Este estudio identifica cinco biomarcadores relacionados con la cuproptosis y la ferroptosis en la colitis ulcerosa mediante el aprendizaje automático integrado, la secuenciación de ARN de célula individual y la validación experimental, aportando información sobre el diagnóstico clínico y la inmunoterapia dirigida.
Artículo de investigación
Abordaje de la ferroptosis y la cuproptosis en la colitis ulcerosa: hallazgos de bioinformática exhaustiva y validación experimental
En este artículo
Resumen
Resumen
La colitis ulcerosa (CU) es un trastorno intestinal persistente con una patogénesis parcialmente definida y tasas crecientes de prevalencia e internación en países recientemente industrializados. En la CU, la muerte excesiva de células epiteliales intestinales altera la barrera mucosa y desencadena respuestas inflamatorias. La ferroptosis y la cuproptosis son dos formas recientemente descritas de muerte celular regulada. La mayoría de los estudios sobre CU han examinado estos procesos por separado; sin embargo, sus funciones combinadas en la progresión de la CU permanecen insuficientemente caracterizadas. Para investigar sus roles sinérgicos en la patogénesis de la CU, utilizamos un enfoque escalonado que incluyó un perfilado transcriptómico a gran escala para identificar dianas candidatas, seguido de validación en modelos in vitro. Los genes diferencialmente expresados (DEG) se intersectaron con genes relacionados con la ferroptosis (FRG) y genes relacionados con la cuproptosis (CRG). Las dianas comunes se priorizaron mediante un consenso de algoritmos de aprendizaje automático y análisis de redes de coexpresión de genes ponderados (WGCNA). Cinco biomarcadores—LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 y CD274—se encontraron significativamente sobreexpresados en la CU. Un análisis a nivel de célula individual caracterizó su expresión en diferentes tipos celulares, observándose que LCN2 y NOS2 se enriquecieron principalmente en células epiteliales. La relevancia mecanicista de estos marcadores se evaluó además mediante ensayos in vitro. El tratamiento con inhibidores de la ferroptosis o de la cuproptosis alivió la inflamación asociada a la CU y moduló la expresión de los biomarcadores en modelos celulares Caco-2. Estos hallazgos identifican cinco biomarcadores asociados con la progresión de la CU y aportan evidencia experimental que respalda su posible aplicación en el diagnóstico clínico y la intervención terapéutica.
Introducción
La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria intestinal recurrente asociada con una carga global creciente y costos sustanciales de tratamiento a largo plazo1,2. Aunque los aminosalicilatos, corticosteroides, terapias biológicas y moléculas pequeñas han ampliado las opciones de tratamiento, lograr una remisión duradera sigue siendo difícil para muchos pacientes3,4. Esta necesidad clínica insatisfecha resalta la importancia de identificar marcadores moleculares reproducibles y mecanismos abordables que puedan facilitar un diagnóstico temprano y un tratamiento guiado por mecanismos5.
La ferroptosis es una forma dependiente del hierro de muerte celular regulada impulsada por la peroxidación lipídica, el agotamiento del glutatión y la actividad deteriorada de GPX46. Los niveles elevados de hierro y malondialdehído en la colitis ulcerosa son compatibles con una lesión epitelial ferroptótica, mientras que la activación experimental del eje SLC7A11–GSH–GPX4 o la inhibición directa de la ferroptosis pueden proteger la barrera intestinal7,8.
La cuproptosis, descrita en 2022, se desencadena cuando el cobre se une a proteínas mitocondriales lipoiladas, lo que provoca agregación proteica y estrés proteotóxico9. Dado que el intestino desempeña un papel central en el metabolismo del cobre, la alteración de esta vía puede amplificar la lesión epitelial oxidativa e inflamatoria en la colitis ulcerosa10.
La ferroptosis y la cuproptosis podrían converger a través del desequilibrio de iones metálicos, el metabolismo mitocondrial, el agotamiento del glutatión y el estrés oxidativo11. Sin embargo, aún no se ha determinado si esta interacción produce una firma molecular reproducible en la colitis ulcerosa ni si dicha firma responde a la inhibición específica de las vías implicadas.
La hipótesis del estudio fue que la interacción disregulada entre ferroptosis y cuproptosis en la colitis ulcerosa converge en una firma reproducible de biomarcadores que puede priorizarse en conjuntos de datos transcriptómicos de población celular completa y de célula individual, y atenuarse mediante la inhibición específica de la vía en un modelo de lesión del epitelio intestinal. Por consiguiente, se integraron bioinformática multicohorte, aprendizaje automático, análisis de célula única y experimentos dirigidos en Caco-2 para identificar y evaluar funcionalmente los biomarcadores candidatos (Figura 1).
Figura 1: Flujo del estudio. Flujo integrado para el cribado transcriptómico multicohorte, priorización de biomarcadores basada en aprendizaje automático y redes, localización a nivel de célula individual y validación mediante inhibidores en células Caco-2. UC: colitis ulcerosa; GEO: Gene Expression Omnibus; WGCNA: análisis de red de coexpresión génica ponderada; PPI: interacción proteína-proteína; ROC: característica operativa del receptor; GSEA: análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocolo
Este estudio utilizó conjuntos de datos de acceso público y líneas celulares humanas disponibles comercialmente. No se incluyeron participantes humanos, tejidos humanos recién recolectados ni animales vertebrados; por lo tanto, no se requirió la aprobación del comité de ética institucional. Las herramientas de investigación, el software y los recursos en línea utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Procesamiento de datos para el análisis de expresión diferencial
Para establecer los cohortes de descubrimiento y validación transcriptómicos, se realizó una búsqueda en la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) utilizando el término «colitis ulcerosa». Cuatro conjuntos de datos—GSE87466, GSE92415, GSE107499 y GSE75214—se utilizaron como conjunto de entrenamiento, mientras que GSE47908 se reservó para validación externa. Los conjuntos de datos de entrenamiento se normalizaron y corrigieron por lotes mediante ComBat en Sangerbox 3.0, mientras que el conjunto de datos de validación se procesó de forma independiente.
