Un protocolo basado en insertos para cultivo celular para la construcción de un modelo simplificado in vitro de barrera sangre-tumor multicelular en metástasis cerebral del cáncer de mama

Resumen

Este estudio establece un modelo simplificado in vitro de barrera sangre-tumor (BTB) multicelular que combina el cultivo celular en co-cultivo Transwell y esferoides tumorales tridimensionales, proporcionando una plataforma fisiológicamente relevante para estudiar la metástasis cerebral del cáncer de mama y seleccionar terapias dirigidas.

Resumen

Los tratamientos efectivos para las metástasis cerebrales del cáncer de mama (BCBM) siguen siendo limitados, principalmente porque la barrera hemato-tumoral (BTB) restringe la entrada de muchos agentes quimioterapéuticos y dirigidos a las lesiones metastásicas dentro del sistema nervioso central. Para modelar in vitro características seleccionadas de este microentorno complejo, este estudio presenta un protocolo estandarizado para construir un modelo tridimensional simplificado de la BTB multicelular. El método comprende tres pasos principales. Primero, se construye un compartimento de la barrera hematoencefálica (BBB) utilizando insertos para cultivo celular con un tamaño de poro de 0,4 μm. Las células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (HBMECs) se siembran en el lado basal de la membrana porosa, y un día después, los astrocitos humanos (HA) y las células microgliales humanas HMC3 (HMC3) se siembran en el lado apical. Utilizando las células SK-BR-3 como ejemplo, las células de cáncer de mama se cultivan mediante el método de la gota colgante para formar esferoides tumorales tridimensionales uniformes y de forma regular tras 3 días de cultivo. Luego, los esferoides se transfieren al lado apical de una membrana porosa recubierta con matriz de membrana basal, lo que proporciona una separación física permitiendo al mismo tiempo la comunicación química entre las células de barrera y los esferoides tumorales durante el cultivo conjunto. Esta plataforma permite un control preciso de la cronología experimental y produce cambios morfológicos y en marcadores astrocíticos coherentes con una respuesta reactiva peritumoral, al tiempo que permite evaluar la integridad de la barrera endotelial y la permeabilidad paracelular.

Introducción

La metástasis cerebral es una complicación común en las etapas avanzadas de diversos tumores sólidos malignos, incluyendo el cáncer de mama y el cáncer de pulmón^1,2. Su pronóstico es extremadamente desfavorable y las opciones de tratamiento son limitadas^1,2. En el sistema nervioso central sano, la barrera hematoencefálica (BHE) es una interfaz altamente especializada y dinámica formada principalmente por células endoteliales microvasculares cerebrales estrechamente conectadas, mientras que su integridad y función se ven sostenidas por la membrana basal vascular e interacciones coordinadas con pericitos, astrocitos, neuronas, microglía, células de la línea oligodendrocítica y otros componentes de la unidad neurovascular³. A través de uniones estrechas entre las células endoteliales y con la ayuda de células gliales periféricas, restringe estrictamente la entrada de sustancias exógenas al sistema nervioso central⁴. Una vez que las células de cáncer de mama se han diseminado y establecido en el cerebro, las lesiones metastásicas cerebrales se expanden, aumenta la hipoxia local, se intensifican las señales inflamatorias y la unidad neurovascular (UNV) se remodela, reconstruyendo progresivamente la barrera sangre-tumor (BST)⁵. Aunque la permeabilidad local de la BST es mayor que la de la BHE, las diferencias en la permeabilidad frente a moléculas de distintos tamaños, junto con una perfusión sanguínea desigual, provocan una pobre acumulación de fármacos en los tumores cerebrales⁶. Por lo tanto, comprender la biología de la BST y desarrollar estrategias de administración capaces de atravesar esta barrera se han convertido en prioridades importantes en neuro-oncología.

Hasta la fecha, las características y los mecanismos de transformación de la BHE han sido solo parcialmente descritos, y las opciones terapéuticas eficaces para la metástasis cerebral en cáncer de mama (BCBM) siguen siendo limitadas en la práctica clínica. Uno de los desafíos es la escasa disponibilidad de muestras clínicas derivadas de metástasis cerebrales, junto con la limitada disponibilidad y la caracterización funcional incompleta de los modelos existentes de la BHE. Los modelos animales in vivo, particularmente los modelos de ratón^7,8, siguen siendo ampliamente utilizados en la investigación de la BHE. Sin embargo, estos modelos presentan limitaciones, como las diferencias entre especies, el bajo rendimiento y las dificultades para la estandarización y la reproducibilidad, lo que puede obstaculizar los estudios mecanicistas y el desarrollo de fármacos^9,10. Además, los modelos in vitro actuales de la BHE comúnmente utilizan cultivos en co-cultivo de células tumorales y células asociadas a la barrera en sistemas de insertos para cultivo celular o en chips microfluídicos.

Estos modelos existentes a menudo carecen de la estructura tridimensional de los tumores y, por lo tanto, tienen limitaciones para reproducir características espaciales relevantes para las metástasis cerebrales, incluyendo gradientes de densidad celular, regiones hipóxicas/necróticas, difusión molecular restringida y distribución celular heterogénea^11,12. Para introducir un componente tumoral tridimensional definido, empleamos un modelo de esferoides que es sencillo, reproducible y compatible con aplicaciones de cribado. Sobre esta base, desarrollamos un compartimento multicelular humano simplificado de la BHE in vitro e integramos esferoides tumorales para construir un modelo simplificado de la BTH (Figura 1A) que reproduce características estructurales y celulares seleccionadas del microambiente metastásico cerebral. El modelo es fácil de operar, permite mediciones cuantitativas de la barrera y posibilita la visualización de cambios espaciales en las poblaciones astrocitarias y microgliales asociadas al tumor.

