La MODS método para el diagnóstico de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente

Resumen

La observación microscópica de susceptibilidad a fármacos (MODS) es un ensayo de bajo costo, baja tecnología de herramientas de alto rendimiento para la detección de la tuberculosis (TB) y la tuberculosis multirresistente (TB-MDR). Este vídeo describe el líquido MODS medios método de cultivo.

Resumen

Los pacientes con tuberculosis pulmonar activa (TB) infectan 10-15 personas por año, por lo que el diagnóstico de tuberculosis activa esencial tanto para la curación del paciente y prevenir nuevas infecciones. Por otra parte, la aparición de tuberculosis multirresistente (TB-MDR) significa que la detección de resistencia a los medicamentos es necesario para detener la propagación de cepas resistentes. La observación microscópica de susceptibilidad a fármacos (MODS) es un ensayo de bajo costo, baja tecnología de herramientas de alto rendimiento para la detección de la TB y TB MDR. El ensayo MODS se basa en tres principios: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) crece más rápido en medios líquidos que en medios sólidos 2) el crecimiento de MTB microscópica puede ser detectado antes en medios líquidos de esperar a que el aspecto macroscópico de las colonias en medios sólidos, y que el crecimiento es característico de MTB, lo que le permite distinguirse de la contaminación por micobacterias atípicas o por hongos o bacterias 3) los medicamentos isoniazida y la rifampicina pueden ser incorporados en el ensayo de MODS para permitir la detección simultánea directa de la TB-MDR, obviando la necesidad de llevar a cabo la subcultura una prueba indirecta de la susceptibilidad de drogas. La competencia de diagnóstico actuales se ven obstaculizados por la baja sensibilidad con frotis de esputo, las largas demoras hasta el diagnóstico con medio de cultivo sólido, con el costo prohibitivo de los actuales métodos de cultivo líquidos medios de comunicación, y la necesidad de hacer la subcultura de las pruebas indirectas para detectar sensibilidad a los medicamentos TB MDR. En contraste, el método no-propietario MODS tiene una alta sensibilidad para la TB y TB MDR, es un método de cultivo relativamente rápido, proporciona pruebas simultáneas sensibilidad a los medicamentos para la TB-MDR, y se puede acceder a recursos limitados, en poco menos de $ 3 para las pruebas de tuberculosis y TB-MDR.

Protocolo

1. Preparar soluciones madre
   1. Fosfato de existencias reguladoras
      1. Mezclar 950 ml de solución de sodio dibásico (9.47g de fosfato de sodio dibásico disuelto en agua destilada 1000 ml) con 950 ml de solución de fosfato de potasio monobásico (9.07g de fosfato de potasio monobásico disuelto en agua destilada 1000 ml) y se agita; retener 50 ml de cada solución para ajustar pH si es necesario
      2. Ajustar el pH a 6,8 ± 0,2: añadir fosfato de sodio dibásico solución para elevar el pH, agregar solución de fosfato monobásico de potasio a un pH más bajo
      3. Autoclave a 121-124 ° C durante 15 minutos para esterilizar
      4. Placa de una alícuota de 100μl de la solución amortiguadora de fosfato en el medio de agar nutriente en una placa de Petri y se incuba a 37 ° C durante 48 horas para confirmar la esterilidad
      5. Guarde en el refrigerador a 2-8 ° C durante un máximo de un mes
         
         Nota: Cada muestra de esputo requiere 10 ml de solución amortiguadora de fosfato
         
   2. Descontaminación de valores
      1. Combinar volúmenes iguales de solución de hidróxido sódico (8,0 g de hidróxido de sodio disuelta en 200 ml de agua destilada estéril) y la solución de citrato de sodio (5,8 g de citrato de sodio en 200 ml de destilado de agua destilada estéril)
      2. Mezclar y esterilizar en autoclave a 121-124 ° C durante 15 minutos
      3. Guarde en el refrigerador a 2-8 ° C durante un máximo de un mes
         