Se obtuvieron un total de 583 genes relacionados con la ferroptosis (FRG) de FerrDB y se complementaron con genes reportados en la literatura para reducir el sesgo de una sola fuente12. Un conjunto de 96 genes relacionados con la cuproptosis (CRG) se compiló a partir de estudios publicados12,13,14. El análisis de expresión diferencial se realizó mediante limma con umbrales de |cambio en el log₂| > 1 y P ajustado por Benjamini–Hochberg < 0,05. Los gráficos diagnósticos de normalización, corrección por lotes, expresión diferencial y agrupamiento se proporcionan en la Figura Suplementaria 1. La composición de las muestras, las plataformas y las asignaciones de las cohortes se detallan en la Tabla Suplementaria 1.
2. Identificación de DEG-FC en la CU
Se realizó un análisis de correlación de Pearson utilizando umbrales de |r| > 0,5 y P < 0,05 para identificar FRG y CRG coexpresados. El conjunto de genes resultante se intersectó con los genes expresados diferencialmente (DEG) para identificar genes expresados diferencialmente con coexpresión de cuproptosis y ferroptosis (CF-DEG).
3. Análisis de enriquecimiento
Se realizaron análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizando clusterProfiler y la plataforma Bioinformatics.com.cn. Se utilizó un valor de P ajustado por Benjamini–Hochberg < 0,05 como umbral de significancia. Los gráficos de enriquecimiento se proporcionan en la Figura Suplementaria 2.
4. Análisis de red de coexpresión génica ponderada (WGCNA)
La estructura modular subyacente a los perfiles de expresión génica se analizó mediante el análisis de red de coexpresión génica ponderada (WGCNA). Las muestras anormales se identificaron y excluyeron mediante agrupamiento jerárquico combinado con la función goodSamplesGenes. Posteriormente, se determinó una potencia adecuada de umbralización suave (β) para cumplir con el criterio de topología libre de escala en la construcción de la red.
Los datos de expresión procesados se utilizaron para construir una matriz de superposición topológica (TOM) para el análisis de coexpresión génica. Mediante el enfoque de corte dinámico de árboles, los genes con patrones de expresión altamente consistentes se organizaron en módulos génicos, cada uno conteniendo al menos 100 genes. Se analizaron las asociaciones entre los eigengenes de los módulos (MEs) y los fenotipos para identificar los módulos asociados con el proceso de la enfermedad y extraer los conjuntos génicos correspondientes. Los diagnósticos de cribado de WGCNA se proporcionan en la Figura Suplementaria 3.
5. Selección de biomarcadores
Para priorizar los candidatos para el seguimiento experimental, se aplicaron en paralelo tres algoritmos de aprendizaje automático15. Se utilizó la regresión mediante el operador de contracción y selección por mínimos absolutos (LASSO, por sus siglas en inglés) para la selección de características, un bosque aleatorio con ntree = 500 para clasificar la importancia de los genes, y una máquina de vectores de soporte con eliminación recursiva de características (SVM-RFE, por sus siglas en inglés) para identificar el subconjunto de características con el menor error de validación cruzada. Los diagnósticos completos del cribado se proporcionan en la Figura Suplementaria 5.
La importancia de los genes se evaluó según la contribución de cada gen individual a la precisión de la clasificación, y se recopilaron los genes con mayor puntuación para generar un conjunto preliminar de genes16. El algoritmo SVM-RFE realizó la selección de características y la optimización del modelo mediante eliminación iterativa de características, lo que permitió identificar el subconjunto óptimo de características para la clasificación17. Los genes comunes a los tres algoritmos se consideraron biomarcadores candidatos identificados mediante aprendizaje automático.
Los genes diferencialmente expresados en la CF (CF-DEGs) se utilizaron para construir una red de interacción proteína-proteína (PPI), y CytoHubba se empleó para clasificar los nodos centrales. La intersección de los módulos clave de WGCNA, las tres salidas del aprendizaje automático y el conjunto central de PPI definió cinco biomarcadores candidatos integrados: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 y CD274. Estos genes se clasificaron como candidatos diagnósticos asociados a la colitis ulcerosa (UC). Experimentos posteriores con inhibidores clasificaron además a LCN2, IDO1, CXCL2 y NOS2 como marcadores sensibles a la inhibición de la ferroptosis y a CD274 como un marcador sensible a la inhibición de la cuproptosis. No se consideró que estos genes fueran reguladores upstream demostrados de ninguna de las dos vías.
6. Desarrollo del modelo predictivo y evaluación multimétodo
Para evaluar el potencial clínico de traslación de la firma génica identificada, se construyó un nomograma utilizando el paquete rms para evaluar el rendimiento diagnóstico. El rendimiento del modelo se evaluó mediante una curva de calibración, la prueba de Hosmer-Lemeshow (HL) y el índice de concordancia de Harrell (índice C).
La calibración del modelo se evaluó utilizando la prueba de Hosmer-Lemeshow (HL) y el error absoluto medio (MAE). Se establecieron como umbrales un valor de P > 0,05 y un MAE < 0,1 para un ajuste y una precisión del modelo aceptables, respectivamente. Se generaron curvas de característica operativa del receptor (ROC) y se calculó el área bajo la curva (AUC) para evaluar el rendimiento predictivo del nomograma para la colitis ulcerosa (UC). Se utilizó un conjunto de datos independiente para evaluar la generalización y estabilidad del modelo.
7. Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)
En el conjunto de entrenamiento, se realizó un análisis de correlación de Spearman entre cada biomarcador y todos los demás genes. Los resultados de correlación se ordenaron para generar un conjunto de genes clasificados. Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando el conjunto de genes c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols de la Base de Datos de Firmas Moleculares (MSigDB) como referencia. Las vías biológicas con P < 0,05 se consideraron significativamente enriquecidas.
8. Análisis del paisaje inmunitario
La herramienta CIBERSORT y la matriz de firmas LM22 se utilizaron para realizar el análisis de desconvolución de los datos de expresión y estimar las proporciones de los 22 subtipos de células inmunitarias. Posteriormente, se realizó un análisis de correlación de Spearman para evaluar las asociaciones entre los cinco biomarcadores y los subtipos de células inmunitarias.
9. Análisis de la red reguladora
Se obtuvo información sobre la regulación de factores de transcripción (TF) y microARN (miARN) relacionados con genes a partir de las bases de datos integradas ChEA3 y TarBase 9.0 mediante la plataforma NetworkAnalyst. Se incluyeron en la red reguladora los miARN asociados con al menos dos nodos.
10. ARN-seq de una sola célula
Los conjuntos de datos de células individuales de UC GSE116222, que comprenden tres muestras sanas y tres muestras de UC, y GSE214695, que comprenden seis muestras sanas y seis muestras de UC, fueron integrados. Las células se conservaron cuando contenían entre 200 y 5.000 genes detectados, >1.000 identificadores moleculares únicos, < 30% de transcritos mitocondriales, < 3% de transcritos de hemoglobina, y < 50 % de transcritos ribosomales. Se utilizó la función NormalizeData para la normalización, y Harmony se empleó para la corrección de lotes antes del agrupamiento y la anotación.
Después del filtrado, los datos se normalizaron utilizando la función NormalizeData. Se utilizó Harmony para minimizar los efectos de lote entre las muestras. Se aplicaron la aproximación uniforme de variedades y proyección (UMAP) y el incrustado estocástico de vecinos distribuido en t (t-SNE) para la reducción de dimensionalidad y la agrupación de células, con el fin de caracterizar las estructuras locales y globales dentro de la población celular. Se conservaron un total de 31.712 células de alta calidad para análisis posteriores. Los tipos celulares se anotaron según los genes marcadores canónicos de células.
Se realizó un análisis de pseudotiempo utilizando Monocle 2 para investigar los cambios en los estados de las células epiteliales y mieloides procedentes de tejidos de CU. Se evaluaron las trayectorias de desarrollo celular y las diferencias entre grupos, y se visualizaron los patrones de expresión de biomarcadores a lo largo de la trayectoria de pseudotiempo.
CellChat se utilizó para evaluar la comunicación entre células epiteliales y subpoblaciones de células mieloides. Se integraron patrones de expresión específicos de subpoblaciones para inferir probabilidades de interacción y vías de señalización clave entre células epiteliales y mieloides, y para caracterizar sus potenciales redes reguladoras intercelulares.
11. Experimentos con células
Las células de adenocarcinoma de colon humano Caco-2 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 10% de suero bovino fetal, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO₂. Las células Caco-2 fueron seleccionadas como un modelo reproducible de monocapa epitelial para ensayos de barrera intestinal y lesión inflamatoria; sin embargo, su origen maligno limita la extrapolación directa al epitelio colónico no maligno. La información sobre los pasajes no estaba disponible en los registros experimentales archivados.
Se estableció un modelo in vitro de inflamación-lesión mediante la exposición de las células a 1 µg/mL de lipopolisacárido (LPS) durante 24 h. Las células se asignaron a un grupo control con vehículo de dimetilsulfóxido, un grupo con solo LPS, un grupo con LPS + 4 µM de ferrostatina-1 o un grupo con LPS + 40 µM de tetratiomolibdato, con concentraciones finales de solvente equivalentes. El grupo con solo LPS sirvió como control positivo de lesión/modelo para las comparaciones de rescate con inhibidores.
- Viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo de viabilidad celular según las instrucciones del fabricante. Después de la incubación a 37 °C durante aproximadamente 2 h, se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. - Medición de los niveles de MDA y Fe²⁺
Los niveles intracelulares de malondialdehído (MDA) y Fe2⁺ se midieron utilizando los kits de ensayo correspondientes según las instrucciones de los fabricantes. La proteína total se cuantificó mediante un ensayo de ácido bicinconínico, y cada resultado se normalizó respecto al contenido proteico de la muestra correspondiente. - Ensayo con sonda fluorescente de iones de cobre
Tras la eliminación del medio de cultivo, se añadió una sonda fluorescente específica para Cu2⁺ a una concentración final de 1 µM y se incubó durante 30 min a 37 °C. Las imágenes se adquirieron inmediatamente sin lavado, utilizando un microscopio de fluorescencia invertido con longitudes de onda de excitación y emisión de 510 y 578 nm, respectivamente. Los parámetros de adquisición se mantuvieron constantes entre los grupos, y la barra de escala de las imágenes se calibró a 50 µm. - RT-qPCR
El ARN total se aisló utilizando un reactivo de extracción de ARN basado en fenol–guanidinio. Se sintetizó ADN complementario a partir de 1 µg de ARN utilizando un kit de síntesis de primera cadena de ADN complementario, y se emplearon reactivos basados en SYBR Green para la PCR en tiempo real. Cada reacción se realizó por triplicado técnico. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en Supplementary Table 2, y la abundancia relativa de ARN mensajero se calculó utilizando el método 2⁻ΔΔCt.
