2.2: Técnica aséptica en ciencias ambientales

1. preparación para el trabajo aséptico

1. Obtener y aplicar los siguientes elementos de la PPE: bata de laboratorio, guantes de látex o de nitrilo (sin desgarros o agujeros) y gafas de seguridad (figura 1). Para seguridad en caso de utilizar una llama abierta, atar el cabello largo.
   
   Figura 1: PPE: una bata de laboratorio, guantes de látex y gafas de seguridad.
2. Un segundo aspecto importante de la técnica aséptica es la correcta esterilización y almacenamiento de los medios de comunicación/reactivos a utilizarse en el laboratorio. Preparación de medio líquido caldo (p. ej., caldo de soja tríptica) y agar-medios de comunicación (p. ej., R2A) pesando la cantidad adecuada de polvo seco de la base, que se agrega a la cantidad apropiada de agua desionizada.
3. Para el medio de caldo disolver el polvo en un plato caliente con poco calor aplicado y dispensar el líquido en volúmenes de 100 mL en frascos de vidrio tapa de rosca o en volúmenes de 10 mL en tubos de ensayo de vidrio tapa de rosca. Utilizando una barra de agitación magnética, agitar el medio de agarosa en el agitador de placa calefactora hasta que el polvo se haya disuelto completamente.
4. Aplique cinta de autoclave a los envases y autoclave de los medios de comunicación según las instrucciones del fabricante (p. ej., 20 min a 121 ° C) (figuras 2 y 3). Tenga en cuenta que el color de las rayas en la cinta de autoclave debe cambiar de blanco (autoclave previo) a negro (post-autoclave). Aunque el cambio de color indica generalmente que la esterilización fue exitosa, esterilidad comprueba utilizando kits de la tira de esporas puede llevarse a cabo para verificar el proceso de esterilización en autoclave.
   
   Figura 2: Cinta de Autoclave se aplica al material.
   
   Figura 3: Tenga en cuenta el cambio de color de las rayas en la cinta de autoclave del blanco (autoclave previo) a negro (post-autoclave).
5. Enfriar los caldos líquidos a temperatura ambiente y luego almacenar a temperatura ambiente o refrigerada a 4 ° C.
6. Enfriar el medio de agarosa colocando el recipiente en un baño de agua a 50 ° C. Una vez fríos, los medios de comunicación se pueden verter en placas de Petri estériles. Permitir que el medio a enfriar y solidificar y consolidar almacenamiento bajo temperaturas especificadas por el fabricante.
7. Hay varias variedades de medios de cultivo que no puede ser esterilizado como las altas temperaturas degradan ingredientes críticos. Esterilizar estos requieren filtro de esterilización mediante un sistema de filtración de vacío empleando un filtro de 0,22 μm, seguido de almacenamiento a la temperatura adecuada.
8. Antes de realizar el trabajo en el Banco, desinfectar la superficie con una solución apropiada (p. ej., 500 ppm de cloro). Esto reduce el riesgo de transferencia de contaminantes de la superficie de trabajo para las culturas y medios estériles.
9. Para establecer un campo estéril, encender un mechero de Bunsen. El tipo de llama más adecuado para metal esterilización inoculación bucles es una llama azul intenso, con un cono azul definitivo en el centro (figura 4).
   
   Figura 4: Aislar a una transferencia de bacterias de una placa de Petri mostrando crecimiento de un cultivo a otro no inoculada placa de Petri conteniendo un medio de cultivo base de agar.
10. Pase lentamente el asa de inoculación a través de la parte más caliente de la llama (punta del cono azul). El bucle debe virar a rojo caliente con el fin de esterilización.

2. traslados bacterianas: De placa de Petri para la placa de Petri

1. Un escenario de la transferencia de bacterias es de una placa de Petri mostrando crecimiento de una placa de Petri aislante a otro, estéril cultivada que contiene un medio de cultivo base de agar.
2. Para comenzar, abra ligeramente la placa de Petri que contiene el cultivo bacteriano puro y golpee suavemente el asa de inoculación esterilizada, caliente sobre la superficie del agar.
3. Recuperar una colonia aislada de la superficie de la placa utilizando el asa de inoculación refrescado y cierre la placa de Petri.
4. Realizar una racha de aislamiento utilizando una nueva placa de Petri que contenga medio de cultivo, con la tapa entreabierta.
5. Para cada porción de la franja de aislamiento (3 total por placa), llama-esterilizar el asa de inoculación justo antes de usar. También, llama-esterilizar el asa justo después de la racha final se realiza con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde puede utilizar o entrar en contacto con las asas de inoculación.
6. Coloque las placas veteadas en una incubadora para el crecimiento durante la noche.

