Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.
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Artículo de método
Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados en ovocitos de Xenopus
En este artículo
Resumen
Resumen
Desde su desarrollo por Sakmann Neher y 1, 2, el patch clamp se ha establecido como una técnica muy útil para la medición electrofisiológica de los canales de iones únicos o múltiples en las células. Esta técnica se puede aplicar a los canales de iones, tanto en su ambiente nativo y se expresa en células heterólogas, tales como oocitos recolectados de la rana de uñas africana, Xenopus laevis. Aquí se describe la técnica bien establecida de la grabación de patch clamp de los ovocitos de Xenopus. Esta técnica se utiliza para medir las propiedades de los canales iónicos, expresados en las poblaciones (macropatch) o de forma individual (un solo canal de grabación). Nos centramos en las técnicas para maximizar la calidad de la preparación de los ovocitos y la generación de sello. Con todos los factores optimizado, esta técnica da una probabilidad de éxito en la generación de sello 90 por ciento. El proceso puede ser optimizado de manera diferente por cada investigador sobre la base de los factores que él o ella encuentra más importante, y se presenta el enfoque que han llevado al éxito más grande en nuestras manos.
Protocolo
Parte 1: Extracción de la membrana vitelina
- Prepare dos juegos de pinzas. Preferimos No. 5 pinzas, donde ha sido un conjunto ligeramente afilado con una lima. También preparan una pipeta de transferencia de cristal por el recorte y pulido fuego-a 7 "pipeta Pasteur.
- Recomendado: Para evitar que los oocitos de deslizamiento, cortar un círculo de rejilla (1 plazas mm) y pegamento en la parte inferior de una placa de Petri de 60 mm. Este plato se puede reutilizar indefinidamente si se mantienen limpias entre los usos.
- Llene la caja de Petri hasta la mitad con una solución hiperosmótico (ver receta) y de lugar en un microscopio de di....
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Discusión
Hay muchos parámetros de registro electrofisiológico no se discute aquí. Configuración de plataforma, sistema de gestión de ruido, la expresión de los canales y protocolos de registro son también fundamentales para un buen resultado experimental.
En nuestra experiencia, estos son los parámetros más importantes para la formación de sellos fiables: los ovocitos de alta calidad, la eliminación de la membrana vitelina rápidamente (también conocido como "peeling"), usar pipetas de nueva tira protegidos del polvo, pipetas suave .......
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Agradecimientos
Receta de la reducción de solución es el laboratorio de RW Aldrich. Agradecemos a los siguientes organismos de financiación y fundaciones de apoyo: National Institutes of Health, National Science Foundation, la American Heart Association, Asociación de Distrofia Muscular, de la B. Donald y Delia E. Baxter Foundation, el Fondo Klingenstein y la Fundación McKnight para la Neurociencia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Amplificador de registro por parche &y Software | Instrumento | HEKA Instruments | EPC-10 | O cualquier otro dispositivo similar (por ejemplo, HEKA EPC-9 o Axopatch 200B) |
| Pinzas número 5 (dos pares) | Herramienta | Fine Science Tools | ||
| Solución de encogimiento de ovocitos | Reactivo | Ingrediente En mMN-metil-D-glucamina 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Ácido aspártico 220KCl 2Ajustar el pH a 7,4 con N-metil-D-glucamina | ||
| malla tejida | 800 µm | Spectrum Labs | 146481 |
Referencias
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
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Reimpresiones y permisos