Este protocolo detalla los pasos críticos desde la preparación y siembra de células hasta la generación de esferoides tumorales, la superposición con matriz de membrana basal, la preparación de controles apareados y la transferencia de esferoides, proporcionando un flujo de trabajo estandarizado para construir este modelo simplificado de BHE.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital de la Universidad Médica de Dalian (Número de aprobación: JW2026-019-01). Todos los datos relacionados con los pacientes se anonimizaron antes del análisis. Las herramientas de investigación utilizadas en este protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación del modelo de barrera hematoencefálica (BHE)

1. Requisitos generales
   1. Realice todas las operaciones en una cabina de flujo laminar estéril y siga estrictamente la técnica aséptica.
   2. Utilice insertos para cultivo celular de 12 pocillos con membranas de PET que tengan un tamaño de poro de 0,4 µm y un área efectiva de membrana de 1,12 cm².
2. Recubrimiento con colágeno tipo I
   1. Añada 1–2 mL de solución de recubrimiento con colágeno tipo I a cada frasco o placa de cultivo y distribúyala uniformemente sobre la superficie inferior.
   2. Añada 200 µL y 800 µL de solución de recubrimiento al lado apical y basal, respectivamente, de cada inserto para cultivo celular. Agite suavemente la placa para asegurar un contacto completo de la membrana, evitando la formación de burbujas debajo de la membrana.
   3. Incube los recipientes e insertos recubiertos a 37 °C con 5 % de CO₂ durante 1 h. Retire la solución de recubrimiento y lave dos veces con PBS.
   4. Mantenga los frascos, placas y insertos para cultivo celular recubiertos a 37 °C con 5 % de CO₂ y úselos dentro de los 3 días. Enjuague una vez con PBS inmediatamente antes de su uso.
   5. Recubra los recipientes de cultivo de HBMEC y HA con colágeno tipo I antes del cultivo celular. Las células HMC3-RFP no requieren recubrimiento con colágeno tipo I.
3. Preparación de la solución de recubrimiento con colágeno tipo I
   1. Disuelva 60 µL de ácido acético glacial en 50 mL de agua ultrapura y enfríe la solución a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: El ácido acético glacial es corrosivo. Manipúlelo en una campana extractora de gases químicos utilizando equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, bata de laboratorio y protección ocular. Deseche los residuos de ácido acético según los procedimientos institucionales para residuos químicos.
   2. Filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 µm, añada 500 µL de colágeno tipo I (9,45 mg/mL), mezcle bien y almacene a 4 °C hasta su uso.
4. Preparación celular
   1. Cultive las células HBMEC, HA y HMC3-RFP hasta que alcancen una confluencia del 80 % al 90 % antes de su uso.
      PRECAUCIÓN: Las líneas celulares derivadas de humanos y los materiales asociados con tejidos humanos deben manipularse como potencialmente biopeligrosos. Siga los procedimientos institucionales de bioseguridad y use equipo de protección personal adecuado. Deseche los materiales de cultivo contaminados como residuos biopeligrosos.
5. Siembra de HBMEC en el día 0
   1. Desprenda las HBMEC utilizando una proteasa recombinante tipo tripsina (1×), centrifugue las células y re suspenda el sedimento para obtener una suspensión de células individuales.
   2. Determine la densidad celular y ajuste la suspensión de modo que 120 µL contenga 1,5 × 10⁵ HBMEC para cada inserto de cultivo celular.
   3. Invierta la placa y dispense 120 µL de la suspensión de HBMEC sobre el lado basal de la membrana porosa. Evite la formación de burbujas de aire durante la siembra (Figura 1B).
   4. Cubra los pocillos, mantenga la placa de 12 pocillos invertida e incube durante 6 h.
   5. Coloque la placa en posición vertical, añada 200 µL y 800 µL de medio de cultivo completo ECM a las cámaras superior e inferior, respectivamente, y continúe la incubación.
6. Siembra de células HA y HMC3-RFP en el día 1
   1. Desprenda las células HA con proteasa recombinante tipo tripsina (1×) y las células HMC3-RFP con tripsina-EDTA al 0,25 %. Centrifugue y re suspenda los dos tipos celulares por separado.
   2. Determine las densidades celulares y combine 2,0 × 10⁵ células HA con 4,0 × 10³ células HMC3-RFP para cada inserto de cultivo celular.
   3. Centrifugue las células mezcladas, deseche el sobrenadante y re suspenda el sedimento en 200 µL de medio completo mixto (medio completo AM : medio completo MEM = 5:1). Añada la suspensión de 200 µL uniformemente a la cámara superior, evitando la formación de burbujas de aire (Figura 1B). 
   4. Añada 800 µL de medio de cultivo completo ECM a la cámara inferior, mantenga la placa en posición vertical en la incubadora y cambie el medio diariamente.