3. bacterianas transferencias: Del caldo de cultivo en placa de Petri

1. Un segundo escenario de la transferencia de bacterias es de un cultivo en caldo exhibiendo crecimiento general observado por turbidez a una placa de Petri estéril con medio de cultivo.
2. Retire la tapa del tubo (o frasco) conteniendo el cultivo bacteriano puro y pasar a la apertura del envase x 2-3 a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
3. Baje con cuidado el asa de inoculación esterilizada en la cubeta de tubo y presione suavemente contra el costado del recipiente para enfriar justo antes de la inserción en el caldo de cultivo.
4. Quitar un asa llena de caldo de cultivo (figura 5) y vuelva a colocar inmediatamente la tapa.
   
   Figura 5: Un asa llena de caldo de cultivo.
5. Realizar una racha de aislamiento utilizando una nueva placa de Petri que contenga medio de cultivo, con la tapa entreabierta.
6. Para cada parte de la raya (3 total por placa), llama-esterilizar el asa de inoculación justo antes de usar. También, llama-esterilizar el lazo justo después de la racha final se realiza con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
7. Coloque las placas de rayas para el aislamiento en una incubadora para el crecimiento durante la noche.

4. bacterianas transferencias: De la placa de Petri con el crecimiento en medio líquido estéril de

1. Un tercer escenario de la transferencia de bacterias es de una placa de Petri que contienen una racha aislada cultura a un tubo/frasco que contenga medio de cultivo líquido estéril.
2. Un poco abrir la placa de Petri que contiene el cultivo bacteriano puro y enfriar el asa de inoculación caliente golpeando suavemente sobre la superficie del agar.
3. Recuperar una colonia aislada de la superficie de la placa utilizando el asa de inoculación refrescado y cierre la placa de Petri.
4. Quite la tapa del tubo de ensayo (o frasco) que contiene el líquido estéril medio de crecimiento y pasar la apertura del envase 2 a 3 veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa en la mesa.
5. Baje con cuidado la Colonia extraída en el medio líquido caldo y frote suavemente el bucle para liberar las bacterias. Inmediatamente vuelva a colocar la tapa.
6. Llama-esterilizar el asa de inoculación para prevenir la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
7. Lugar el frasco en una incubadora para el crecimiento durante la noche.
8. Retire el frasco de incubación el día siguiente. Realizar una serie de diluciones para enumerar la cultura.
9. Las diluciones de la serie sobre los medios de cultivo de la agarosa de la placa e incubar las placas durante la noche.
10. Retire las placas al día siguiente y observar para cualquier tipo de contaminación.

5. transferencias bacterianas: De caldo de cultivo al medio de cultivo líquido estéril

1. Un cuarto escenario de la transferencia de bacterias es de un cultivo en caldo exhibiendo crecimiento a un tubo/frasco que contenga medio de cultivo líquido estéril.
2. Retire la tapa del tubo (o frasco) conteniendo el cultivo bacteriano puro y pasar la apertura del envase dos veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
3. Cuidadosamente baje el asa de inoculación en el frasco de tubo y presione suavemente contra el costado del recipiente para enfriar justo antes de la inserción en el caldo de cultivo.
4. Quitar un asa llena de caldo de cultivo y vuelva a colocar inmediatamente la tapa.
5. Quite la tapa del tubo de ensayo (o frasco) que contiene el líquido estéril medio de crecimiento y pasar la apertura del envase dos veces a través de la parte más caliente de la llama. Para evitar la contaminación, no ponga la tapa sobre la mesa.
6. Cuidadosamente baje el asa llena extraído en el medio caldo líquido estéril y frote suavemente el bucle para liberar las bacterias. Inmediatamente vuelva a colocar la tapa.
7. Llama-esterilizar el asa de inoculación (figura 6) con el fin de evitar la contaminación de la superficie del Banco y como una consideración a los demás en el laboratorio que más tarde pueda utilizar las asas de inoculación.
   
   Figura 6: Inocular lazo rojo que da vuelta caliente mientras se esterilizan con un mechero de Bunsen.
8. Lugar el frasco en una incubadora para el crecimiento durante la noche.
9. Retire el frasco de incubación el día siguiente. Realizar una serie de diluciones para enumerar la cultura.
10. Las diluciones de la serie sobre los medios de cultivo de la agarosa de la placa e incubar las placas durante la noche.
11. Retire las placas al día siguiente y observar para cualquier tipo de contaminación.

La técnica aséptica es una habilidad fundamental en microbiología y tiene aplicaciones cruciales en la investigación ambiental.

Si los cultivos microbiológicos están contaminados, el tiempo, la mano de obra y los costos financieros que se requerirían de un laboratorio para "limpiar" o reemplazar los cultivos, particularmente los aislados raros de entornos únicos, podrían ser muy altos y prohibitivos, y algunas muestras podrían ser irremplazables.