12. Análisis estadístico
La normalidad y la homogeneidad de la varianza se evaluaron mediante las pruebas de Shapiro-Wilk y de Levene centrada en la mediana, respectivamente. Los datos que cumplían ambos supuestos se analizaron utilizando una prueba t no apareada de dos colas o un análisis de varianza de un solo factor seguido de la prueba de diferencia significativa honesta de Tukey. Cuando no se cumplía alguno de los supuestos, se utilizó la prueba t de Welch o el análisis de varianza de Welch seguido de comparaciones de Games-Howell.
Los resultados se presentan como media ± desviación estándar. Las cuentas reales de réplicas biológicas, los valores P exactos bilaterales y las comprobaciones de supuestos se informan en la Tabla Suplementaria 3. La hoja fuente archivada de la Figura 13 contiene menos réplicas de control para los paneles A (n = 4), C (n = 4) y F (n = 2), mientras que todas las demás combinaciones de panel/grupo contienen n = 6.
Los análisis computacionales se realizaron utilizando R y los flujos de trabajo limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC, rms, Seurat v4, Harmony, Monocle 2, CellChat, y Cytoscape/CytoHubba. Los recursos en línea incluyeron FerrDB, GEO, STRING, ChEA3, TarBase 9.0, NetworkAnalyst, CIBERSORT/LM22, MSigDB, Bioinformatics.com.cn, y Sangerbox 3.0.
Resultados
Identificación y anotación funcional de genes coexpresados en cuproptosis y ferroptosis
Se integraron cuatro conjuntos de datos de entrenamiento que comprendían 421 muestras de UC y 97 controles sanos. Se identificaron un total de 551 genes expresados diferencialmente, incluyendo 362 genes sobreexpresados y 189 genes subexpresados. El análisis de correlación arrojó 444 genes correlacionados con ferroptosis y cuproptosis, y la intersección con los genes expresados diferencialmente produjo 32 genes expresados diferencialmente coexpresados en cuproptosis y ferroptosis (CF-DEGs).
Los 32 CF-DEG mostraron enriquecimiento en respuestas a heridas, iones de cobre, transporte de ácidos grasos, lipopolisacárido, enfermedad inflamatoria intestinal, señalización de NF-κB, señalización de TNF y ferroptosis (Supplementary Table 4).
Priorización de biomarcadores centrales mediante el aprendizaje automático integrado y el WGCNA
El análisis de red de coexpresión génica ponderada (WGCNA) identificó MEpurple, MEbrown y MEblack como los módulos más fuertemente asociados con la UC. Juntos, los módulos seleccionados contenían 1,426 genes (Supplementary Table 5).
LASSO (operador de contracción y selección por mínimos absolutos), máquina de vectores de soporte con eliminación recursiva de características (SVM-RFE) y bosque aleatorio seleccionaron 21, 32 y 19 características, respectivamente. Trece genes fueron comunes a los tres modelos. La integración del consenso de aprendizaje automático, el núcleo de interacción proteína-proteína clasificado por CytoHubba y los módulos WGCNA seleccionados produjo cinco biomarcadores candidatos asociados a la colitis ulcerosa: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 y CD274.
Evaluación diagnóstica y enriquecimiento de vías de la firma de biomarcadores
Los cinco biomarcadores candidatos mostraron correlación positiva y estuvieron sobreexpresados en la colitis ulcerosa en la cohorte de entrenamiento (Figura 2A, B). Cada marcador alcanzó un área bajo la curva característica de operación del receptor > 0.80 en la cohorte de entrenamiento y > 0.75 en la cohorte de validación independiente GSE47908 (Figura 2C–E).
El nomograma de cinco genes mostró una calibración favorable, con una P de Hosmer-Lemeshow > 0,05 y un error absoluto medio < 0,1, así como una buena discriminación en la cohorte analizada, con un área bajo la curva y un índice de concordancia de 0,945 y un intervalo de confianza del 95 % para el índice de concordancia de 0,922–0,968 (Figura 3).
El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes vinculó a los cinco candidatos con las vías de señalización JAK–STAT, interferón–RIPK1/3 y receptor tipo Toll–NF-κB (Figura 4).
Figura 2: Expresión del biomarcador candidato y rendimiento diagnóstico. (A) Mapa de calor de correlación. (B, C) Expresión del biomarcador y curvas de característica operativa del receptor en la cohorte de entrenamiento. (D, E) Expresión del biomarcador y curvas de característica operativa del receptor en la cohorte de validación GSE47908. ROC: característica operativa del receptor; AUC: área bajo la curva; UC: colitis ulcerosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Desarrollo y evaluación del nomograma para la colitis ulcerosa. (A) Nomograma de cinco genes. (B) Gráfica de calibración. (C) Curva característica de operación del receptor. ROC: característica de operación del receptor; UC: colitis ulcerosa; AUC: área bajo la curva; C-index: índice de concordancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de los cinco biomarcadores candidatos. (A–E) Resultados del análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes para LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 y CD274, respectivamente. GSEA: análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Perfil del microentorno inmunitario y análisis de la red reguladora
Las muestras de CU mostraron proporciones aumentadas de neutrófilos, linfocitos T CD4⁺ de memoria activados, macrófagos M1 y mastocitos activados, con disminuciones recíprocas en macrófagos M2, mastocitos en reposo y células dendríticas en reposo. Estos patrones se reprodujeron en la cohorte de validación (Figura 5A–E).
