplementado precalentado a cada pocillo para inducir la diferenciación vascular.
    3. Observar los cultivos durante los siguientes 1–3 días para detectar brotación vascular.
    4. NOTA: Calentar previamente el medio a 37 °C antes de añadirlo a los cultivos para minimizar la desestabilización de la matriz en gel.
  4. Cambio de medio y mantenimiento del cultivo
    1. Realizar el primer cambio de medio 3 días después de la inclusión.
    2. Reemplazar el medio cada dos días a partir de entonces, utilizando medio N2B27 fresco que contenga 15% de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A y 100 ng/mL de FGF-2.
    3. Mantener un tercio del medio condicionado durante cada cambio de medio y reemplazar los dos tercios restantes con medio suplementado fresco.
  5. Proceder con el aislamiento de organoides vasculares en el día 10.

4. Establecimiento de organoides vasculares y preparación para la tinción

  1. Aislamiento de redes vasculares individuales
    1. Introduzca el extremo redondeado de una espátula estéril a lo largo del borde del pocillo y desprenda suavemente la matriz de gel del fondo.
    2. Continúe moviendo la espátula desde el borde del pocillo hacia el centro hasta que toda la matriz de gel flote libremente.
    3. Utilice dos agujas estériles para excisar redes vasculares individuales del gel. Retire la mayor cantidad posible de matriz excedente sin dañar la red vascular.
  2. Cultivo de organoides aislados
    1. Transfiera cada organoide aislado directamente a un pocillo individual de una placa de 96 pocillos con superficie no adherente, utilizando una pipeta desechable estéril.
    2. Añada 100 µL de medio N2B27 suplementado con 15 % de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A y 100 ng/mL de FGF-2 a cada pocillo.
    3. Incube los organoides durante 5 días adicionales y reemplace el medio suplementado diariamente.
    4. Confirme que los organoides presenten una morfología redondeada y completamente encapsulada al día 5 de maduración.
  3. Fijación de organoides vasculares
    1. Transfiera los organoides morfológicamente maduros a tubos microcéntrifugos de 2 mL. Procese no más de aproximadamente 60 organoides por tubo.
    2. Aspire cuidadosamente el medio y añada paraformaldehído (PFA) al 4 % en PBS.
    3. Fije los organoides a temperatura ambiente durante 1 h.
      ADVERTENCIA: El PFA es tóxico y un posible carcinógeno. Manipule el PFA en una campana extractora de gases químicos utilizando equipo de protección personal adecuado.
    4. Aspire el PFA y sustitúyalo por PBS.
      PUNTO DE PAUSA: Almacene los organoides vasculares fijados en PBS a 4 °C durante hasta 1 mes.