2. Preparación de esferoides tumorales tridimensionales

1. Preparación de células SK-BR-3
   1. Cultive las células SK-BR-3 hasta que alcancen una confluencia del 80%–90% antes de proceder a la formación de esferoides.
   2. Desprenda las células SK-BR-3 con tripsina-EDTA al 0,25%, centrifugue las células y re suspenda el precipitado para obtener una suspensión de células individuales.
   3. Determine la densidad celular y ajuste la suspensión para que cada gota de 30 µL contenga 2 × 10⁴ células.
2. Formación de gotas colgantes
   1. Invierta una placa de cultivo celular de 10 cm y dispense gotas de 30 µL de la suspensión celular sobre la tapa de la placa. Coloque aproximadamente 20 gotas por tapa.
   2. Recoloque la base de la placa e invierta rápidamente la placa ensamblada (Figura 1B). Prepare nuevamente las gotas si se deslizan desde la tapa o pierden su forma.
3. Cultivo de esferoides
   1. Añada 5 mL de PBS a la placa y colóquela en el incubador. No perturbe la placa durante los primeros 2 días de cultivo.
   2. Para cultivos a largo plazo, añada 10 µL de medio de cultivo completo a cada gota cada 2 días.
   3. Añada el medio desde el borde de cada gota utilizando la punta de la pipeta y evite el contacto con los esferoides tumorales.

3. Preparación del modelo simplificado de la barrera hemato-tumoral (BHT)

1. Preparación de materiales
   1. Recubrir los recipientes para cultivo celular y los insertos para cultivo celular (membrana de PET, tamaño de poro de 0,4 µm) con colágeno tipo I y mantenerlos en el incubador hasta su uso.
   2. Cortar los extremos de las puntas de pipeta de 200 µL con tijeras y esterilizar las puntas modificadas mediante autoclave.
2. Establecimiento del modelo
   1. Día 0–1: Construir el modelo de BBB y preparar esferoides tumorales como se describió anteriormente.
   2. Día 2: Descongelar la matriz de membrana basal sobre hielo. Retirar el medio de cultivo de ambas cámaras y lavar ambas cámaras con PBS.
   3. Añadir 800 µL de medio completo de ECM a la cámara inferior y 30 µL de matriz de membrana basal descongelada a la cámara superior. Distribuir uniformemente la matriz de membrana basal sobre la membrana porosa.
   4. Incubar la placa a 37 °C durante 20 min, luego añadir lentamente 200 µL de medio completo mixto (AM:MEM = 5:1) por la pared lateral de la cámara superior. Devolver la placa al incubador (Figura 1B).
   5. Mantener la matriz de membrana basal sobre hielo y trabajar rápidamente. Utilizar una punta de pipeta previamente enfriada al aspirar la matriz de membrana basal.
3. Control emparejado sin esferoides/matriz de membrana basal
   1. Preparar insertos de control utilizando el mismo volumen de matriz de membrana basal (30 µL), composición del medio, pasos de lavado, tiempos de incubación y programa diario de cambio de medio que en la condición de BTB, pero omitir la transferencia de esferoides tumorales el día 3. Así, el control emparejado difiere de la condición de BTB únicamente en la presencia o ausencia de esferoides tumorales, y no en la exposición o manipulación de la matriz de membrana basal.
4. Transferencia de esferoides tumorales el día 3
   1. Examinar los esferoides tumorales bajo un microscopio invertido y confirmar que tengan forma regular y hayan formado esferoides compactos.
   2. Aspirar los esferoides tumorales hacia tubos microcéntrifugos de 1,5 mL utilizando una punta de pipeta cortada y lavarlos dos veces con PBS. Manipular los esferoides con cuidado para evitar su desintegración.
   3. Reemplazar el medio en la cámara inferior y retirar el medio de cultivo de la cámara superior.
   4. Transferir cinco esferoides tumorales a cada cámara superior utilizando una punta de pipeta cortada.
   5. Añadir 200 µL de medio de cultivo completo mixto (AM:MEM = 5:1) a la cámara superior y agitar suavemente la placa para evitar que los esferoides entren en contacto o se fusionen (Figura 1B).
   6. Mantener la placa en el incubador y cambiar el medio diariamente.
5. Recolección de muestras
   1. Recoger las muestras el día 7 para experimentos posteriores, o ajustar el momento de recolección según los requisitos experimentales.

4. Medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER)

1. Preparación de los electrodos
   1. Cargue completamente el medidor de TER e introduzca los electrodos tipo palillos en etanol al 75 % durante 15 min.
      PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable. Mantenga el etanol al 75 % alejado de llamas abiertas, chispas y otras fuentes de ignición, y manipúlelo de acuerdo con los procedimientos institucionales de seguridad química.
   2. Exponga la cabina de seguridad biológica a luz ultravioleta durante 30 min para esterilizarla. No exponga directamente los electrodos a la irradiación ultravioleta.
   3. Retire los electrodos del etanol, equilíbrelos en PBS durante 15 min y séquelos en condiciones estériles.
2. Equilibración de los insertos de cultivo celular
   1. Retire la placa de 12 pocillos que contiene los insertos de cultivo celular del incubador y déjela reposar a temperatura ambiente durante 15 min antes de la medición.
3. Medición de la resistencia
   1. Prepare un inserto de cultivo celular sin células con 200 µL y 800 µL del mismo medio de cultivo completo en las cámaras superior e inferior, respectivamente.
   2. Introduzca suavemente los electrodos tipo palillos a lo largo del borde del inserto de cultivo celular sin tocar la membrana porosa ni el fondo del pocillo.
   3. Lave los electrodos con PBS y séquelos. Mida cada inserto que contenga células utilizando el mismo procedimiento y registre la resistencia como R₍medida₎.
4. Cálculo del TER
   1. Calcule el valor de la resistencia eléctrica transepitelial (TER) utilizando la siguiente fórmula¹³:
      TER (Ω·cm²) = (R₍medida₎ − R₍blanco₎ × S    (1.1)
   2. R₍medida₎ es la resistencia a través de la membrana porosa que contiene la capa celular (Ω); R₍blanco₎ es la resistencia a través de una membrana porosa sin células (Ω); y S es el área efectiva de la membrana (cm²). El área efectiva de la membrana utilizada en este estudio es 1.12 cm².