Los cinco candidatos mostraron correlación positiva con neutrófilos, linfocitos T CD4⁺ de memoria activados y macrófagos M1, y correlación inversa con mastocitos en reposo y macrófagos M2 (Figura 5F–J). La red génica de miARN contenía 98 nodos y 146 aristas. hsa-miR-34a-5p y hsa-miR-16-5p mostraron la mayor conectividad como biomarcadores, mientras que AR y RELA fueron los factores de transcripción con mayor conectividad (Figura 6).
Figura 5: Análisis de infiltración inmunitaria. (A) Composición de células inmunitarias. (B) Diferencias entre grupos en las proporciones de células inmunitarias. (C) Mapa de calor de correlación entre células inmunitarias. (D, E) Infiltración de células inmunitarias en las cohortes de entrenamiento y validación. (F–J) Correlaciones entre biomarcadores candidatos y poblaciones de células inmunitarias. UC: colitis ulcerosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Redes predichas de microARN y factores de transcripción. (A) Red gen–microARN. Los círculos indican biomarcadores candidatos y los cuadrados indican microARNs. (B) Red factor de transcripción–gen. Los diamantes indican biomarcadores candidatos y los triángulos invertidos indican factores de transcripción. microARN: microARN; TF: factor de transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Dinámica de expresión espacio-temporal con resolución a nivel de célula individual
Después del control de calidad, 31.712 células formaron 22 grupos que se anotaron como nueve poblaciones celulares principales (Figura 7A–C). Las proporciones de células epiteliales y plasmáticas fueron más altas en la CU. LCN2 y NOS2 estuvieron enriquecidos en células epiteliales, mientras que IDO1, CXCL2 y CD274 estuvieron enriquecidos en células mieloides (Figura 7D–G).
La subagrupación de células epiteliales identificó 11 subconjuntos, con una expansión de colonocitos inflamatorios y un enriquecimiento de LCN2 y NOS2 en este subconjunto (Figura 8). La subagrupación de células mieloides identificó siete subconjuntos, con un aumento de monocitos, una reducción de macrófagos y un enriquecimiento de IDO1, CXCL2 y CD274 en los monocitos (Figura 9).
Los colonocitos inflamatorios se acumularon al final de la trayectoria epitelial, con un aumento en la expresión de LCN2 y NOS2 (Figura 10). Los monocitos mostraron una trayectoria distintiva asociada a la colitis ulcerosa, con expresión dinámica de IDO1, CXCL2 y CD274 (Figura 11).
Los colonocitos inflamatorios mostraron la señalización saliente más intensa y una comunicación destacada con los monocitos. APP–CD74 fue el par principal de ligando–receptor entre estos subconjuntos (Figura 12).
Figura 7: Expresión de biomarcadores candidatos en poblaciones celulares. (A) Agrupamientos celulares. (B) Marcadores de anotación. (C) Nueve poblaciones celulares anotadas. (D, E) Distribución y proporciones celulares en muestras sanas y de CU. (F, G) Expresión de biomarcadores candidatos visualizada mediante UMAP y gráfico de burbujas. CU: colitis ulcerosa; UMAP: aproximación y proyección uniforme de variedades. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Subagrupamiento de células epiteliales y expresión de candidatos. (A) Agrupaciones iniciales de células epiteliales. (B) Marcadores de anotación. (C) Subconjuntos de células epiteliales anotados. (D) Proporciones de subconjuntos en muestras sanas y con colitis ulcerosa. (E) Expresión de LCN2 y NOS2 en los subconjuntos de células epiteliales. t-SNE: incrustación estocástica de vecinos distribuida en t; UC: colitis ulcerosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Subagrupamiento de células mieloides y expresión de candidatos. (A) Grupos iniciales de células mieloides. (B) Marcadores de anotación. (C) Subconjuntos anotados de células mieloides. (D) Proporciones de subconjuntos en muestras sanas y de colitis ulcerosa. (E) Expresión de IDO1, CXCL2 y CD274 en los subconjuntos de células mieloides. t-SNE: incrustación estocástica de vecinos distribuida en t; UC: colitis ulcerosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Análisis de pseudotiempo en células epiteliales. (A) Trayectoria de pseudotiempo y asignaciones de estado. (B) Distribución de células epiteliales sanas y con colitis ulcerosa a lo largo de la trayectoria. (C) Dinámica de expresión de LCN2 y NOS2 a lo largo del pseudotiempo. UC: colitis ulcerosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Análisis de pseudotiempo en células mieloides. (A) Trayectoria de pseudotiempo y asignaciones de estados. (B) Distribución de células mieloides sanas y con colitis ulcerosa a lo largo de la trayectoria. (C) Dinámica de expresión de IDO1, CXCL2 y CD274 a lo largo del pseudotiempo. UC: colitis ulcerosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: Comunicación epitelial–mieloide. (A) Número y fuerza de interacción. (B) Fuerzas de señalización saliente y entrante. (C) Interacciones que involucran colonocitos inflamatorios. (D) Mapa de calor de la fuerza de comunicación. (E) Pares ligando–receptor que involucran colonocitos inflamatorios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
in vitro validación experimental de intervenciones sobre ferroptosis y cuproptosis
La exposición a lipopolisacárido (LPS) redujo la viabilidad de las células Caco-2 y aumentó la expresión de IL-6 e IL-1β en comparación con el control de vehículo (Figura 13A–C y Figura suplementaria 5).