El uso adecuado de técnicas asépticas reduce la probabilidad de contaminación bacteriana y fúngica de los reactivos, los medios de cultivo y las muestras ambientales, y también evita la contaminación cruzada entre muestras. También es una medida de seguridad que disminuye la posible transmisión de microbios al experimentador, lo cual es especialmente importante cuando se trabaja con patógenos.

Este video presentará los principios de la asepsia; varias técnicas importantes para mantener reactivos y cultivos estériles; y, por último, algunos de sus usos en las ciencias ambientales.

El objetivo del uso de técnicas asépticas es crear y mantener un entorno de trabajo, equipos y reactivos estériles, para minimizar la contaminación de las muestras biológicas. Las fuentes comunes de contaminación incluyen microorganismos transportados por el aire, microbios presentes en la mesa o el equipo de laboratorio y los del cabello, el cuerpo y la ropa del investigador.

Dos tipos de agentes son fundamentales para eliminar o prevenir la contaminación en el laboratorio: los productos químicos desinfectantes y el calor. Soluciones como el etanol al 70% y la lejía diluida se utilizan a menudo para desinfectar los equipos, las superficies de trabajo y los guantes de los experimentadores antes de realizar un trabajo aséptico.

Al mismo tiempo, los microbios en o dentro de herramientas, cristalería y medios líquidos se pueden matar por calor en un autoclave, que es una cámara que esteriliza el contenido mediante la exposición a vapor presurizado a alta temperatura. Además, las herramientas como las varillas de vidrio utilizadas para el enchapado extendido y los bucles de inoculación de metal se pueden esterilizar con calor utilizando una fuente de llama, como un quemador Bunsen.

El uso de una fuente de llama es también una de las formas más comunes de establecer un entorno de trabajo aséptico. El calor de la llama provoca la convección del aire, generando una corriente ascendente que eleva los contaminantes transportados por el aire lejos de las proximidades del quemador y creando un "campo estéril" en el que realizar trabajos experimentales asépticos.

Ahora que comprende los principios detrás de las técnicas asépticas y por qué son importantes, repasemos un protocolo para crear un entorno de trabajo aséptico, crear medios de crecimiento estériles y transferir bacterias de manera aséptica entre diferentes condiciones de cultivo.

Antes de comenzar el trabajo aséptico, es importante que el experimentador se ponga el equipo de protección personal o EPP adecuado. El propósito de esto es evitar que el experimentador contamine las muestras y los cultivos de laboratorio, y también evitar la transferencia de microbios potencialmente patógenos al investigador. Los artículos de EPP incluyen una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad.

El siguiente paso es esterilizar y almacenar adecuadamente los medios de crecimiento que se utilizarán para cultivar las muestras microbianas. Primero, pese la cantidad adecuada de componentes de medio sólido y agréguelos al volumen adecuado de solvente líquido especificado por el fabricante, como agua desionizada, en un recipiente esterilizable en autoclave Agregue una barra agitadora magnética, coloque el recipiente en un agitador de placa caliente y disuelva los componentes del medio sólido a fuego lento y agitando.

Cierre los recipientes medianos. Si utiliza un recipiente de vidrio con tapa de rosca, asegúrese de no apretar la tapa por completo, ya que el aire dentro de los recipientes se expandirá debido al calentamiento durante el autoclave y necesita escapar. Sin escape, el gas podría hacer que el recipiente se rompiera. Coloque un trozo de cinta de autoclave en los recipientes y autoclave el medio de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como 20 minutos a 121 °C. Después de esterilizar en autoclave, verifique que las rayas de las cintas del autoclave se hayan vuelto negras, lo que indica que se alcanzó la temperatura adecuada.

En el caso de los medios de crecimiento líquidos, deje que se enfríen a temperatura ambiente y guárdelos a temperatura ambiente o con refrigeración, según corresponda. Para medios de crecimiento sólidos a base de agar, déjelos enfriar a aproximadamente 50 ? C, luego vierta en placas de Petri estériles. Deje que el agar se enfríe y solidifique antes de almacenarlo a la temperatura adecuada.

En el caso de los medios que no se pueden esterilizar en autoclave debido a la presencia de componentes sensibles al calor, esterilize con un filtro de 0,22 μm.

Una técnica fundamental en el trabajo microbiológico es la transferencia aséptica de cultivos bacterianos entre diferentes medios de crecimiento, tanto sólidos como líquidos. Antes de comenzar, limpie la superficie de la mesa de laboratorio con un desinfectante. Esto reduce el riesgo de contaminar cultivos o medios estériles.

La transferencia de cultivos bacterianos comúnmente hace uso de una herramienta llamada circuito de inoculación, que debe esterilizarse antes de su uso calentando una llama.