5. Tinción e imagen confocal de organoides vasculares

  1. Bloqueo y permeabilización
    1. Añada 2 mL de tampón de bloqueo a cada tubo que contenga organoides vasculares fijados.
    2. Coloque los tubos verticalmente sobre un agitador orbital e incube con agitación a temperatura ambiente durante 2 h para bloquear y permeabilizar los organoides.
  2. Incubación con anticuerpo primario
    1. Aspire el tampón de bloqueo y añada 50–100 µL de anticuerpo primario diluido 1:100 en tampón de bloqueo.
    2. Coloque los tubos en posición vertical sobre un agitador e incube con agitación a 4 °C durante la noche.
  3. Lavado e incubación con anticuerpo secundario
    1. Lave las muestras tres veces con PBST durante 10–15 min por cada lavado. Agite los tubos colocados verticalmente durante cada lavado.
    2. Añada anticuerpo secundario fluorescente diluido 1:300 en tampón de bloqueo.
    3. Incube las muestras a temperatura ambiente durante 2 h.
  4. Contraste nuclear y lavado final
    1. Lave las muestras dos veces con PBST durante 10–15 min por cada lavado.
    2. Añada solución de Hoechst diluida 1:5.000 en PBS e incube a temperatura ambiente durante 10–15 min.
    3. Lave las muestras con PBS durante 10–15 min.
  5. Imagen confocal
    1. Transfiera los organoides teñidos a placas para imagen confocal.
    2. Adquiera imágenes confocales utilizando parámetros de imagen consistentes entre los grupos experimentales.
  6. Análisis cuantitativo de imágenes de organoides vasculares
    NOTA: Realice el análisis cuantitativo de imágenes utilizando Fiji/ImageJ y AngioTool. Mantenga configuraciones idénticas de adquisición microscópica en todos los grupos experimentales.
    1. Medición del diámetro del agregado
      1. Adquiera imágenes de campo claro de agregados de hiPSC del Día 0 utilizando un microscopio invertido con una escala calibrada. Capture imágenes de agregados bien separados e incluya una barra de escala.
      2. Importe cada imagen a Fiji/ImageJ. Trace una línea a lo largo de la barra de escala utilizando la herramienta Línea Recta y seleccione Analyze > Set Scale.
      3. Introduzca la distancia y unidad conocidas (por ejemplo, 100 µm) y seleccione Global para aplicar la calibración a todas las imágenes de la sesión.
      4. Trace una línea a través del diámetro más ancho de cada agregado utilizando la herramienta Línea Recta. Seleccione Analyze > Measure o pulse Ctrl+M y registre el diámetro en µm.
      5. Mida al menos 30 agregados por lote.
      6. Para agregados no esféricos, delinee cada agregado utilizando la herramienta de Selección Ovalada o Poligonal. Seleccione Analyze > Set Measurements > Feret's diameter y registre la medición.
      7. Exporte las mediciones desde la tabla de Resultados y compile los datos en una hoja de cálculo.
      8. Calcule la media, la desviación estándar (SD) y el coeficiente de variación (CV) como CV = SD/media × 100% para cada lote.
    2. Medición del diámetro del organoide
      1. Adquiera imágenes de campo claro de organoides vasculares maduros del Día 15 utilizando un microscopio invertido con una escala calibrada. Incluya una barra de escala en cada imagen.
      2. Importe cada imagen a Fiji/ImageJ y calibre la escala como se describió en el paso
      3. Trace una línea a través del diámetro más ancho de cada organoide utilizando la herramienta Línea Recta. Seleccione Analyze > Measure o pulse Ctrl+M y registre el diámetro en µm.
      4. Mida al menos 30 organoides por lote.
      5. Para organoides de forma irregular, mida los diámetros más largo y más corto y calcule su promedio, o determine el diámetro de Feret como se describió en el paso 5.6.1.6.
      6. Exporte las mediciones y calcule la media, SD y CV para cada lote.
    3. Cuantificación del área vascular positiva para CD31
      1. Adquiera imágenes z-stack confocales de organoides completos del Día 15 teñidos para CD31. Utilice potencia del láser, ganancia, offset y configuraciones de diafragma idénticas para todas las muestras.
      2. Genere proyecciones de intensidad máxima (MIPs) a partir de los z-stacks utilizando el software del microscopio o Fiji/ImageJ.
      3. Aplique un umbral de intensidad para segmentar la red vascular positiva para CD31, excluyendo la señal de fondo.
      4. Seleccione Process > Noise > Remove Outliers y utilice un radio de 2–5 píxeles para eliminar artefactos pequeños. Seleccione Process > Binary > Fill Holes para rellenar pequeños huecos dentro de la red vascular.
      5. Seleccione Analyze > Set Measurements y active Area y Area fraction. Seleccione Analyze > Measure para determinar el área vascular.
      6. Calcule el área vascular positiva para CD31 como porcentaje del área total del organoide.
      7. Analice al menos tres organoides por lote provenientes de tres lotes independientes. Exporte las mediciones para análisis estadístico.
    4. Cuantificación de la cobertura de pericitos positivos para PDGFR-β
      1. Adquiera imágenes z-stack confocales de organoides completos del Día 15 teñidos para CD31 y PDGFR-β. Genere MIPs a partir de los z-stacks.
      2. Importe las MIPs de CD31 y PDGFR-β a Fiji/ImageJ y verifique el alineamiento de las imágenes.
      3. Umbralice el canal de CD31 para generar una máscara binaria que defina la red vascular.
      4. Umbralice el canal de PDGFR-β utilizando el mismo enfoque de segmentación para generar una máscara binaria de la señal de pericitos.
      5. Seleccione Process > Image Calculator y aplique la operación AND a las máscaras de CD31 y PDGFR-β para identificar píxeles superpuestos.
      6. Mida el área de la señal superpuesta.
      7. Calcule la cobertura de pericitos como (área positiva para PDGFR-β dentro de los vasos positivos para CD31/área vascular total positiva para CD31) × 100%.
      8. Analice al menos tres organoides por lote provenientes de tres lotes independientes. Exporte las mediciones para análisis estadístico.
    5. Análisis del índice de ramificación utilizando AngioTool
      1. Adquiera imágenes z-stack confocales de organoides completos del Día 15 teñidos para CD31. Genere MIPs a partir de los z-stacks.
      2. Inicie AngioTool y cargue la imagen MIP.
      3. Establezca el diámetro de los vasos según el diámetro típico observado en las imágenes.
      4. Ajuste el umbral de intensidad para segmentar la red vascular excluyendo la señal de fondo. Establezca el tamaño mínimo del vaso para excluir artefactos pequeños.
      5. Realice el análisis y registre el área vascular, la densidad vascular, la longitud total de los vasos, el número de uniones y el índice de ramificación.
      6. Verifique la imagen de salida confirmando que la vasculatura esté delineada en amarillo, el esqueleto vascular se muestre en rojo y los puntos de ramificación estén marcados con puntos azules.
      7. Exporte los resultados cuantitativos de AngioTool.
      8. Analice al menos tres campos de visión por lote provenientes de tres lotes independientes y compile los datos para análisis estadístico.

6. Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de organoides vasculares

NOTA: Realice todos los aislamientos de ARN y procedimientos posteriores en condiciones libres de RNasas.

  1. Extracción de ARN
    1. Recoger 5–10 organoides vasculares maduros del día 15 en un tubo microcentrífugo libre de RNasas de 1,5 mL. Eliminar completamente el medio residual.
      NOTA: Agrupar múltiples organoides cuando sea necesario para obtener suficiente ARN.
    2. Añadir 350 µL de tampón de lisis suplementado con 1 % de β-mercaptoetanol.
    3. Pipetear las muestras de 10 a 15 veces hasta que los organoides estén completamente lisados.
    4. Transferir el lisado a una columna giratoria de eliminación de ADN genómico colocada en un tubo de recolección. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s a temperatura ambiente.
    5. Desechar la columna y conservar el flujo pasante.
    6. Añadir un volumen igual de etanol al 70 %, aproximadamente 350 µL, al flujo pasante y mezclar completamente mediante pipeteo.
    7. Transferir hasta 700 µL de la mezcla a una columna giratoria de ARN colocada en un tubo de recolección. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s y desechar el flujo pasante.
    8. Añadir 350 µL del tampón de lavado 1 a la columna. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s y desechar el flujo pasante.
    9. Preparar la mezcla de DNasa I combinando 10 µL de DNasa I con 70 µL de tampón de digestión de DNasa por muestra.
    10. Añadir 80 µL de la mezcla de DNasa I directamente a la membrana de la columna e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    11. Añadir 350 µL del tampón de lavado 1 a la columna. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s y desechar el flujo pasante.
    12. Añadir 500 µL del tampón de lavado 2 a la columna. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s y desechar el flujo pasante.
    13. Repetir el lavado con 500 µL del tampón de lavado 2.
    14. Centrifugar la columna vacía a 11.000 × g durante 2 min para secar la membrana.
    15. Transferir la columna a un tubo microcentrífugo nuevo de 1,5 mL libre de RNasas. Añadir 30–50 µL de agua libre de RNasas directamente sobre la membrana e incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
    16. Centrifugar a 11.000 × g durante 1 min para eluir el ARN. Almacenar el ARN a −80 °C hasta su uso.
      NOTA: Evaluar la concentración y pureza del ARN mediante espectrofotometría. Utilizar una relación A260/A280 de 1,8–2,1 como rango aceptable.
  2. Síntesis de ADNc
    1. Preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa en hielo.
    2. Combinar 600 ng de ARN total con 4 µL de mezcla maestra de RT que contiene transcriptasa inversa, tampón, dNTPs y cebadores aleatorios. Añadir agua libre de RNasas hasta un volumen final de 20 µL.
    3. Incubar la reacción a 37 °C durante 15 min, seguido de 85 °C durante 5 s.
    4. Almacenar el ADNc resultante a −20 °C hasta su uso.
  3. PCR cuantitativa en tiempo real
    1. Preparar 9 µL de mezcla maestra de qPCR por reacción combinando 5 µL de mezcla maestra 2× de SYBR Green, 3 µL de agua libre de RNasas y 1 µL de cebadores directo e inverso premezclados a 10 µM cada uno.
    2. Distribuir 9 µL de mezcla maestra en cada pocillo de una placa de qPCR de 96 pocillos.
    3. Añadir 1 µL de ADNc a cada pocillo para obtener un volumen final de reacción de 10 µL.
    4. Sellar la placa con una película adhesiva óptica y centrifugar a 1.000 × g durante 1 min.
    5. Realizar la desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s.
    6. Realizar 40 ciclos de amplificación de 95 °C durante 5 s seguidos de 60 °C durante 30 s.
    7. Realizar un análisis de curva de fusión para confirmar la especificidad del amplicón.
      NOTA: Realizar cada muestra en duplicado o triplicado.
    8. Calcular la expresión relativa del gen diana utilizando el método 2−ΔΔCt. Normalizar los valores de Ct al gen de referencia (por ejemplo, GAPDH) y calibrar la expresión frente a muestras de hiPSC no diferenciadas.