El LPS aumentó el Fe2⁺, el malondialdehído y la abundancia de ARN mensajero de LCN2, IDO1, CXCL2 y NOS2, mientras que el ferrostatina-1 revirtió cada cambio asociado al LPS (Figura 13D–I). Para las comparaciones entre LPS y LPS + ferrostatina-1, los valores exactos de P bilaterales oscilaron entre 9,45 × 10⁻5 y 0,0027 tras promediar los réplicas técnicas dentro de cada réplica biológica.
El LPS redujo la viabilidad y aumentó la IL-6, la IL-1β, FDX1/DLAT, CD274 y la fluorescencia sensible al cobre, mientras que el tetratiomolibdato revirtió estos cambios (Figura 14 A–E). Para las comparaciones entre LPS y LPS + tetratiomolibdato, los valores exactos de P bilaterales oscilaron entre < 1 × 10⁻15 y 0.0008.
En conjunto, los análisis identificaron cinco candidatos diagnósticos asociados a la colitis ulcerosa, localizaron su expresión en poblaciones epiteliales y mieloides, y mostraron que LCN2, IDO1, CXCL2 y NOS2 respondieron a la inhibición de la ferroptosis, mientras que CD274 respondió a la quelación del cobre en células Caco-2.
Figura 13: El ferrostatina-1 atenúa los cambios inflamatorios asociados al LPS y relacionados con la ferroptosis en células Caco-2. (A) Viabilidad celular. (B, C) Expresión de ARN mensajero de IL-6 e IL-1β. (D, E) Niveles intracelulares de malondialdehído y Fe2⁺. (F–I) Expresión de ARN mensajero de LCN2, IDO1, CXCL2 y NOS2. Las réplicas técnicas por triplicado se promediaron dentro de cada réplica biológica independiente; las barras de error indican la desviación estándar. Las cantidades disponibles de réplicas biológicas fueron Control n = 4 en A y C, Control n = 2 en F, y n = 6 para todas las demás combinaciones de panel/grupo. Los valores exactos de P bilaterales y las comprobaciones de supuestos se informan en la Tabla Suplementaria 5. Fer-1: ferrostatina-1; LPS: lipopolisacárido; MDA: malondialdehído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 14: El tetratiomolibdato atenúa los cambios inflamatorios asociados a LPS y relacionados con la cuproptosis en células Caco-2. (A) Viabilidad celular. (B, C) Expresión de ARN mensajero de IL-6 e IL-1β. (D) Expresión de ARN mensajero de FDX1 y DLAT. (E) Expresión de ARN mensajero de CD274. (F) Fluorescencia intracelular de Cu2⁺; barra de escala = 50 µm. Se promediaron réplicas técnicas por triplicado dentro de cada una de seis réplicas biológicas independientes por grupo; las barras de error indican la desviación estándar. Los valores exactos de P bilaterales y las comprobaciones de supuestos se informan en la Tabla Suplementaria 5. TTM: tetratiomolibdato; LPS: lipopolisacárido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los datos brutos y procesados, los scripts de análisis y las hojas de cálculo fuente de los experimentos con células están disponibles públicamente en https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720.
Figura suplementaria 1: Preprocesamiento de datos y diagnósticos de expresión diferencial. (A–F) Distribuciones de las muestras antes (A–C) y después (D–F) de la corrección por lotes. (G) Gráfico de volcan para genes diferencialmente expresados. (H) Mapa de calor de los patrones de expresión normalizados. DEGs: genes diferencialmente expresados; GEO: Gene Expression Omnibus.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2: Análisis de enriquecimiento de CF-DEGs. (A) Enriquecimiento de la Ontología Genética. (B) Enriquecimiento de la Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas. CF-DEGs: genes expresados diferencialmente coexpresados por cuproptosis y ferroptosis; GO: Ontología Genética; KEGG: Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 3: Diagnósticos de cribado de WGCNA. (A) Selección del umbral suave. (B) Agrupamiento de eigengenes de módulos. (C) Dendrograma gen-módulo. (D) Asociaciones entre módulos y rasgos. (E–G) Relaciones entre significancia génica y pertenencia al módulo para los módulos púrpura, marrón y negro. WGCNA: análisis de red de coexpresión génica ponderado; UC: colitis ulcerosa.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 4: Cribado multietapa de biomarcadores. (A, B) Selección de características mediante LASSO. (C, D) Selección de características mediante SVM-RFE. (E, F) Clasificación de características por bosque aleatorio. (G) Consenso entre los tres modelos. (H, I) Red de interacción proteína-proteína y nodos centrales de CytoHubba. (J) Integración de los resultados del aprendizaje automático, WGCNA y PPI. (K) Ubicaciones cromosómicas de los cinco candidatos. LASSO: operador de contracción y selección por mínimos absolutos; SVM-RFE: eliminación recursiva de características mediante máquina de vectores de soporte; RF: bosque aleatorio; PPI: interacción proteína-proteína; WGCNA: análisis de red de coexpresión génica ponderada.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 5: Validación del modelo de LPS en células Caco-2. (A) Viabilidad celular. (B, C) Expresión de ARN mensajero de IL-6 e IL-1β. Las réplicas técnicas se promediaron dentro de seis réplicas biológicas independientes por grupo; las barras de error indican la desviación estándar. LPS: lipopolisacárido.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 1: Conjuntos de datos GEO utilizados para el descubrimiento y la validación. Números de acceso de los conjuntos de datos, plataformas, composición de las muestras y asignaciones de cohortes para los conjuntos de datos GEO incluidos en los análisis de descubrimiento y validación. GEO: Gene Expression Omnibus.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 2: Secuencias de cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa. Secuencias de cebadores utilizadas para el análisis mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa de los genes evaluados en este estudio.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 3: Detalles estadísticos para las Figuras 13, 14 y la Figura suplementaria 1. Números de réplicas biológicas, comprobaciones de supuestos, métodos de análisis estadístico y valores P exactos para las comparaciones experimentales indicadas.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 4: Genes expresados diferencialmente coexpresados en cuproptosis y ferroptosis. Lista de DEG-FC identificados mediante la intersección de genes correlacionados con ferroptosis y cuproptosis con genes expresados diferencialmente.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 5: Genes en los módulos WGCNA seleccionados para la detección de biomarcadores. Lista de genes contenidos en los módulos WGCNA seleccionados para la detección subsiguiente de biomarcadores. WGCNA: análisis de red de coexpresión génica ponderado.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Este estudio integró la transcriptómica masiva, el aprendizaje automático, el análisis a nivel de célula individual y experimentos celulares dirigidos para examinar la interacción entre ferroptosis y cuproptosis en la colitis ulcerosa. Cinco candidatos diagnósticos asociados a la colitis ulcerosa fueron reproducibles en las cohortes de descubrimiento y validación, se localizaron principalmente en compartimentos epiteliales y mieloides, y mostraron expresión sensible a la inhibición de vías en células Caco-2. Estos hallazgos respaldan un flujo de trabajo por etapas en el que la priorización computacional guía la validación biológica enfocada, al tiempo que evita afirmar categóricamente que los cinco genes son reguladores upstream establecidos de la ferroptosis o la cuproptosis.
