En este artículo se muestra cómo disecar el sistema nervioso central del tercer estadio las larvas de Drosophila.
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Artículo de método
La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster
En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema nervioso central (SNC) de las larvas de Drosophila es compleja y poco comprendida. Una manera de investigar el sistema nervioso central es el uso de inmunohistoquímica para examinar la expresión de la novela de varias proteínas y marcadores. Tinción de las larvas de todo es práctico, porque la cutícula dura evita que los anticuerpos de penetrar en el interior de la cavidad corporal. Con el fin de manchar estos tejidos es necesario disecar el animal antes de la fijación y tinción. En este artículo se muestra cómo diseccionar las larvas de Drosophila, sin dañar el sistema nervioso central. Empiece por romper la larva en el medio con un par de pinzas finas, y luego gire a la cutícula "de adentro hacia fuera" para exponer el sistema nervioso central. Si la disección se realiza con cuidado el sistema nervioso central permanecerá unido a la cutícula. Por lo general, mantener el sistema nervioso central unido a la cutícula a lo largo de los pasos de fijación y la tinción, y sólo eliminar por completo el sistema nervioso central de la cutícula, justo antes de montar las muestras sobre portaobjetos de vidrio. También muestran algunas imágenes representativas de un sistema nervioso central larvas manchadas con Eva, un factor de transcripción expresado en un subconjunto de neuronas del sistema nervioso central. El artículo concluye con una discusión de algunos de los usos prácticos de esta técnica y las posibles dificultades que puedan surgir.
Protocolo
- Diseccionar 3 de larvas, dejando SNC unido a la cutícula. Colocar en un tubo de 1,5 ml.
- Fijar en PBS (1x) que contiene 2% de formaldehído durante 40 min con la oscilación. ; Uso 250ul por cada SNC 50-10 disecados.
- Eliminar el formaldehído y el breve lavar 3 veces con PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Utilice una tira fina pipeta Pasteur para evitar la pérdida de tejido.
- Bloque no específicas sitios de unión a proteínas y permeabilizar las membranas celulares mediante la incubación de los tejidos 1-8 horas en PBST + 5% de BSA, meciéndose a 4 ° C.
- Se incuban en anticuerpo primario diluido en PBST + 5% BSA mecedora a 4 ° C durante la noche. Dilución del anticuerpo óptima variará para diferentes anticuerpos.
- Enjuagar 3 veces en PBST seguido de dos lavados 30 minutos a 4 ° C.
- Se incuban en anticuerpo secundario diluido en PBST + 5% de BSA para 1.3 horas meciéndose a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en PBST seguido de dos lavados 30 minutos a 4 ° C. Si el secundario está conjugado con un compuesto sensible a la luz, envuelva el tubo con papel de aluminio.
- Diseccionar tejido más (si es necesario) y montar en las diapositivas.
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Discusión
Este video muestra la forma de analizar el sistema nervioso central del tercer estadio las larvas de Drosophila. Después de la disección, el sistema nervioso central pueden ser teñidos utilizando un protocolo estándar de inmunohistoquímica. En la actualidad, queda mucho por descubrir acerca de cómo el sistema nervioso adulto se genera, así como la forma en que almacena y transmite información. Los estudios de los países en desarrollo larval de Drosophila SNC debe mejorar el conocimiento de cableado del sistema nervioso y la función.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Pinzas | punta fina | |||
| Placa de reloj de 9 pozos | ||||
| Placa de Petri de plástico |
Referencias
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13, 507-523 (1994).
- Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S. even skipped is required to produce a trans-acting signal for larval neuroblast proliferation that can be mimicked by ecdysone. Development 128. , 1899-1909 (2001).
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Reimpresiones y permisos