7. Análisis estadístico

  1. Presentar los datos cuantitativos como la media ± desviación estándar (DE) de al menos tres réplicas biológicas independientes (n ≥ 3) por condición.
  2. Trate cada lote independiente como una réplica biológica para las mediciones del diámetro de agregados y organoides, y promedie las 30 estructuras individuales medidas dentro de cada lote para obtener una media a nivel de lote.
  3. Mida el área vascular media, la cobertura de pericitos y el índice de ramificación en múltiples organoides o campos dentro de cada lote para obtener un valor único a nivel de lote, y utilice estos valores a nivel de lote para las comparaciones estadísticas.
  4. Comparar el protocolo optimizado con el protocolo original de Wimmer utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas t-prueba.
  5. Definir la significación estadística como p < 0.05. Indique los niveles de significancia como p < 0.05, p < 0.01, y p < 0,001, según corresponda.
  6. Realice todos los análisis estadísticos utilizando el software de análisis estadístico versión 10.

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Resultados

El protocolo optimizado descrito aquí permite la generación de organoides vasculares maduros a partir de células iPS humanas en aproximadamente 15 días, mediante una estrategia de diferenciación escalonada (Figura 1A). En resumen, los agregados de células iPS humanas se generaron en placas de baja adhesión suplementadas con PVA al 0,25% en un agitador orbital (Día −1). La inducción del mesodermo se inició el Día 0 utilizando CHIR99021 (12 µM) y BMP-4 (30 ng/mL) durante 3 días, seguida de la ...