Los DEG-FC se enriquecieron en respuestas al lipopolisacárido, manejo del cobre, transporte de lípidos, señalización NF-κB/TNF y ferroptosis, proporcionando una conexión coherente entre el estrés oxidativo dependiente de metales y la inflamación mucosa10,19.
Los cinco candidatos ocupan contextos complementarios de inflamación y estrés por metales. LCN2 conecta el secuestro de hierro, la disbiosis microbiana y el eje de ferroptosis LCN2–ALOX1520,21,22,23; IDO1 vincula el metabolismo del triptófano, la inflamación mucosal y la alteración en el manejo del hierro24,25,26; y CXCL2 conecta la señalización de IL-17/IL-22, el reclutamiento de neutrófilos y la peroxidación lipídica27,28,29,30. NOS2 tiene efectos dependientes del contexto, pero puede amplificar la lesión oxidativa y la susceptibilidad a la ferroptosis cuando se induce excesivamente31,32,33,34,35,36. CD274 es un marcador epitelial inmunorregulador cuya relación con FDX1 y la sensibilidad al ionóforo de cobre sugiere una respuesta a la cuproptosis más que un control establecido de la vía37,38,39. Los experimentos con inhibidores fueron coherentes con estas clasificaciones: el ferrostatina-1 redujo LCN2, IDO1, CXCL2 y NOS2, mientras que el tetrationomolibdato redujo CD274.
El análisis inmunológico conectó además la firma candidata con macrófagos M1, neutrófilos, linfocitos T CD4⁺ de memoria activados y mastocitos activados, todos los cuales pueden mantener la lesión epitelial mediante citocinas, especies reactivas de oxígeno y señales que alteran la barrera40,41,42,43,44. RELA, hsa-miR-34a-5p y hsa-miR-16-5p surgieron como reguladores upstream plausibles, mientras que la evidencia sobre un papel directo del receptor de andrógenos en la colitis ulcerosa sigue siendo limitada45,46,47,48,49,50. Estos hallazgos deben interpretarse como hipótesis a nivel de red para futuros experimentos de perturbación, más que como prueba de regulación directa.
El análisis a nivel de célula individual localizó LCN2 y NOS2 en colonocitos inflamatorios, e IDO1, CXCL2 y CD274 en poblaciones ricas en monocitos de origen mieloide. Se predijo que los colonocitos inflamatorios actúan como centros de comunicación, siendo APP–CD74 uno de los principales pares ligando–receptor epitelial–mieloide51,52,53,54,55,56. Esta resolución a nivel de tipo celular delimita el contexto biológico en el que deben evaluarse los cinco candidatos y respalda el uso de sistemas de co-cultivo u organoides con células inmunitarias como siguiente paso experimental.
Varias limitaciones restringen la interpretación. Caco-2 es una línea celular de adenocarcinoma colorrectal y no recapitula completamente el epitelio colónico no maligno, la heterogeneidad entre pacientes, las interacciones estroma-inmunitarias ni la colitis ulcerosa crónica; por lo tanto, se requiere validación en células epiteliales intestinales primarias, organoides derivados de pacientes, sistemas de co-cultivo y modelos de colitis in vivo. Además, la hoja de cálculo fuente del Figura 13 archivada carecía de algunos registros de réplicas control en los paneles A, C y F, lo que redujo la precisión en esas comparaciones; todos los conteos de réplicas disponibles y los valores P exactos se indican en la Tabla Suplementaria 5. Por último, la edad, el sexo, la exposición a tratamientos y otras covariables clínicas no estaban disponibles de forma uniforme en los cohortes públicos. Serán necesarios cohortes prospectivos multicéntricos y la perturbación directa de los cinco candidatos para establecer su utilidad diagnóstica y sus roles causales. Dentro de estas limitaciones, el estudio proporciona un conjunto de hipótesis transparente y basado experimentalmente que vincula la muerte celular dependiente de metales, la comunicación epitelial-mieloide y la colitis ulcerosa. Investigaciones recientes de farmacología de redes en el cáncer de próstata ilustran el valor generador de hipótesis de la priorización computacional de dianas, pero no constituyen una validación específica para la colitis ulcerosa57. Asimismo, la reciente discusión sobre la ferroptosis en la osteoartritis y la degeneración ósea refleja un interés terapéutico más amplio en la modulación de la ferroptosis, aunque los mecanismos específicos de la enfermedad no pueden extrapolarse directamente a la colitis ulcerosa58. Por ello, se utilizaron validación en cohortes externos y experimentos con inhibidores para reforzar, pero no exagerar, las asociaciones bioinformáticas.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Jóvenes Eruditos Qihuang de la Administración Nacional de Medicina Tradicional China (Número de subvención 2022256). Se agradece a todos los miembros de los equipos de investigación de la Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning y del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning por el apoyo técnico y las contribuciones a la curación de datos y al análisis bioinformático.