         Nota: Cada muestra de esputo requiere 2ml de las acciones de descontaminación
         
   3. Los medios de cultivo de valores
      1. En 900 ml de agua destilada estéril añadir 3.1ml de glicerol y 1,25 g de casitona y 5.9g de polvo de medio 7H9; mezcla con agitación constante hasta que se disuelva
      2. Autoclave a 121-124 ° C durante 15 minutos
      3. Dejar enfriar y dividir el medio estéril en alícuotas 4.5ml en estériles 16x 100 mm tubos de vidrio para preparación de muestras y alícuotas de 10.8ml para la preparación de las soluciones de antibióticos y los controles internos
      4. Se incuba a 37 ° C durante 48 horas para verificar la esterilidad (ausencia de turbidez)
      5. Almacenar a 2-8 ° C con la tapa bien cerrada para un máximo de un mes
         
         Nota: Cada muestra de esputo requiere un tubo que contiene 4.5ml de medio 7H9
         
   4. Las soluciones de antibióticos de valores
      1. A. La isoniazida acciones (8 mg / ml)
         1. Disolver 20 mg de isoniazida por completo en 2,5 ml de agua destilada estéril
         2. Filtro con filtro de jeringa de 0.2μm para solventes acuosos
         3. Almacenar en alícuotas de 20μl en tubos estériles centrifugación micro a -20 ° C hasta por 6 meses
            
            Nota: Cada alícuota almacenada 20μl es suficiente para un máximo de 100 muestras (incluyendo desperdicios)
            
      2. B. La rifampicina acciones (8 mg / ml)
      1. Disolver 20 mg de rifampicina por completo en 1.25ml DMSO
      2. Añadir 1.25ml de agua destilada estéril y mezclar
      3. Filtro con filtro de jeringa de 0.2μm para solventes orgánicos
      4. Almacenar en alícuotas de 20μl en tubos de microcentrífuga estériles a -20 ° C hasta por 6 meses
         
         Nota: Cada alícuota almacenada 20μl es suficiente para un máximo de 100 muestras (incluyendo desperdicios)
         
2. Prepare las soluciones de trabajo
   1. Solución de trabajo de descontaminación
      1. Disolver 0,1 g de cristales de NALC en cada 20 ml de solución de descontaminación necesarios
         
         Nota: Cada muestra de 2 ml de solución de las necesidades de descontaminación
         
         Nota: Desechar la solución de descontaminación NaOH-NALC que no se utilice después de 24 horas NALC pierde su actividad mucolítica con el tiempo
         
   2. Cultura de los medios de solución de trabajo
      1. Establece:
         1. 1 tubo con medio 7H9 para cada muestra de esputo para ser procesados, además de un tubo adicional para cada plato (para la columna de control negativo)
         2. 2 tubos de medio 7H9 para los controles positivos (3 cepas monorresistentes si se utilizan)
         3. 1-2 tubos con 10.8ml 7H9 para la preparación de una solución antibiótica
      2. Añadir 0,5 ml OADC al 4.5ml de 7H9 en cada tubo de muestra
      3. Añadir 1,2 ml OADC a los tubos con 10.8ml 7H9
      4. Ponga a un lado 2 tubos con 5ml 7H9-OADC para los controles positivos, y el tubo (s) con 12 ml 7H9-OADC a utilizar para la preparación de una solución antibiótica (que no requieren PANTA)
      5. Reconstituir PANTA y añadir 0,1 ml a cada tubo de muestra y los tubos de control negativo (7H9-OADC-PANTA: volumen total = 5.1ml)
         
         Nota: medio completo con PANTA (7H9-OADC-PANTA) se utiliza para muestras de esputo y los controles negativos, el uso de 7H9-OADC sin PANTA para los controles positivos y para la preparación de una solución antibiótica
         
   3. Antibióticos soluciones de trabajo
      1. 1. En la figura 1 pasos para hacer la solución de antibióticos que trabajan en un 24 sin usar y placa
         