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Discusión

El protocolo optimizado descrito aquí introduce varias mejoras clave al sistema de diferenciación de organoides vasculares originalmente establecido por Wimmer et al.18, con el objetivo de mejorar la homogeneidad, la reproducibilidad y la integridad estructural de la generación de organoides vasculares. En comparación con el protocolo original, el método optimizado ofrece mejoras significativas en los siguientes aspectos. En primer lugar, la optimización de las condiciones de formación de agregado...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) a través del Fondo para Científicos Jóvenes (C) (No. 32200655) y el Programa General (No. 32270847). Los autores también agradecen al Plataforma Pública de Servicios de la Universidad de Anhui por su apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro de botella de 0,22 μmNalgeneFPE204030Para filtración estéril de medios y tampones
Tubo cónico de 15 mLSparkJadeGD0001Estéril
Tubo microcentrífugo de 2 mLEppendorf22363204Estéril
2-Mercaptoetanol (1000×)Gibco21985023Usar en cabina de gases
Alexa Fluor 488 Fragmento F2 AffiniPure de Asno Anti-IgG de Conejo (H+L)LableadY1104Anticuerpo secundario; diluir 1:300
Alexa Fluor 594 Fragmento F(ab′)2 AffiniPure de Asno Anti-IgG de Cabra (H+L)LableadY1007Anticuerpo secundario; diluir 1:300
Anticuerpo anti-CD31Cell Signaling3528sAnticuerpo primario; diluir 1:100 en tampón de bloqueo
Anticuerpo anti PDGFR βZenbio347269Anticuerpo primario; diluir 1:100 en tampón de bloqueo
Contador celular automatizadoLife TechnologiesCountess™ IIIncluye portaobjetos con cámara de conteo
Suplemento B27 (50×)Gibco17504044Para medio N2B27; descongelar a 4ºC, alícuotas y almacenar a −20ºC, evitar ciclos de congelación-descongelación
Centrífuga de bancoZonkiaSC-3610Con rotor de cubeta oscilante
Cabina de seguridad biológica (Clase II)Thermo FisherNANA
BMP4ProteintechHZ-1045Reconstituir en ddH2O estéril a 100 ng/μL, alícuotas y almacenar a −20 °C
Albúmina sérica bovina (BSA)Biosharp9048-46-8Para tampón de bloqueo
CHIR99021MCEHY-10182Preparar stock de 10 mM en DMSO, almacenar a −20ºC hasta 1 año
Incubadora de CO2Fisher ScientificLS-CO15037 ºC, 5% CO2, humidificada
Placa para imágenes confocalesBiosharpBS-20-GJMPara imágenes tras tinción
Microscopio confocalLEICANAEquipado con objetivos de 10×, 20×, 63× y software ZEN
DMEMVivacellC3113-0500Para dilución de Matrigel y solución de colágeno I
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAXGibco10565018Para dilución de Matrigel y medio N2B27
EDTA (0,5 M, pH 8,0)InvitrogenAM9260GDiluir con PBS al 0,02% para el paso de subcultivo
Suero bovino fetal (FBS)Gibco10270-106Para medio de diferenciación completo N2B27 (15% final)
FGF-2NovoproteinC046Preparar stock de 1 mg/mL en PBS estéril, alícuotas y almacenar a −20ºC
ForskolinaR&D Systems1099Preparar stock de 10 mM en DMSO, almacenar a −20ºC
HEPES (1 M)Gibco15630080Para solución de colágeno I
HoechstBeyotimeC1071S-4Preparar stock de 1 mg/mL en agua desionizada, alícuotas y almacenar a −20ºC
Microscopio invertidoLEICADMIL LEDObservación rutinaria de células
Matrigel (con factores de crecimiento reducidos)STEEMABM05Almacenar a −20ºC tras alícuotas, evitar ciclos de congelación-descongelación; manipular sobre hielo
Solución de aminoácidos no esenciales MEM (NEAA, 100×)Gibco11140035Para medio N2B27
Suplemento N2 (100×)Gibco17502048Para medio N2B27; almacenar a −20ºC protegido de la luz
Medio NeurobasalGibco21103049Para medio N2B27
Agua libre de nucleasas (libre de DNasa/RNasa)LableadDoo55WJPara preparación de ARN/cADN y qPCR
Agitador orbitalJoan LabNAPara pasos de lavado
Paraformaldehído (solución al 4%)ServicebioG1101Diluir con PBS al 4% para fijación; usar en cabina de gases
Penicilina-Estreptomicina (100×)Gibco15140122Para medio N2B27
Medio PGM1CellapyA1517001Medio de expansión de hiPSC; almacenar a 4ºC protegido de la luz, estable durante 2 semanas
Suplemento PGM1 (25×)CellapyA1517101Para usar con medio basal PGM1
Alcohol polivinílico (PVA)Sigma-AldrichP8136Disolver en PGM1 al 0,25% (p/v) para promover la agregación
PureCol (Colágeno tipo I bovino, 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5005Para mezcla de colágeno I-Matrigel; probar lote para capacidad de polimerización
Ciclador térmico para qPCRThermo FisherStepOnePlus™Con capacidad de curva de fusión; para detección de PCR en tiempo real
Kit de transcripción inversaAccurate BiologyAG11706Para síntesis de cADN a partir de ARN total; contiene mezcla maestra de RT con transcriptasa inversa, tampón, dNTPs y cebadores aleatorios
Kit de extracción de ARNYeasen19221ES50Para aislamiento de ARN total de organoides vasculares; incluye columnas de eliminación de ADN genómico y DNasa I libre de RNasas
Bicarbonato de sodio (7,5%)Gibco25080094Para solución de colágeno I
Deoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750Preparar solución al 1% (p/v) en agua desionizada para tampón de bloqueo
Hidróxido de sodio (1,0 N)Sigma-AldrichS2770Para ajuste de pH de la solución de colágeno I
Pipetas desechables estériles (10 mL)Bkmamlab110205007Individuales, estériles
Puntas de pipeta estériles con filtro (1000, 200, 20 μL)BiozymVT0270/VT0250/VT0220Estériles, con filtro
Aguja estéril (30 G)NANAPara disección de redes vasculares
espátula estéril (extremo redondeado)Fisher Scientific21-401-5Acero inoxidable
Mezcla maestra SYBR GreenAccurate BiologyAG11733Concentración 2× para qPCR; contiene ADN polimerasa con activación térmica, tampón, dNTPs y colorante SYBR Green
Placa de 12 pocillos tratada para cultivo celularBD Falcon353043Para inclusión en gel y cultivo de redes vasculares
Placa de 6 pocillos tratada para cultivo celularEppendorf30720113Tratamiento estándar para cultivo celular
Tritón X-100Sigma-AldrichT9084Para tampón de bloqueo
Azul de tripano (0,4%)Thermo Fisher15250061Para conteo celular
Tween 20Sigma-AldrichP7949Para solución de lavado PBS-T al 0,05%
Placa de 6 pocillos con adherencia ultrabajaCorning3471Para formación de agregados y diferenciación
Placa de 96 pocillos redonda con fondo plano y adherencia ultrabajaBeyotimeFULA962-6pcsPara cultivo en suspensión de organoides vasculares
VEGF-AProteintechHZ-1038Preparar stock de 1 mg/mL en PBS estéril, alícuotas y almacenar a −20ºC
Baño de aguaBlue pardHWS-2437ºC
Y-27632MCEHY-10071Preparar stock de 10 mM en PBS estéril o DMSO, almacenar a −20ºC; concentraciones de trabajo: 5 μM (descongelación), 50 μM (formación de agregados)

Referencias

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