5. Ensayo de permeabilidad paracelular con dextrano-FITC (dirección apical a basal)

1. Preparación de la dextrana marcada con FITC
   1. Prepare una solución de trabajo de dextrana marcada con FITC (4 kDa) a 2 mg/mL antes del experimento y proteja la solución de la luz.
2. Interpretación del sentido del ensayo
   1. Interprete el presente ensayo como una lectura de la integridad de la barrera paracelular de apical a basal, ya que las HBMEC se adhieren a la cara basal de la membrana, mientras que los astrocitos, microglía y esferoides tumorales ocupan el compartimento apical.
      NOTA: Para estudios destinados a imitar la exposición sistémica, introduzca la dextrana marcada con FITC o un compuesto de prueba en el compartimento inferior/basal orientado hacia las células endoteliales y recoja muestras del compartimento superior/apical utilizando un esquema de muestreo validado por separado y el cálculo de Papp.
3. Lavado y equilibración
   1. Retire todo el medio de cultivo de ambas cámaras. Añada 400 µL y 1 mL de medio basal DMEM sin glucosa precalentado al compartimento superior e inferior, respectivamente, lave suavemente una vez y deseche el medio.
   2. Añada 400 µL y 1 mL de medio basal DMEM sin glucosa fresco y precalentado al compartimento superior e inferior, respectivamente. Equilibre a 37 °C con 5 % de CO₂ durante 15 min y luego aspire todo el líquido.
4. Medición de la permeabilidad
   1. Añada 200 µL de la solución de trabajo de dextrana marcada con FITC a 2 mg/mL al lado apical y 800 µL de medio basal DMEM sin glucosa al compartimento inferior. Incube a 37 °C con 5 % de CO₂ durante 30 min en la oscuridad.
   2. Recoja 100 µL de medio del compartimento inferior de cada inserto experimental después de 30 min. Transfiera tres alícuotas de cada inserto a una placa negra de 96 pocillos y proteja la placa de la luz.
5. Preparación de la curva patrón de dextrana marcada con FITC
   1. Prepare patrones de dextrana marcada con FITC a concentraciones de 0, 0,5, 1,0 y 1,5 mg/mL. Añada 100 µL de cada patrón a una placa negra de 96 pocillos por triplicado y proteja la placa de la luz.
6. Medición de la fluorescencia y cálculo de Papp
   1. Mida la intensidad de fluorescencia utilizando un lector multifuncional de microplacas con una longitud de onda de excitación de 492 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm. Registre los datos y calcule el coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) utilizando las siguientes ecuaciones¹⁴.
   2. Primero, realice un ajuste lineal de las concentraciones de las soluciones patrón de dextrana marcada con FITC (C) frente a las intensidades de fluorescencia correspondientes (A) para generar una curva patrón:
       A = kC + b    (1.2)
   3. Aquí, k representa la pendiente de la curva patrón, y b representa la ordenada en el origen.
   4. A continuación, sustituya la intensidad de fluorescencia de la muestra (A_t) medida en el tiempo t en la ecuación de la curva patrón para obtener la concentración de dextrana marcada con FITC (C_a) en el lado basolateral en el tiempo t. Luego sustituya C_a en la siguiente fórmula para calcular Papp (cm/s):
   5. Papp = (C_a × V_a)/(t × S × C₀)  (1.3)
   6. Aquí, V_a es el volumen total del compartimento basolateral (mL); t es el tiempo de permeación (s); S es el área efectiva de la membrana porosa (cm²); y C₀ es la concentración inicial en el lado apical.