         Nota: Para obtener los resultados de sensibilidad precisa, las concentraciones de antibióticos final son críticos. El siguiente procedimiento es adecuado para laboratories equipado con micropipetas. Si no se dispone de pipetas, jeringas de tuberculina se puede utilizar con una serie de diferentes diluciones se describe en la Guía del usuario Apéndice 3 al modsperu.org
         
         Nota: No vuelva a congelar o re-uso de antibióticos de trabajo o soluciones estándar actividad de la droga se puede perder Descartar las soluciones de antibióticos no utilizados al final del día figura la transformación 1.. Lo que las soluciones de antibióticos de trabajo (de la Guía del usuario en modsperu.org)
         
3. Muestra de esputo y la placa de preparación
   1. Descontaminación
      1. 2ml lugar de muestra de esputo en un tubo de centrífuga de 15 ml (si es menos, que hasta 2 ml con tampón fosfato, si más, use solamente 2 ml)
      2. Añadir 2 ml de NaOH-NALC solución
      3. Tubo de tapa y vortex durante 20 segundos, invierta el tubo para asegurar NaOH-NALC contactos solución de la superficie interior del tubo y la tapa
      4. Deje reposar por un mínimo de 15 minutos - puede prolongar por unos minutos si la muestra es muy viscoso. Para evitar el exceso de tratamiento, no debe exceder los 20 minutos
      5. Llene el tubo de 14 ml con tampón fosfato (pH 6,8) para neutralizar el álcali y terminar el proceso de descontaminación, y mezclar bien invirtiendo el tubo 4 veces
      6. Centrifugar a 3000 g durante 15 minutos (véase el apéndice 2 de la Guía del usuario en modsperu.org para la ecuación de revoluciones por minuto necesarias para llegar a 3000 g)
      7. Elimínese el líquido sobrenadante en un recipiente de residuos líquidos con hipoclorito de sodio al 10% u otro desinfectante adecuado y retener el sedimento
   2. Preparación de la suspensión de la muestra final y copia de seguridad
      1. Utilizando 7H9-OADC-PANTA (del tubo que contiene 5.1ml), resuspender el pellet de la muestra en un volumen total de 2 ml en el tubo de centrífuga con una pipeta Pasteur, mezclar bien
      2. Retire 1 ml de suspensión de la muestra y guardar en un tubo de microcentrífuga a 2-8 ° C como una copia de seguridad
      3. Añadir 1 ml de la segunda suspensión de la muestra en el tubo con el resto de 7H9-OADC-PANTA y mezcle bien. Esta es la solución final de la muestra preparada para la siembra
   3. La colocación de suspensiones de la muestra en 24 y la placa
      1. Coloque 900μl de la suspensión de la muestra final en cada uno de los 4 pozos de una columna en la placa de 24 pocillos
      2. Repita el procedimiento con muestras adicionales hasta que todas las columnas de la placa, con excepción de la columna 3, están llenos (o hasta que todas las muestras son colocadas)
      3. 900μl 7H9-lugar de OADC medio sin muestra en los 4 pozos de la columna 3 de cada plato de muestras (controles internos negativos)
   4. Añadir antibióticos a las muestras
      1. Con una pipeta de canales múltiples, llenar cuidadosamente 4 puntas con 100μl de los pozos con soluciones de trabajo 7H9-OADC y antibióticos (columna 2 en la dilución de antibióticos placa-ver Figura 1)
      2. Añadir las alícuotas de 100μl de la columna 1 pozos con soluciones de muestra 900μl sin tocar la placa o de la muestra
      3. Repita hasta que todas las columnas han recibido la más 100μl de medio (libre de drogas pozos) o soluciones de antibióticos (incluyendo la columna de control negativo 3)
      4. Cerrar la placa con su tapa y coloque en un cierre hermético de polietileno (Ziplock) y sellar la bolsa (bolsa no se vuelve a abrir a partir de este punto)
      5. Se incuba a 37 ° C (enriquecimiento del CO ₂ no es necesario)
4. Control de calidad
   1. Los controles negativos se practican en cada plato. La presencia de cualquier crecimiento en cualquiera de los pozos en la columna de control negativo indica que la contaminación cruzada, por lo tanto, toda la placa debe ser desechado y las muestras de re-plateado.
   2. Los controles positivos se ejecutan en un plato aparte, al final del día. Una totalmente sensible a los medicamentos cepa se ejecuta en una columna y una cepa resistente a INH y RIF se ejecuta en otra columna. Si existe la preocupación acerca de la ejecución de una cepa MDR, tanto una cepa monorresistentes INH y RIF monorresistentes una cepa se puede ejecutar en el lugar de las cepas susceptibles y MDR. Todos los controles positivos deberían tener un crecimiento en los pozos sin drogas para demostrar que el crecimiento del apoyo a los medios de comunicación. Para demostrar que las concentraciones de fármaco son correctas, la cepa susceptible no debe crecer en el INH y RIF pozos, pero la cepa MDR debe crecer también crecer en el INH y RIF pozos.
      