OpenAI Codex (OpenAI) se utilizó durante la revisión únicamente para ayudar con la edición en inglés, el formato del documento y las verificaciones de calidad de las figuras. Todo el contenido científico, los análisis, las citas y la presentación final fueron revisados y verificados por los autores, quienes asumen toda la responsabilidad por el manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Beyotime Institute of Biotechnology | P0010 | Cuantificación de proteínas para normalización. |
| Bioinformatics.com.cn | Bioinformatics.com.cn | Plataforma en línea; acceso en 2026 | Plataforma de visualización y análisis GO/KEGG. |
| Línea celular Caco-2 | ATCC | HTB-37 | Línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano utilizada para el modelo de lesión epitelial. |
| Kit de conteo celular-8 | GLPBio | GK10001 | Ensayo de viabilidad celular medido a 450 nm. |
| CIBERSORT con firma LM22 | Desarrolladores de CIBERSORT | LM22 | Desconvolución de 22 fracciones de células inmunitarias. |
| ChEA3 | Laboratorio Ma'ayan | Plataforma en línea; acceso en 2026 | Enriquecimiento de factores de transcripción y predicción de redes reguladoras. |
| Incubadora de CO2 | No registrado | N/A | Incubadora humedecida utilizada para cultivo a 37 °C y 5 % de CO2. |
| Sonda fluorescente para Cu2+ | BIOFOUNT | CAS 98907-26-7 | Detección de fluorescencia intracelular de Cu2+ . |
| Cytoscape con CytoHubba | Consortium Cytoscape | Versión no registrada | Visualización de interacciones proteína-proteína y clasificación de nodos centrales. |
| Medio de Eagle modificado de Dulbecco | Gibco | 11965092 | Medio de cultivo para células Caco-2. |
| Dietilsulfóxido | No registrado | N/A | Control vehicular. |
| Suero bovino fetal | No registrado | N/A | Suplemento del medio al 10 %. |
| Kit de ensayo para Fe2+ | Abcam | ab83366 | Medición de Fe2+ intracelular. |
| FerrDB | Desarrolladores de FerrDB | Base de datos en línea; acceso en 2026 | Fuente de genes relacionados con la ferroptosis. |
| Ferrostatina-1 | Sigma-Aldrich | SML0583 | Inhibidor de la ferroptosis; concentración final de 4 µM. |
| Harmony | Broad Institute/comunidad | Versión no registrada | Corrección de lotes en análisis de célula individual. |
| Microscopio invertido de fluorescencia | Olympus | IX71 | Imagen de fluorescencia de Cu2+ con excitación/emisión a 510/578 nm. |
| Lipopolisacárido | No registrado | N/A | Estímulo de lesión inflamatoria a 1 µg/mL durante 24 h. |
| Kit de ensayo de malondialdehído | Beyotime Institute of Biotechnology | S0131S | Medición de peroxidación lipídica. |
| Lector de microplacas | No registrado | N/A | Medición de absorbancia a 450 nm. |
| Monocle | Bioconductor/comunidad | Versión 2 | Análisis de seudotiempo en células individuales. |
| Base de datos de firmas moleculares | Broad Institute | c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs | Conjunto de genes de referencia para GSEA. |
| NetworkAnalyst | Desarrolladores de NetworkAnalyst | Plataforma en línea; acceso en 2026 | Integración de redes de factores de transcripción y de miARN. |
| Penicilina–estreptomicina | No registrado | N/A | 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. |
| R | Foundation R para computación estadística | Versión no registrada | Entorno de análisis bioinformático. |
| Conjunto de paquetes R | CRAN/Bioconductor | Versiones de paquetes no registradas | Flujos de trabajo con limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC y rms. |
| Sistema de PCR en tiempo real | No registrado | N/A | Instrumento de RT-qPCR con SYBR Green. |
| Kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid | Thermo Fisher Scientific | K1622 | Síntesis de ADNc de primera cadena a partir de 1 µg de ARN. |
| Sangerbox | Desarrolladores de Sangerbox | 3.0 | Normalización y corrección de lotes con ComBat. |
| Seurat | Satija Lab/comunidad | Versión 4 | Control de calidad, normalización, agrupamiento y visualización en células individuales. |
| Software de análisis estadístico | No registrado | N/A | Análisis estadístico de los experimentos originales con células. |
| STRING | Consortium STRING | Base de datos en línea; acceso en 2026 | Construcción de red de interacciones proteína–proteína. |
| Reactivos de PCR en tiempo real con SYBR Green | Takara | RR820A | PCR cuantitativa en tiempo real. |
| TarBase | DIANA Tools | 9.0 | Interacciones miARN–gen respaldadas experimentalmente. |
| Tetratiomolibdato | Sigma-Aldrich | 323446 | Cheleador de cobre; concentración final de 40 µM. |
| Reactivo TRIzol | Takara | 9108 | Extracción de ARN total. |
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