6. Tinción por inmunofluorescencia

1. Fijación, lavado y permeabilización
   1. Retire todo el medio de cultivo de los insertos de cultivo celular, lave dos veces con PBS y aspire todo el líquido residual.
   2. Añada 200 µL y 800 µL de paraformaldehído al 4% a las cámaras superior e inferior, respectivamente, y fije las células durante toda la noche a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es peligroso y debe manipularse en una campana extractora de gases químicos certificada, utilizando guantes, bata de laboratorio y protección ocular. Recoja los residuos de paraformaldehído por separado y deseche según los procedimientos institucionales para residuos peligrosos.
   3. Retire el paraformaldehído y añada 200 µL y 800 µL de PBS a las cámaras superior e inferior, respectivamente. Lave en agitador tres veces durante 5 min cada vez.
   4. Añada 200 µL y 800 µL de surfactante no iónico al 0,5% a las cámaras superior e inferior, respectivamente, y permeabilice durante 10 min a temperatura ambiente.
   5. Retire la solución de surfactante no iónico y lave con PBS tres veces durante 5 min cada vez.
2. Resecado de la membrana y bloqueo
   1. Dé la vuelta a los insertos de cultivo celular sobre la tapa de una placa de cultivo, reseque cuidadosamente las membranas por el borde con un escalpelo y transfiéralas a una placa de 24 pocillos.
   2. Añada 200 µL de PBS con BSA al 3% para cubrir cada membrana y bloquee durante 90 min a temperatura ambiente. Si es necesario, corte las membranas en trozos más pequeños para tinción por separado.
3. Incubación con anticuerpo primario
   1. Diluya los anticuerpos primarios con diluyente estándar para anticuerpos y añada suficiente solución para cubrir completamente cada membrana.
   2. Añada agua ultrapura a los pocillos vacíos circundantes para reducir la evaporación e incube las muestras durante toda la noche a 4 °C. Utilice muestras sin anticuerpo primario específico como controles negativos.
   3. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpo primario y lave las membranas con 1 mL de PBS en agitador tres veces durante 10 min cada vez.
4. Tinción con anticuerpo secundario y DAPI
   1. Diluya los anticuerpos secundarios con diluyente para anticuerpos de fluorescencia en condiciones protegidas de la luz, cubra completamente las membranas e incube durante 90 min a temperatura ambiente. Lave con PBS tres veces durante 10 min cada vez, protegiendo de la luz.
   2. Añada la solución de tinción con DAPI lista para usar para cubrir las membranas e incube durante 15 min a temperatura ambiente. Lave con PBS tres veces durante 10 min cada vez, protegiendo de la luz.
5. Clarificación, montaje e imagen
   1. Añada un volumen adecuado de reactivo de clarificación para cultivo celular 3D para cubrir las membranas e incube durante 15 min a temperatura ambiente en condiciones protegidas de la luz.
   2. Transfiera las membranas sobre portaobjetos con pinzas oftálmicas, añada medio de montaje antifade y monte las muestras en condiciones protegidas de la luz. Observe e image las muestras utilizando un microscopio confocal de barrido láser.

7. Informe estadístico

1. Para las comparaciones funcionales, n = 3 indica tres réplicas biológicas independientes por condición, y cada réplica biológica se trató como la unidad experimental. Puntos de datos individuales para las tres réplicas biológicas. Los datos se presentan como media ± DE. Realice las comparaciones utilizando pruebas t de Student no pareadas de dos colas, con valores exactos de t y p.

Figura 1: Ilustración esquemática y flujo de trabajo de la construcción del modelo de BHE. (A) Las HBMEC se sembraron en el lado basal de la membrana porosa del inserto para cultivo celular, mientras que las células HA y las células HMC3-RFP se distribuyeron en el lado apical. Se utilizó una capa de matriz de membrana basal para separar los esferoides tumorales del compartimento de células de barrera. Para el control emparejado sin esferoides, se empleó el mismo recubrimiento de matriz de membrana basal y el mismo manejo, pero se omitieron los esferoides tumorales. (B) Los números circulares en la parte superior indican los días correspondientes de cultivo. La construcción de la BHE y la preparación de los esferoides tumorales se realizaron simultáneamente. Después de añadir una capa de matriz de membrana basal a la superficie superior del inserto para cultivo celular, los esferoides tumorales se transfirieron a la cámara superior utilizando una punta de pipeta cortada. Luego, el modelo de BHE se mantuvo en cultivo durante hasta 1 semana antes de la recolección de muestras. Normalmente, las muestras se pueden recolectar el día 7 para experimentos posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

In the matched spheroid-free BBB control overlaid with the same amount of basement membrane matrix, HMC3-RFP signals were distributed relatively broadly across the apical cell layer (Figure 2). In the BTB condition, endpoint images showed HMC3-RFP signals mainly in regions not covered by tumor spheroids, with reduced signal beneath the spheroids and in immediately adjacent regions (Figure 2). These data demonstrate a spatial association between the presence of tumor spheroids and the endpoint distribution of HMC3-RFP cells. Because baseline HMC3-RFP distribution before spheroid introduction and longitudinal cell tracking were not assessed, the present data do not establish active microglial migration, repulsion, or tumor-driven exclusion.

Astrocytes also showed differences in marker signal and morphology in the BTB condition (Figure 2). Compared with the matched spheroid-free/basement membrane matrix control, representative images suggested stronger GFAP fluorescence in both peri-spheroid and distal regions. Astrocytes at the spheroid margin displayed enlarged cell bodies, thicker and elongated processes, and processes oriented toward the spheroid edge (Figure 2). These endpoint features are consistent with a reactive astrocyte-like phenotype, but they do not by themselves establish a specific reactive-astrogliosis program or its underlying mechanism. Morphologically similar peritumoral astrocytic structures were observed in human breast cancer brain-metastasis tissue sections, where immunofluorescence staining showed features consistent with peritumoral reactive astrogliosis (Figure 3A). To further characterize AQP4-associated astrocytic features, AQP4 immunofluorescence staining was performed in the matched spheroid-free BBB model and in the distal and peri-spheroid regions of the BTB model (Figure 3B). Representative images of the BBB model, the distal region of the BTB model, and the peri-spheroid region adjacent to the tumor spheroids are shown in the first, second, and third rows, respectively (Figure 3B). Within the BTB model, peri-spheroid astrocytes showed morphological differences compared with distal astrocytes. Taken together, the GFAP/AQP4 and morphological observations support tumor-spheroid-associated astrocytic remodeling within this model; the resemblance to patient tissue should be interpreted as phenotypic similarity rather than evidence that the model fully reproduces human peritumoral astrogliosis.