5. Placa de la lectura
   1. Con el día de la siembra como el "Día 0", lectura de matrículas comienza el día 5, y si es negativo el día 5 de lectura se hace cada día (o días alternos en función de la carga de trabajo) hasta el día 14 y luego cada 2-3 días desde el día 15 -21. Las placas se examinaron en unmicroscopio invertido de luz con el objetivo de 10x
   2. Una cultura positiva es aquella en la que hay dos o más unidades formadoras de colonias (> 2 ufc) en ambos pozos sin drogas. Crecimiento de las micobacterias se parece a principios de pequeñas curvas comas o espirales (días 5-9). La formación de colonias por lo general avanza a "cuerdas" o "enredos" (ver la biblioteca de imágenes en modsperu.org)
   3. El día en un cultivo es positivo en los 2 libres de drogas pozos, los pozos que contienen drogas debe ser leído. Cualquier crecimiento en la presencia de un fármaco indica la resistencia a ese medicamento.
      
      Nota: Si la lectura de los pozos que contiene el fármaco se hace> una semana después de un cultivo positivo se observó en los pozos sin drogas, esto puede no representar la resistencia de ruptura a través del crecimiento se ve ocasionalmente
      
   4. Las muestras que no son positivos en el día 21 se consideran cultivos negativos
   5. Nubosidad de los pozos es el resultado del crecimiento excesivo de la contaminación, mientras que el crecimiento de micobacterias no da lugar a la nubosidad
   6. Al término de 21 días las culturas pueden ser descartados. Culturas permanecer en sus bolsas selladas y se colocan en bolsas de autoclave y en autoclave a 121-124 ° C durante 45-60 minutos

Discusión

El ensayo MODS está dirigido a entornos de recursos limitados. Por primera vez, trae la posibilidad de MODS para la detección rápida de cultivo líquido de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente a los entornos con recursos limitados en poco menos de 3 dólares por prueba. MODS es un no-propietario, metodología iterativa, y la comunidad de MODS está siempre interesada en las mejoras que otros laboratorios han logrado hacer.

