En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

1. Gelatinizar T75 frasco con una solución de gelatina al 0,1% y la placa se incuba en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora de cultivo de tejidos durante la noche un día antes.
2. Saque las células MES de incubar, se aspira el medio, enjuague el cultivo de células ES con PBS, se añaden 0,05% de solución de tripsina para cubrir el fondo del plato (2 placas ml/100mm).
3. Se incuba a 37 ° C durante aproximadamente un minuto, hasta que las células son desprendimiento de la placa.
   
4. Suavemente triturar (pipeta de arriba y abajo) de las células trypsinized cuatro a seis veces para dispersar las células madre embrionarias con una pipeta Pasteur conectada,. Transferencia de las células madre embrionarias se dispersaron en un tubo de centrífuga de 15 ml cónicos que contengan precalentado (37 ° C) medio MES.
   
5. Recoger las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante, agregar 10 ml de medio de MES y la pipeta hacia arriba y abajo para formar una suspensión de células individuales.
   
6. La transferencia de la suspensión celular en un matraz T75 pre-recubiertas con gelatina al 0,1% y se incuba a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante una hora
   
   * Después de una hora, los fibroblastos se han adherido a la placa, pero las células madre permanecen en el medio. Pipeta hasta el medio para recolectar las células madre.
   
   
7. Vuelta a las células a 1000 rpm durante 5 min y se aspira el medio de MES. A continuación, añadir otra de 10 ml de medio de diferenciación MES y volver a suspender las células mediante pipeteo repetitivo hasta que parece que hay una suspensión fina de las células.
8. Recuento de células con un medio de diferenciación hemocitómetro utilizar para diluir la suspensión de células madre a una concentración de 400 a 500 células por 20 ul (20ul/drop) en un recipiente estéril.
9. Levante la tapa, con cuidado invertir y colocar en la parte superior de la cápsula que contiene 10 ml de PBS. Con una pipeta multicanal, hacer filas de las gotas de 20 ul en la superficie interna hasta convertido de la tapa de la placa de cultivo de tejidos.
10. Coloque cuidadosamente el plato en la incubadora por 2 días. Después de dos días, con cuidado a su vez sobre la cubierta de la placa, aspirar el medio 180 ul diferenciación fresca y poner unas gotas en el pocillo de una placa de 96 pozos ultra adjunto. Luego de recogida la caída de las gotas de pipeta y la transferencia, una por una, a la placa de 96 pocillos. Coloque las placas en el reposo durante tres días incubadora.
    
11. Cubrir cada pocillo de una placa de tejido de 48 pocillos con 300ul de 0,1% de gelatina. Después de añadir la gelatina, se incuba la placa durante la noche a 37 ° C, un día antes antes de la transferencia de la EBS.
    
12. Al día siguiente, se aspira que la gelatina de la placa de 48 pocillos. A continuación, añadir 300 ul de medio de diferenciación a cada pocillo. Transferir el EBs de la 96 y placas a los 48 y recubiertos de gelatina placas de uno por uno. Cambiar el medio al día siguiente y luego cambiar el medio de cada dos días para mantener las células.
    
13. Contracciones espontáneas cardiaomyocyte debe ser evidente en los últimos 7 días.

The disadvantages of hanging drop method are as follows: the liquid volume of a drop is limited to less than 50ul due to maintaining hanging drops on the lid by surface tension, and it’s impossible to change the medium for hanging drops. Observation of forming EBs in drops directly with microscopy is also very difficult during cultivation. Further more , the hanging drop method consists of two steps, therefore, a series of step of the hanging drop method may be troublesome.