To evaluate tumor-spheroid-associated changes in endothelial junctional organization, we performed immunofluorescence staining of the tight-junction protein ZO-1 in the basal HBMEC layer of the simplified BBB and BTB models, using matched spheroid-free and spheroid-containing conditions overlaid with equal amounts of basement membrane matrix. Confocal imaging was focused on the region corresponding to the tumor spheroids (Figure 4A). In the matched spheroid-free control, ZO-1 signals between HBMECs showed a relatively continuous, linear distribution with clearly defined intercellular borders. In the BTB condition, ZO-1 fluorescence in regions corresponding to tumor spheroids appeared sparser, with focal disruption and discontinuity (Figure 4A). These endpoint images are consistent with local loss of tight-junction organization. However, without additional BTB-specific molecular markers or mechanistic perturbation experiments, the present data cannot distinguish specific BTB remodeling from nonspecific tumor-associated endothelial injury or barrier disruption.

At the functional level, TEER measurement and FITC-dextran permeability assays were performed simultaneously on Day 7 in the matched spheroid-free/basement membrane matrix control and the spheroid-containing BTB condition (Figure 4B). Individual values from all three independent biological replicates are displayed as scatter points in Figure 4B, with summary data presented as mean ± SD. The TEER value of the BTB condition (106.0 ± 9.5255 Ω·cm², n = 3 independent biological replicates) was lower than that of the matched control (168.0 ± 5.1325 Ω·cm², n = 3 independent biological replicates). Consistently, the apparent permeability coefficient (Papp) measured in the apical-to-basal FITC-dextran assay was higher in the BTB condition (5.851 ± 1.2080 × 10⁻³ cm/s, n = 3 independent biological replicates) than in the matched control (2.656 ± 1.0937 × 10⁻³ cm/s, n = 3 independent biological replicates). Two-tailed unpaired Student’s t-tests showed statistically significant differences [TEER: t(4) = 9.920, p = 0.0006; Papp: t(4) = 3.395, p = 0.0274] (Figure 4B). Within this experimental configuration, the concordant reduction in electrical resistance and increase in FITC-dextran permeability demonstrate reduced barrier integrity in the presence of tumor spheroids. These measurements alone do not establish a specific BBB-to-BTB remodeling mechanism, and the apical-to-basal FITC-dextran assay should not be interpreted as a physiological blood-to-tumor drug-delivery experiment.

Figure 2: Immunofluorescence staining in the BTB model. Representative immunofluorescence images of Pan-CK and GFAP staining in the apical cell layers of the matched spheroid-free BBB control and BTB model, both overlaid with equal amounts of basement membrane matrix, with the HMC3-RFP signal also shown. The first column presents schematic illustrations, and the black square indicates the viewing area for confocal imaging. The first row shows the matched control without a spheroid (No Spheroid); the second row shows regions distal to the tumor spheroids in the BTB model (Distal Region); and the third row shows regions adjacent to the tumor spheroids in the BTB model (Peri-spheroid Region). Arrows indicate regions showing astrocytic morphological features consistent with a reactive phenotype. Cell nuclei were counterstained with DAPI (blue), tumor cells were labeled with pan-cytokeratin (Pan-CK; green), RFP-expressing microglia are shown in red, and GFAP staining is shown in cyan. Scale bar = 100 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 3: Immunofluorescence staining reveals morphological features consistent with peritumoral reactive astrogliosis in the BTB model. (A) Brain tissue sections from patients with breast cancer brain metastases were subjected to H&E staining. Astrocytic structures at the interface between tumor tissue and brain parenchyma or blood vessels showed morphological features consistent with peritumoral reactive astrogliosis. Black arrows indicate representative regions. Immunofluorescence staining further showed astrocytic morphological features consistent with a reactive phenotype; the red arrow highlights a representative region. Scale bars: 50 µm for the H&E-stained images in the first row, 10 µm for the H&E-stained images in the second row, and 50 µm for the immunofluorescence images in the third row. (B) AQP4 immunofluorescence staining was performed in the matched spheroid-free BBB model and in the distal and peri-spheroid regions of the BTB model. The first row shows representative images of the BBB model, the second row shows representative images of the distal region of the BTB model, and the third row shows representative images of the peri-spheroid region adjacent to the tumor spheroids. Arrows indicate astrocytic morphological changes in the peri-spheroid region. Nuclei were stained with DAPI and are shown in blue, while AQP4 is shown in yellow. Scale bar = 100 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 4: Functional characterization of the BTB model. (A) Immunofluorescence staining of ZO-1 in the basal endothelial cell layer of the BBB and BTB models overlaid with an equal amount of basement membrane matrix. The first column shows schematic diagrams, with black boxes indicating the regions selected for confocal imaging. The first row shows representative images of the basal cell layer in the BBB model without tumor spheroids (No Spheroid), and the second row shows representative images of the basal cell layer in the BTB model with tumor spheroids (With Spheroid). The red arrow highlights a region with sparse ZO-1 fluorescence and focal discontinuities. Nuclei were stained with DAPI and are shown in blue, while ZO-1 is shown in green. Scale bar = 50 µm. (B) TEER values and FITC-dextran (4 kDa) apparent permeability coefficients (Papp) of the matched spheroid-free BBB control (No Spheroid) and the BTB condition (With Spheroid), both overlaid with an equal amount of basement membrane matrix. n = 3 independent biological replicates per condition. Individual data points for all three biological replicates are shown, and summary data are presented as mean ± SD. FITC-dextran Papp values were obtained in the apical-to-basal direction. Please click here to view a larger version of this figure.