Encienda una fuente de llama. Pase lentamente el asa de inoculación a través de la punta de la llama. El bucle se pondrá al rojo vivo. Para transferir una colonia bacteriana de una placa de agar sólida, abra ligeramente la placa de Petri y golpee suavemente el asa de inoculación caliente en una parte vacía de la superficie del agar para evitar que las bacterias maten por calor. Raspe una sola colonia con el asa de inoculación y cierre la placa.

Para transferir bacterias de un medio de crecimiento líquido, retire la tapa del recipiente de cultivo. Para ayudar a prevenir la contaminación, evite colocar la tapa sobre el banco. Pase la boca del recipiente 2-3 veces a través de la parte más caliente de la llama. Luego, toque con cuidado el asa de inoculación caliente y esterilizada en el interior del recipiente y déjelo enfriar antes de insertarlo en el cultivo de caldo. Retire un bucle de la referencia cultural y cierre inmediatamente la tapa.

Para transferir las bacterias obtenidas a un medio de crecimiento estéril, retire la tapa de un recipiente con el caldo estéril y pase la abertura del recipiente a través de la llama 2-3 veces. Luego, baje con cuidado el asa de inoculación en el medio y agite suavemente para liberar las bacterias. Cierre inmediatamente la tapa. Esterilice el asa de inoculación después de su uso.

Si transfiere bacterias a una placa de agar estéril, abra la tapa de una placa de Petri nueva con agar sin inocular. Raye el circuito de inoculación con el cultivo bacteriano de un lado a otro a través de un sector del agar. Esterilice el bucle y enfríelo tocando una parte vacía del agar, luego haga otra raya en el agar en un ángulo obtuso con respecto a la primera raya, asegurándose de cruzar la primera raya en los primeros 1-2 golpes, pero evite tocar la primera raya en los golpes posteriores. Repita la esterilización y el rayado 2 veces más. Cierre la placa de Petri y esterilice el circuito de inoculación.

Una vez inoculado, el caldo o la placa de agar deben incubarse a la temperatura de crecimiento ideal para que el microorganismo dado obtenga un cultivo viable. En medio sólido, un césped o una hebra continua de bacterias sería visible en agar cubierto por las dos primeras rayas, pero se deben obtener colonias individuales en la raya final. Las técnicas asépticas deficientes darían como resultado el crecimiento de moho y otros contaminantes en la placa.

Las técnicas asépticas son importantes en muchos experimentos con muestras microbianas del medio ambiente. En este estudio, los investigadores aislaron bacteriófagos, que son virus que infectan bacterias, de la bacteria común del suelo Arthrobacter. Los cultivos de Arthrobacter se cultivaron primero en condiciones asépticas. A continuación, las muestras de suelo se lavaron y filtraron en tampón de fagos, y la solución de fagos se mezcló con el cultivo bacteriano y se colocó en placas de agar. Se formaría un césped bacteriano en la placa, pero habría claros, o "placas", en los lugares donde el virus había infectado y matado a las bacterias. A continuación, el fago podría purificarse a partir de estas placas para su posterior estudio.

Además de usar quemadores Bunsen, los entornos de trabajo asépticos también se pueden mantener en estaciones de trabajo especializadas conocidas como campanas de flujo laminar, que utilizan flujo de aire dirigido y filtros para mantener la esterilidad. Aquí, los científicos trabajaron en una campana de flujo para aislar bacterias y virus patógenos potenciales de muestras de agua. Estos aislados se cultivaron junto con amebas. Debido a que las amebas normalmente comen o "fagocitan" bacterias, cualquier bacteria que pueda resistir la digestión amebiana y permanecer en estos organismos también puede potencialmente permanecer viable en las células humanas y causar enfermedades.

Finalmente, las condiciones estériles permiten un estudio detallado de los mecanismos ecológicos, como la formación de nódulos radiculares en las plantas leguminosas, órganos llenos de bacterias que "fijan" el nitrógeno atmosférico en amoníaco, que es utilizado por la planta para el crecimiento. Los investigadores crearon "microcosmos" para estudiar el proceso de nodulación utilizando placas de Petri con muescas con medio de crecimiento de plantas, colocaron plántulas en ellas e inocularon las plántulas con bacterias rizobianas formadoras de nódulos. El entorno aséptico de la campana de flujo evita la contaminación de los cultivos con otras bacterias u hongos.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre las técnicas asépticas en las ciencias medioambientales. Ahora debería entender por qué son importantes las condiciones de trabajo asépticas; cómo realizar experimentos microbiológicos de forma aséptica; y algunas aplicaciones de las técnicas asépticas a la investigación ambiental. Como siempre, ¡gracias por mirar!