No invasivo en 3D de visualización con la Sub-micron resolución mediante sincrotrón de rayos X de la tomografía

Summary

Hemos utilizado sincrotrón de rayos X de tomografía en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) de forma no invasiva producir conjuntos de datos 3D tomográfica con un píxel de resolución de 0.7μm. El uso de software volumen renderizado, lo que permite la reconstrucción de las estructuras internas en su estado natural, sin los artefactos producidos por el corte histológico.

Abstract

Poco se sabe sobre la organización interna de muchos micro-artrópodos con un tamaño corporal por debajo de 1 mm. Las razones por las que son el pequeño tamaño y la cutícula dura que hace difícil el uso de protocolos de la histología clásica. Además, el corte histológico destruye la muestra y no puede ser utilizado para material único. Por lo tanto, un método no destructivo, es deseable que permite ver el interior de pequeñas muestras sin necesidad de seccionar.

Hemos utilizado sincrotrón de rayos X de tomografía en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Grenoble (Francia) para producir de forma no invasiva por tomografía 3D conjuntos de datos con una resolución de píxel de 0.7μm. El uso de software volumen renderizado, lo que nos permite reconstruir la organización interna en su estado natural, sin los artefactos producidos por el corte histológico. Estas fecha se puede utilizar para la morfología cuantitativa, puntos de referencia o para la visualización de películas de animación para comprender la estructura de las partes del cuerpo oculto y seguir sistemas completos de órganos o tejidos a través de las muestras.

Protocol

Los animales utilizados en este estudio

Las muestras de los ácaros oribátidos partenogenética longisetosus Archegozetes (Acari, Oribatida) se tomaron de nuestros cultivos de laboratorio. La cultura crece en un yeso / mezcla de carbón (9:1) en frascos de plástico, en la oscuridad constante a 20-23 ° C, con aproximadamente el 90% de humedad relativa del aire.

Preparación de la muestra

1. Las muestras fueron tomadas de la cultura, limpiar con un cepillo de cerdas finas y se colocan en una mezcla 06:03:01 de etanol al 80%, 35% de formaldehído y el 100% de ácido acético durante 24 horas.
2. Posteriormente, las muestras se deshidrataron en una serie de etanol escalonadas al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% y 100% con tres cambios en cada concentración, y 10 minutos entre los pasos.
3. Finalmente, las muestras se colocaron en el nuevo punto de etanol al 100% durante la noche y crítico seca en CO ₂ (CPD 020, Balzers). Las muestras secas se adjunta a la punta de los pasadores de plástico (1,2 cm de largo, 3,0 mm de diámetro).

Sincrotrón de rayos X de tomografía

Tomografía de rayos X se realizó en la línea de luz ID19 (ESRF, Grenoble, Francia, el experimento de SC-2127).

1. Las muestras fueron montadas en el portamuestras y se ajusta a una posición central en la viga.
2. Las muestras se midieron con una energía de 20,5 keV. Las radiografías fueron grabados con un CCD enfriado (ESRF Frelon cámara) con un rango dinámico de 14 bits, 2048 × 2048 píxeles y un tamaño de píxel de 0,7 micras eficaz. 1500 las proyecciones se registraron más de la rotación de 180 ° de la muestra con un tiempo de exposición de 0,35 s para cada proyección. La distancia del detector a la muestra fue de 20 mm.

Utilizando una cierta distancia entre la muestra y el detector permite una imagen diferencial de los materiales con bajos coeficientes de atenuación de rayos X (Cloetens, et al. 1996), lo que produciría el contraste es insuficiente en las imágenes de absorción (en el ejemplo se encuentra directamente en frente del detector ). La mayoría de los asuntos biológicos son objetos de fase, compuesta de materiales con baja absorción y / o sólo pequeñas diferencias en el número atómico (Betz, et al. 2007). Sin embargo, la fase de tomografía axial requiere una alta coherencia espacial de un grupo homogéneo haz de rayos X. Por lo tanto, la radiación de sincrotrón es más adecuado que los escáneres de escritorio para este tipo de mediciones.

Análisis de los datos

1. Las radiografías resultantes 2D a 3D se transformaron los datos de voxel (8-bit color gris-valores) con una retroproyección filtrada algoritmo (Cloetens, et al., 1997)
2. Los datos voxel se analizaron con el software Max vgstudio 1.2.1. (Gráficos de volumen, Heidelberg, Alemania).
3. Grey-los valores del fondo fueron retirados del histograma para la visualización 3D.
4. Predefinido de cámara caminos fueron utilizados para generar animaciones de rotación y planos de animación de recorte.
5. Definido por el usuario camino de la cámara se ha generado a seguir el sistema digestivo de A. longisetosus.

Discussion

En esta presentación, nos centramos en la visualización en 3D de la anatomía interna de un chelicerate micro-artrópodos. El sincrotrón de rayos X de las mediciones de permitir que un pixel de resolución de hasta 0.3μm, dependiendo del tamaño de la muestra. En este caso, hemos demostrado con datos 0.7μm píxeles de resolución. Por lo general, de sincrotrón de rayos X de tomografía puede ser útil para el análisis de pequeños materiales biológicos (o tejidos) con rayos X de baja atenuación. Los píxeles de resolución casi alcanza la de microscop...