Discusión

Se utilizó un modelo de esferoide para introducir un componente tridimensional del tumor que proporciona organización espacial y restricciones de difusión que no se capturan mediante el cultivo convencional de células tumorales en dos dimensiones. Su simplicidad y reproducibilidad también lo hacen compatible con protocolos orientados al cribado. Los esferoides se combinaron con un compartimento de barrera humana de tres células que contiene células endoteliales microvasculares cerebrales, astrocitos y microglía para construir un modelo in vitro simplificado, multicelular, de la BHE humana. El sistema es fácil de operar, compatible con cultivos en placas de múltiples pocillos y mediciones cuantitativas de la barrera (Figura 1), y permite la visualización de la morfología celular y la distribución espacial mediante tinción de inmunofluorescencia. Los cambios astrocíticos asociados a GFAP/AQP4 observados y su semejanza morfológica con los astrocitos peritumorales en tejido de metástasis cerebral de cáncer de mama respaldan la relevancia del modelo para estudiar interacciones seleccionadas entre tumor, glía y endotelio⁵, aunque estos hallazgos no establecen equivalencia con la BHE humana completa.

Se utilizó el método de gota colgante para generar esferoides tumorales, que se cultivaron en co-cultivo con células endoteliales microvasculares cerebrales humanas, astrocitos humanos y microglia humana para establecer una plataforma in vitro humana simplificada del BTB multicelular. En las condiciones evaluadas, los esferoides tumorales se asociaron con una reducción del TEER, un aumento de la permeabilidad de dextrano-FITC de apical a basal, una organización alterada de ZO-1 y cambios en el marcador y la morfología astrocitaria. Las mediciones de TEER y permeabilidad son métodos establecidos para evaluar la integridad de la barrera en sistemas de barrera in vitro^13,14. Estos hallazgos demuestran un deterioro de la barrera asociado a los esferoides tumorales y una reorganización glial dentro de este sistema definido. Sin embargo, esta plataforma del BTB no establece una transformación completa de BBB a BTB, la migración activa de microglia ni un mecanismo molecular específico de remodelación del BTB. Por lo tanto, la plataforma debe considerarse mejor como un modelo experimental manejable para la generación de hipótesis y estudios controlados de interacciones tumorales-gliales-endotheliales, requiriéndose ensayos de transporte con dirección adecuada al modelar la administración sistémica de fármacos.