Una preocupación recurrente es la bioseguridad de los medios de cultivo líquidos de la tuberculosis y...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Refrigerador/congelador	Equipo			para almacenar caldo pre-preparado y existencias de antibióticos
Equipo			vórtice	para ayudar a la descontaminación del esputo
Equipo			centrífuga	para la concentración de esputo; capaz de alcanzar 3000 g; d– s no necesita ser refrigerado, pero DEBE ser bioseguro (los cubos se pueden sellar)
Incubadora (37 grados C)	Equipo			para cultivo; no necesita ser enriquecido con CO2
Microscopio de luz invertida	Microscopio			para leer placas MODS
Equipo			autoclave	para esterilizar medios, PBS y placas usadas
Equipo				de equilibriopara pesar isoniazida, rifampicina y caldo NALC
Middlebrook 7H9 (Difco)	Reactivo	Fisher Scientific	DF0713-17-9	500gr/botella; base de medios de cultivo
Casitone (caseína de digestión pancreática)	Reactivo	Fisher Scientific	DF0259‐ 17‐ 9	500gr/botella; base de medios
de cultivo Glicerol (glicerina) liofilizado	Reactivo	Sigma-Aldrich	G‐ 33‐ 500	500 ml/botella; base
de medios de cultivo PANTA (Mezcla de antibióticos liofilizada BD)	Reactivo	Fisher Scientific	B4345114	6 frascos/paquete; suplemento antibiótico
OADC (Middlebrook OADC enrichment BD)	Reactivo	Fisher Scientific	B11886	10 x 20 ml/paquete; suplemento nutricional de medios
Dimethyl sulfóxido (Hibri-Max)	Reactivo	Sigma-Aldrich	D-2650	100 ml/frasco; para preparar caldo de rifampicina
Stocks de antibióticos: isoniazida	Reactivo	Sigma-Aldrich	I-3377	50gr/frasco; pruebas de susceptibilidad directa
Existencias de antibióticos: rifampicina	Reactivo	Sigma-Aldrich	R-3501	1gr/frasco; pruebas de susceptibilidad directa
Hidróxido de sodio (pellets)	Reactivo	Sigma-Aldrich	221465	500gr/botella; Descontaminación de esputo
Citrato de sodio (sal trisódica dihidratada)	Reactivo	Sigma-Aldrich	S-4641	500gr/frasco; descontaminación de esputo
N-acetil-L-cisteína	Reactivo	Sigma-Aldrich	A-7250	50gr/botella; descontaminación de esputo
Fosfato de potasio Cristal monobásico. KH2PO4	Reactivo	Sigma-Aldrich	P0662	500gr/frasco; descontaminación de esputo
Fosfato Sódico Dibásico, anhidro. Na2HPO4	Reactivo	Sigma-Aldrich	S0876	500gr/botella; Descontaminación de esputo
Hipoclorito de sodio	Reactivo	lejía		para desechar residuos contaminados
15ml tubos de centrífuga (polipropileno 15ml Falcon 35‐ 2096)	Consumible	Fisher Scientific	14‐ 959‐ 49B	500ea/caja; para la descontaminación y concentración de esputo
placas de 24 pocillos (Placas Tissue 24 pocillos BD Falcon 35‐ 3047)	Consumible	Fisher Scientific	08-772-1	50 placas/caja; para la cultura y la lectura
Bolsas de polietileno sellables 6 X 6 “ (cierre hermético)	Consumible			para bioseguridad para contener placa de 24 pocillos
Tubos de vidrio con tapa (16 x 100 mm y 18 x 145 mm)	Consumible	VWR international	47729-583	500 tubos/caja; para almacenar alícuotas de caldo preparado
Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca (1,5 ml)	Consumible	Fisher Scientific	05‐ 669‐ 22	1000ea/caja; para almacenar alícuotas de existencias de antibióticos
0,22μ m filtros (disolventes acuosos) Filtro de jeringa Millex azul	Consumible	Fisher Scientific	SLGL 025 OS	50 unidades/caja; para filtrar existencias de antibióticos
0,22μ m filtros (disolventes orgánicos) Filtro de jeringa Millex amarillo	Consumible	Fisher Scientific	SLGV 033 RS	50 unidades/caja; para filtrar las existencias de antibióticos
Pipetas desechables Pasteur vidrio de borosilicato 9″	Consumible	Fisher Scientific	13‐ 678‐ 20C	720ea/caja; para mezclar PANTA con mezcla de medios
Puntas de barrera contra aerosoles 1000‐ 1300μ l	Consumible	Fisher Scientific	02‐ 707‐ 51	1000ea/pk; para dispensar medios en la placa
USA Scientific Tips One 1‐ 200μ l puntas amarillas	Consumible	Fisher Scientific	1111‐ 0006	1000 puntas/bolsa; para diluir las existencias de antibióticos