Este modelo simplificado tiene varias limitaciones importantes. En primer lugar, no contiene la unidad neurovascular completa ni el microambiente cerebro-tumor. No están presentes los pericitos, las neuronas, una membrana basal/extramatriz extracelular fisiológicamente completa ni las células inmunitarias circulantes. Los pericitos son reguladores importantes de la función neurovascular y de la barrera^15,16,17, pero su incorporación en un modelo humano in vitro estandarizado sigue siendo un desafío debido a la disponibilidad limitada y a la variabilidad entre lotes de pericitos humanos primarios. Por lo tanto, este modelo no debe describirse como una BHE humana completa, sino más bien como una plataforma experimental simplificada. En segundo lugar, el presente estudio utiliza SK-BR-3 como una única línea celular de cáncer de mama. Por consiguiente, los fenotipos observados no pueden generalizarse a toda la biología de las MCH. Será importante validar los resultados con subtipos adicionales de cáncer de mama, modelos con tropismo cerebral y esferoides u organoides de MCH derivados de pacientes para establecer la generalización y la relevancia clínica. En tercer lugar, los datos actuales de HMC3-RFP son observaciones de punto final y no permiten determinar si el patrón espacial se debe a una migración activa, a una supervivencia diferencial o a una distribución preexistente. Sería necesario realizar imágenes longitudinales de células vivas para distinguir entre estas posibilidades. En cuarto lugar, los datos de ZO-1, TEER y dextrano-FITC demuestran un deterioro de la barrera, pero no distinguen entre una remodelación específica de la BHE y una lesión endotelial inespecífica; se requieren caracterizaciones moleculares adicionales y controles mecanicistas. En quinto lugar, dado que las HBMEC se siembran en la cara basal de la membrana en esta configuración, el ensayo de dextrano-FITC de apical a basal es una medida de integridad de la barrera, no un ensayo fisiológico de transporte de sangre a tumor. En estudios de administración sistémica, se debería introducir el trazador o fármaco en el compartimento inferior/basal orientado hacia el endotelio y validar el transporte hacia el compartimento tumoral superior/apical. Finalmente, las mediciones funcionales actuales se basaron en tres réplicas biológicas independientes por condición. Aunque este diseño permite distinguir entre replicación biológica y técnica, aumentar el número de réplicas biológicas independientes reforzaría aún más la evaluación de la reproducibilidad. La incorporación de estas mejoras, incluyendo pericitos y material derivado de pacientes, podría aumentar progresivamente la relevancia fisiológica y traslacional de la plataforma.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tripsina-EDTA al 0,25 % (1×) (para desprender células HMC3-RFP)	NCM Biotech	C100C1	Se utiliza para desprender células HMC3-RFP durante la preparación celular.
Tubos centrífugos de 1,5 mL	Jet Biofil	CFT001015	Se utilizan para recoger, lavar y manipular esferoides tumorales.
Placa de cultivo celular de 12 pocillos	Jet Biofil	TCP011012	Se utiliza para alojar insertos de cultivo celular de 12 pocillos durante la construcción del modelo BBB/BTB.
Reactivo de aclarado para cultivo celular 3D	Thermo Fisher	V11326	Se utiliza para aclarar membranas de cultivo celular teñidas antes del montaje e imagen confocal.
Anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 anti-conejo	Proteintech	RGAR002	Anticuerpo secundario fluorescente utilizado para la detección por inmunofluorescencia de anticuerpos primarios de conejo.
Anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 647 anti-ratón	Proteintech	RGAM005	Anticuerpo secundario fluorescente utilizado para la detección por inmunofluorescencia de anticuerpos primarios de ratón.
Diluyente de anticuerpos	Solarbio	A1800	Se utiliza para diluir anticuerpos primarios en tinción por inmunofluorescencia.
Medio de montaje con protección contra el desvanecimiento	Solarbio	S2100	Se utiliza para montar membranas teñidas y reducir el desvanecimiento de la fluorescencia durante la imagen.
Suplemento de crecimiento para astrocitos (AGS)	ScienCell	1852	Suplemento utilizado para el cultivo de astrocitos humanos.
Medio para astrocitos (AM)	ScienCell	1801	Medio de cultivo utilizado para astrocitos humanos y como componente del medio mixto de la cámara superior.
Placa de cultivo celular	Servicebio	CCD-100	Se utiliza para cultivo celular rutinario y preparación de esferoides tumorales por método de gota colgante.
Colágeno tipo I	Corning	354249	Se utiliza para recubrir recipientes de cultivo e insertos de cultivo celular antes de la siembra celular.
Cubreobjetos	Citotest	10212450C	Se utilizan para montaje y preparación para microscopía.
Solución de tinción con DAPI	Servicebio	G1012-10ML	Se utiliza para contratincción nuclear durante la tinción por inmunofluorescencia.
DMEM básico (1×)	Gibco	C11995500BT	Se utiliza como medio basal en el ensayo de permeabilidad con dextrano marcado con FITC.
Suplemento de crecimiento para células endoteliales (ECGS)	ScienCell	1052	Suplemento utilizado para el cultivo de células endoteliales microvasculares cerebrales humanas.
Medio para células endoteliales (ECM)	ScienCell	1001	Medio de cultivo utilizado para HBMEC y para la cámara inferior del modelo BBB/BTB.
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco	A5669701	Suplemento sérico utilizado en medios completos de cultivo celular.
Dextrano marcado con FITC (PM 4.000)	Beyotime	ST2930-50mg	Trazador fluorescente utilizado para evaluar la permeabilidad paracelular y calcular Papp.
Diluyente para anticuerpos fluorescentes	Solarbio	A1840	Se utiliza para diluir anticuerpos secundarios fluorescentes en tinción por inmunofluorescencia.
Ácido acético glacial	Sigma	27225	Se utiliza para preparar la solución de recubrimiento con colágeno tipo I.
HA	Astrocito humano	NA	Componente astrocítico para evaluar respuestas morfológicas y de marcadores asociadas al tumor
HBMEC	Células endoteliales microvasculares cerebrales humanas	NA	Componente de barrera endotelial BBB/BTB
HMC3-RFP	Línea celular microglial humana HMC3 marcada con RFP	NA	Componente microglial para seguimiento por fluorescencia
Matrigel	Corning	354230	Matriz de membrana basal utilizada como recubrimiento para separar esferoides tumorales del compartimento de células de barrera.
Medio completo MEM (con NEAA) (10)	Procell System	PM150410B	Medio utilizado como componente del medio de cultivo mixto de la cámara superior.
Portaobjetos para microscopio	Citotest	188105	Se utilizan para montar membranas teñidas extraídas para imagen confocal.
Anticuerpo anti-GFAP humano de ratón	EMD Millipore	MAB360-25μL	Anticuerpo primario utilizado para detectar GFAP en astrocitos mediante inmunofluorescencia.
Paraformaldehído	Servicebio	G1101-500ML	Se utiliza para fijar células antes de la tinción por inmunofluorescencia.
Polvo de PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Servicebio	G0002-2L	Se utiliza para lavados, equilibrado y pasos de preparación a lo largo del protocolo.
Solución de penicilina-estreptomicina (P/S)	Servicebio	G4003-100ML	Suplemento antibiótico utilizado en medios completos de cultivo celular.
Pipeta	Eppendorf	3123000250	Se utiliza para manipulación de líquidos durante los procedimientos de cultivo celular y ensayos.
Puntas de pipeta	MWM Bio	800201	Se utilizan para manipulación rutinaria de líquidos; se usan puntas modificadas con corte para la transferencia de esferoides tumorales.
Anticuerpo policlonal de conejo anti-PAN-CK humano	MedChemExpress	HY-P81164	Anticuerpo primario utilizado para identificar células tumorales mediante inmunofluorescencia.
Anticuerpo de conejo anti-ZO-1 humano	Proteintech	21773-1-AP	Anticuerpo primario utilizado para evaluar la organización de uniones estrechas endoteliales mediante inmunofluorescencia.
SK-BR-3	Línea celular de cáncer de mama humano	NA	Componente de esferoide tumoral para la construcción de BTB
Inserto para placa de cultivo tisular (membrana PET de 0,4 μm), placas de 12 pocillos	Jet Biofil	TCS016012	Inserto poroso de cultivo celular utilizado para construir el modelo de co-cultivo BBB/BTB.
Medidor de resistencia eléctrica transepitelial (TEER)	Millicell	ERS-2	Se utiliza para medir la resistencia eléctrica a través del inserto de cultivo celular como indicador de integridad de barrera.
TrypLE Express (1×) (para desprender células HBMEC y HA)	Gibco	12605-010	Se utiliza para desprender células HBMEC y HA durante la preparación celular.